CN1352650A - 用于治疗il－18介导疾病的重组il－18拮抗物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了源于高亲和性中和单克隆抗体的嵌合、人源化或其它IL－18单克隆抗体,含有该抗体的药物组合物以及治疗和诊断方法。

Description

用于治疗IL-18介导疾病的重组IL-18拮抗物
发明领域
本发明涉及诊断和治疗IL-18介导疾病的抗体和修饰抗体，更具体地是单抗，Fab，嵌合及人源化抗体。
发明背景
人白细胞介素-18近来被鉴定为一种细胞因子，它是作为无生物活性的193氨基酸前体蛋白被合成的(Ushio等，J.Immunol.156：4274，1996)。受caspase-1或caspase-4作用，前体蛋白裂解，释放出156氨基酸的成熟蛋白(Gu等，Science 275：206.1997：Ghayur等，Nature 386：619，1997)，其生物活性包括共同刺激T细胞增殖，增强NK细胞的细胞毒性，诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ，和加强T辅助细胞1(Th1)分化(Okamura等，Nature378：88，1995；Ushio等，J.Immunol.156：4274，1996；Micallef等，Eur.J.Immunol.26：1647，1996；Kohno等，J.Immunol.158：1541，1997；Zhang等，Infect.Immunol.65：3594，1997；Robinson等，Immunity 7：571，1997)。此外，IL-18高效诱导人单核细胞促炎介体，包括IL-8，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)(Ushio，S.等，J.Immunol.156：4274-4279，1996；Puren，A.J.等，J.Clin.Invest.10：711-721，1997；Podolin等，J.Immunol.submitted，1999)。
此前克隆的IL-1受体相关蛋白(IL-1 Rrp)(Parnet等，J.Biol.Chem.271：3967，1996)近来被鉴定为IL-18受体(Kd＝18nM)(Torigoe等，J.Biol.Chem.272：25737，1997)的一个亚基。IL-18受体的另一个亚基与IL-1受体辅助蛋白具有同源性，并称为AcPL(辅助蛋白类)。IL-18诱导的NF-κB和JNK激活需IL-1 Rrp和AcPL二者的表达(Born等，J.Biol.Chem.273：29445，1998)。除NF-κB和JNK外，IL-18信号也可经IL-1受体相关激酶(IRAK)，p561ck(LCK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)(Micallef等，Eur.J.Immunol.26：1647，1996；Matsumoto等，Biophys Biochem.Res.Comm.234：454，1997；Tsuji-Takayama等，Biochem.Biophys.Res.Comm.237：126，1997)传递。
产生促炎细胞因子如IFN-γ，IL-2和TNF-β(Mosmann等，J.Immunol.136：2348，1986)的Th1细胞参与介导许多自身免疫疾病，包括多发性硬化(MS)、类风湿关节炎(RA)、I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、炎性肠病(IBD)和牛皮癣(Mosmann and Sad，Immunol.Today 17：138，1996)。因此，预期促Th1细胞因子如IL-18的拮抗将抑制疾病发展。IL-18特异单抗可用作拮抗物。
IL-18在自身免疫疾病发展中的作用已证实。相应地，证实了非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠发病前，胰脾中IL-18表达迅速而显著增加(Rothe等，J.Clin.Invest.99：469，1997)。类似地，已表明类风湿关节炎病人滑液中IL-18水平明显升高(Kawashima等，Arthritis and Rheumatism 39：598，1996)。进而证实服用IL-18加重实验小鼠变态反应性脑脊髓炎(EAE)的临床症状，EAE是一种Th1介导的自身免疫疾病，为多发性硬化模型。此外，已表明中和抗大鼠IL-18抗血清可预防雌路易斯大鼠患EAE(Wildbaum等，J.Immunol.161：6368，1998)。由此，IL-18是发展自身免疫新疗法的理想靶标。
Taniguchi等，J.Immunol.Methods 206：107记述了7个小鼠和6个大鼠抗人IL-18单抗，它们结合于4个不同的抗原位点。一个小鼠单抗(#125-2H)和6个大鼠单抗抑制IL-18诱导KG-1细胞产生IFN-γ，这些大鼠单抗的中和活性比#125-2H低10倍。如蛋白质印迹分析显示，3个小鼠单抗但无一大鼠单抗，与膜结合人IL-18强烈反应。此外，还记述了用#125-2H和大鼠单抗检测人IL-18的酶联免疫吸附实验(ELISA)。
欧洲专利申请EP0712931公开了两个小鼠抗人IL-18单抗H1(IgGl)和H2(IgM)。如蛋白质印迹分析显示，此二单抗均与膜结合人IL-18反应，而不与膜结合人IL-12反应。H1在免疫亲和层析中用于纯化人IL-18，在ELISA中用于测量人IL-18。H2在放免实验中用于测量人IL-18。
中和IL-18抗体可在缓解人自身免疫疾病及相关症状上有潜在应用。因此，本领域需要高度亲和IL-18的拮抗物，如人白细胞介素-18的中和单克隆抗体，这将减弱Th1分化和增殖及自身免疫疾病和相关症状。
发明概述
首先，本发明提供啮齿类(如大鼠和小鼠)特异于人白细胞介素18的中和单克隆抗体，它具结合亲和性，其特征在于等于或小于约3.9×10-11M的解离常数，见详述部分。这些单克隆抗体的示例有大鼠单克隆抗体2C10和大鼠及小鼠单克隆抗体如14B7和13G9。本发明还有关淋巴细胞杂交瘤，如19522C10(2)F2(1)A1，195214B7(1)H10和187413G9(3)F12。
其次，本发明提供特异于人白细胞介素-18的中和Fab片段或其F(ab’)2片段，这些片段可由删除本发明中啮齿类中和单克隆抗体的Fc区得到。
再次，本发明提供特异于人白细胞介素-18的变体抗体及其编码核酸，它包括源于非人中和单克隆抗体(mAb)的互补决定区(CDR)，该单抗特征在于对人白细胞介素-18等于或小于约3.9×10-11M的解离常数。当变体抗体为人源化抗体时，编码来自非人免疫球蛋白互补决定区(CDR)的序列插入至第一免疫球蛋白配偶体，其中第一免疫球蛋白配偶体互补决定区(CDR)的至少一个且优选全部由非人单克隆抗体的CDR置换。优选地，第一免疫球蛋白配偶体也与第二免疫球蛋白配偶体有效地连接，这包括免疫球蛋白恒定链的全部或一部分。
又次，本发明提供来自非人中和单克隆抗体(mAbs)的CDR，其特征在于对人白细胞介素18等于或小于约3.9×10-11M的解离常数，及编码此CDR的核酸分子。
又次，还提供嵌合抗体，它含来自非人中和单克隆抗体的人重链和轻链恒定区及重链和轻链可变区，其特征在于对人白细胞介素18等于或小于约3.9×10-11M的解离常数。
又次，本发明提供一种药物组合物，它含上述修饰抗体之一(或更多)及药学上可接受的载体。
又次，本发明提供一种疗法，通过服用本发明中药物组合物之有效量来治疗人Th1过量相关的异常，如自身免疫疾病。
又次，本发明提供修饰抗体(如工程抗体、CDR、Fab片段或其F(ab’)2片段)重组生产的方法及有用组分，这些修饰抗体来自非人中和单克隆抗体(mAbs)，其特征在于对人IL-18等于或小于约3.9×10-11M的解离常数。这些组分包括编码人IL-18的分离核酸序列，和含受控于选定调控序列之核酸序列的重组质粒，这些调控序列能指导重组质粒转染的宿主细胞(优选哺乳类)表达。生产方法包括培养本发明中的转染宿主细胞系等，以至在该细胞中表达修饰抗体，优选人源化抗体并分离其中表达产物。
又次，本发明提供一种诊断人Th1过量产生相关病变的方法，它包括从病人取得生物体液样品，使本发明的抗体和修饰抗体与此样品接触以至形成IL-18/抗体(单克隆或修饰)复合物，并检测该IL-18/抗体复合物的存在与否。
本发明的其他方面和优点将在详述部分和优选实施方案中进一步阐明。
附图简述
图1[SEQ ID NOS：1和2]示大鼠抗体2C10的轻链可变区。图1含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：3-8]。黑体部分示简并引物序列。
图2[SEQ ID NOS：9和10]示大鼠抗体2C10的重链可变区。图2含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：11-16]。黑体部分示简并引物序列。
图3[SEQ ID NOS：17和18]示小鼠抗体13G9的轻链可变区。图3含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：19-24]。黑体部分示简并引物序列。
图4[SEQ ID NOS：25和26]示小鼠抗体13G9的重链可变区。图4含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：27-32]。黑体部分示简并引物序列。
图5[SEQ ID NOS：33和34]示大鼠抗体14B7的轻链可变区。图5含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：35-40]。黑体部分示简并引物序列。
图6[SEQ ID NOS：41和42]示大鼠抗体14B7的重链可变区。图6含双链序列数据。框盒部分示CDR’s[SEQ ID NOS：43-48]。黑体部分示简并引物序列。
发明详述
本发明提供各种抗体和修饰抗体及其片段，其特征在于人IL-18结合特异性，中和活性，和对人IL-18高亲和性，例见大鼠单克隆抗体2C10，小鼠单克隆抗体13G9和大鼠单克隆抗体14B7。本发明抗体的制备是由传统的杂交瘤技术来产生新的中和抗体。这些产品作为治疗和药物组合物用于治疗IL-18介导疾病，如自身免疫疾病，包括多发性硬化(MS)、类风温关节炎、(RA)I型或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、炎性肠病(IBD)和牛皮癣(Mosmann and Sad，Immunol.Todav 17：138.1996)。这些产品还用于由测量(如酶联免疫吸附实验(ELISA))人内源IL-18水平或来自体内激活细胞释放的IL-18来诊断IL-18介导的症状。I定义
“修饰抗体”指由修饰免疫球蛋白编码区编码的蛋白质，可由选定宿主细胞表达获得。这些修饰抗体为工程抗体(如嵌合或人源化抗体)或免疫球蛋白恒定区全部或部分缺失的抗体片段，如Fv，Fab，F(ab)2等。
“修饰免疫球蛋白编码区”指编码本发明中修饰抗体的核酸序列。当修饰抗体为CDR移植或人源化抗体时，来自非人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)的编码序列被插入至含人可变构架序列的第一免疫球蛋白配偶体。可选地，第一免疫球蛋白配偶体可有效地连于第二免疫球蛋白配偶体。
“第一免疫球蛋白配偶体”指编码人框架区或人免疫球蛋白可变区的核酸序列，其中天然(或天然发生)CDR编码区由供体抗体的CDR编码区置换。人可变区可以是免疫球蛋白重链，轻链(或二链)，类似物或其功能片段。这些位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的CDR区可由技术上已知的方法测定。如Kabat等(重要免疫蛋白序列，第4版，美国卫生与民政部，国立卫生研究院(1987))公开了定位CDR的规则。此外，还有用于鉴定CDR区/结构的计算机程序。
“中和”指抑制IL-18活性的抗体，二者结合可阻止人IL-18与其特异受体结合，或结合后抑制IL-18经由其受体的信号途径。单抗中和指它在IL-18中和实验中被测为90％有效，优选95％有效和最优100％有效地抑制IL-18活性，见例1和表I。
术语“高亲和性”指抗体的结合亲和性特征在于光生物传感分析测定的对人IL-18的Kd等于或小于3.9×10-11M(见例2和表I)。
“对人IL-18结合特异性”指对人IL-18的亲和性高于对小鼠或其他IL-18。
“第二免疫球蛋白配偶体”指另一核苷酸序列，它编码的蛋白或多肽中，第一免疫球蛋白配偶体已框内融合或通过可选的传统连接序列融合(即有效连接)。优选地，这是一个免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配偶体可包括为相同(即同源——第一和第二修饰抗体来源相同)或另外(即异源)抗体编码完整恒定区的核酸序列。它可为免疫球蛋白重链或轻链(或二链作为单一多肽的一部分)。第二免疫球蛋白配偶体不限于特殊免疫球蛋白类别或同型。此外，第二免疫球蛋白配偶体可含一部分免疫球蛋白恒定区，如见于Fab，F(ab)2者(即相应人恒定区或框架区的一个分离部分)。此第二免疫球蛋白配偶体也可含暴露于宿主细胞外表面的膜内在蛋白编码序列，如噬菌体展示文库的一部分，分析或诊断检测蛋白的编码序列，如辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶等。
术语Fv，Fc，Fd，Fab或F(ab)2按其标准含义使用(例见Harlow等，抗体实验手册，冷泉港实验室(1988))。
“工程抗体”此处指一类修饰抗体，即全长合成抗体(如与一抗体片段相对的嵌合或人源化抗体)，其中选定受体抗体轻链和/或重链可变区的一部分由对选定抗原决定基具特异性的一或多个供体抗体的类似部分所置换。例如，这些分子可含特征在于一条人源化重链与一条未经修饰的轻链(或嵌合轻链)相联的抗体，反之亦然。工程抗体的特征也可以是受体抗体轻链或重链可变域框架区编码核酸序列的修饰，来保留供体抗体结合特异性。这些抗体可包括由此处所述供体抗体CDR对受体抗体一或多个(优选全部)CDR的置换。
“嵌合抗体”指一类工程抗体，它含来自供体抗体的天然可变区(轻链和重链)并与来自受体抗体轻链和重链恒定区相缔合。
“人源化抗体”指一类工程抗体，其CDR来自非人供体免疫球蛋白，此分子其余免疫球蛋白源的部分来自一(或多)个人免疫球蛋白。此外，构架支持残基可变动以保留结合亲和性(例见Queen等，Proc.Natl Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9：421(1991))。
术语“供体抗体”指抗体(单克隆或重组)，将其可变区，CDR，或其他功能片段或其类似物的核酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，从而提供修饰免疫球蛋白编码区并导致表达修饰抗体，它具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征。适用于本发明的一个供体抗体是记作2C10的非人(即大鼠)中和单克隆抗体。抗体2C10定义为高亲和性，人IL-18特异的(即不识别小鼠IL-18)同型IgGLK中和抗体，它分别在适当小鼠IgG恒定区具有SEQ ID NO：1的可变轻链DNA序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列，及SEQ ID NO：9可变区重链DNA序列和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
术语“受体抗体”指与供体抗体异源的(单克隆或重组)抗体，它将其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区编码核酸序列的全部(或任一部分，但优选全部)贡献给第一免疫球蛋白配偶体。优选人抗体为受体抗体。
“CDR”定义为抗体互补决定区氨基酸序列，是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。例见Kabat等重要免疫蛋白序列，第4版，美国卫生与民政部，国立卫生研究院(1987)。免疫球蛋白可变区有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，“CDR”用于此处指全部三个重链CDR或全部三个轻链CDR(或全部重链和全部轻链CDR)。
CDR为抗体结合抗原或抗原决定基提供大部分接触残基。本发明中的CDR来自供体抗体可变重链和轻链序列，并包括天然CDR的类似物，该类似物共享或保留与其来源供体抗体同样的抗原结合特异性和/或中和能力。
共享抗原结合特异性或中和能力指，例如，尽管单抗2C10的特征在于一定水平的抗原亲和性，2C10核酸序列编码的CDR在适当的结构环境中可有或更低或更高的亲和性。
预期2C10的CDR在此环境仍将识别与2C10相同的抗原决定基。2C10的轻链CDR的示例有：
SEQ ID NO：3；
SEQ ID NO：5；
SEQ ID NO：7；
2C10重链CDR的示例有：
SEQ ID NO：11；
SEQ ID NO：13；
及SEQ ID NO：15。
“功能片段”为部分重链或轻链可变序列(例如，免疫球蛋白可变区氨基或羧基端的少量删除)，保留与其来源抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
“类似物”是至少有一个氨基酸被修饰的氨基酸序列，该修饰可是化学的或若干氨基酸(即不多于10个)的替换或重排，该修饰允许氨基酸序列保留未经修饰序列的生物特性，如抗原特异性和高亲和性。例如，(沉默)突变可由替换构建，这时CDR编码区内或附近制造了特定限制酶限制位点。
类似物也可是等位变异。“等位变异或修饰”是本发明氨基酸或多肽序列的编码核酸序列的改变。此变异或修饰可以是由于遗传密码简并或可以是蓄意设计来提供所需特性的。这些变异或修饰可以或可以不导致被编码氨基酸序列的改变。
术语“效应剂”指非蛋白载体分子，可由传统方法联结修饰抗体和/或供体抗体的天然或合成轻链或重链或其他片段。此非蛋白载体可包括用于诊断领域的常规载体，如聚苯乙烯或其他塑料珠，如用于BIAcore[Pharmacia]系统的多糖，或其他医用且人畜安全的非蛋白物质。其他效应剂可包括用于络合重金属原子或放射性同位素的大环分子。这些效应剂可用于提高修饰抗体的半衰期，如聚乙二醇。II高亲和性的IL-18单克隆抗体
为用于构建本发明的抗体，修饰抗体和片段，非人物种(如，牛，羊，猴，鸡，啮齿类(如小鼠和大鼠)等)将用来生产所需的免疫球蛋白和天然人IL-18或其多肽抗原决定基。传统杂交瘤技术用于提供分泌IL-18非人单抗的杂交瘤细胞系。然后用IL-18包被的96孔板筛选结合的杂交瘤，述于实施例部分，或用生物素化的IL-18结合链霉亲和素包被的板。
本发明中高亲和性中和单抗的一个例子是单抗2C10，一种可用于发展嵌合或人源化抗体的大鼠抗体，详述于实施例。2C10单抗的特征在于对人IL-18的Kd约为3.9×10-11M的抗原结合特异性。此单抗的特征在于同型IgGLK。
另一所需供体单抗为小鼠单抗13G9。此该单抗的特征在于同型IgGLK。该单抗对IL-18的解离常数约为12×10-9M。
另一所需供体单抗为大鼠单抗14B7。此单抗对IL-18的解离常数约为1.5×10-10M。14B7的特征也在于同型IgGLK。
本发明不限于13G9，2C10，14B7或其超变(即CDR)序列的应用。因此，任何其他特征在于对人IL-18的解离常数等于或小于3.9×10-11M的相应高亲和性IL-18抗体和相应的抗IL-18 CDR均可被取代。下述供体抗体鉴定为13G9，2C10，14B7，此定义只为图解和叙述简明。III抗体片段
本发明还包括来自针对人IL-18的单抗的Fab片段或F(ab’)2片段的应用。这些片段用作体内针对IL-18和Th1介导症状的保护剂或体外IL-18的部分诊断。Fab片段含重链氨基端部分和完整的轻链；F(ab’)2片段由二个Fab片段通过二硫键键合而成。单抗13G9、2C10、14BF和其他类似的高亲和性IL-18结合抗体提供了Fab片段和F(ab’)2片段的来源，这可由传统方法得到，如以相应蛋白水解酶，木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶裂解单抗，或通过重组方法得到。这些Fab和F(ab’)2片段本身可用作治疗剂、预防剂或诊断剂，并作为含可变区和CDR序列的序列供体用于形成述于此的重组或人源化抗体。
Fab和F(ab’)2片段构建可通过重组噬菌体库(例见Winter等，Ann.Rev.Immunol.，12：433-455(1994))或通过免疫球蛋白链改组(例见Markets等，Bio/Technology，10：779-783(1992)，全文引作参考)，其中来自选定抗体(如13G9)的Fd或VH免疫球蛋白可结合轻链免疫球蛋白的全部组分，VL(或VK)来形成新的Fab，反之，选定抗体的轻链免疫球蛋白可结合全部重链免疫球蛋白，VH(或Fb)，来形成新的Fab。IV目的抗IL-18氨基酸和核苷酸序列
单抗2C10或上述其他抗体可贡献序列，如可变重链和/或轻链多肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段及其类似物和其编码核酸序列，用于设计和获得各种修饰抗体，其特征在于供体抗体的抗原结合特异性。
作为一例，本发明提供IL-18单抗2C10的可变轻链和可变重链序列及其衍生序列。
本发明中编码可变轻链和重链多肽序列的核酸序列或其片段还用于在CDR或框架区编码核酸序列内引入特异突变，及将所得修饰或融合核酸序列整合至表达质粒。
考虑到遗传密码的简并性，可构建各种编码序列来编码本发明的可变重链和轻链氨基酸序列，CDR编码序列、功能片段及其类似物，它们共享供体抗体的抗原特异性。本发明中分离的编码可变链肽序列或CDR的核苷酸序列或其片段，当有效结合第二免疫球蛋白偶联体时，可用于产生本发明的修饰抗体，如嵌合或人源化抗体，或其他工程抗体。
应注意除述于此的编码修饰抗体和抗体一部分的分离核苷酸序列外，本发明中还包括其他这样的核苷酸序列，如互补于天然CDR编码序列的或互补于CDR编码区周围经修饰的人框架区的序列。有用的DNA序列包括在严紧杂交条件下(见T.Maniatis等，分子克隆，(实验室手册)，冷泉港实验室(1982)，387-389页)与这些DNA序列杂交的那些序列。这样严紧杂交条件的一个例子是于65℃在4×SSC杂交，然后于65℃在0.1×SSC洗涤一小时。另一严紧杂交条件的例子是于42℃在50％甲酰胺和4×SSC。优选地，这些杂交DNA序列至少约18核苷酸长，即约一个CDR大小。V修饰免疫球蛋白分子和修饰抗体
修饰免疫球蛋白分子可编码修饰抗体，它包括如嵌合抗体和人源化抗体的工程抗体。理想的修饰免疫球蛋白编码区含CDR编码区，其编码的多肽具IL-18抗体的抗原特异性，优选地，如本发明提供的高亲和性抗体，被插入至第一免疫球蛋白偶联体(人框架区或人免疫球蛋白可变区)。
优选地，第一免疫球蛋白偶联体有效地连接于第二免疫球蛋白偶联体，第二免疫球蛋白偶联体定义于上，可含序列编码感兴趣的第二抗体区，如Fc区。第二免疫球蛋白偶联体还可含编码另一免疫球蛋白的序列，轻链或重链恒定区与其框内融合或由连接序列融合。针对IL-18功能片段或其类似物的工程抗体，可设计为诱导与相同抗体的增强结合。
第二免疫球蛋白偶联体也可结合以上定义的效应剂，包括非蛋白载体分子，第二免疫球蛋白偶联体可由传统方式与其有效连接。
第二免疫球蛋白伴侣如抗体序列和效应剂之间的融合或连接，可通过任何适当的方式，如传统的共价键或离子键、蛋白融合，或异源双功能交联剂，如碳二亚胺、戊二醛等。这些技术已知并详述于传统的化学和生物化学教材中。
此外，仅为第二免疫球蛋白偶联体和效应剂之间提供理想空间的传统连接序列，也可被构建至修饰免疫球蛋白编码区。这些连接序列的设计已为本领域的技术人员所熟知。
另外，本发明中的分子信号序列可经修饰增强表达。
示例修饰抗体含可变重链和/或轻链多肽或蛋白序列，它具对单抗2C10，如VH和VL链的抗原特异性。本发明中又一理想修饰抗体的特征在于其氨基酸序列，含至少一个、优选全部大鼠抗体分子2C10重链和/或轻链可变区CDR，而其余部分源于人，或功能片段或其类似物。
在另一实施方案中，本发明的工程抗体可结合其他因子。例如，重组DNA技术过程可用于生产本发明的工程抗体，其中完整抗体分子的Fc片段或CH2 CH3域已由酶或其他可检测的分子(即多肽效应剂或报告分子)所置换。
第二免疫球蛋白偶联体也可有效连接于非免疫球蛋白多肽、蛋白或其含CDR的异源序列片段，如具大鼠2C10的抗原特异性的序列。产物蛋白表达时可既显示抗IL-18抗原特异性，又可显示非免疫球蛋白的特征。该融合偶联体特征可以是，例如功能特征，如另一结合或受体域，或若该融合偶联体本身即为一种治疗蛋白，可以为其他治疗特征或其他抗原特征。
本发明的另一理想蛋白可含完整的抗体分子，具全长重链和轻链，或其任意分离片段，如Fab或F(ab’)2片段，重链双体或其任意最小重组片段，如Fv或单链抗体(SCA)或具与选定供体单抗如单抗2C10相同特异性的任何其他分子。此蛋白可以修饰抗体形式或其未融合形式应用。
无论何时第二免疫球蛋白偶联体源于供体抗体之外的抗体，如免疫球蛋白构架或恒定区的任意同型或类别，即得到一个工程抗体。工程抗体所含免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变框架区来自单一来源，如受体抗体，和供体抗体的一个或多个(优选全部)CDR，如此处所述的抗IL-18抗体。此外，受体单抗轻链和/或重链可变域框架区核苷酸或氨基酸水平或供体CDR区的修饰，如删除、替换或添加，可用来保留供体抗体抗原结合特异性。
这样的工程抗体设计为利用IL-18单抗(可选如所述经修饰的)可变重链和/或轻链之一(或二者)或者一或多个以下鉴定的重链或轻链CDR，这些工程抗体预期将被中和，即它们如期阻断结合IL-18蛋白受体，它们还阻断或防止IL-18依赖细胞的增殖。
这样的工程抗体可包括含选定人免疫球蛋白或亚型框架区的人源化抗体，或含与IL-18抗体功能片段融合的人重链和轻链恒定区的嵌合抗体。适宜的人(或其他动物)受体抗体可由同源于供体抗体的核苷酸和氨基酸序列选自传统数据库，如KABAT数据库，Los Alamos数据库，和瑞士蛋白数据库。特征在于与供体抗体框架区同源(基于氨基酸)的人抗体可适于为供体CDR插入提供重链恒定区和/或重链可变框架区。能给出轻链恒定区或可变框架区的适宜受体抗体可以类似方式选择。应注意，不要求受体抗体重链和轻链源于同一受体抗体。
理想地，异源框架区和恒定区选自人免疫球蛋白类别和同型，如IgG(亚型1至4)，IgM，IgA和IgE。然而受体抗体不必只包括人免疫球蛋白蛋白序列。例如，可构建一个基因，其中编码部分人免疫球蛋白链的DNA序列融合编码非免疫球蛋白氨基酸序列，如多肽效应剂或报告分子的DNA序列。
特别理想的人源化抗体将含2C10的CDR插入至选定的人抗体序列框架区。为中和人源化抗体，IL-18抗体重链和/或轻链可变区的一个，两个或优选地三个CDR被插入至选定人抗体序列框架区，取代后者抗体的天然CDR。
优选地，在人源化抗体，人重链和轻链可变域已被一或多个CDR置换所工程化。用全部六个CDR或少于六个CDR的各种组合是可能的。优选地，全部六个CDR被取代。用人受体抗体未经修饰的轻链作轻链，而只在人重链取代CDR是可能的。或者，可依赖于传统抗体数据库从另一人抗体选择兼容的轻链。工程抗体的其余部分可源于任意适宜的受体人免疫球蛋白。
人源化工程抗体优选地具有天然人抗体或其片段的结构，并具备有效治疗应用，如治疗IL-18介导的人炎症疾病或诊断应用所需的若干特性组合。
另一例，工程抗体可含2C10可变轻链区和13G9可变重链区的CDR。产物人源化抗体的特征在于与单抗2C10相同的抗原结合特异性和亲和性。
本领域的技术人员将理解工程抗体可由可变域氨基酸变化进一步修饰而不必影响供体抗体(即一种类似物)的特异性和高亲和性。预期重链和轻链氨基酸可由可变域构架或CDR或二者上的其他氨基酸所替换。
此外，可改变恒定区来增强或减弱本发明分子的选择特性。例如，二聚化，与Fc受体结合，或结合并激活互补的能力(例见Angal等，Mol.Immunol.30：105-108(1993)；Xu等，J.Biol.Chem.269：3469-3474(1994)；Winter等，EP 307，434-B)。
作为嵌合抗体的修饰抗体与上述人源化抗体不同，在于它提供完整非人供体抗体重链和轻链可变区，包括框架区及人免疫球蛋白二链的恒定区。预期相对于本发明人源化抗体保留额外的非人类序列的嵌合抗体可诱发人显著的免疫反应。
这样的抗体可用于IL-18介导疾病的预防和治疗，讨论如下。VI修饰抗体和工程抗体的生产
优选地，单抗2C10或其他适宜供体单抗的可变轻链和/或重链序列和CDR及其编码序列，用来构建本发明的修饰抗体。优选地人源化抗体，过程如下。相同或类似的技术也可用于得到本发明的其他实施方案。
生产选定供体单抗如大鼠抗体2C10的杂交瘤，按传统方式克隆，并由本领域技术人员熟知的技术，如Sambrook等记述的技术(分子克隆，(实验室手册)，第二版，冷泉港实验室(1989))，得到其重链和轻链可变区DNA。可用多核苷酸引物和逆转录酶得到2C10含至少CDR编码区的可变重链和轻链区、受体单抗轻链和/或重链可变域框架区的那些所需部分，来保留供体单抗结合特异性，及源于人免疫球蛋白的抗体链的其余免疫球蛋白来源部分。使用已知数据库并与其他抗体比较，鉴定了CDR编码区。
然后可制备大鼠/人嵌合抗体并测定结合力。此嵌合抗体含完整非人供体抗体VH和VL区，结合人Ig恒定区的两链。
人源化抗体可来源于嵌合抗体，或者优选地，由将把重链和轻链的供体单抗CDR编码区适当地插入至被选定的重链和轻链构架中而合成的。或者，本发明的人源化抗体可用标准诱变技术制备。因此，所得的人源化抗体含人框架区和供体单抗CDR编码区。其次是构架残基的调整。所得的人源化抗体可在重组宿主细胞如COS，CHO或骨髓瘤细胞中表达。其他的人源化抗体可用此技术在别的合适的Il-18特异的、中性的、高亲和的及非人的抗体中制备。
常规的表达载体或重组质粒由将修饰抗体编码序列置于与常用调控序列有效联结而成，这些调控序列能控制其在宿主细胞中的复制、表达和/或分泌。调控序列包括启动子序列，如CMV启动子及来自其他已知抗体的信号序列。类似地，也可生成另一表达载体，它具有编码互补抗体轻链或重链的DNA序列。优选地，就编码序列和可选择标记而言，除了尽可能保证每一多肽链被功能表达外，后一表达载体与前一表达载体是相同的。或者，修饰抗体重链和轻链编码序列可定位在一个单一载体上。
由常规技术，选定宿主细胞可被第一和第二载体(或由单一载体简单转染)共转染形成本发明转染中的宿主细胞，它包括重组或合成的轻链和重链，可由常规技术培养转染细胞来生产本发明的工程抗体。含重组重链和/或轻链缔合的人源化抗体由合适的方法如ELISA或RIA在培养物中筛选到。类似的常规技术可用于构建本发明的其他修饰抗体和分子。
本领域技术人员可选用用于本发明方法和构建部分克隆和亚克隆步骤的适宜载体。例如，可用常用的pUC系列克隆载体。所用载体pUC19是来自供应商，如Amersham(Buckinghamshire，英国)或Pharmacia(Uppsala。瑞典)。另外，易于复制的，具有多克隆位点和可选择基因(如抗生素抗性)的，且易于操作的任何载体都可用于克隆。因此，克隆载体的选择不是本发明的一个限制因素。
类似地，根据本发明，工程抗体表达中使用的载体可由本领域的技术人员从常规载体中选择。这些载体还含在选定的宿主细胞中指导异源DNA序列复制和表达的选定调控序列(如CMV启动子)。这些载体含上述的编码工程抗体或免疫球蛋白编码区的DNA序列。另外，这些载体可包括因方便操作而插入了理想的限制位点的选定免疫球蛋白序列。
这些表达载体的特征也在于适于扩增异源DNA序列的基因，如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其他优选的载体序列包括polyA信号序列，如源于牛生长激素(BGH)和β-珠蛋白启动子(β-glopro)，用于此的表达载体可由本领域的技术人员熟知的技术合成。
这些载体的成分如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可从商业或自然界中获得，也可由用于指导选定宿主的重组DNA产物的表达和/或分泌的已知程序合成。本领域中已知的许多用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达其他的适宜表达载体也可为此而选用。
本发明也包括由重组质粒转化的细胞系。该重组质粒含其工程抗体或修饰免疫球蛋白分子的编码序列。用于这些克隆质粒的克隆及其他操作的宿主细胞也是常用的。然而，最理想地，来自大肠杆菌不同株细胞被用于克隆载体复制和本发明的修饰抗体构建中的其他步骤。
用于本发明工程抗体或修饰抗体表达的适宜宿主细胞或细胞系优选地是哺乳细胞，如CHO、COS、成纤维细胞(如3T3)和骨髓细胞，更优选地是CHO或骨髓细胞，人细胞可被选用。因此，可用人细胞，因而能用人糖苷化模型修饰分子。或，也可用其他真核细胞株。合适哺乳动物细胞的选用及转化、培养、扩增、筛选及产物形成和纯化的方法在技术上已知。例见以上引用的Sambrook等。
可证明细菌细胞适于作为本发明重组Fabs表达的宿主细胞(例见Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130：151-188(1992))。然而，由于细菌细胞表达蛋白有非折叠或非正确折叠的形式或非糖苷化形式的趋向，细菌细胞表达的任何重组Fab必须检测其抗原结合能力的存留。如果细菌细胞表达的分子以正确折叠的方式产生，该细菌细胞将应是理想的宿主。如用于表达的大肠杆菌不同株在生物技术领域已知为宿主细胞。芽孢杆菌、链丝菌及其他杆菌等菌株也可用于此方法中。
需要时，本领域技术人员熟知的酵母细胞株也适于用作宿主细胞，也可以是昆虫细胞，如果蝇和鳞翅目昆虫及病毒表达系统，例见Miller等，Genetic Engineering，8：277-298，Plenum Press(1986)及其引用文献。
本发明载体构建的常用方法，本发明宿主细胞所需的转化方法及从此宿主细胞生产修饰抗体的必需培养方法都是常规技术。同样，本发明的修饰抗体一旦产生，就可从细胞培养物中根据本领域标准程序纯化，标准操作步骤包括硫酸铵沉降、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这些技术是本领域的熟知技术且不限制本发明。
而人源化抗体表达的另一方法可利用转基因动物的表达，如述于美国专利号4873316的方法。这涉及到一个用动物酪蛋白启动子的表达系统，该启动子若转基因导入哺乳动物，可使雌性动物在奶中产生期望的重组蛋白。
工程抗体一旦用适宜方法表达出，即可用合适的检测方法在体外被检测到。目前常用的ELISA检测方法可用于评估工程抗体对IL-18的定性及定量结合。另外，在人临床研究以估计体内工程抗体的持久性之前，其他体外方法也可用来验证其中和功效。
所述制备人源化抗体的一般程序后，本领域技术人员也可以由从其他供体IL-18抗体，可变区序列及此处所述CDR多肽来构建人源化抗体。工程抗体也可由工程抗体受体接受者潜在识别为“自我”的可变区构架产生。不需要对接受者大幅度提高免疫原性，对可变区框架少量的修饰可使抗原结合能力大大的提高，这些工程抗体能有效地治疗人IL-18介导疾病，还可以用于这类疾病的诊断。VIII治疗/预防应用
本发明还关于治疗患自身免疫相关症状，如MS的一种方法，它包括服用有效量的抗体，包括一或多个述于此的工程抗体或修饰抗体或其片段。
使用本发明的分子诱导的治疗反应由与人IL-18结合并随后阻断Th1刺激而产生。这样，当制备和构建适于治疗应用时，本发明的分子对患自身免疫疾病，如但不限于MS、RA、IDDM、IBM和牛皮癣的那些人非常理想。
本发明的修饰抗体抗体及其片段还可用于偶联其他抗体特别是人单抗，它们与特定症状相关的标记(抗原决定基)反应，这些抗体是针对所述症状产生的。
本发明的治疗剂据信治疗自身免疫病约2日至6个月是理想的，或根据自身免疫症状调整。如当治疗MS或类似症状时，可以需更长期的治疗。治疗剂量和持续时间与本发明的分子在人体循环中相对持续时间有关，并由本领域技术人员依受治疗症状和病人的健康状况来调整。
本发明治疗剂的服用方式可以是将药剂送达受治者的任何适当途径。本发明的修饰抗体，抗体工程抗体及其片段和药物组合物对肠胃外服用，即皮下、肌肉、静脉，鼻内尤其有用。
本发明的治疗剂可制备为药物组合物，其中含本发明工程(如人源化)抗体的有效量，作为药学上可接受载体的活性成分。在本发明的预防剂中，最好是含工程抗体的水悬液或溶液，优选地缓冲至生理pH，便于注射的形式。肠胃外服用的组分一般包括本发明的工程抗体的溶液或其混合物，溶于药学上可接受的载体，优选水相载体，可采用各种水相载体，如0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。这些溶液无菌且一般无微粒物质。这些溶液可由常规已知的灭菌技术(如过滤)消毒。组分含所需的药学上可接受的辅助物质来接近生理条件，如pH调节和缓冲剂等。本发明的抗体在此药剂中的浓度可变化很大，即从重量百分浓度约0.5％，通常或至少约1％到多至15％或20％，并主要根据液体体积、粘性等选定，取决于选定的特定的服用方式。
这样本发明的药物组合物的肌肉注射液可制为含1mL无菌缓冲水和约1ng至约100mg，如约50ng至约30mg或更优选地，约5mg至约25mg本发明的工程抗体。类似地，本发明的药物组合物的静脉注射液可制为含约250mL无菌林格液和约1至约30，和优选5mg至约25mg本发明的工程抗体，制备肠胃外服用组合物的实际方法已众所周知，或将为本领域技术人所理解，并详述于文献中，如Remington药学科学第15版，Mack出版公司，Easton，宾西法尼亚。
药物制备中，本发明的治疗剂宜以单位剂量提供。相应的治疗有效剂量易于由本领域技术人员决定。为有效治疗人或其他动物炎症疾病，每70kg体重约0.1mg至约20mg本发明的蛋白或抗体剂量应肠胃外服用，优选静脉或肌肉注射。必要时，此剂量可由医生在治病中的适当时间间隔重复使用。
本发明的修饰抗体和工程抗体也可用于诊断方法，如确定IL-18介导疾病或此类疾病的跟踪治疗。作为诊断剂，这些抗体可被常规地标记，用于ELISA或其他常规测试方式来测量血清中、胞浆中或其他相应组织中或培养人细胞释放的IL-18水平。修饰抗体应用的测试实质上是常规的，并不限制在此公开的内容。
这样，本发明的一个实施方案关于辅助诊断自身免疫疾病和与病人过量Th1 T细胞产生相关的其他症状的一种方法。其步骤包括确定取自病人的样品(胞浆或组织)中人IL-18的量，并将其与正常人群人IL-18平均量相比较，由此病人样品中IL-18量显著升高，即为自身免疫疾病和与过量Th1 T细胞产生相关的其他症状的指标。
述于此的抗体、修饰抗体及其片段可冻干保存，并于用前用合适的载体重配。此技术已证实对常见免疫球蛋白有效，且可采用已知的冻干和重构技术。
以下实例解释本发明的各方面，包括示范工程抗体的构建及其在适宜载体或宿主细胞表达，这些实例并不限制本发明的范围。所有氨基酸示为传统的三字或单字符。所有必需限制酶，质粒及其他试剂和材料除非标明，均由商业来源获得。所有通用克隆流程和其他重组DNA方法学操作均依上面引用的T.Maniatis等，或其第二版(1989)，同一出版商Sambrook等编。例1  IL-18单抗的生产A.单克隆抗体生产
小鼠(Balb/c和C57BL/6 F1杂种)或大鼠(Sprague Dawley)以30μg重组IL-18佐剂免疫，4周后继以30μg IL-18佐剂。在对IL-18血清抗体滴度好的基础上，动物接受10-30μg IL-18(i.p.盐水)进一步免疫。最后一次免疫后三天行脾脏切除术，小鼠或大鼠脾细胞用于以标准过程(H.Zola编，单克隆抗体，CRC出版公司，1987)制备杂交瘤。由有限稀释法克隆阳性杂交瘤。B.单抗纯化
按厂商说明，用ProsepA(Bio Processing，Consett，英国)层析法分别纯化单抗。单抗由SDS-PAGE检测为＞95％纯。C.单抗同型化
所有大鼠和小鼠单抗由商品试剂盒(Zymed，Amersham)同型化，且为IgG 1κ。例2  测试A.IL-18的生物素化
用购自分子探针公司的试剂盒以10∶1生物素试剂比例将IL-18生物素化。生物素化不影响IL-18的生物活性。B.杂交瘤筛选测试
以链霉亲和素(2μg/mL，100μL/孔PBS)包被96孔板，4℃孵育过夜。吸取溶液，以250μL/孔1％牛血清清蛋白(BSA)于TBS缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.02％ Kathon，pH7.4)中封闭非特异结合位点，室温5-60分钟。此后的每一步，板以洗涤缓冲液(10mMTris，150mM NaCl，0.05％ Tween 20，0.02％ Kathon，pH7.4)洗涤4次。每孔中加入100μL测试缓冲液(0.5％BSA，0.05％牛γ-球蛋白，0.01％Tween 40，20μM二乙烯三胺基戊乙酸于TBS缓冲液)中的生物素IL-18(100ng/mL)，板于室温振荡孵育30min。然后每孔加入50μL杂交瘤培养基和50μL测试缓冲液，室温振摇孵育60min。然后每孔加100μL 0.5μg/mL Eu3+标记的测试缓冲液中的抗小鼠或抗大鼠抗体。最后加入200μL/孔增强剂(Wallac)，室温孵育5min，测量时间分辨荧光。计数＞100K的杂交瘤扩增至24孔板。C.免疫测试
为确定抗IL-18单抗的特异性，以生物素IL-18如上包被，阻断并孵育涂板产生的96孔板。所有以下孵育均于室温振荡培养箱中操作。洗涤孔道后，加入50μL IL-18(3μg/mL)或测试液和50μL单抗，并孵育60min。洗涤后，加入100μL 0.5μg/mL Eu3+标记的抗小鼠或抗大鼠抗体60min，抗体溶于测试缓冲液，洗涤后加入100μL/孔增强剂(Wallac)，并室温孵育5min，测定时间分辨荧光。所有阳性杂交瘤都显示与IL-18结合的移位。D.中和测试
来自健康供体的PBMC以Ficol-Paque(Pharmacia)梯度分离，并在96孔板中培养于10％FBS DMEM/F12培养基上，其中含1μg/mLConA(Sigma)及IL-18(5ng/mL)和/或单抗。37℃、5％CO2、90％温度培养18h后，取25μL培养基并以免疫测试测定γ-干扰素(IFNg)浓度。三次实验的平均结果见表I。E.单克隆抗体的亲和性测定
在BIAcore光生物传感器(Pharmacia Biosensor，Uppsala，瑞典)上以30μL/min流速测定纯化单抗的亲和性。动力学数据以前述关系(Karlsson等，J.Immunol.Meth.，145：229-240(1991)并在文献全文引用)评估。单抗(用含10mM HEPES，150mM NaCl，0.01％ Tween-20，pH7.4的HBS缓冲液稀释)注射于兔抗小鼠IgG Fc或羊抗大鼠IgG Fc表面后以缓冲液漂洗并记录RU。然后IL-18(以HBS缓冲液稀释)注射180秒后用缓冲液漂洗500秒并记录RU。注射0.1M磷酸使传感器芯片表面再生。用BIAcore软件计算结合开率(Kass)和关率(Kdiss)，计算得平衡常数(KD)，对单抗13G9为12×10-9M，对单抗2C10为3.9×10-11M，对单抗14B7为1.5×10-10M，见表I。F.单克隆抗体抗原决定基分析
纯化单抗抗原决定基分析于BIAcore上测定。用10μL/min流速，第一单抗(用HBS缓冲液稀释)注射于兔抗小鼠IgG Fc或羊抗大鼠IgG Fc表面，然后注射IL-18 240秒，阻断单抗48秒，并注射第二单抗240秒。每次注射后，注射0.1M磷酸使其表面再生，并记录RU。发现单抗13G9、2C10和14B7具相似或重叠的抗原决定基。
表I    单抗与人IL-28作用的亲和与中和活性单抗           Kd(pM)a      中和IC50(nM)b2C10 (大鼠)      39              0.114B7(大鼠)       150             0.213G9(小鼠)       12000           3.0
a.由光生物传感器(BIAcore)分析测定(25℃)
b.5ng/mL人IL-18对PMBC中IFNγ产生的抑制(nM)例3  CDR序列基因克隆和序列分析
用简述于下的标准分子生物学方法，由杂交瘤细胞克隆可变重链和轻链基因。据厂商说明，用TRIzol试剂(Life Technologies，目录号15596-026)从杂交瘤细胞分离总RNA。据厂商说明，用RT-PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，目录号1483-188)，以poly dT寡核苷酸为引物进行RNA逆转录。第一链cDNA合成后，用3′恒定区特异引物和简并5′引物PCR扩增重链和轻链V区。简并5′引物序列设计为编码以前测定的可变重链和轻链区N端氨基酸序列。多个克隆的全长序列来自每一次PCR扩增，并进行排列比较以获得共有序列。据此，重链和轻链DNA序列的前17碱基来自PCR引物，而翻译的蛋白序列为原本的。
杂交瘤抗体2C10、13G9和14B7的核苷酸序列和推断的氨基酸序列见图1-6。各图中，CDR及其编码核酸序列列于框内。简并引物序列为黑体。
                    序列表<110>S.D.霍尔梅斯(Holmes，Stephen D.)
 Y.S.候(Ho，Yen Sen)
 A.H.泰勒(Taylor，Alexander)
 S.S.阿布德尔-梅圭德(Abdel-Meguid，Sherin S.)
<120>用于治疗IL-18介导疾病的重组IL-18拮抗物
<130>P50897
<140>60/125，299
<141>1999-03-19
<160>48
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>324
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(324)
<223>轻链V区
<400>1gac att caa atg acc cag tct cca gct tcc ctg tct gca tct ctg gga       48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1               5                  10                  15gaa act gtc tcc atc gaa tgt ctg gca agt gag gac ata tac act tat       96Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr
         20                  25                  30tta aca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct caa ctc ctg atc       144Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
     35                  40                  45tat ggt gca aat aag ttg caa gat ggg gtc cca tca cgg ttc agt ggc       192Tyr Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60agt gga tct ggc aca cag tat tct ctc aag atc agc ggc ata caa cct       240Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Ile Gln Pro65                  70                  75                  80gaa gat gaa ggg gat tat ttc tgt cta cag ggt tcc aag ttt ccg ctc       288Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu
             85                  90                  95acg ttc ggt tct ggg acc aag ctg gag atc aaa cgg                       324Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105
<210>2
<211>108
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>2Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1               5                  10                  15Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr
         20                  25                  30Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
     35                  40                  45Tyr Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Ile Gln Pro65                   70                  75                  80Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu
             85                  90                  95Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(33)
<223>VK2C10轻链CDR I
<400>3ctg gca agt gag gac ata tac act tat tta aca    33Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr1               5                   10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>4Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr1               5                   10
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(21)
<223>VK2C10轻链CDR II
<400>5ggt gca aat aag ttg caa gat    21Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp1               5
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>6Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp1               5
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(27)
<223>VK2C10轻链CDR III
<400>7cta cag ggt tcc aag ttt ccg ctc acg    27Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>8Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr1               5
<210>9
<211>378
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(1)...(378)<223>重链V区
<400>9gag gtc cag cta cag cag tct ggg gct gag ctt gtg aga cct ggg acc         48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1               5                   10                  15tct gtg aag tta tct tgc aaa gtt tct ggc gaa ata agt aca gga tac         96Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu Ile Ser Thr Gly Tyr
         20                  25                  30tat ttc cac ttt gtg agg cga agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg ata        144Tyr Phe His Phe Val Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45gga agg att gat cct gag gat gat agt act aaa tat gct gag agg ttc        192Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe
 50                  55                  60aaa gac agg gcg acg ctc act gca caa aca tcc tcc aac aca gcc tac        240Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gln Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80ctg aac ctc agc agc ctg acc tct gag gac act gca act tat ttt tgt        288Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
             85                  90                  95acc aca tgg cgg ata tac cga gat agt tct ggc cgc ccc ttc tat gtt        336Thr Thr Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val
        100                 105                 110atg gat gcc tgg ggt caa gga gct tca gtc act gtc tcc tca                378Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
    115                 120                 125
<210>10
<211>126
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>10Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1               5                  10                  15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu Ile Ser Thr Gly Tyr
         20                  25                  30Tyr Phe His Phe Val Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe
50                  55                  60Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gln Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
            85                  90                  95Thr Thr Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val
        100                 105                 110Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
    115                 120                 125
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(15)
<223>VH2C10重链CDR I
<400>11gga tac tat ttc cac                                    15Gly Tyr Tyr Phe His1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>12Gly Tyr Tyr Phe His1               5
<210>13
<211>51
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(51)
<223>VH2C10重链CDR II
<400>13agg att gat cct gag gat gat agt act aaa tat gct gag agg ttc aaa        48Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys1               5                       10              15gac                                                                    51
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 14Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys1               5                  10                  15
<210>15
<211>51
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(51)
<223>VH2C10重链CDR III
<400>15tgg cgg ata tac cga gat agt tct ggc cgc ccc ttc tat gtt atg gat        48Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val Met Asp1               5                   10                  15gcc                                                                    51
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>16Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val Met Asp1               5                  10                  15
<210>17
<211>342
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(342)
<223>轻链V区
<400>17gac gtt gtt atg act caa act cct ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga        48Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1               5                   10                  15gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt gta cac agt        96Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
         20                  25                  30aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct       144Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
     35                  40                  45cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca       192Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
 50                  55                  60gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggt aca gat ttc aca ctc aag atc       240Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65                  70                  75                  80agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt       288Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
             85                  90                  95aca cat gtt cct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata       336Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        100                 105                 110aaa cgg                                                               342Lys Arg
<210>18
<211>114
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>18Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1               5                  10                  15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
        20                  25                  30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
    35                  40                  45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65                  70                  75                  80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
            85                  90                  95Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
        100                 105                 110Lys Arg
<210>19
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(48)
<223>VK13G9轻链CDR I
<400>19aga tct agt cag agc ctt gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat        48Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His1               5                   10                  15
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>20Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His1               5                  10                  15
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(21)
<223>VK13G9  轻链CDR II
<400>21aaa gtt tcc aac cga ttt tct                                            21Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1               5
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>22Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1               5
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(30)
<223>CK13G9轻链CDR III
<400>23tct caa agt aca cat gtt cct ccg tac acg               30Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr1               5                   10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>24Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr1               5                  10
<210>25
<211>369
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(369)
<223>重链V区
<400>25caa gtt act ctt aag gag tct ggc cct ggg ata ttg aag ccc tca cag        48Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln1               5                   10                  15acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tct ctg agc act tct        96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
         20                  25                  30ggt atg ggt att gcc tgg gtt cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag       144Gly Met Gly Ile Ala Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
     35                  40                  45tgg ctg gca gac att tgg tgg gat gat aat aag tat tat aat cca tcc       192Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
 50                  55                  60ctg gag agc cag ctc aca atc tcc aag gat acc tcc aga aac cag gta       240Leu Glu Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val65                  70                  75                  80ttc ctc acg atc acc agt gtg gac act gca gat tct gcc act tat tac       288Phe Leu Thr Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
             85                  90                  95tgt gct cgt cat cat tac gac ggt agt agc ctc ctg cct atg gac tac       336Cys Ala Arg His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr
        100                  105                110tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca                           369Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
    115                 120
<210>26
<211>123
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>26Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln1               5                  10                  15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
        20                  25                  30Gly Met Gly Ile Ala Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
    35                  40                  45Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60Leu Glu Ser Gln Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val65                  70                  75                  80Phe Leu Thr Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
            85                  90                  95Cys Ala Arg His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr
        100                 105                 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
    115                 120
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(21)
<223>VH13G9重链CDR I
<400>27act tct ggt atg ggt att gcc                        21Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala1               5
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>28Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala1               5
<210>29
<211>48
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(48)
<223>VH13G9重链CDR II
<400>29gac att tgg tgg gat gat aat aag tat tat aat cca tcc ctg gag agc  48Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser1               5                   10                  15
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>30Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser1               5                  10                  15
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(39)
<223>VH13G9重链CDR III
<400>31cat cat tac gac ggt agt agc ctc ctg cct atg gac tac    39His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr1               5                   10
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>32His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr1               5                  10
<210>33
<211>324
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(324)
<223>轻链V区
<400>33gat att caa atg acg cag tct cca gct tcc ctg tct gca tct ctg gga        48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1               5                  10                    15gaa act gtc tcc atc gaa tgt cta gca agt gag gac ata tac agt tat        96Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr
         20                  25                  30tta gca tgg tat caa cag aag cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg atc       144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
     35                   40                 45tat gcc aca aaa agg ttg caa gat ggg gtc cca tca cgg ttc agt ggc       192Tyr Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60agt gga tct ggc aca cag tat tct ctc aaa ata agc gac atg caa cct       240Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asp Met Gln Pro65                  70                  75                  80gaa gat gaa ggg gat tat ttc tgt cta cag aat tcc aag ttt ccg gtc       288Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val
             85                  90                  95acg ttc ggt tct ggg acc aag ctg gag atc aaa cgg                       324Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105
<210>34
<211>108
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>34Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1               5                  10                  15Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr
        20                  25                  30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
    35                  40                  45Tyr Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asp Met Gln Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val
            85                  90                  95Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
        100                 105
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(33)
<223>VK14B7轻链CDR I
<400>35cta gca agt gag gac ata tac agt tat tta gca                33Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala1               5                   10
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>36Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala1               5                  10
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(21)
<223>CK14B7轻链CDR II
<400>37gcc aca aaa agg ttg caa gat                        21Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp1               5
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>38Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp1               5
<210>39
<211>27
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(27)
<223>VK14B7轻链CDR III
<400>39cta cag aat tcc aag ttt ccg gtc acg                  27Leu Gln Asn Ser Lys phe Pro Val Thr1              5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>40Leu Gln Asn Ser Lys phe pro Val Thr1               5
<210>41
<211>368
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(368)
<223>重链V区
<400>41gag gtt cag ctt cag cag tct ggg gct gag ctt gtg aga cct ggg acc         48Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1               5                   10                  15tct gtg aag ttt tct tgc aaa gtt tct ggc gat acc cct aca aca tac         96Ser Val Lys Phe Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Pro Thr Thr Tyr
         20                  25                 30tac gtg cac ttt gtg aga caa agg cct gga cag ggt ctg gaa tgg ata        144Tyr Val His Phe Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
     35                  40                  45gga agg att gat cct gag gat act agt act aaa tat gct gag aag ttc        192Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
 50                  55                  60aga aat aag gcg aca ttc act gca gat cca tcc tcc aac aca gcc tac        240Arg Asn Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80cta aac ctc agc agc ctg acc cct gag gac act gca acc tat ttt tgt        288Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
             85                  90                  95acc ata atg cgg tac cat agt acc tat agg gtc tat gtt atg gat ttc        336Thr Ile Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe
        100                 105                 110tgg ggt caa gga act gca gtc act gtc tcc tc                             368Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser
     115                120
<210>42
<211>122
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>42Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1               5                  10                  15Ser Val Lys Phe Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Pro Thr Thr Tyr
        20                  25                  30Tyr Val His Phe Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    35                  40                  45Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe
50                  55                  60Arg Asn Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
            85                  90                  95Thr Ile Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe
        100                 105                 110Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser
    115                 120
<210>43
<211>15
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(15)
<223>VH14B7重链CDR I
<400>43aca tac tac gtg cac    15Thr Tyr Tyr Val His1               5
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>44Thr Tyr Tyr Val His1               5
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(51)
<223>VH14B7重链CDR II
<400>45agg att gat cct gag gat act agt act aaa tat gct gag aag ttc aga    48Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg1               5                   10                  15aat                                                                51
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>46Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg1               5                  10                  15
<210>47
<211>42
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(42)
<223>VH14B7重链CDR III
<400>47atg cgg tac cat agt acc tat agg gtc tat gtt atg gat ttc    42Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe1               5                   10
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>48Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe1              5                  10

Claims (26)

1.一种啮齿类中和单克隆抗体，特异于人IL-18，并具结合亲和性，其特征在于解离常数等于或小于约3.9×10-11M。
2.权利要求1的单克隆抗体，为大鼠单克隆抗体。
3.权利要求1的单克隆抗体，为小鼠单克隆抗体。
4.权利要求2的单克隆抗体，含轻链氨基酸序列SEQ ID NO：1和重链氨基酸序列SEQ ID NO：9。
5.权利要求3的单克隆抗体，含轻链氨基酸序列SEQ ID NO：17和重链氨基酸序列SEQ ID NO：25。
6.权利要求2的单克隆抗体，含轻链氨基酸序列SEQ ID NO：33和重链氨基酸序列SEQ ID NO：41。
7.权利要求1的单克隆抗体，具2C10、14B7或13G9的鉴别特征。
8.产生权利要求4单克隆抗体的杂交瘤。
9.产生权利要求5单克隆抗体的杂交瘤。
10.产生权利要求6单克隆抗体的杂交瘤。
11.具细胞系19522C10(2)F2(1)A1、195214B7(1)H10及187413G9(3)F12的鉴别特征的杂交瘤。
12.中和Fab片段或其F(ab’)2片段，由删除权利要求1中单克隆抗体Fc区得到。
13.包括重链和轻链的一种修饰抗体，其重链和轻链框架区来自至少一个选定的抗体，且各链互补决定区氨基酸序列得自权利要求1的单克隆抗体。
14.一种免疫球蛋白轻链互补决定区(CDR)，其氨基酸序列选自如下序列：
(a)SEQ ID NO：3
(b)SEQ ID NO：5
(c)SEQ ID NO：7
(d)SEQ ID NO：19
(e)SEQ ID NO：21
(f)SEQ ID NO：23
(g)SEQ ID NO：35
(h) SEQ ID NO：37
(i)SEQ ID NO：39
15.一种免疫球蛋白重链互补决定区(CDR)，其氨基酸序列选自如下序列：
(a)SEQ ID NO：11
(b)SEQ ID NO：13
(c)SEQ ID NO：15
(d)SEQ ID NO：27
(e)SEQ ID NO：29
(f)SEQ ID NO：31
(g)SEQ ID NO：43
(h)SEQ ID NO：45
(i)SEQ ID NO：47
16.编码权利要求14中免疫球蛋白互补决定区(CDR)的一种核酸分子。
17.编码权利要求15中免疫球蛋白互补决定区(CDR)的一种核酸分子。
18.一种药物组合物，含权利要求13中的修饰抗体和药学上可接受的载体。
19.处理自身免疫疾病相关症状的一种方法，包括向需要病人施用权利要求13中的修饰抗体的有效量之步骤。
20.权利要求19的方法，其中该病为多发性硬化。
21.权利要求19的方法，其中该病为类风湿性关节炎或者I型或胰岛素依赖性糖尿病。
22.权利要求19的方法，其中该病为炎性肠病。
23.权利要求19的方法，其中该病为牛皮癣。
24.分离的一段核酸序列，选自如下：
(a)编码权利要求13中修饰抗体的一段核酸序列
(b)互补于(a)的一段核酸序列；及
(c)(a)或(b)的一个片段或类似物，编码一个蛋白，其特征在于对人白细胞介素-18具特异性；其中该序列可选地含限制位点。
25.评估人体内有无人IL-18的一种方法，包括从病人获取生物体液样品，使权利要求1中单克隆抗体接触此样品以至能形成IL-18/单克隆抗体复合物，并检测该IL-18/单克隆抗体复合物的存在与否。
26.辅助诊断自身免疫疾病的一种方法，步骤包括：根据权利要求25中的方法测定病人样品中人IL-18的量，并将其与正常人群人IL-18平均量比较，由此病人的人IL-18量显著升高，即为自身免疫疾病的指示。
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