KR20020008130A - Ｉｌ-18 매개 질환의 치료에 유용한 재조합 ｉｌ-18 길항제 - Google Patents

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Abstract

고친화성 중화 mAb에서 유래된 키메라 mAb, 인간화 mAb 및 기타 IL-18 mAb, 이를 함유하는 제약학적 조성물, 치료 및 진단 방법이 제공된다.

Description

ＩＬ-18 매개 질환의 치료에 유용한 재조합 ＩＬ-18 길항제 {Recombinant IL-18 Antagonists Useful in Treatment of IL-18 Mediated Disorders}
인간 인터루킨-18은 생물학적으로 불활성인 193개 아미노산 전구 단백질로서 합성되는 최근에 동정된 사이토카인이다 (Ushio 등,J. Immunol.156: 4274, 1996). 예를 들어 카스파제-1 또는 카스파제-4에 의한 전구 단백질의 절단은 156개 아미노산 성숙 단백질을 유리시키며 (Gu 등,Science275:206, 1997; Ghayur 등,Nature386:619, 1997), 이것은 T 세포 증식의 공동자극, NK 세포 세포독성의 상승, T 세포 및 NK 세포에 의한 IFN-γ생성의 유도, 및 T 헬퍼 유형 1 (Th1) 분화의 강화작용을 포함한 생물학적 활성을 나타낸다 (Okamura 등,Nature378:88, 1995; Ushio 등,J.Immunol. 156:4274, 1996; Micallef 등, Eur.J. Immunol. 26: 1647, 1996; Kohno 등,J.Immunol. 158: 1541, 1997; Zhang 등,Infect.Immunol. 65:3594, 1997; Robinson 등,Immunity7:571, 1997). 또한, IL-18은 IL-8, 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 포함한 인간 단핵구 전염증성매개체의 효과적인 유도인자이다 (Ushio, S. 등, J.Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A.J. 등, J.Clin.Invest. 10:711-721, 1997; Podolin 등,J.Immunol.submitted, 1999).
최근 들어, 앞서 클로닝된 IL-1 수용체-관련 단백질 (IL-1 Rrp) (Parnet 등,J.Biol.Chem.271: 3967, 1996)이 IL-18 수용체의 서브유닛 (Kd = 18 nM)으로서 확인되었다 (Torigoe 등,J.Biol.Chem.272:25737, 1997). IL-18 수용체의 두번째 서브유닛은 IL-1 수용체 보조 단백질과 상동성을 나타내며, AcPL (유사 보조 단백질)라고 불리워져 왔다. IL-18-유도된 NF-κB 및 JNK 활성화를 위해서는 IL-1 Rrp 및 AcPL 모두의 발현이 요구된다 (Born 등,J.Biol.Chem. 273:29445, 1998). NF-κB 및 JNK 외에, IL-18은 IL-1 수용체-관련 키나제 (IRAK), p56lck (LCK) 및 마이토젠-활성화된 단백질 키나제 (MAPK)를 통하여 신호를 전달한다 (Micallef 등,Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Matsumoto 등,Biophys Biochem. Res. Comm.234: 454, 1997; Tsuji-Takayama 등,Biochem. Biophys. Res. Comm. 237: 126, 1997).
IFN-γ, IL-2 및 TNF-β와 같은 전염증성 사이토카인을 생성하는 Th1 세포 (Mosmann 등,J.Immunol. 136:2348, 1986)는 다발성 경화증 (MS), 류마티스성 관절염 (RA), 유형 1, 또는 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 염증성 장 질환 (IBD) 및 건선을 포함한 다수의 자가면역 질환을 매개하는데 관련되어 왔다 (Mosmann 및 Sad, Immunol. Today 17:138, 1996). 따라서, IL-18과 같은 Th1을 촉진하는 사이토카인의 길항작용이 질병의 발생을 억제할 것으로 기대된다. IL-18에 특이적인 mAb가길항제로서 사용될 수 있다.
자가면역 질환의 발생에서 IL-18의 역할이 증명되었다. 따라서, 질병의 개시 직전에 비비만성 당뇨 (NOD) 뮤린 (murine) 췌장 및 비장에서 IL-18 발현이 상당히 증가되는 것으로 증명되었다 (Rothe 등,J.Clin.Invest.99:469, 1997). 유사하게, 류마티스성 관절염 환자의 활액에서 IL-18 수준이 상당히 상승하는 것으로 나타났다 (Kawashima 등,Arthritis and Rheumatism39:598, 1996). 또한, IL-18 투여는 다발성 경화증의 모델이 되는 Th1-매개 자가면역 질환인 실험적 알레르기성 뮤린 뇌척수염 (EAE)의 임상적 중증도를 증가시키는 것으로 증명되었다. 또한, 항-랫트 IL-18 항혈청을 중화시키면 암컷 루이스 쥐에서 EAE의 발생을 예방함을 보였다 (Wildbaum 등,J.Immunol.161:6368, 1998). 따라서, Il-18은 자가면역 질환에 대한 새로운 치료법의 개발에 바람직한 표적이다.
문헌 [Taniguchi 등,J.Immunol. Methods206:107]은, 4개의 상이한 항원 부위에 결합하는, 7 개의 뮤린 항-인간 IL-18 mAb 및 6 개의 랫트의 항-인간 IL-18 mAb를 기재하고 있다. 뮤린 mAb 중 하나 (#125-2H), 및 6 개의 랫트 mAb는 KG-1 세포에 의한 IL-18-유도 IFN-γ생성을 억제하고, 랫트 mAb는 #125-2H에 비해 10배 낮은 중화 활성을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명된 바와 같이, 뮤린 mAb 중 3개는 막-결합된 인간 IL-18과 강하게 반응하지만, 랫트 mAb는 모두 막 결합된 인간 IL-18과 강하게 반응하지 않는다. 또한, 인간 IL-18을 검출하기 위해, #125-2H 및 랫트 mAb를 사용하는 효소 결합된 면역흡착 분석법 (ELISA)이 기재되어 있다. 이러한 ELISA의 검출 한계는 10 pg/㎖이다.
유럽 특허 출원 EP 0 712 931호는 2 개의 뮤린 항-인간 IL-18 mAb, H1 (IgG1) 및 H2 (IgM)을 개시하고 있다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명된 바와 같이, 두가지 mAb 모두는 막-결합된 인간 IL-18과 반응하지만, 막-결합된 인간 IL-12와는 반응하지 않는다. H1은 인간 IL-18을 정제하기 위한 면역친화성 크로마토그래피 프로토콜 및 인간 IL-18을 측정하기 위한 ELISA에서 이용된다. H2는 인간 IL-18을 측정하기 위한 방사면역분석법에 이용된다.
IL-18 중화 항체는 인간에서의 자가면역 질환 및 관련된 증상을 경감시키는데 매우 유용할 수 있다. 따라서, Th1 분화 및 증식을 감소시키고 이에 따라 자가면역 질환 및 관련된 증상을 감소시키는, 인간 인터루킨 18에 대한 중화 모노클로날 항체와 같은 고친화성 IL-18 길항제가 당 기술분야에서 요구되고 있다.
발명의 요약
첫번째 측면에서, 본 발명은 상세한 설명에 기재된 바와 같이 인간 인터루킨-18에 대해 특이적이고, 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 결합 친화성을 갖는 설치류 (예, 랫트 및 뮤린) 중화 모노클로날 항체를 제공한다. 이러한 모노클로날 항체의 예는 랫트 모노클로날 항체 2C10 및 랫트 및 뮤린 모노클로날 항체, 예컨대 14B7 및 13G9이다. 본 발명의 다른 양태는 19522C10(2)F2(1)A1, 195214B7(1)H10 및 187413G9(3)F12와 같은 하이브리도마이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 설치류 중화 모노클로날 항체의 Fc 영역을 결실시킴으로써 생성된, 인간 인터루킨-18에 대해 특이적인 중화 Fab 단편또는 F(ab')2단편을 제공한다.
또 다른 관련된 측면에서, 본 발명은 인간 인터루킨-18에 대한 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 비인간 중화 모노클로날 항체 (mAb)에서 유래된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 인간 인터루킨-18에 대해 특이적인 변형된 항체를 제공한다. 변형된 항체가 인간화 항체일 때, 비인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 서열을 첫번째 면역글로불린 파트너내에 삽입하여, 첫번째 면역글로불린 파트너의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두가 이 비인간 모노클로날 항체의 CDR로 치환된다. 바람직하게는, 첫번째 면역글로불린 파트너는 면역글로불린 불변 쇄의 전부 또는 일부를 포함하는 두번째 면역글로불린 파트너내에 작동가능하게 연결된다.
관련된 측면에서, 본 발명은 인간 인터루킨-18에 대한 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 비인간 중화 모노클로날 항체 (mAb)로부터 유래된 CDR, 및 상기 CDR을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 인간 인터루킨-18에 대한 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 비인간 중화 모노클로날 항체로부터 유래된, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 키메라 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 변형된 항체의 하나 (또는 그 이상) 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제약학적 조성물의 유효량을 인간에게 투여함으로써, 과다한 Th1 생성와 연관된 인간의 질병, 예를 들어 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 IL-18에 대한 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 비인간 중화 모노클로날 항체 (mAb)로부터 유래되어진 변형된 항체 (예를 들어, 조작된 (engineered) 항체, CDR, Fab 또는 F(ab)2단편, 또는 이의 유사체)의 재조합 생성을 위한 방법 및 이의 재조합 생성에서 유용한 성분을 제공한다. 이러한 성분들은 이를 코딩하는 단리된 핵산 서열, 재조합 플라스미드로 형질감염된 숙주 세포 (바람직하게는 포유동물)에서 그의 형질발현을 나타낼 수 있는 선택된 조절 서열의 조절하에 있는 핵산 서열을 함유하는 재조합 플라스미드를 포함한다. 생성 방법은 변형된 항체, 바람직하게는 인간화 항체가 상기 세포내에서 발현되도록 하는 조건하에서 본 발명의 형질감염된 숙주 세포주를 배양하고, 그로부터 발현된 생성물을 단리하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 환자로부터 생체액 시료를 수득하고, IL-18/항체 (모노클로날 항체 또는 변형된 항체) 결합체가 형성되도록 하는 조건하에서 본 발명의 항체 및 변형된 항체를 상기 시료와 접촉시키고, 상기 IL-18/항체 결합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 인간에서의 과량의 Th1 생성과 연관된 질병을 진단하는 방법이다.
본 발명의 다른 측면 및 장점은 이하 발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현양태에서 더욱 설명된다.
본 발명은, IL-18에 의해 매개되는 질병의 치료 및 진단에서 유용한 항체 및 변형된 항체, 보다 구체적으로 mAb, Fab, 키메라 및 인간화 항체에 관한 것이다.
도 1 [서열번호 1 및 2]은 랫트 항체 2C10에 대한 경쇄 가변 영역을 예시한다. 도 1은 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 3-8]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 (degenerate) 프라이머 서열을 나타낸다.
도 2 [서열번호 9 및 10]은 랫트 항체 2C10에 대한 중쇄 가변 영역을 예시한다. 도 2는 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 11-16]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 프라이머 서열을 나타낸다.
도 3 [서열번호 17 및 18]은 뮤린 항체 13G9에 대한 경쇄 가변 영역을 예시한다. 도 3은 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 19-24]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 프라이머 서열을 나타낸다.
도 4 [서열번호 25 및 26]은 뮤린 항체 13G9에 대한 중쇄 가변 영역을 예시한다. 도 4는 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 27-32]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 프라이머 서열을 나타낸다.
도 5 [서열번호 33 및 34]은 랫트 항체 14B7에 대한 경쇄 가변 영역을 예시한다. 도 5는 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 35-40]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 프라이머 서열을 나타낸다.
도 6 [서열번호 41 및 42]은 랫트 항체 14B7을 위한 중쇄 가변 영역을 예시한다. 도 6은 양쪽 가닥에 대한 서열 데이타를 포함한다. 박스로 나타낸 부분은 CDR [서열번호 43-48]을 나타낸다. 굵게 나타낸 부분은 다의성 프라이머 서열을 나타낸다.
본 발명은 랫트 모노클로날 항체 2C10, 뮤린 모노클로날 항체 13G9 및 랫트 모노클로날 항체 14B7에서 예시된 바와 같이, 인간 IL-18 결합 특이성, 중화 활성, 및 인간 IL-18에 대한 고친화성을 특징으로 하는 각종 항체, 변형된 항체 및 그의 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 신규의 중화 항체를 생성하기 위한 종래의 하이브리도마 기술에 의해 제조되었다. 이러한 생성물은 다발성 경화증 (MS), 류마티스성 관절염 (RA), 유형 1, 또는 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 염증성 장 질환 (IBD), 및 건선을 포함한 IL-18-매개 질환, 예를 들어 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료적 및 제약학적 조성물에서 유용하다 (Mosmann 및 Sad,Immunol. Today17:138, 1996). 이러한 생성물은 또한, 인간에서의 내인성 IL-18 수준 또는 활성화된 세포로 부터 생체외 (ex vivo) 방출된 IL-18을 측정 (예를 들어, 효소 결합된 면역흡착 분석 (ELISA))함으로써, IL-18-매개 질병을 진단하는데 유용하다.
I. 정의
"변형된 항체"란, 선택된 숙주 세포에서의 형질발현에 의해 수득될 수 있는, 변형된 면역글로불린 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질을 말한다. 이러한 변형된 항체로는 조작된 항체 (예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체) 또는 면역글로불린 불변 영역의 전부 또는 일부가 소실된 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab 또는 F(ab)2등이 있다.
"변형된 면역글로불린 코딩 영역"이란 본 발명의 변형된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 변형된 항체가 CDR이 그래프팅된 항체 또는 인간화 항체일 때, 비인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 서열을 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 첫번째 면역글로불린 파트너내에 삽입한다. 임의로, 첫번째 면역글로불린 파트너가 두번째 면역글로불린 파트너에 작동가능하게 연결된다.
"첫번째 면역글로불린 파트너"란 천연의 (또는 자연 발생) CDR 코딩 영역을 공여 항체의 CDR 코딩 영역으로 대체시킨, 인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 말한다. 인간 가변 영역은 면역글로불린 중쇄, 경쇄 (또는 양쪽 모두), 그의 유사체 또는 기능적 단편일 수 있다. 항체 (면역글로불린)의 가변 영역 내에 위치한 이러한 CDR 영역은 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Kabat 등, (Sequences of Proteins of Immunological Interest), 제 4 판, 미국 보건복지부, 국립보건원 (Department of Health and Human Services, National Institutes of Health) (1987)]은 CDR의 위치를 결정하는 규칙을 개시하고 있다. 또한, CDR 영역/구조를 확인하는데 유용한 컴퓨터 프로그램이 공지되어 있다.
"중화"란 결합이 발생할 경우 특이적 수용체에 대해 인간 IL-18의 결합을 방지함으로써 또는 그의 수용체를 통한 IL-18의 시그날 전달을 억제함으로써 IL-18 활성을 억제하는 항체를 말한다. IL-18 중화 분석법으로 측정시에, IL-18 활성을 억제함에 있어서 mAb가 90 % 효과적, 바람직하게는 95 % 효과적, 가장 바람직하게는 100 % 효과적일 때 mAb는 중화 항체이다 (실시예 1 및 표 1 참조).
용어 "고친화성"이란, 광학 바이오센서 분석에 의해 측정시에, 인간 IL-18에 대한 Kd가 3.9 ×1011M 이하인 것을 특징으로 하는 결합 친화성을 가진 항체를 말한다 (실시예 2 및 표 1 참조).
"인간 IL-18에 대한 결합 특이성"이란 뮤린 또는 기타 IL-18에 비해 인간 IL-18에 대해 더욱 고친화성을 의미한다.
"두번째 면역글로불린 파트너"란 첫번째 면역글로불린 파트너가 프레임으로 융합되거나 또는 통상적인 임의의 링커 서열에 의해 융합되어진 (즉, 작동가능하게 결합된), 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 또하나의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 바람직하게는, 이것은 면역글로불린 유전자이다. 두번째 면역글로불린 파트너는 동일하거나 (즉, 상동성 - 첫번째 및 두번째 변형 항체가 동일한 출처에서 유래된다) 또는 또다른 (즉, 이종성) 항체의 불변 영역 전체를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수도 있다. 이것은 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 (또는 단일 폴리펩티드의 일부로서의 양쪽 쇄 모두)일 수도 있다. 두번째 면역글로불린 파트너는 특정한 면역글로불린 부류 또는 이소형 (isotype)으로 제한되지 않는다. 또한, 두번째 면역글로불린 파트너는 Fab 또는 F(ab)2(즉, 적절한 인간 불변 영역 또는 프레임워크 영역의 별개의 부분)에서 발견되는 것과 같은 면역글로불린 불변 영역의 일부를 포함할 수도 있다. 이러한 두번째 면역글로불린 파트너는, 예를 들어 파아지 디스플레이 라이브러리의 일부로서 숙주 세포의 외면에 노출된 세포막내 (integral) 막 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 분석 또는 진단 검출용 단백질, 예를 들어 서양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제 등을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)2는 그들의 일반적인 의미로 사용된다 (참조, Harlow 등,Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
본원에서 사용된 "조작된 항체"란 선택된 수용 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인의 일부가 선택된 에피토프에 대해 특이성을 가진 하나 이상의 공여 항체의 유사한 부분으로 대체되어진, 변형된 항체의 유형, 즉 전장의 합성 항체 (예를 들어, 항체 단편에 대립되는 키메라 또는 인간화 항체)를 말한다. 예를 들어, 이러한 분자들은 변형되지 않은 경쇄 (또는 키메라 경쇄)와 결합된 인간화 중쇄, 또는 변형되지 않은 중쇄와 결합된 인간화 경쇄를 특징으로 하는 항체를 포함할 수도 있다. 조작된 항체는 공여 항체 결합 특이성을 유지하기 위하여 수용 항체 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열의 변형을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 항체들은 수용 항체의 CDR 중 하나 이상 (바람직하게는 전부)를 본원에 기재된 공여 항체의 CDR로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
"키메라 항체"란 수용 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 결합되고, 공여 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)을 함유하는 조작된 항체의 유형을 말한다.
"인간화 항체"란 CDR이 비인간 공여 면역글로불린에서 유래되고 면역글로불린에서 유래된 분자의 나머지 부분이 하나 (또는 그 이상)의 인간 면역글로불린(들)에서 유래된 유형의 조작된 항체를 말한다. 또한, 결합 친화성을 보존하기 위하여 프레임워크 지지 잔기를 변형시킬 수도 있다 (참조, 예를 들어 Queen 등,Proc.Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson 등,Bio/Technology, 9:421 (1991)).
용어 "공여 항체"란 변형된 면역글로불린 코딩 영역 및 그 결과로 발현된 변형된 항체에 항원 특이성 및 공여 항체의 중화 활성 특징을 제공하기 위하여 그의 가변 영역, CDR 또는 기타 기능적 단편 또는 그의 유사체의 핵산 서열을 첫번째 면역글로불린 파트너에 제공하는 항체 (모노클로날 또는 재조합 항체)를 말한다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 공여 항체 중 하나는 2C10으로 명명되는 비인간 (즉, 랫트) 중화 모노클로날 항체이다. 항체 2C10은 적절한 뮤린 IgG 불변 영역 상에 각각 서열번호 1 및 2의 가변 경쇄 DNA 및 아미노산 서열과 서열번호 9 및 10의 가변 중쇄 DNA 및 아미노산 서열을 갖는 이소형 IgG1.K의 고친화성, 인간 IL-18에 특이적인 (즉, 뮤린 IL-18을 인식하지 않음), 중화 항체로서 정의된다.
용어 "수용 항체"란 중쇄 및(또는) 경쇄 프레임워크 영역 및(또는) 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열의 전부 (또는 임의의 일부, 그러나 바람직하게는 전부)를 첫번째 면역글로불린 파트너에게 제공하는, 공여 항체와 이종성인 항체 (모노클로날 또는 재조합 항체)를 말한다. 바람직하게는, 인간 항체가 수용 항체가다.
"CDR"이란 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 참조, 예를 들어 문헌 [Kabat 등,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., 미국 보건복지부, 국립보건원 (1987)]. 면역글로불린의 가변 영역에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 영역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개의 중쇄 CDR 모두, 또는 3개의 경쇄 CDR 모두 (또는 적절한 경우 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR 양쪽 모두)를 일컫는 것이다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 항체를 결합시키기 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 본 발명에서 주요한 CDR은 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되고, 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하며, 이 유사체는 이들이 유래된 공여 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 능력을 공유하거나 보유한다.
항원 결합 특이성 또는 중화 활성을 공유한다는 것은, 예를 들어, mAb 2C10이 특정한 수준의 항원 친화성을 특징으로 할 수도 있긴 하지만, 적절한 구조 환경에서 2C10의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR이 더욱 낮거나 더욱 높은 친화성을 가질 수도 있음을 의미한다. 그렇지만, 이러한 환경에서 2C10의 CDR은 2C10과 동일한 에피토프(들)을 인식할 것으로 기대된다. 2C10의 경쇄 CDR의 예로는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7이 포함되고, 2C10의 중쇄 CDR의 예로는 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 15가 포함된다.
"기능적 단편"이란 단편이 유래된 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 능력을 보유하는, 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 아미노 또는 카르복시 말단에서의 작은 결실)이다.
"유사체"란 하나 이상의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열이며, 이때 상기 변형이란 몇 개의 아미노산 (즉, 10개 이하)의 화학적 변화 또는 치환 또는 재배열일 수 있고, 이러한 변형은 아미노산 서열이 변형되지 않은 서열의 생물학적 특징, 예를 들어 항원 특이성 및 고친화성을 보유할 수 있도록 한다. 예를 들어, 특정한 엔도뉴클레아제 제한효소 부위가 CDR 코딩 영역 내에서 또는 그 주위에서 생성될 때, 치환을 통해 (사일런트) 돌연변이가 구축될 수 있다.
유사체는 또한 대립 유전자 변이로서 일어날 수도 있다. "대립 유전자 변이 또는 변형"은 본 발명의 아미노산 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열 에서의 변형이다. 이러한 변이 또는 변형은 유전자 코드의 다의성에 기인할 수도 있거나, 또는 목적하는 특징을 제공하기 위해 의도적으로 조작될 수도 있다. 이러한 변이 또는 변형은 임의의 코딩된 아미노산 서열에서 변화를 일으킬 수 있거나 일으키지 않을 수도 있다.
용어 "효과기 (effector) 인자"란 변형된 항체 및(또는) 공여 항체의 자연발생 또는 합성 경쇄 또는 중쇄, 또는 공여 항체의 다른 단편들이 통상적인 수단에 의해 결합되어질 수도 있는 비단백질 담체 분자를 말한다. 이러한 비단백질 담체는 진단 분야에서 사용되는 통상적인 담체, 예를 들어 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱 비드, 예를 들어 BIA 코어 [파르마시아 (Pharmacia)] 시스템에서 사용되는 것과 같은 다당류, 또는 인간 및 동물에 투여하기 위해 안전하고 의약 분야에서 유용한 기타 비단백질 물질을 포함할 수 있다. 다른 효과기 인자는 중금속 원자를 킬레이트화하기 위한 마크로사이클 (macrocycle) 또는 방사성동위원소를 포함할 수도 있다. 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 이러한 효과기 인자는 변형된 항체의 반감기를 증가시키 위해 유용할 수도 있다.
II. 고친화성 IL-18 모노클로날 항체
본 발명의 항체, 변형된 항체 및 단편을 구축하는데 사용하기 위해, 비인간 종 (예를 들어, 소, 양, 원숭이, 닭, 설치류 (예를 들어, 뮤린 및 랫트) 등)을 사용하여, 천연의 인간 IL-18 또는 그의 펩티드 에피토프를 제시하는 경우 바람직한 면역글로불린을 생성할 수도 있다. 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여, IL-18에 대한 비인간 mAb를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 실시예 부분에 설명된 바와 같이, 96-웰 플레이트에 코팅된 IL-18을 사용하거나, 또는 별법으로 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트에 결합된 바이오티닐화 IL-18을 사용하여, 이러한 하이브리도마를 결합에 대해 스크리닝한다.
본 발명의 고친화성 중화 mAb의 한 예는 이하 실시예에서 더욱 상세히 기재된, 키메라 또는 인간화 항체의 발생을 위해 사용될 수 있는 랫트 항체인 mAb 2C10이다. 2C10 mAb는 인간 IL-18에 대한 항원 결합 특이성이 약 Kd3.9×10-11M인 것을 특징으로 한다. 이러한 mAb는 이소형 IgG1.K인 것을 특징으로 한다.
다른 바람직한 공여 항체는 뮤린 mAb 13G9이다. 이러한 mAb는 이소형 IgG1K를 특징으로 한다. mAb는 IL-18에 대한 해리 상수가 약 12×10-9M이다.
또한, 다른 바람직한 공여 항체는 랫트 mAb 14B7이다. 이러한 mAb는 IL-18에 대한 해기 상수가 약 1.5×10-10M인 것을 특징으로 한다. 또한, 14B7은 이소형 IgG1K인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 13G9, 2C10, 14B7 또는 이들의 과가변 (즉, CDR) 서열의 사용에 제한되지 않는다. 인간 IL-18에 대한 해리 상수가 약 3.9×10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 다른 적절한 고친화성 IL-18 항체 및 상응하는 항 IL-18 CDR로 대체할 수도 있다. 하기 상세한 설명에서 공여 항체를 13G9, 2C10, 14B7로서 나타내는 경우에, 이러한 명명은 단지 예시 및 간단한 설명을 위해 주어진 것이다.
III. 항체 단편
본 발명은 또한, 인간 IL-18에 대한 mAb에서 유래된 Fab 단편 또는 F(ab')2단편의 사용을 포함한다. 이러한 단편들은 생체내에서 IL-18 및 TH1-매개 질병에 대한 보호 약제로서 또는 시험관내에서 IL-18 진단의 일부로서 유용하다. Fab 단편은 경쇄 전체 및 중쇄의 아미노 말단 부위를 함유하고; F(ab')2단편은 디설파이드 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편에 의해 형성되는 단편이다. mAb 13G9, 2C10, 14B7 및 기타 유사한 고친화성 IL-18 결합 항체는 통상적인 수단, 예를 들어 적절한 단백질분해 효소, 파파인 및(또는) 펩신에 의한 mAb의 절단 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있는 Fab 단편 및 F(ab')2단편의 공급원을 제공한다. 이러한 Fab 및 F(ab')2단편은 그 자체로 치료, 예방 또는 진단 약제로서 유용하고, 본원에 기재된 재조합 또는 인간화 항체의 형성에서 유용한 CDR 서열 및 가변 영역을 포함하는 서열의 공여체로서 유용하다.
조합 (combinatorial) 파아지 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Winter 등,Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)]참조) 또는 면역글로불린 쇄 셔플링 (예를 들어, 문헌 [Mark 등,Bio/Technology, 10:779-783 (1992)] 참조) (이들 문헌은 모두 본원에서 참고문헌으로 인용된다)으로 Fab 및 F(ab')2단편을 구축할 수 있으며, 여기에서, 선택된 항체 (예, 13G9)의 Fd 또는 VH면역글로불린을 경쇄 면역글로불린의 레퍼토리, VL(또는 VK)와 결합시켜 신규의 Fab를 형성한다. 역으로, 선택된 항체의 경쇄 면역글로불린을 중쇄 면역글로불린의 레퍼토리, VH(또는 Fd)와 결합시켜 신규의 Fab를 형성할 수도 있다.
IV. 항 IL-18 아미노산 및 주요 뉴클레오티드 서열
상기 기재된 mAb 2C10 또는 기타 항체는 공여 항체의 항원 결합 특이성을 특징으로 하는 각종 변형된 항체를 구축하고 수득하는데 유용한, 가변 중쇄 및(또는)경쇄 펩티드 서열, 프레임워크 서열, CDR 서열, 기능적 단편, 및 그의 유사체, 및 이를 코딩하는 핵산 서열과 같은 서열을 제공할 수 있다.
일례로서, 본 발명은 IL-18 mAb 2C10의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열 및 그로부터 유래된 서열을 제공한다.
가변 경쇄 및 중쇄 펩티드 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 그의 단편은 CDR 또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열내에서 특정한 변화를 돌연변이로 도입하는데 유용하고, 생성된 변형되거나 융합된 핵산 서열을 발현 플라스미드에 결합시키기에 유용하다.
유전자 코드의 다의성을 고려하여, 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 및 공여 항체의 항원 특이성을 공유하는 본 발명의 CDR 서열 뿐만 아니라 기능적 단편 및 그의 유사체을 코딩하는 각종 코딩 서열를 구축할 수도 있다. 두번째 면역글로불린 파트너와 작동가능하게 조합될 경우 가변 쇄 펩티드 서열 또는 CDR을 코딩하는 본 발명의 단리된 핵산 서열 또는 그의 단편을 사용하여 변형된 항체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체를 생성하거나 또는 본 발명의 다른 조작된 항체를 생성할 수 있다.
본원에 기재된 변형된 항체 및 항체들의 일부를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 외에, 천연의 CDR 코딩 서열에 상보적이거나 또는 CDR 코딩 영역 주위에 변형된 인간 프레임워크 영역에 상보적인 것과 같은 기타 핵산 서열이 본 발명에 포함된다는 것을 주목해야 한다. 유용한 DNA 서열은 엄격한 혼성화 조건하에서 DNA 서열에 혼성화하는 서열을 포함한다 (참조 [T.Maniatis 등,Molecular Cloning (ALaboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 387-389면]). 이러한 엄격한 혼성화 조건의 예는 65 ℃에서 4 ×SSC에서 혼성화한 다음, 65 ℃에서 1 시간 동안 0.1 ×SSC중에서 세척하는 것이다. 별법으로, 엄격한 혼성화 조건의 한 예는 42 ℃에서 50 % 포름아미드중 4 ×SSC이다. 바람직하게는, 혼성화하는 DNA 서열의 길이는 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 즉 대략 CDR의 크기이다.
V. 변형된 면역글로불린 분자 및 변형된 항체
변형된 면역글로불린 분자는 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 조작된 항체를 포함한 변형된 항체를 코딩할 수 있다. 목적하는 변형된 면역글로불린 코딩 영역은 IL-18 항체에 항원 특이성을 갖는 펩티드, 바람직하게는 본 발명에서 제공하는 고친화성 항체를 코딩하고, 첫번째 면역글로불린 파트너 (인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역)내에 삽입된 CDR 코딩 영역을 함유한다.
바람직하게는, 첫번째 면역글로불린 파트너가 두번째 면역글로불린 파트너에 작동가능하게 연결된다. 두번째 면역글로불린 파트너는 상기 정의된 바와 같으며, 목적하는 두번째 항체 영역을 코딩하는 서열, 예를 들어 Fc 영역을 포함할 수도 있다. 두번째 면역글로불린 파트너는 또한, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역이 프레임으로 또는 링커 서열로 융합된 또다른 면역글로불린을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다. IL-18의 기능적 단편 또는 유사체에 대한 조작된 항체는 동일한 항체와의 결합을 향상시키도록 구성될 수도 있다.
두번째 면역글로불린 파트너를 두번째 면역글로불린 파트너가 통상적인 수단에 의해 작동가능하게 연결될 수도 있는 비단백질 담체 분자를 포함한 상기 정의된효과기 인자와 결합시킬 수도 있다.
두번째 면역글로불린 파트너, 예를 들어 항체 서열들과 효과기 인자 간의 융합 또는 결합은 적절한 수단, 예를 들어 통상적인 공유 또는 이온 결합, 단백질 융합, 또는 헤테로-이관능성 가교제, 예를 들어 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등에 의해 일어날 수 있다. 적절한 기술이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 통상적인 화학 및 생화학 문헌에 쉽게 기술되어 있다.
추가로, 두번째 면역글로불린 파트너와 효과기 인자 사이에 원하는 양의 간격을 제공하는 통상적인 링커 서열을 변형된 면역글로불린 코딩 영역내에 구축할 수도 있다. 이러한 링커의 구조는 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 본 발명의 분자를 위한 시그날 서열을 변형시켜 발현을 촉진할 수도 있다.
변형된 항체의 일례는 mAb 2C10의 항원 특이성을 가진 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 또는 단백질 서열, 예를 들어 VH및 VL쇄을 함유한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 변형된 항체는 아미노산 서열이 랫트 항체 분자 2C10의 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역의 CDR을 하나 이상, 바람직하게는 전부를 함유하고, 나머지 서열은 인간 공급원으로부터 유래된, 아미노산 서열 또는 그의 기능적 단편 또는 유사체를 특징으로 한다.
추가의 구현양태에서, 본 발명의 조작된 항체를 또다른 인자에 결합시킬 수도 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 기술의 절차를 사용하여 전체 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2 CH3 도메인이 효소 또는 다른 검출가능한 분자 (즉, 폴리펩티드 효과기 또는 리포터 분자)에 의해 대체되어진 본 발명의 조작된 항체를 생성할 수도 있다.
또한, 두번째 면역글로불린 파트너를, 예를 들어 랫트 2C10의 항원 특이성을 갖는 CDR 함유 서열에 대해 이종성인 비면역글로불린 펩티드, 단백질 또는 그의 단편에 작동가능하게 연결시킬 수도 있다. 생성된 단백질은 발현시에 항-IL-18 항원 특이성 및 비면역글로불린 특징을 모두 나타낼 수도 있다. 융합 파트너 특징은 예를 들어 다른 결합 또는 수용체 도메인과 같은 기능적 특징일 수도 있거나, 또는 융합 파트너가 치료 단백질인 경우 치료 특징일 수도 있거나, 또는 추가의 항원 특징일 수도 있다.
본 발명의 다른 바람직한 단백질은 전체 길이의 중쇄 및 경쇄를 가진 전체 항체 분자 또는 그의 분리된 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2단편, 중쇄 이량체, 또는 Fv또는 단일 쇄 항체 (SCA)와 같은 최소의 재조합 단편, 또는 선택된 공여 mAb와 동일한 특이성을 가진 기타 분자, 예를 들어 mAb 2C10을 포함할 수도 있다. 이러한 단백질은 변형된 항체의 형태로 사용될 수도 있거나, 또는 융합되지 않은 형태로 사용될 수도 있다.
두번째 면역글로불린 파트너가 공여 항체와는 상이한 항체, 예를 들어 면역글로불린 프레임워크의 이소형 또는 부류, 또는 불변 영역으로부터 유래될 때, 조작된 항체가 얻어진다. 조작된 항체는 하나의 출처, 예를 들어 수용 항체의 면역글로불린 (Ig) 불변 영역 및 프레임워크 영역, 및 공여 항체, 예를 들어 항-IL-18 항체의 CDR 중 하나 이상 (바람직하게는 모두)을 포함할 수 있다. 또한, 공여 항체 항원 결합 특이성을 유지하기 위하여, 핵산 또는 아미노산 수준에서 수용 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역, 또는 공여체 CDR 영역의 변형, 예를 들어 결실, 치환 또는 추가를 행할 수도 있다.
IL-18 mAb (임의로 상기 기재된 바와 같이 변형됨)의 가변 중쇄 및(또는) 경쇄의 하나 (또는 양쪽 모두) 또는 하나 이상의 하기 나타낸 중쇄 또는 경쇄 CDR을 사용하여 이러한 조작된 항체를 구성한다. 조작된 항체는 중화 항체인 것으로 생각되며, 즉 IL-18 단백질의 수용체와의 결합을 바람직하게 차단하고 IL-18 의존성 세포의 증식을 차단하거나 막는다.
이러한 조작된 항체는 선택된 인간 면역글로불린 또는 아형의 프레임워크 영역을 함유하는 인간화 항체, 또는 IL-18 항체 기능적 단편에 융합된 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 키메라 항체를 포함할 수도 있다. 적절한 인간 (또는 기타 동물) 수용 항체는 공여 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 상동성에 의해 통상적인 데이타베이스, 예를 들어 KABAT(등록상표) 데이타베이스, 로스 알라모스 (Los Alamos) 데이타베이스, 및 스위스 프로테인 (Swiss Protein) 데이타베이스로부터 선택되는 것일 수도 있다. (아미노산 기준으로) 공여 항체의 프레임워크 영역에 대한 상동성을 특징으로 하는 인간 항체는 공여체 CDR의 삽입을 위해 중쇄 불변 영역 및(또는) 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하기에 적절할 수도 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 공여할 수 있는 적절한 수용 항체가유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용 항체 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용 항체에서 유래하도록 요구되지 않는다는 것을 알아야 한다.
바람직하게는, 인간 면역글로불린 부류 및 이소형, 예컨대 IgG (아형 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE로부터 이종성 프레임워크 및 불변 영역이 선택된다. 그러나, 수용 항체가 단지 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 쇄의 일부를 코딩하는 DNA 서열이 비면역글로불린 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열, 예컨대 폴리펩티드 효과기 또는 리포터 분자에 융합되어진 유전자를 구축할 수도 있다.
특히 바람직한 인간화 항체의 한 예는 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역내에 삽입된 2C10의 CDR을 들 수 있다. 중화 인간화 항체의 경우, IL-18 항체 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역의 CDR 중 1개, 2개 또는 바람직하게는 3개를 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역내에 삽입하여, 인간 항체의 천연 CDR을 대체한다.
바람직하게는, 인간화 항체에서, 인간 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인을 하나 이상의 CDR로 치환 조작하였다. 6개 모두의 CDR을 사용하거나, 또는 6 개 미만의 CDR의 각종 조합을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 6개 모든 CDR가 대체된다. 인간 수용 항체의 변형되지 않은 경쇄를 경쇄로서 사용하여, 인간 중쇄에 있는 CDR만을 대체할 수 있다. 또한 별법으로, 통상적인 항체 데이타베이스에 기초하여 다른 인간 항체로부터 양립가능한 경쇄를 선택할 수도 있다. 조작된 항체의 나머지는 적절한 수용 인간 면역글로불린으로부터 유래될 수도 있다.
따라서, 조작된 인간화 항체는 바람직하게는 자연 발생 인간 항체 또는 그의 단편의 구조를 가지며, 효과적인 치료 용도, 예를 들어 인간에서의 IL-18 매개 염증성 질환의 치료를 위해 또는 진단 용도를 위해 요구되는 특성의 조합을 갖는다.
다른 예로서, 조작된 항체는 2C10의 가변 경쇄 영역의 CDR 및 13G9의 가변 중쇄 영역의 CDR을 함유할 수도 있다. 생성된 인간화 항체는 동일한 항원 결합 특이성 및 mAb 2C10의 고친화성을 특징으로 해야 한다.
공여 항체 (즉, 유사체)의 특이성 및 고친화성에 반드시 영향을 끼치지 않으면서, 조작된 항체를 가변 도메인 아미노산에서의 변화에 의해 더 변형시킬 수도 있음을 당업자라면 이해할 것이다. 중쇄 및 경쇄 아미노산을 가변 도메인 프레임워크 또는 CDR 또는 양쪽 모두에서의 다른 아미노산으로 치환할 수도 있는 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 분자의 선택된 특성을 향상시키거나 저하시키기 위해 불변 영역을 변형시킬 수도 있다. 예를 들면, 이량체화, Fc 수용체에 대한 결합, 또는 보체에 결합하는 능력 및 보체를 활성화시키는 능력 (예를 들어 [Angal 등,Mol.Immunol. 30:105-108 (1993), Xu 등,J.Biol.Chem., 269:3469-3474 (1994), Winter 등, EP 307,434-B] 참조)을 들 수 있다.
키메라 항체인 변형된 항체는 양쪽 쇄에 대해 인간 면역글로불린 불변 영역과 함께, 프레임워크 영역을 포함하여 전체 비인간 공여 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 제공함으로써 상기 기재된 인간화 항체와는 상이하다. 본 발명의 인간화 항체에 비해 추가의 비인간 서열을 보유하는 키메라 항체가 인간에서의 중요한 면역 반응을 이끌어낼 수도 있는 것으로 기대된다.
이러한 항체는 하기 언급된 바와 같은 IL-18 매개 질환의 예방 및 치료에서 유용할 수 있다.
VI. 변형된 항체 및 조작된 항체의 생성
바람직하게는, 가변 경쇄 및(또는) 중쇄 서열 및 mAb 2C10의 CDR 또는 기타 적절한 공여 mAb, 및 그들의 코딩 핵산 서열을 하기 방법에 의해 본 발명의 변형된 항체, 바람직하게는 인간화 항체의 구축에서 사용한다. 동일하거나 유사한 기술을 사용하여 본 발명의 다른 구현양태를 형성할 수도 있다.
선택된 공여 mAb, 예를 들어 랫트 항체 2C10을 생성하는 하이브리도마는 통상적으로 클로닝되고, 당 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 문헌 [Sambrook 등, (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 제 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]에 기재된 기술에 의해 수득된 그의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA이다. 적어도 CDR 코딩 영역을 함유하는 2C10의 가변 중쇄 및 경쇄 영역 및 공여 mAb 결합 특이성을 보유하기 위해 요구되는 수용 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 일부, 뿐만 아니라 인간 면역글로불린으로부터 유래된 항체 쇄의 나머지 면역글로불린-유래 부분은 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 역 전사효소를 사용하여 수득될 수 있다. CDR 코딩 영역은 공지된 데이타베이스를 사용하고 또한 다른 항체와의 비교에 의해 동정된다.
랫트/인간 키메라 항체를 제조하여 결합 활성에 대해 분석할 수도 있다. 이러한 키메라 항체는 양쪽 쇄에 대한 인간 Ig 불변 영역과 결합된, 전체 비인간 공여 항체 VH및 VL영역을 함유한다.
인간화 항체는 키메라 항체로부터 유래될 수도 있거나, 또는 바람직하게는 중쇄 및 경쇄의 공여 mAb CDR 코딩 영역을 선택된 중쇄 및 경쇄 프레임워크내에 적절하게 삽입함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간화 항체는 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 따라서, 얻어진 인간화 항체는 인간 프레임워크 영역 및 공여 mAb CDR 코딩 영역을 함유한다. 연속하여 프레임워크 잔기를 조작할 수도 있다. 얻어진 인간화 항체는 재조합 숙주 세포, 예를 들어 COS, CHO 또는 골수 세포에서 발현될 수 있다. 기타 적절한 IL-18-특이적, 중화, 고-친화성, 비인간 항체에 대해 이러한 기술을 사용하여 다른 인간화 항체를 제조할 수도 있다.
변형된 항체에 대한 이러한 코딩 서열을 숙주 세포에서의 복제 및 발현 및(또는) 이로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절 제어 서열과 작동가능하게 결합시킴으로써, 통상적인 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드를 제조할 수 있다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예를 들어 CMV 프로모터 및 시그날 서열을 포함하며, 이들은 기타 공지된 항체로부터 유래될 수 있다. 유사하게, 상보적 항체 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 가진 두번째 발현 벡터를 제조할 수 있다. 각각의 폴리펩티드 쇄이 가능한한 기능적으로 발현되도록 하기 위해서, 이러한 두번째 발현 벡터는 코딩 서열 및 선택가능한 마커에 관한 범위를 제외하고는, 첫번째의 벡터와 동일한 것이 바람직하다. 별법으로, 변형된 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩서열이 단일 벡터상에 존재할 수도 있다.
재조합 또는 합성 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 본 발명의 형질감염된 숙주 세포를 생성하기 위해서, 통상적인 기술에 의해 선택된 숙주 세포를 첫번째 및 두번째 벡터 모두로 동시-형질감염한다 (또는 단일 벡터에 의해 간단히 형질감염한다). 이어서, 형질감염된 세포를 통상적인 기술에 의해 배양하여 본 발명의 조작된 항체를 생성한다. 재조합 중쇄 및(또는) 경쇄 모두의 결합을 포함한 인간화 항체를 적절한 분석, 예컨대 ELISA 또는 RIA와 같은 적절한 분석에 의해 배양액으로부터 선별한다. 본 발명의 다른 변형된 항체 및 분자를 구축하기 위하여, 유사한 통상적인 기술을 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 구성에서 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적절한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈가 사용될 수도 있다. 사용되는 한 벡터는 pUC19이고, 이것은 아머샴 (Amersham) (영국 버킹엄쉬어) 또는 파르마시아 (Pharmacia) (스웨덴 업살라)와 같은 공급업자로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 추가로, 쉽게 복제될 수 있는 벡터는 다수의 클로닝 부위 및 선택가능한 유전자 (예를 들어, 항생물질 내성)을 갖고 있으며, 쉽게 조작되고 클로닝을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서의 제한 인자가 아니다.
유사하게, 본 발명에 따른 조작된 항체의 발현을 위해 사용되는 벡터는 임의의 통상적인 벡터로부터 당업자에 의해 선택될 수도 있다. 벡터는 또한, 선택된 숙주 세포에서 이종성 DNA 서열의 복제 및 발현을 지시하는 선택된 조절 서열 (예컨대 CMV 프로모터)을 함유한다. 이러한 벡터는 조작된 항체 또는 변형된 면역글로불린 코딩 영역을 코딩하는 상기 기재된 DNA 서열을 함유한다. 또한, 벡터는 용이한 조작을 위해 바람직한 제한효소 부위를 삽입함으로써 변형시킨 선택된 면역글로불린 서열을 포함할 수도 있다.
발현 벡터는 이종성 DNA 서열의 발현을 증폭시키기에 적절한 유전자, 예를 들어 포유동물 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 (DHFR)를 특징으로 할 수도 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은 예컨대 소 성장 호르몬 (BGH)의 폴리 A 시그날 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열 (betaglopro)을 포함한다. 여기에서 유용한 발현 벡터는 당 업자에게 공지된 기술에 의해 합성될 수도 있다.
이러한 벡터의 성분, 예를 들어 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 시그날 서열 등은 상업적 또는 자연 발생적 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 또는 선택된 숙주내에서 재조합 DNA의 산물의 발현 및(또는) 분비를 지시하기 위해 사용되는 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 포유동물, 세균, 곤충, 효모 및 진균 발현을 위해 당기술분야에 공지된 다수 유형의 기타 적절한 발현 벡터가 이 목적을 위해 선택될 수도 있다.
본 발명은 또한 조작된 항체 또는 그의 변형된 면역글로불린 분자의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질감염된 세포주를 포함한다. 클로닝 벡터의 클로닝 및 기타 조작을 위해 유용한 숙주 세포는 또한 종래의 것이다. 그러나, 가장 바람직하게는, 클로닝 벡터의 복제 및 본 발명의 변형된 항체의 구축에 있어서의 다른 단계를 위해서는 각종 이.콜라이 (E. coli) 균주 세포가 사용된다.
본 발명의 조작된 항체 또는 변형된 항체의 발현을 위해 적절한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 CHO, COS, 섬유아세포 (예, 3T3) 및 골수 세포, 더욱 바람직하게는 CHO 또는 골수 세포와 같은 포유동물 세포이다. 인간 세포를 사용할 수도 있으며, 따라서 분자가 인간 글리코실화 패턴으로 변형될 수 있다. 별법으로, 다른 진핵 세포주를 사용할 수도 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선택 및 형질전환, 배양, 증폭, 선별 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 상기 인용된 문헌 (Sambrook 등) 참조.
세균 세포는 본 발명의 재조합 Fab의 발현에 적절한 숙주 세포로서 유용한 것으로 입증될 수도 있다 (참조, 예를 들어 Pluckthun. A.,Immunol.Rev., 130: 151-188 (1992)). 그러나, 세균 세포내에서 발현된 단백질이 폴딩 (folding)되지 않거나 또는 부적절하게 폴딩된 형태로 존재하거나 또는 글리코실화되지 않은 형태로 존재하는 경향으로 인해, 세균 세포에서 생성되는 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유에 대해 스크리닝하여야 한다. 세균 세포에 의해 발현된 분자가 적절히 폴딩된 형태로 생성된다면, 세균 세포는 바람직한 숙주가 될 것이다. 예를 들면, 발현에 사용되는 이.콜리의 각종 균주는 생물공학 분야에서 숙주 세포로서 공지되어 있다. 비.섭틸리스 (B.subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 기타 바실러스 등의 각종 균주를 이 방법에서 또한 사용할 수도 있다.
원한다면, 당 업자에게 공지된 효모 세포의 균주는 숙주 세포로서 이용할 수도 있을 뿐만 아니라, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 및 레피도프테라 (Lepidoptera)와 같은 곤충 세포 및 바이러스 발현 시스템을 이용할 수도 있다.참조, 예를 들어 [Miller 등,Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) 및 여기에 인용된 참고문헌].
본 발명의 벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성하기 위해 필요한 형질감염 방법, 및 숙주 세포로부터 본 발명의 변형된 항체를 생성하기 위해 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술이다. 유사하게, 일단 생성된 후에, 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 당 기술분야의 표준 절차에 따라 본 발명의 변형된 항체를 세포 배양물로부터 정제할 수도 있다. 이러한 기술은 당 분야의 기술에 포함되며, 본 발명을 제한하지 않는다.
인간화 항체의 다른 발현 방법은 미국 특허 4,873,316호에 기재된 것과 같이, 트랜스제닉 동물에서의 발현을 이용할 수도 있다. 이는 동물의 카제인 프로모터를 사용하는 발현 시스템에 관한 것으로, 포유동물내에 트랜스진으로 혼입될 때, 암컷이 우유중에 원하는 재조합 단백질을 생성할 수 있다.
원하는 방법에 의해 일단 발현되면, 조작된 항체를 적절한 분석법을 사용하여 시험관내 활성을 시험한다. 조작된 항체의 IL-18에 대한 정성 및 정량적 결합을 평가하기 위하여, 현재 통상적인 ELISA 분석 형태가 사용된다. 추가로, 일반적인 제거 메카니즘에도 불구하고, 신체내에서 조작된 항체의 지속성을 평가하기 위해 수행되는 연속된 인체 임상 연구에 앞서서, 하기 위해 다른 시험관내 분석을 사용하여 중화 효능을 입증할 수 있다.
인간화 항체를 제조하기 위해 기재된 일반적인 절차에 따라서, 당업자라면기타 공여 IL-18 항체, 가변 영역 서열 및 여기에 기재된 CDR 펩티드로부터 인간화 항체를 구축할 수도 있다. 조작된 항체의 수용 항체가 "자신"으로 가능하게 인식하는 가변 영역 프레임워크를 사용하여 조작된 항체를 생성할 수 있다. 수용체에 대해 면역원성이 인식할 수 있을 정도로 증가되지 않는다면 가변 영역 프레임워크를 약간 변형시켜 항원 결합을 크게 증가시킬 수 있다. 이러한 조작된 항체는 인간의 IL-18 매개 질병을 효과적으로 치료할 수 있다. 이러한 항체는 또한 질병의 진단에서 유용할 수도 있다.
VII. 치료/예방 용도
본 발명은 또한, 본원에 기재된 조작된 항체 또는 변형된 항체의 하나 이상 또는 그의 단편을 포함하는 항체의 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는, MS와 같은 자가면역 관련 증후군을 경험한 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 분자의 사용에 의해 유도되는 치료 반응은 인간 IL-18에 대한 결합과 이에 따른 Th1 자극을 차단으로써 발생한다. 따라서, 본 발명의 분자는 치료 용도에 적절한 제제 및 제형으로 사용될 때, MS, RA, IDDM, IBD 및 건선과 같은 자가면역 질환 (이에 한정되지는 않음)을 앓고 있는 환자에게 매우 바람직하다.
본 발명의 변형된 항체, 항체 및 그의 단편은 다른 항체들, 특히 본 발명의 조작된 항체가 대항하는 질병의 원인이 되는 다른 마커 (에피토프)와 반응성인 인간 mAb와 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 치료제는 약 2 일 내지 6 개월동안 또는 필요에 따라 자가면역 질환의 치료에 바람직한 것으로 생각된다. 예를 들면, MS 등을 치료할 때에는 더욱긴 치료기간이 요망될 수도 있다. 투여량 및 치료 기간은 인체 순환에서 본 발명의 분자의 상대적 지속시간에 관련되며, 치료되는 상태 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 당업자가 조정할 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에 약물을 전달하는 적절한 경로일 수 있다. 본 발명의 변형된 항체, 항체, 조작된 항체, 및 그의 단편, 및 제약학적 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내 또는 비내 투여에 유용하다.
본 발명의 치료제는 제약학적으로 허용가능한 담체내에 활성 성분으로서 본 발명의 조작된 (예를 들어, 인간화) 항체의 유효량을 함유하는 제약학적 조성물로서 제조할 수도 있다. 본 발명의 예방 약제에서, 바람직하게는 생리적 pH로 완충된 조작된 항체를 함유하는, 주사용으로 준비된 형태의 수성 현탁액 또는 용액이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 조성물은 통상 본 발명의 조작된 항체의 용액 또는 제약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체내에 용해된 그의 혼합액을 포함한다. 예를 들어 0.4 % 염수, 0.3 % 글리신 등과 같은 각종 수성 담체를 사용할 수도 있다. 이러한 용액들은 무균성이고 일반적으로 입상물질을 함유하지 않는다. 이러한 용액들은 통상적으로 공지된 살균 기술 (예, 여과)에 의해 살균할 수도 있다. 조성물은 생리적 조건을 맞추기 위해 요구되는 pH 조절 및 완충제 등과 같은 제약학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수도 있다. 제약학적 제형내에서 본 발명의 항체 농도는 넓게, 즉 약 0.5 % 미만, 통상 약 1 % 이상에서 많으면 15 또는 20 중량%까지 변할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 방식에 따라서 주로 유체 부피, 점도 등을 기준으로 하여 선택된다.
따라서, 1 ㎖ 멸균 완충수를 함유하고, 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 조작된 항체를 함유하는, 근육내 주사를 위한 본 발명의 제약학적 조성물을 제조할 수 있다. 유사하게, 약 250 ㎖의 멸균 링거 용액, 및 약 1 내지 약 30, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25mg의 본 발명의 조작된 항체를 함유하도록, 정맥내 주사를 위한 본 발명의 제약학적 조성물을 만들 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 공지되어 있거나 당업자에게 명백하며, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 제 15 판, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 치료제는 제약학적 제제에서 사용될 때 단위 투여 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 적절한 치료적으로 유효한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 인간 또는 다른 동물에서의 염증성 질환을 효과적으로 치료하기 위하여, 본 발명의 단백질 또는 항체를 체중 70 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg의 1회 투여량으로 비경구적으로, 바람직하게는 정맥내 또는 근육내 투여하여야 한다. 필요하다면, 이러한 투여량을 질병 기간동안에 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복할 수도 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 조작된 항체를, 예컨대 IL-18 매개 질환을 결정하거나 이러한 질환의 치료 진행 상황을 추적하기 위한 진단법에 사용할 수도 있다. 혈청, 혈장 또는 기타 적절한 조직내에서의 IL-18 수준을 측정하거나 또는 배양액중에서 인간 세포에 의한 분비를 측정하기 위하여, ELISA 및 기타 통상적인 분석 형태에서의 사용을 위해 이러한 변형된 항체를 진단 시약으로서 통상적으로 표지화할 수도 있다. 변형된 항체가 사용되는 분석의 특징은 통상적이며 본 발명의 개시내용을 제한하지 않는다.
따라서, 본 발명의 하나의 구현양태는, 환자로부터 수득된 시료 (혈장 또는 조직)내의 인간 IL-18의 양을 결정하고, 상기 결정된 양을 정상 집단중의 인간 IL-18의 평균 양과 비교하는 단계를 포함하는, 환자에서 자가면역 질환 및 과다한 Th1 T 세포 생성과 연관된 기타 질병의 진단을 보조하는 방법에 관한 것이며, 이때 환자의 시료중에 상당히 높은 양의 IL-18이 존재하는 것은 자가면역 질환 및 과다한 Th1 T 세포 생성과 연관된 기타 질병을 암시한다.
본원에 기재된 항체, 변형된 항체 또는 그의 단편을 보관을 위해 동결건조하고 사용하기 전에 적절한 담체중에서 재구성시킬 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린에서 효과적인 것으로 나타났으며, 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
하기 실시예들은 일례의 조작된 항체의 구축 및 적절한 벡터와 숙주 세포에서의 그의 발현을 포함한 본 발명의 다양한 측면을 예시하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 모든 아미노산들은 통상적인 3개 문자 또는 단일 문자 코드에 의해 표시된다. 모든 필요한 제한 효소, 플라스미드 및 기타 시약과 물질들은 다른 지시가 없는 한 상업적인 원료로부터 수득되었다. 모든 일반적인 클로닝 라이게이션 및 기타 재조합 DNA 방법은 상기 인용된 문헌 [T.Maniatis 등의 문헌 또는 그의 제 2 판 (1989), 동일 출판업자에 의한 Sambrook 등의 문헌]에 기재된 바와 같이 수행되었다.
실시예 1 - IL-18에 대한 mAb의 생성
A. 모노클로날 항체 발생
마우스 (Balb/c 및 C57BL/6의 F1 하이브리드) 또는 랫트 (스프라그 돌리)를 면역보강제중의 30 ㎍ 재조합 IL-18로 면역화하고, 4 주 후에 면역보강제중의 30 ㎍ IL-18로 면역화하였다. IL-18에 대한 혈청 항체의 양호한 역가를 기준으로 하여, 동물을 10 내지 30 ㎍ IL-18로 추가로 면역화하였다 (염수중에 복강내 투여). 3 일 후에 최종 면역화하고 비장절제술을 수행하였다. 마우스 또는 랫트 비장 세포를 사용하여 표준 절차에 의해 하이브리도마를 제조하였다 (Zola, H.Ed., Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc. 1987). 제한 희석법으로 양성 하이브리도마를 클로닝하였다.
B. mAb의 정제
제조업자의 지시에 따라 ProsepA (바이오 프로세싱 (Bio Processing), 영국 콘세트) 크로마토그래피로 mAb를 정제하였다. mAb는 SDS-PAGE로 95 % 이상 순수한 것으로 나타났다.
C. mAb의 이소형 결정
모든 랫트 및 마우스 mAb를 통상적으로 이용가능한 키트 (지메드 (Zymed), 아머샴 (Amersham))로 이소형을 결정하였으며 IgG1 카파인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2- 분석
A. IL-18의 바이오티닐화
10:1 비율의 바이오티닐화 시약을 사용하여 몰레큘러 프로브 인코포레이티드 (Molecular Probes Inc.)에서 구입한 키트를 사용하여 IL-18을 바이오티닐화하였다. 바이오티닐화는 IL-18의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않았다.
B. 하이브리도마 스크리닝 분석
96-웰 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 스트렙타비딘 (PBS 중 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/웰)로 코팅하였다. 용액을 흡인시키고, 비특이적 결합 부위를 TBS 완충액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.02 % Kathon, pH 7.4)중의 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 250 ㎕/웰로 실온에서 5 내지 60 분동안 블로킹하였다. 각각의 단계 이후에, 플레이트를 세척 완충액 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween 20, 0.02 % Kathon, pH 7.4)중에서 4회 세척하였다. 각각의 웰에, 분석 완충액 (TBS 완충액중의 0.5 % BSA, 0.05 % 소 감마 글로블린, 0.01 % 트윈 40, 20 μM 디에틸렌트리아민펜타아세트산)중의 100 ㎕ 바이오틴 IL-18 (100 ng/㎖)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분동안 회전 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 50 ㎕ 하이브리도마 배지 및 50 ㎕ 분석 완충액을 첨가하고, 회전 인큐베이터에서 실온에서 60 분동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 분석 완충액중의 100 ㎕ 0.5㎍/㎖ Eu3+표지된 항-마우스 또는 항-랫트 항체를 첨가하였다. 마지막으로, 200 ㎕/웰의 인핸서 (왈락 (Wallac))를 첨가하고, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하고, 시간-분석된 형광을 측정하였다. 100 K가 넘는 수를 가진 하이브리도마를 24-웰플레이트내로 확장시켰다.
C. 면역분석
항-IL-18 mAb의 특이성을 결정하기 위하여, 96-웰 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 코팅하고, 블로킹하고 바이오틴 IL-18로 인큐베이션하였다. 하기 모든 인큐베이션을 실온에서 회전 인큐베이터에서 수행하였다. 웰을 세척한 후에, 50 ㎕ IL-18 (3 ㎍/㎖) 또는 분석 완충액 및 50 ㎕ Mab를 첨가하고 60 분동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 후에, 분석 완충액중의 100 ㎕ 0.5 ㎍/㎖ Eu3+표지된 항-마우스 또는 항-랫트 항체를 60 분동안 첨가하고, 웰을 세척한 다음, 100 ㎕/웰의 인핸서 (왈락 (Wallac))를 첨가하고, 실온에서 5 분동안 인큐베이션하고, 시간-분석된 형광을 측정하였다. 모든 양성 하이브리도마는 IL-18의 결합이 치환되었음을 나타내었다.
D. 중화 분석
건강한 공여체로부터의 PBMC를 피콜-파크 (Ficol-Paque) (파르마시아) 구배에 의해 단리하고, IL-18 (5 ng/㎖) 및(또는) mAb의 존재하에서 1 ㎍/㎖ ConA (시그마) 함유 10 % FBS DMEM/F12 배지내의 96 웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 37 ℃, 공기중 5 % CO2, 90 % 습도에서 18 시간 배양후에, 25 ㎕ 배지를 제거하고 인터페론 감마 (IFNg) 농도를 면역분석법으로 측정하였다. 3번의 실험의 평균으로부터 얻어진 결과를 표 1에 요약한다.
E. 모노클로날 항체의 친화성 측정
정제된 mAb의 친화성을 30㎕/분의 유량을 사용하여 BIA코어 광학 바이오센서 (파르마시아 바이오센서, 스웨덴 업살라)로 측정하였다. 앞서 기재되고 본원에서 참고문헌으로 인용된 문헌 [Karlsson등,J.Immunol.Meth., 145:229-240 (1991)]에 기재된 연관성을 이용하여 키네틱 데이타를 평가하였다. mAb (HBS 완충액으로 희석함, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.01 % 트윈-20, pH 7.4)를 토끼 항-마우스 IgG Fc 또는 염소 항-랫트 IgG Fc 표면에 주입한 다음, 완충액을 유동시키고 RU를 기록하였다. IL-18 (HBS 완충액으로 희석함)을 180 초동안 주입한 다음, 500 초동안 완충액을 유동시키고, RU를 기록하였다. 0.1 M 인산을 주입하여 센서 칩 표면을 재생시켰다. BIA코어 소프트웨어를 사용하여 결합의 온-속도 (on-rate) (Kass) 및 오프-속도 (off-rate) (Kdiss)를 계산하였으며, 이들은 함께 mAb 13G9에 대해 12 × 10-9M, mAb 2C10에 대해 3.9 × 10-11M 및 mAb 14B7에 대해 1.5 × 10-10M의 평형 상수 (K) 계산치를 산출하였다. 표 1 참조.
F. 모노클로날 항체의 에피토프 분석
정제된 mAb의 에피토프 분석을 BIA 코어에서 측정하였다. 10 ㎕/분의 유량을 사용하여, 첫번째 Mab (HBS 완충액에 희석됨)를 토끼 항-마우스 IgG Fc 또는 염소 항-랫트 IgG Fc 표면에 주입한 다음, IL-18을 240초 동안 주입하고, 블로킹된 mAb를 48초 동안 주입하고 두번째 Mab를 240 초동안 주입하였다. 0.1 M 인산의 주입에 의해 표면을 재생시키고, 각각의 주입 후에 RU를 기록하였다. mAb 13G9, 2C10 및 14B7은 유사하거나 중복되는 에피토프를 갖는 것으로 밝혀졌다.
인간 IL-18과 반응성인 mAb의 친화성 및 중화 활성
mAb Kd(pM)a 중화 IC50 (nM)b
2C10 (랫트) 39 0.1
14B7 (랫트) 150 0.2
13G9 (마우스) 12000 3.0
a 광학 바이오센서 (BIA코어) 분석 (25℃)에 의해 결정됨b 5 ng/㎖ 인간 IL-18에 대한 반응에서 PBMC의 IFN 감마 생성 (nM)의 억제
실시예 3 - CDR 서열
유전자 클로닝 및 서열 분석:
하기에 간략하게 기술된 표준 분자 생물학적 방법을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 가변 중쇄 및 경쇄 유전자를 클로닝하였다. 제조업자의 설명서에 따라 TRIzol 시약 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) Cat. #15596-026)을 사용하여 하이브리도마 세포로 부터 전체 RNA를 단리하였다. 프라이밍을 위해 폴리-dT 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제조업자의 지시 (뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) Cat. No. 1483-188)에 따라 RT-PCR 키트로 RNA를 역 전사시켰다. 첫번째 스트랜드 cDNA를 합성한 후, 3' 불변 영역 특이적 프라이머 및 다의성 5' 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄 V 영역을 PCR 증폭시켰다. 가변 중쇄 또는 경쇄 영역의 미리 결정된 N 말단 아미노산 서열을 코딩하도록 다의성 5' 프라이머 서열을 고안하였다. 각각의 PCR 증폭으로부터 다수 클론의 전체 길이 서열을 수득하고, 정렬하여 컨센서스 서열을 제공하였다. 따라서, 중쇄 및 경쇄 양쪽에 대한 DNA 서열의 처음 17개 염기는 PCR 프라이머로 생성되지만, 번역된 단백질 서열은 천연 서열이다.
하이브리도마 항체 2C10, 13G9 및 14B7에 대한 뉴클레오티드 및 추정된 아미노산 서열을 도 1 내지 도 6에 나타낸다. 각각의 경우에, CDR 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 박스로 나타낸다. 다의성 프라이머 서열은 굵게 나타낸다.

Claims (26)

  1. 인간 인터루킨-18에 대해 특이적이며, 해리 상수가 약 3.9 × 10-11M 이하인 것을 특징으로 하는 결합 친화성을 갖는 설치류 중화 모노클로날 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 랫트 모노클로날 항체인 모노클로날 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 뮤린 모노클로날 항체인 모노클로날 항체.
  4. 제 2 항에 있어서, 서열번호 1의 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 9의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  5. 제 3 항에 있어서, 서열번호 17의 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 25의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  6. 제 2 항에 있어서, 서열번호 33의 경쇄 아미노산 서열 및 서열번호 41의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 모노클로날 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 2C10, 14B7 또는 13G9의 동정 특징을 갖는 모노클로날 항체.
  8. 제 4 항의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마.
  9. 제 5 항의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마.
  10. 제 6 항의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마.
  11. 세포주 19522C10(2)F2(1)A1, 195214B7(1)H10 및 187413G9(3)F12의 동정 특징을 갖는 하이브리도마.
  12. 제 1 항의 모노클로날 항체의 Fc 영역을 결실시킴으로써 생성되는, 중화 Fab 단편 또는 그의 F(ab')2단편.
  13. 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 (framework) 영역이 적어도 하나의 선택된 항체로부터 유래되고, 각각의 상기 쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산 서열이 제 1 항의 모노클로날 항체로부터 유래되는 것인 변형된 항체.
  14. (a) 서열번호 3
    (b) 서열번호 5
    (c) 서열번호 7
    (d) 서열번호 19
    (e) 서열번호 21
    (f) 서열번호 23
    (g) 서열번호 35
    (h) 서열번호 37
    (i) 서열번호 39
    로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR).
  15. (a) 서열번호 11
    (b) 서열번호 13
    (c) 서열번호 15
    (d) 서열번호 27
    (e) 서열번호 29
    (f) 서열번호 31
    (g) 서열번호 43
    (h) 서열번호 45
    (i) 서열번호 47
    로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR).
  16. 제 14 항의 면역글로불린 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 핵산 분자.
  17. 제 15 항의 면역글로불린 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 핵산 분자.
  18. 제 13 항의 변형된 항체 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  19. 제 13 항의 변형된 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환과 관련된 질병의 치료 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 질병이 다발성 경화증인 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 질병이 류마티스성 관절염 유형 1 또는 인슐린 의존성 당뇨병인 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 질병이 염증성 장 질환인 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 질병이 건선인 방법.
  24. 인간 인터루킨-18에 대해 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 코딩하고, 임의로 제한효소 부위를 함유하는,
    (a) 제 13 항의 변형된 항체를 코딩하는 핵산 서열
    (b) (a)에 상보성인 핵산 서열, 및
    (c) 상기 (a) 또는 (b)의 단편 또는 유사체
    로 구성된 군에서 선택되는 단리된 핵산 서열.
  25. 환자의 생체액 시료를 수득하고, IL-18/모노클로날 항체 결합체가 형성될 수 있도록 하는 조건하에서 제 1 항의 모노클로날 항체를 상기 시료와 접촉시키고, 상기 IL-18/모노클로날 항체 결합체의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 인간에서 인간 IL-18의 존재 또는 부재를 평가하는 방법.
  26. 제 25 항의 방법에 따라 환자의 시료중의 인간 IL-18의 양을 결정하고 이것을 정상 집단에서 인간 IL-18의 평균 양과 비교하는 단계를 포함하며, 이때 환자에서 인간 IL-18이 상당히 상승된 양으로 존재하는 것이 자가면역 질환의 징후가 되는 것인, 자가면역 질환의 진단을 보조하는 방법.
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