PL202396B1 - Neutralizujące przeciwciało monoklonalne szczurze, kwas nukleinowy kodujący to przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała lub fragmentu neutralizującego tego przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia stanów w których uczestniczy IL-18 - Google Patents

Abstract

Wynalazek dostarcza neutralizuj acego monoklonalnego przeciwcia la szczurzego specyficznego dla ludzkiej interleukiny-18 oraz kompozycji farmaceutycznej zawieraj acej to przeciwcia lo, a tak ze zastosowania tego przeciwcia la lub neutralizujacego fragmentu, do leczenia chorób o pod lo zu auto- immunologicznym. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest neutralizujące przeciwciało monoklonalne szczurze, kwas nukleinowy kodujący to przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie przeciwciała lub fragmentu neutralizującego tego przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia stanów w których uczestniczy IL-18.

Ludzka interleukina-18 jest ostatnio zidentyfikowaną cytokiną, która jest syntetyzowana w postaci nieaktywnego biologicznie białka prekursorowego o długości 193 aminokwasów (Ushio i in., J. Immunol. 156: 4274, 1996). Rozszczepienie białka prekurosorowego, na przykład przez kaspazę-1 lub kaspazę-4, uwalnia dojrzałe białko o długości 156 aminokwasów (Gu i in., Science 275: 206, 1997; Ghayur i in., Nature 386, 619, 1997), które wykazuje aktywności biologiczne obejmujące kostymulację proliferacji komórek T, wzmacnianie cytotoksyczności komórek NK, indukcję wytwarzania IFN-γ przez komórki T i komórki NK oraz wzmacnianie różnicowania komórek pomocniczych T typu 1 (Th1) (Okamura i in., Nature 378: 88, 1995; Ushio i in., J. Immunol. 156, 4274, 1996; Micallef i in., Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Kohno i in., J. Immunol. 158, 1541, 1997; Zhang i in., Infect. Immunol. 65: 3594, 1997; Robinson i in., Immunity 7: 571, 1997). Ponadto, IL-18 jest skutecznym induktorem prozapalnych mediatorów ludzkich monocytów, obejmujących IL-8, czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α) oraz prostaglandynę E2 (PGE2) (Ushio, S. i in., J. Immunol. 156: 4274-4279, 1996; Puren, A.J. i in., J. Clin. Invest. 10: 711-721, 1997; Podolin i in., J. Immunol., zgłoszone, 1999).

Sklonowane uprzednio białko zbliżone do receptora IL-1 (IL-1Rrp) (Parnet i in., J. Biol. Chem. 271: 3967, 1996) zidentyfikowano ostatnio jako podjednostkę receptora IL-18 (Kd = 18 nM) (Torigoe i in., J. Biol. Chem. 272: 25737, 1997). Druga podjednostka receptora IL-18 wykazuje homologię do białka pomocniczego receptora IL-1 i nazwano ją AcPL (od białka podobnego do białka pomocniczego). Do indukowanej IL-18 aktywacji NF-kB i JNK wymagana jest ekspresja zarówno IL-Rrp, jak i AcPL (Born i in., J. Biol. Chem. 273: 29445, 1998). Poza NF-kB i JNK, IL-18 przekazuje sygnały poprzez kinazę związaną z receptorem IL-1 (IRAK), p561ck (LCK) oraz kinazę białkową aktywowaną mitogenami (MAPK) (Micallef i in., Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Matsumoto i in., Biophys. Biochem. Res. Comm. 234: 454, 1997; Tsuji-Takayama i in., Biochem. Biophys. Res. Comm. 23 7: 12 6, 1997).

Komórki Th1, które wytwarzają cytokiny prozapalne, takie jak IFN-γ, IL-2 i TNF-β (Mosmann i in., J. Immunol. 136: 2348, 1986), biorą udział w wielu chorobach autoimmunologicznych, włącznie ze stwardnieniem rozsianym (MS), reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), cukrzycą typu 1, czyli insulinozależną (IDDM), zapalną chorobą jelit (IBD) oraz łuszczycą (Mosmann i Sad, Immunol. Today 17: 138, 1996). A zatem, można oczekiwać, że antagonizm wobec cytokiny indukującej Th1, takiej jak IL-18, będzie hamował rozwój choroby. Jako antagonistę można stosować specyficzne wobec IL-18 przeciwciała monoklonalne.

Wykazano udział IL-18 w rozwoju chorób autoimmunologicznych. Stwierdzono, że ekspresja IL-18 jest zasadniczo podwyższona w trzustce i śledzionie nieotyłych myszy z cukrzycą (NOD) bezpośrednio przed wystąpieniem choroby (Rothe i in., J. Clin. Invest. 99: 469, 1997). Podobnie, wykazano, że poziomy IL-18 były znacznie podwyższone w płynie maziowym pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (Kawashima i in., Arthritis and Rheumatism 39: 598, 1996). Ponadto, wykazano, że podawanie IL-18 pogarsza kliniczny przebieg doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy, choroby autoimmunologicznej przebiegającej z udziałem Th1, która stanowi model stwardnienia rozsianego. Ponadto, wykazano, że neutralizująca antysurowica skierowana przeciw IL-18 szczura zapobiega rozwojowi EAE u samic szczurów Lewis (Wildbaum i in., J. Immunol. 161: 6368, 1998). A zatem, IL-18 jest pożądanym celem przy opracowywaniu nowych leków na choroby autoimmunologiczne.

Taniguchi i in., J. Immunol. Methods 206: 107, opisują siedem przeciwciał monoklonalnych myszy i sześć szczura, skierowanych przeciw IL-18 człowieka, które wiążą się z odrębnymi miejscami antygenowymi. Jedno z mysich przeciwciał monoklonalnych (numer 125-2H) oraz sześć przeciwciał monoklonalnych szczura hamuje indukowane IL-18 wytwarzanie IFN-γ przez komórki KG-1, przy czym sześć przeciwciał monoklonalnych szczura wykazuje 10-krotnie niższe aktywności neutralizujące, niż przeciwciało numer 125-2H. Jak wykazano poprzez analizę metodą blottingu typu Western, trzy z przeciwciał myszy - mAbs, ale żadne z mAbs szczura nie wykazuje silnej reaktywności wobec związanej z błoną IL-18 człowieka. Opisano ponadto enzymatyczne oznaczenie immunosorbcyjne (ELISA) do wykrywania IL-18 człowieka z wykorzystaniem przeciwciała numer 125-2H i mAb szczura. Granica wykrywalności w tym oznaczeniu ELISA wynosi około 10 pg/ml.

PL 202 396 B1

Europejskie zgłoszenie patentowe numer EP 0 712 931 ujawnia dwa przeciwciała monoklonalne myszy skierowane przeciw IL-18 człowieka, H1 (IgG1) oraz H2 (IgM). Jak wykazano poprzez analizę przez blotting typu Western, oba przeciwciała monoklonalne reagują ze związaną z błoną IL-18 człowieka, ale nie ze związaną z błoną IL-12. H1 wykorzystuje się w procedurze chromatografii immunopowinowactwa do oczyszczania IL-18 człowieka oraz w ELISA do pomiaru ilości IL-18 człowieka. H2 wykorzystuje się w oznaczeniu radioimmunologicznym do pomiaru ilości IL-18 człowieka.

Neutralizujące przeciwciała skierowane przeciw IL-18 mogą być potencjalnie użyteczne w łagodzeniu chorób autoimmunologicznych i związanych z nimi objawów u człowieka. Dlatego też istnieje zapotrzebowanie w tej dziedzinie na antagonistę IL-18 o wysokim powinowactwie, takiego jak neutralizujące przeciwciało skierowane przeciw interleukinie-18 człowieka, który mógłby zmniejszać różnicowanie i proliferację Th1, a zatem łagodzić choroby autoimmunologiczne i związane z nimi objawy.

Przedmiotem wynalazku jest zatem neutralizujące monoklonalne przeciwciało szczurze specyficzne dla ludzkiej interleukiny-18 lub jego fragment, charakteryzujące się tym, że zawiera region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr: 9.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, neutralizują ce przeciwciał o jest humanizowanym przeciwciałem zawierającym następujące regiony determinujące komplementarność (CDR);

CDRL1 o sekwencji SEQ ID nr: 4

CDRL2 o sekwencji SEQ ID nr: 6

CDRL3 o sekwencji SEQ ID nr: 8

CDRLH1 o sekwencji SEQ ID nr: 12

CDRLH2 o sekwencji SEQ ID nr: 14

CDRLH3 o sekwencji SEQ ID nr: 16

W innym korzystnym wykonaniu neutralizujące przeciwciało jest chimerycznym przeciwciałem zawierającym region zmienny łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała jak zdefiniowano powyżej.

Korzystnie, neutralizujące przeciwciało według wynalazku stanowi jego neutralizujący fragment Fab lub jego dalszy fragment - F(ab')2.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas nukleinowy kodujący przeciwciało według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kolejno, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub fragmentu neutralizującego Fab lub F(ab')2 według wynalazku, do wytwarzania leku do leczenia stanów wybranych z grupy obejmującej chorobę autoimmunologiczną, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzycę typu 1, czyli insulinozależną, chorobę zapalną jelit i łuszczycę.

W wynalazku opracowano neutralizujące przeciwciała monoklonalne gryzoni (np. szczura i myszy) specyficzne wobec ludzkiej interleukiny-18 i posiadające powinowactwo wiązania charakteryzujące się stałą dysocjacji równą lub niższą od około 3,9 x 10^-11 M.

Przykładami takich przeciwciał monoklonalnych są przeciwciało monoklonalne 2C10 szczura oraz przeciwciała monoklonalne myszy, takie jak 14B7 i 13G9. Mogą to być także hybrydomy, takie jak 19522C10(2)F2(1) A1, 195214B7(1)H10 i 187413G9(3)F12.

Specyficzne wobec interleukiny-18 człowieka neutralizujące fragmenty Fab i fragmenty F(ab')2, według wynalazku utworzone są przez delecję regionu Fc neuralizujących monoklonalnych przeciwciał gryzoni.

Neutralizujące przeciwciało według wynalazku może też być zmienionym przeciwciałem specyficznym wobec interleukiny-18 człowieka, które zawiera regiony determinujące komplementarność (CDR) pochodzące z neutralizującego przeciwciała monoklonalnego (mAb) gatunku nie będącego człowiekiem, charakteryzujące się stałą dysocjacji równą lub niższą od około 3,9 x 10^-11 M wobec interleukiny-18 człowieka, oraz kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych. Jeśli zmienionym przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane, sekwencje, które kodują regiony determinujące komplementarność (CDR) z immunoglobuliny gatunku nie będącego człowiekiem wstawia się do pierwszej składowej immunoglobulinowej, w której co najmniej jeden, a korzystnie wszystkie regiony determinujące komplementarność(CDR) pierwszej składowej immunoglobulinowej zastąpiono CDR z przeciwciała monoklonalnego gatunku nie będącego człowiekiem. Korzystnie, pierwsza składowa immunoglobulinowa

PL 202 396 B1 połączona jest w sposób umożliwiający działanie z drugą składową immunoglobulinowa, która zawiera całość lub część stałego łańcucha immunoglobuliny.

Niniejszy wynalazek zapewnia CDR pochodzące z neutralizującego przeciwciała monoklonalnego (mAb) gatunku nie będącego człowiekiem, charakteryzujące się stałą dysocjacji równą lub niższą od 3,9 x 10^-11 M wobec interleukiny-18 człowieka, oraz cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące takie CDR.

W jeszcze innym aspekcie, zapewnia się przeciwciał o chimeryczne, zawieraj ą ce regiony stał e ciężkich i lekkich łańcuchów człowieka oraz regiony zmienne ciężkich i lekkich łańcuchów pochodzące z neutralizujących przeciwciał monoklonalnych gatunku nie będącego człowiekiem, charakteryzujące się stałą dysocjacji równą lub niższą od 3,9 x 10^-11 M wobec interleukiny-18 człowieka.

W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną , która zawiera jedno (lub więcej) z opisanych powyżej zmienionych przeciwciał oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku można wytworzyć lek do leczenia u człowieka stanów związanych z nadmiernym wytwarzaniem Th1, na przykład do leczenia chorób autoimmunologicznych. W takim przypadku skuteczne jest podawanie wspomnianemu człowiekowi skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej według wynalazku.

Neutralizujące monoklonalne przeciwciała według wynalazku wytwarza się za pomocą rekombinacyjnych technik wytwarzania zmienionych przeciwciał (np. technikami inżynierii genetycznej przeciwciał, CDR, fragmentów Fab lub F(ab)2 lub ich analogów), które pochodzą z neutralizujących przeciwciał monoklonalnych (mAb) gatunku nie będącego człowiekiem, charakteryzujących się stałą dysocjacji równą lub niższą od 3,9 x 10^-11 M dla IL-18 człowieka. Składniki te obejmują kodujące je wyizolowane sekwencje kwasów nukleinowych pod kontrolą wybranych sekwencji regulujących, które są zdolne do kierowania ich ekspresją w stransfekowanych zrekombinowanymi plazmidami komórkach gospodarza (korzystnie ssaczych). Sposób wytwarzania obejmuje hodowanie linii stransfekowanych komórek gospodarza w takich warunkach, że zmienione przeciwciało, korzystnie przeciwciało humanizowane, ulega ekspresji w tych komórkach, oraz izolowanie z nich ulegającego ekspresji produktu.

W oparciu o przeciwciała według wynalazku możliwe jest też realizowanie metody diagnozowania stanów związanych z nadmiernym wytwarzaniem Th1 u człowieka, która obejmuje otrzymywanie próbki płynu biologicznego pacjenta i umożliwianie wchodzenia w kontakt z próbką przeciwciał i zmienionych przeciwciał według niniejszego wynalazku w takich warunkach, że tworzy się kompleks IL-18/przeciwciało (monoklonalne lub zmienione), a następnie wykrywa się obecność lub brak kompleksu IL-18/przeciwciało.

Wynalazek został zilustrowany następującymi rysunkami.

Fig. 1 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2] przedstawia region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała 2C10 szczura. Fig. 1 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3-8]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Fig. 2 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10] przedstawia region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała 2C10 szczura. Fig. 2 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11-16]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Fig. 3 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 17 i 18] przedstawia region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała 13G9 myszy. Fig. 3 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19-24]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Fig. 4 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 25 i 26] przedstawia region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała 13G9 myszy. Fig. 4 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 27-32]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Fig. 5 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 33 i 34] przedstawia region zmienny łańcucha lekkiego przeciwciała 14B7 szczura. Fig. 5 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 35-40]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Fig. 6 [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 41 i 42] przedstawia region zmienny łańcucha ciężkiego przeciwciała 14B7 szczura. Fig. 6 zawiera dane o sekwencji obu nici. Obszary w ramkach

PL 202 396 B1 wskazują CDR [sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 43-48]. Obszar pogrubiony wskazuje zdegenerowaną sekwencję startera.

Niniejszy wynalazek dostarcza szereg przeciwciał, zmienionych przeciwciał i ich fragmentów, które charakteryzują się specyficznością wiązania IL-18, aktywnością neutralizującą oraz wysokim powinowactwem wobec IL-18, czego przykładem jest przeciwciało monoklonalne 2C10 szczura, przeciwciało monoklonalne 13G9 myszy oraz przeciwciało monoklonalne 14B7 szczura. Przeciwciała według niniejszego wynalazku przygotowano stosując konwencjonalne techniki hybrydom do tworzenia nowych przeciwciał neutralizujących. Produkty te są użyteczne w terapeutycznych i farmaceutycznych kompozycjach do leczenia zaburzeń, w których uczestniczy IL-18, np. chorób autoimmunologicznych, włącznie ze stwardnieniem rozsianym (MS), reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), cukrzycą typu 1, czyli insulinozależną (IDDM), zapalną chorobą jelit (IBD) oraz łuszczycą (Mosman i Sad, Immunol. Today 17: 138, 1996). Produkty te są również użyteczne w diagnozowaniu stanów, w których uczestniczy IL-18 przez pomiar (np. enzymatyczne oznaczenie immunosorbcyjne (ELISA)) poziomów endogennej IL-18 u ludzi bądź IL-18 uwalnianej ex vivo z aktywowanych komórek.

I. Definicje „Zmienione przeciwciało” odnosi się do białka kodowanego przez zmieniony region kodujący immunoglobulinę, które można otrzymać przez ekspresję w wybranej komórce gospodarza. Takimi zmienionymi przeciwciałami są utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała (np. przeciwciała chimeryczne lub humanizowane) lub fragmenty przeciwciał pozbawione całości lub części stałego regionu immunoglobuliny, np. Fv, Fab lub F(ab)2 i podobne.

„Zmieniony region kodujący immunoglobulinę” odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego zmienione przeciwciało według wynalazku. Jeśli zmienionym przeciwciałem jest przeciwciało z CDR przeniesionym z innego przeciwciała lub humanizowane, sekwencje, które kodują regiony determinujące komplementarność (CDR) z immunoglobuliny gatunku nie będącego człowiekiem wstawia się do pierwszej składowej immunoglobulinowej, zawierającej ludzkie zmienne sekwencje zrębu. Ewentualnie, pierwszą składową immunoglobulinową łączy się w sposób umożliwiający działanie z drugą składową immunoglobulinową.

„Pierwsza składowa immunoglobulinowa” odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego ludzki zrąb lub ludzki region zmienny immunoglobuliny, w którym natywne (lub występujące naturalnie) regiony kodujące CDR zastępuje się regionami kodującymi CDR przeciwciała donorowego. Ludzkim regionem zmiennym może być łańcuch ciężki, łańcuch lekki (lub oba łańcuchy) immunoglobuliny, bądź ich analogi lub funkcjonalne fragmenty. Takie regiony CDR, położone w zmiennym regionie przeciwciał (immunoglobulin) można określać metodami znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, Kabat i in. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 4, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) ujawniają zasady lokalizowania CDR. Ponadto, znane są programy komputerowe, które są użyteczne do identyfikowania regionów/struktur CDR.

„Neutralizujące” odnosi się do przeciwciała, które hamuje aktywność IL-18 przez zapobieganie wiązania IL-18 człowieka z jej specyficznym receptorem lub przez hamowanie przekazywania sygnałów IL-18 poprzez jej receptor, chociaż wiązanie zachodzi. Przeciwciało monoklonalne jest neutralizujące, jeśli jest skuteczne w 90%, korzystnie skuteczne w 95%, a najkorzystniej skuteczne w 100% pod względem hamowania aktywności IL-18, mierzonego w oznaczeniu neutralizacji IL-18, patrz Przykład 1 i Tablica I.

Termin „o wysokim powinowactwie” odnosi się do przeciwciała posiadającego powinowactwo charakteryzujące się Kd równą lub niższą od 3,9 x 10^-11 M wobec IL-18, określone przez analizę z zastosowaniem metody biosensora optycznego (patrz Przykład 2 i Tablica I).

Przez „specyficzność wiązania wobec IL-18 człowieka” rozumie się wyższe powinowactwo wobec IL-18 człowieka niż myszy bądź innych IL-18.

„Druga składowa immunoglobulinowa” odnosi się do innej sekwencji nukleotydowej, kodującej białko lub peptyd, z którym pierwsza składowa immunoglobulinowa jest połączona w tej samej ramce odczytu lub za pomocą ewentualnej konwencjonalnej sekwencji łącznikowej (tj. połączona w sposób umożliwający działanie). Korzystnie, jest ona genem immunoglobuliny. Druga składowa immunoglobulinowa może obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującego cały region stały tego samego (tj. homologicznego - pierwsze i drugie zmienione przeciwciała pochodzą z tego samego źródła) lub dodatkowego (tj. heterologicznego) przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. Może ona być łańcuchem ciężkim lub łańcuchem lekkim immunoglobuliny (bądź obu łańcuchów w postaci pojedynczego polipeptydu). Druga składowa immunoglobulinowa nie ogranicza się do określonej klasy lub

PL 202 396 B1 izotypu immunoglobulin. Ponadto, druga składowa immunoglobulinowa może zawierać część regionu stałego immunoglobuliny, takiego jak występujący w Fab lub F(ab)2 (tj. odrębna część odpowiedniego ludzkiego regionu stałego lub regionu zrębu). Taka druga składowa immunoglobulinowa może również zawierać sekwencję kodującą integralne białko błonowe eksponowane na zewnętrznej powierzchni komórki gospodarza, np. jako część biblioteki prezentowanej przez fagi, lub sekwencję kodującą białko do detekcji analitycznej lub diagnostycznej, np. peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę itp.

Terminy Fv, Fc, Fd, Fab lub F(ab)2 stosuje się w ich standardowych znaczeniach (patrz np. Harlow i in., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, „przeciwciało utworzone technikami inżynierii genetycznej” opisuje rodzaj zmienionego przeciwciała, tj. syntetycznego przeciwciała o pełnej długości (np. przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego, w przeciwieństwie do fragmentu przeciwciała), w którym część zmiennych domen łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego wybranego przeciwciała akceptorowego zastąpiono analogiczną częścią z jednego lub więcej przeciwciał donorowych, które wykazują specyficzność wobec wybranego epitopu. Na przykład, takie cząsteczki mogą obejmować przeciwciała charakteryzujące się humanizowanym łańcuchem ciężkim związanym z niemodyfikowanym łańcuchem lekkim (lub chimerycznym łańcuchem lekkim), bądź odwrotnie. Przeciwciała utworzone technikami inżynierii genetycznej mogą również charakteryzować się zmianą sekwencji kwasu nukleinowego kodującego regiony zrębu domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała akceptorowego w celu zachowania specyficzności wiązania przeciwciała donorowego. Przeciwciała te mogą zawierać zastąpienia jednego lub więcej CDR (korzystnie wszystkich) przeciwciała akceptorowego przez CDR z opisanego w niniejszym opisie przeciwciała donorowego.

„Przeciwciało chimeryczne” odnosi się do rodzaju przeciwciała utworzonego technikami inżynierii genetycznej, które zawiera naturalnie występujący region zmienny (łańcucha lekkiego i łańcuchów ciężkich) pochodzący z przeciwciała donorowego wraz z regionami stałymi łańcuchów lekkich i ciężkich pochodzącymi z przeciwciała akceptorowego.

„Przeciwciało humanizowane” odnosi się do rodzaju utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała posiadającego CDR pochodzące z immunoglobuliny donorowej gatunku nie będącego człowiekiem, gdzie pozostałe części pochodzące z immunoglobuliny otrzymano z jednej (lub więcej) immunoglobuliny(lin) człowieka. Ponadto, podtrzymujące funkcje reszty zrębu mogą zostać zmienione dla zachowania powinowactwa wiązania (patrz np. Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson i in., Bio/Technology, 9: 421 (1991)).

Termin „przeciwciało donorowe” odnosi się do przeciwciała (monoklonalnego lub zrekombinowanego), które wnosi sekwencje kwasów nukleinowych swoich regionów zmiennych, CDR lub inne funkcjonalne fragmenty lub analogi do pierwszej składowej immunoglobulinowej, tak aby zapewnić zmieniony region kodujący immunoglobulinę i w wyniku ulegające ekspresji zmienione przeciwciało o specyficzności antygenowej i aktywności neutralizującej charakterystycznych dla przeciwciała donorowego. Jednym przeciwciałem donorowym odpowiednim do stosowania w tym wynalazku jest neutralizujące przeciwciało monoklonalne gatunku nie będącego człowiekiem (tj. szczura), oznaczone jako 2C10. Przeciwciało 2C10 definiuje się jako posiadające wysokie powinowactwo neutralizujące przeciwciało specyficzne wobec IL-18 człowieka (tj. nie rozpoznaje IL-18 myszy) izotypu IgG₁._K, posiadające sekwencje DNA i aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przedstawione odpowiednio jako sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2, sekwencje DNA i aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przedstawione odpowiednio jako sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10, w odpowiednim regionie stałym IgG myszy.

Termin „przeciwciało akceptorowe” odnosi się do przeciwciała (monoklonalnego lub zrekombinowanego) heterologicznego wobec przeciwciała donorowego, które wnosi całość (bądź jakąkolwiek część, ale korzystnie całość) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego jego regiony zrębu łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego i/lub regiony stałe łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego do pierwszej składowej immunoglobulinowej. Korzystnie, przeciwciałem akceptorowym jest przeciwciało człowieka.

„CDR” zdefiniowano jako sekwencje aminokwasowe regionów determinujących komplementarność przeciwciała, które są regionami hiperzmiennymi łańcuchów ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny. Patrz np. Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wyd. 4, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). W zmiennej części immunoglobuliny występują CDR (lub regiony CDR) łańcucha ciężkiego i trzy łańcucha lekkiego. A zatem, „CDR” w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, odnosi się do wszystkich trzech CDR łańcucha ciężkiego

PL 202 396 B1 lub wszystkich trzech CDR łańcucha lekkiego (bądź CDR zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego, jeśli jest to odpowiednie).

CDR zapewniają większość reszt kontaktowych, służących do wiązania przeciwciała z antygenem lub epitopem. Będące przedmiotem zainteresowania CDR według tego wynalazku pochodzą ze zmiennych sekwencji łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała donorowego, i obejmują analogi naturalnie występujących CDR, które to analogi również posiadają, lub zachowują, taką samą specyficzność wiązania antygenu i/lub zdolność neutralizowania, jak przeciwciało donorowe, z którego je otrzymano.

Przez posiadanie takiej samej specyficzności wiązania antygenu lub zdolności neutralizowania rozumie się, na przykład, że chociaż przeciwciało monoklonalne 2C10 może charakteryzować pewien poziom powinowactwa do antygenu, CDR kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego 2C10 w odpowiednim otoczeniu strukturalnym moż e posiadać niż sze, bą d ź wyż sze, powinowactwo. Oczekuje się, że CDR 2C10 w takich otoczeniach będzie nie mniej jednak rozpoznawać ten sam epitop (y), jak 2C10. Przykładowe CDR łańcucha lekkiego 2C10 obejmują sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 3;

sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 5;

sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 7;

a przykładowe CDR łańcucha ciężkiego 2C10 obejmują sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 11;

sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 13; sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 15.

„Funkcjonalny fragment” jest częściową zmienną sekwencją łańcucha ciężkiego lub lekkiego (np. z niewielkimi delecjami na końcu aminowym lub karboksylowym regionu zmiennego immunoglobuliny), która zachowuje taką samą specyficzność wiązania antygenu i/lub zdolność neutralizowania, jak przeciwciało, z którego fragment otrzymano.

„Analog” jest sekwencją aminokwasową zmodyfikowaną o co najmniej jeden aminokwas, przy czym rzeczoną modyfikacją może być modyfikacja chemiczna, lub postawienie bądź poprzestawianie kilku aminokwasów (tj. nie więcej, niż 10), która to modyfikacja umożliwia zachowywanie przez sekwencję aminokwasową właściwości biologicznych, np. specyficzności antygenowej i wysokiego powinowactwa niezmodyfikowanej sekwencji. Na przykład, można tworzyć mutacje (milczące), poprzez podstawienia, gdy w regionach CDR lub ich otoczeniu tworzy się określone miejsca rozpoznawane przez endonuklezy restrykcyjne.

Analogi mogą również powstawać jako warianty alleliczne. „Zmianą lub modyfikacją alleliczną” jest zmiana sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencje aminokwasowe lub peptydowe według wynalazku. Takie zmiany lub modyfikacje mogą być spowodowane degeneracją kodu genetycznego lub mogą być rozmyślnie wprowadzone technikami inżynierii genetycznej dla zapewnienia pożądanych właściwości. Te zmiany lub modyfikacje mogą prowadzić, lub nie, do zmian jakiejkolwiek kodowanej sekwencji aminokwasowej.

Termin „czynniki efektorowe” odnosi się do niebiałkowych cząsteczek nośnikowych, z którymi zmienione przeciwciała i/lub naturalne lub syntetyczne łańcuchy lekki lub ciężki przeciwciała donorowego, bądź inne fragmenty przeciwciała donorowego, mogą być połączone w konwencjonalny sposób. Takie niebiałkowe nośniki mogą obejmować konwencjonalne nośniki stosowane w dziedzinie diagnostyki, np. perełki polistyrenowe lub inne plastikowe, polisacharydy, np. jak stosowane w systemie BIAcore [Pharmacia], lub inne niebiałkowe substancje użyteczne w dziedzinie medycyny i bezpieczne przy podawaniu ludziom i zwierzętom. Inne czynniki efektorowe mogą obejmować związki makrocykliczne, do chelatowania atomu metalu ciężkiego, lub izotopy promieniotwórcze. Takie czynniki efektorowe mogą również być użyteczne do zwiększania okresu półtrwania zmienionych przeciwciał, np. glikol polietylenowy.

II. Skierowane przeciw IL-18 przeciwciała monoklonalne o wysokim powinowactwie

Do stosowania w konstruowaniu przeciwciał wykorzystywać można zmienione przeciwciała i fragmenty wedł ug wynalazku gatunków nie b ę d ą cych czł owiekiem (np. bydł a, owcy, mał p, kury, gryzoni (np. myszy i szczura) do tworzenia pożądanej immunoglobuliny po prezentacji wobec natywnej IL-18 człowieka lub otrzymanego z niej peptydowego epitopu. Dla zapewnienia linii komórek hybrydomy, wydzielających skierowane przeciw IL-18 przeciwciało monoklonalne gatunku nie będącego człowiekiem wykorzystuje się konwencjonalne techniki hybrydom. Takie hybrydomy przeszukuje się następnie pod kątem wiązania stosując opłaszczone IL-18 96-studzienkowe płytki, jak opisano

PL 202 396 B1 w części Przykłady, lub alternatywnie, biotynylowaną IL-18 związaną z płytkami opłaszczonymi streptawidyną.

Jednym przykładowym neutralizującym przeciwciałem monoklonalnym o wysokiem powinowactwie według tego wynalazku jest przeciwciało monoklonalne 2C10, przeciwciało szczura, które można stosować do opracowywania przeciwciała chimerycznego lub humanizowanego, opisanego bardziej szczegółowo w przykładach poniżej. Przeciwciało monoklonalne 2C10 charakteryzuje się specyficznością wiązania antygenu wobec IL-18 człowieka o Kd około 3,9 x 10^-11 M. To przeciwciało monoklonalne charakteryzuje się izotypem IgG1.k.

Innym pożądanym przeciwciałem donorowym jest przeciwciało monoklonalne myszy, 13G9. To przeciwciało monoklonalne charakteryzuje się izotypem IgG1.k. Przeciwciało monoklonalne posiada stałą dysocjacji wobec IL-18 wynoszącą około 12 x 10^-9 M.

Jeszcze innym pożądanym przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne szczura, 14B7. To przeciwciało monoklonalne charakteryzuje się stałą dysocjacji wobec IL-18 wynoszącą około 1,5 x 10^-10 M. 14B7 charakteryzuje się również izotypem IgG1.k.

Wynalazek ten nie ogranicza się do stosowania 13G9, 2C10, 14B7 lub ich sekwencji hiperzmiennych (tj. CDR). Można je zastąpić jakimikolwiek innymi odpowiednimi skierowanymi przeciw IL-18 przeciwciałami o wysokim powinowactwie, charakteryzującymi się stałą dysocjacji równą lub niższą od około 3,9 x 10^-11 M wobec IL-18 człowieka oraz odpowiadającymi skierowanymi przeciw IL-18 CDR. Chociaż w poniższym opisie przeciwciało donorowe identyfikuje się jako 13G9, 2C10, 14B7, to ma to jedynie na celu zilustrowanie i uproszczenie opisu.

III. Fragmenty przeciwciał

Niniejszy wynalazek obejmuje również stosowanie fragmentów Fab lub fragmentów F(ab')2 pochodzących z przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw IL-18 człowieka. Fragmenty te użyteczne są jako czynniki chroniące in vivo przed stanami, w których uczestniczą IL-18 i Th1 lub in vitro jako część diagnostyki IL-18. Fragment Fab zawiera cały łańcuch lekki i aminokońcową część łańcucha ciężkiego, a fragment F(ab')2 jest fragmentem tworzonym przez dwa fragmenty Fab połączone wiązaniami disiarczkowymi. Przeciwciała monoklonalne 13G9, 2C10, 14B7 i inne podobne, wiążące IL-18 przeciwciała o wysokim powinowactwie zapewniają źródła fragmentów Fab i fragmentów F(ab')2, które można otrzymywać konwencjonalnymi sposobami, np. przez rozszczepianie przeciwciała monoklonalnego odpowiednimi enzymami proteolitycznymi, papainą i/lub pepsyną, lub metodami rekombinacyjnymi. Te fragmenty Fab i F(ab')2 są same użyteczne jako czynniki terapeutyczne, profilaktyczne lub diagnostyczne oraz jako donory sekwencji obejmujących regiony zmienne i sekwencji CDR użytecznych w tworzeniu przeciwciał zrekombinowanych lub humanizowanych, jak opisano w niniejszym opisie.

Fragmenty Fab i F(ab')2 można konstruować wykorzystując kombinatoryczną bibliotekę fagową (patrz np. Winter i in., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) lub przez tasowanie łańcuchów immunoglobulinowych (patrz np. Marks i in., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992), w całości włączony do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy), w której to metodzie umożliwia się łączenie Fd lub vH immunoglobuliny wybranego przeciwciała (np. 13G9) z zestawem vL (lub vK) lekkich łańcuchów immunoglobulin, z utworzeniem nowych Fab. W przeciwieństwie, umożliwia się łączenie lekkiego łańcucha immunoglobuliny wybranego przeciwciała z zestawem vH (lub Fd) ciężkich łańcuchów immunoglobulin, z utworzeniem nowych Fab.

IV. Będące przedmiotem zainteresowania sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe skierowane przeciw IL-18

Przeciwciało monoklonalne 2C10 lub inne opisane powyżej przeciwciała mogą dostarczać sekwencji, takich jak sekwencje peptydowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, sekwencje zrębu, sekwencje CDR, funkcjonalne fragmenty i ich analogi oraz sekwencje kodujących je kwasów nukleinowych, użytecznych do projektowania i otrzymywania różnych zmienionych przeciwciał, które charakteryzują się specyficznością wiązania antygenu przeciwciała donorowego.

Jako jeden przykład, niniejszy wynalazek zapewnia zmienne sekwencje łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego ze skierowanego przeciw IL-18 przeciwciała monoklonalnego 2C10 oraz sekwencje od nich pochodzące.

Sekwencje kwasów nukleinowych według tego wynalazku, lub ich fragmenty, kodujące sekwencje peptydowe regionów zmiennych łańcuchów lekkiego i ciężkiego, są również użyteczne do mutagennego wprowadzania specyficznych zmian w sekwencjach kwasów nukleinowych kodujących CDR lub regiony zrębu oraz do wprowadzania otrzymanej w wyniku zmodyfikowanej lub fuzyjnej sekwencji kwasu nukleinowego do plazmidu dla ekspresji.

PL 202 396 B1

Biorąc pod uwagę degenerację kodu genetycznego, można konstruować różne sekwencje kodujące, które kodują zmienne sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego, jak również ich funkcjonalne fragmenty lub analogi, które posiadają specyficzność antygenową przeciwciała donorowego. Sekwencje wyizolowanych kwasów nukleinowych według tego wynalazku, lub ich fragmenty, kodujące zmienne sekwencje peptydowe łańcuchów lub CDR, można stosować do wytwarzania zmienionych przeciwciał, np. przeciwciał chimerycznych lub humanizowanych, bądź innych utworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał według tego wynalazku, jeśli połączy się je w sposób umożliwiający działanie z drugą składową immunoglobulinową.

Należy zauważyć, że poza sekwencjami wyizolowanych kwasów nukleinowych kodujących części zmienionego przeciwciała i przeciwciał opisanych w niniejszym opisie, niniejszy wynalazek obejmuje inne sekwencje kwasów nukleinowych, takie jak te komplementarne do sekwencji kodujących natywne CDR lub komplementarne do zmodyfikowanych ludzkich regionów zrębu otaczających regiony CDR. Użyteczne sekwencje DNA obejmują te sekwencje, które hybrydyzują w surowych warunkach hybrydyzacji [patrz T. Maniatis i in., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), strony od 387 do 389] z sekwencjami DNA. Jednym przykładem takich surowych warunków hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4XSSC w temperaturze 65°C, po której następuje przemywanie w 0,1XSSC w temperaturze 65°C w ciągu godziny. Alternatywnie, przykładowymi surowymi warunkami hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 50% formamidzie, 4XSSC w temperaturze 42°C. Korzystnie, te hybrydyzujące sekwencje DNA mają długość co najmniej 18 nukleotydów, tj. w przybliżeniu wielkość CDR.

V. Zmienione cząsteczki immunoglobulin i zmienione przeciwciała

Zmienione cząsteczki immunoglobulin mogą kodować zmienione przeciwciała, które obejmują utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała, takie jak przeciwciała chimeryczne lub przeciwciała humanizowane. Pożądany region kodujący zmienione przeciwciało zawiera regiony kodujące CDR, które kodują peptydy posiadające specyficzność antygenową przeciwciała skierowanego przeciw IL-18, korzystnie przeciwciała o wysokim powinowactwie, takiego jak zapewniane przez niniejszy wynalazek, wstawione do pierwszej składowej immunoglobulinowej (ludzkiego zrębu lub ludzkiego regionu zmiennego immunoglobuliny).

Korzystnie, pierwsza składowa immunoglobulinową jest połączona w sposób umożliwiający działanie z drugą składową immunoglobulinowa. Drugą składową immunoglobulinową zdefiniowano powyżej, i może ona obejmować sekwencję kodującą będącego przedmiotem zainteresowania regionu drugiego przeciwciała, na przykład regionu Fc. Drugie składowe immunoglobulinowe mogą również obejmować sekwencje kodujące inną immunoglobulinę, z którymi region stały łańcucha lekkiego lub ciężkiego poddaje się fuzji w tej samej ramce odczytu lub poprzez sekwencję łącznikową. Tworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała skierowane przeciw funkcjonalnym fragmentom lub analogom IL-18 można projektować z celu uzyskania wzmocnionego wiązania dla tego samego przeciwciała.

Drugą składową immunoglobulinową można również połączyć ze zdefiniowanymi powyżej czynnikami efektorowymi, włącznie z niebiałkowymi cząsteczkami nośnikowymi, z którymi druga składowa immunoglobulinowa może być połączona, konwencjonalnymi sposobami, w sposób umożliwiający działanie.

Fuzji lub połączenia pomiędzy drugimi składowymi immunoglobulinowymi, np. sekwencjami przeciwciała, a czynnikiem efektorowym można dokonywać w jakikolwiek odpowiedni sposób, np. przez konwencjonalne wiązania kowalencyjne lub jonowe, fuzje białkowe bądź heterobifunkcjonalne czynniki sieciujące, np. karbodiimid, glutaraldehyd i podobne. Takie techniki są znane w tej dziedzinie i są prosto opisane w konwencjonalnych tekstach chemicznych i biochemicznych.

Ponadto, w regionie kodującym zmienioną immunoglobulinę można również umieścić konwencjonalne sekwencje łącznikowe, które zapewniają po prostu pożądaną odległość pomiędzy drugą składową immunoglobulinową a czynnikiem efektorowym. Projektowanie takich łączników jest dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.

Ponadto, dla wzmacniania ekspresji można modyfikować sekwencje sygnałowe dla cząsteczek według wynalazku.

Przykładowe zmienione przeciwciało zawiera zmienną sekwencję peptydu lub białka łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego, posiadającą specyficzność antygenową przeciwciała monoklonalnego 2C10, np. łańcuchy VH i VL. Jeszcze inne pożądane zmienione przeciwciało według tego wynalazku charakteryzuje się sekwencją aminokwasową zawierającą co najmniej jeden, a korzystnie wszystkie z CDR

PL 202 396 B1 zmiennego regionu łańcuchów ciężkich i/lub lekkich cząsteczki przeciwciała 2C10 szczura, z pozostałymi sekwencjami pochodzącymi z przeciwciał ludzkich, bądź jej funkcjonalnym fragmentem lub analogiem.

W jeszcze dalszym rozwiązaniu, utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało według wynalazku może posiadać połączony ze sobą dodatkowy czynnik. Na przykład, procedurę techniki rekombinacji DNA można zastosować do utworzenia technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku, w którym fragment Fc lub domenę CH2 CH3 pełnej cząsteczki przeciwciała zastąpiono enzymem lub inną wykrywalną cząsteczką (np. polipeptydową cząsteczką efektorową lub reporterową).

Druga składowa immunoglobulinowa może być również połączona w sposób umożliwiający działanie z peptydem nie będącym immunoglobuliną, białkiem lub jego fragmentem, heterologicznym wobec sekwencji zawierającej CDR, na przykład posiadającej specyficzność antygenową 2C10 szczura. Otrzymane w wyniku białko może po ekspresji wykazywać zarówno specyficzność antygenową wobec IL-18, jak i właściwości składowej nie będącej immunoglobuliną. Właściwości takiej składowej fuzji mogą stanowić, np., właściwości funkcjonalne, takie jak inna domena wiążąca lub receptorowa, bądź właściwości terapeutyczne, jeśli składowa fuzji sama jest białkiem terapeutycznym, bądź dodatkowe właściwości antygenowe.

Inne pożądane białko według tego wynalazku może obejmować pełną cząsteczkę przeciwciała, posiadającą pełnej długości łańcuchy ciężkie i lekkie, lub jakikolwiek jego odrębny fragment, taki jak fragmenty Fab i F(ab')2, dimer ciężkiego łańcucha, lub jakiekolwiek minimalne zrekombinowane jego fragmenty, takie jak F, bądź przeciwciało jednołańcuchowe (SCA) lub jakąkolwiek inną cząsteczkę o takiej samej specyficzności, jak wybrane donorowe przeciwciało monoklonalne, np. mAb 2C10. Takie białko można stosować w postaci zmienionego przeciwciała lub można je stosować w postaci nie poddanej fuzji.

Jeśli druga składowa immunoglobulinowa pochodzi z przeciwciała różnego od przeciwciała donorowego, np. o jakimkolwiek izotypie lub klasie regionów zrębu lub stałych immunoglobuliny, wynikiem jest utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało. Przeciwciała utworzone technikami inżynierii genetycznej mogą zawierać regiony stałe immunoglobuliny (Ig) i zmienne regiony zrębu z jednego źródła, np. przeciwciała akceptorowego, oraz jeden lub więcej (korzystnie wszystkie) CDR z przeciwciała donorowego, np. opisanego w niniejszym opisie przeciwciała skierowanego przeciw IL-18. Ponadto, można dokonywać zmian, np. delecji, podstawień lub addycji, regionu zrębu domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego akceptorowego przeciwciała monoklonalnego na poziomie kwasu nukleinowego lub aminokwasowym, bądź regionów CDR donora, w celu zachowania specyficzności wiązania antygenu przeciwciała donorowego.

Takie utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała projektuje się do wykorzystywania jednego (lub obu) regionów zmiennych łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw IL-18 (ewentualnie zmodyfikowanych w opisany sposób) lub jednego bądź więcej ze zidentyfikowanych poniżej CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego. Oczekuje się, że utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała będą neutralizujące, tj. pożądane jest blokowanie przez nie wiązanie białka IL-18 z receptorem, a blokują one także lub zapobiegają proliferacji komórek zależnych od IL-18.

Takie utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą obejmować przeciwciało humanizowane, zawierające regiony zrębu wybranej immunoglobuliny lub subtypu człowieka, lub przeciwciało chimeryczne, zawierające regiony stałe łańcucha ciężkiego i lekkiego poddane fuzji z funkcjonalnymi fragmentami przeciwciał a skierowanego przeciw IL-18. Odpowiednie przeciwciało akceptorowe człowieka (lub zwierzęcia) można wybrać z konwencjonalnej bazy danych, np. bazy danych KABAT®, bazy danych Los Alamos i bazy danych Swiss Protein, dzięki homologii sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej przeciwciała donorowego. Ludzkie przeciwciało charakteryzujące się homologią do regionów zrębu przeciwciała donorowego (na poziomie aminokwasowym) może być odpowiednie do zapewnienia regionu stałego łańcucha ciężkiego i/lub zrębu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego do wstawiania donorowego CDR. W podobny sposób można wybrać odpowiednie przeciwciało akceptorowe zdolne do zapewniania regionu stałego i zrębu regionu zmiennego łańcucha lekkiego. Należy zauważyć, że nie jest wymagane, aby łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała akceptorowego pochodziły z tego samego przeciwciała akceptorowego.

Korzystnie, heterologiczne regiony zrębu i stały wybiera się z klas i izotypów immunoglobulin człowieka, takich jak IgG (subtypy od 1 do 4), IgM, IgA i igE. Jednakże, przeciwciało akceptorowe nie

PL 202 396 B1 musi zawierać tylko sekwencji białka immunoglobuliny człowieka. Na przykład, można skonstruować gen, w którym sekwencję DNA kodującą część łańcucha immunoglobuliny człowieka poddano fuzji z sekwencją DNA kodującą nieimmunoglobulinową sekwencję aminokwasową, taką jak polipeptydowa cząsteczka efektorowa lub reporterowa.

Jeden przykład szczególnie pożądanego przeciwciała humanizowanego mógłby zawierać CDR 2C10 wstawione do regionów zrębu sekwencji wybranego przeciwciała człowieka. W celu uzyskania neutralizujących przeciwciał humanizowanych, jeden, dwa lub, korzystnie, trzy CDR z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego przeciwciała skierowanego przeciw IL-18 wstawia się do regionów zrębu sekwencji wybranego przeciwciała człowieka, zastępując natywne CDR tego ostatniego przeciwciała.

Korzystnie, w przeciwciele humanizowanym domeny zmienne obu łańcuchów ludzkich, ciężkiego i lekkiego, utworzono technikami inżynierii genetycznej przez jedno lub więcej zastąpień CDR. Możliwe jest wykorzystanie wszystkich sześciu CDR bądź różnych kombinacji mniej niż sześciu CDR. Korzystnie, zastępuje się wszystkie sześć CDR. Możliwe jest zastąpienie CDR tylko w ludzkim łańcuchu ciężkim, jako łańcuch lekki wykorzystując niezmodyfikowany łańcuch lekki z akceptorowego przeciwciała człowieka. Jeszcze inaczej, kompatybilny łańcuch lekki można wybrać z innego przeciwciała ludzkiego, przez wykorzystanie konwencjonalnej bazy danych przeciwciał. Pozostałe części przeciwciała utworzonego technikami inżynierii genetycznej mogą pochodzić z jakiejkolwiek odpowiedniej akceptorowej immunoglobuliny ludzkiej.

A zatem, utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało humanizowane korzystnie posiada strukturę naturalnego przeciwciała ludzkiego lub jego fragmentu i wykazuje kombinację właściwości wymaganych do skutecznego stosowania terapeutycznego, np. leczenia chorób zapalnych człowieka, w których uczestniczy IL-18, bądź do zastosowań diagnostycznych.

Jako inny przykład, utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało może zawierać CDR zmiennego regionu łańcucha lekkiego 2C10 oraz CDR zmiennego regionu łańcucha ciężkiego 13G9. Otrzymane w wyniku przeciwciało humanizowane powinno charakteryzować się taką samą specyficznością wiązania antygenu oraz wysokim powinowactwem przeciwciała monoklonalnego 2C10.

Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało można dalej modyfikować przez zmiany w aminokwasach domeny zmiennej, bez konieczności wpływania na specyficzność i wysokie powinowactwo przeciwciała donorowego (tj. tworzyć analog). Uważa się, że aminokwasy łańcucha ciężkiego i lekkiego można podstawiać innymi aminokwasami, albo w zrębach domen zmiennych, albo w CDR, bądź w obu.

Ponadto, można zmieniać region stały w celu wzmacniania lub obniżania właściwości selektywności cząsteczek według niniejszego wynalazku. Na przykład, zdolności dimeryzacji, wiązania receptorów Fc lub zdolności wiązania i aktywacji dopełniacza (patrz np. Angal i in., Mol. Immunol. 30: 105-108 (1993), Xu i in., J. Biol. Chem. 269: 3469-3474 (1994), Winter i in., europejski opis patentowy numer 307 434-B).

Zmienione przeciwciało, które jest przeciwciałem chimerycznym, różni się od opisanych powyżej przeciwciał humanizowanych tym, że zawiera całe regiony zmienne łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała donorowego gatunku nie będącego człowiekiem, włącznie z regionami zrębu, w połączeniu z regionami stałymi obu łańcuchów immunoglobuliny człowieka. Uważa się, że przeciwciała chimeryczne, które zawierają dodatkowe sekwencje gatunku nie będącego człowiekiem, mogą wywoływać znaczącą odpowiedź immunologiczną u ludzi w porównaniu do przeciwciał humanizowanych według tego wynalazku.

Takie przeciwciała mogłyby być użyteczne w zapobieganiu i leczeniu zaburzeń, w których uczestniczy IL-18, jak dyskutowano powyżej.

VI. Wytwarzanie przeciwciał zmienionych i przeciwciał zmodyfikowanych technikami inżynierii genetycznej

Korzystnie, zmienne sekwencje łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego oraz CDR przeciwciała monoklonalnego 2C10 lub innych odpowiednich donorowych przeciwciał monoklonalnych oraz sekwencje kodujących je kwasów nukleinowych wykorzystuje się w konstruowaniu zmienionych przeciwciał, korzystnie przeciwciał humanizowanych, według tego wynalazku, stosując poniżej opisany sposób. Te same lub podobne techniki można również wykorzystywać do tworzenia innych rozwiązań tego wynalazku.

Hybrydomę wytwarzającą wybrane donorowe przeciwciało monoklonalne, np. przeciwciało 2C10 szczura, konwencjonalnie klonuje się i otrzymuje DNA jego regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego, stosując techniki znane specjaliście w tej dziedzinie, np. techniki opisane w Sambrook

PL 202 396 B1 i in., (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Zmienne regiony łańcucha ciężkiego i lekkiego 2C10, zawierające co najmniej regiony kodujące CDR i te części regionów zrębu domeny zmiennej łańcucha lekkiego i/lub ciężkiego akceptorowego przeciwciała monoklonalnego, które są wymagane do zachowania specyficzności wiązania donorowego przeciwciała monoklonalnego, jak również pozostałe części pochodzące z ludzkiego immunoglobulinowego łańcucha przeciwciała, można otrzymać stosując startery polinukleotydowe i odwrotną transkryptazę. Regiony kodujące CDR identyfikuje się stosując znaną bazę danych i porównywanie z innymi przeciwciałami.

Następnie można przygotować przeciwciało chimeryczne szczurze/ludzkie i oznaczyć je pod kątem zdolności wiązania. Takie przeciwciało chimeryczne zawiera całe regiony VH i VL przeciwciała donorowego gatunku nie będącego człowiekiem w połączeniu z regionami stałymi obu łańcuchów ludzkiej Ig.

Przeciwciało humanizowane może pochodzić od przeciwciała chimerycznego lub, korzystnie, można je otrzymać syntetycznie przez wstawienie regionów kodujących CDR donorowego przeciwciała monoklonalnego z łańcuchów ciężkiego i lekkiego, odpowiednio do zrębu łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, humanizowane przeciwciało według wynalazku można przygotować stosując standardowe techniki mutagenezy. A zatem, uzyskane w wyniku przeciwciało humanizowane zawiera ludzkie regiony zrębu i regiony kodujące CDR donorowego przeciwciała. Reszty zrębu można poddawać kolejnym manipulacjom. Ekspresję uzyskanego w wyniku przeciwciała humanizowanego można prowadzić w zrekombinowanych komórkach gospodarza, np. komórkach COS, CHO lub szpiczaka. Inne przeciwciała humanizowane można przygotowywać stosując tę technikę wobec innych odpowiednich, specyficznych wobec IL-18, neutralizujących przeciwciał o wysokim powinowactwie gatunku nie będącego człowiekiem.

Konwencjonalny wektor ekspresyjny lub zrekombinowany plazmid można utworzyć przez umieszczenie tych sekwencji kodujących zmienione przeciwciało w połączeniu umożliwiającym działanie z konwencjonalnymi regulującymi sekwencjami kontrolującymi, zdolnymi do kontrolowania replikacji i ekspresji w, i/lub wydzielania z komórek gospodarza. Sekwencje regulujące obejmują sekwencje promotorowe, np. promotor CMV, sekwencje sygnałowe, które mogą pochodzić z innych znanych przeciwciał. Podobnie, można utworzyć drugi wektor ekspresyjny, posiadający sekwencję DNA, która koduje komplementarny lekki lub ciężki łańcuch przeciwciała. Korzystnie, ten drugi wektor ekspresyjny jest identyczny z pierwszym, z wyjątkiem sekwencji kodującej i markerów selekcyjnych, tak, aby zapewnić, na tyle, na ile to możliwe, że każdy łańcuch polipeptydowy ulega funkcjonalnej ekspresji. Alternatywnie, sekwencje kodujące łańcuch ciężki i lekki zmienionego przeciwciała mogą być obecne w jednym wektorze.

Wybraną komórkę gospodarza kotransfekuje się, stosując konwencjonalne techniki, obydwoma wektorami, pierwszym i drugim (lub po prostu transfekuje pojedynczym wektorem) w celu utworzenia stransfekowanej komórki gospodarza według wynalazku, zawierającej zrekombinowane lub syntetyczne oba łańcuchy, lekki i ciężki. Stransfekowaną komórkę hoduje się następnie konwencjonalnymi technikami w celu wytwarzania technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Hodowlę przeszukuje się pod kątem przeciwciała humanizowanego, które obejmuje połączenie zarówno zrekombinowanego łańcucha ciężkiego, jak i/lub łańcucha lekkiego, w odpowiednim oznaczeniu, takim jak ELISA lub RIA. Podobne konwencjonalne techniki można wykorzystywać do konstruowania innych zmienionych przeciwciał i cząsteczek według tego wynalazku.

Specjalista w tej dziedzinie może wybrać wektory odpowiednie do etapów klonowania i subklonowania, wykorzystywanych w metodach i tworzeniu kompozycji według wynalazku. Można na przykład zastosować szereg konwencjonalnych wektorów pUC. Jednym ze stosowanych wektorów jest pUC19, który jest komercjalnie dostępny w firmach, takich jak Amersham (Buckinghamshire, Wielka Brytania) lub Pharmacia (Uppsala, Szwecja). Ponadto, do klonowania można zastosować jakikolwiek wektor, który jest zdolny do łatwej replikacji, posiada znaczną ilość miejsc klonowania i genów selekcyjnych (np. oporności na antybiotyki) i jest łatwy do manipulacji. A zatem, wybór wektora klonującego nie jest czynnikiem ograniczającym wynalazek.

Podobnie, specjalista w tej dziedzinie może wybrać, z dowolnych konwencjonalnych wektorów, wektor wykorzystywany do ekspresji utworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał według wynalazku. Wektory te zawierają również wybrane sekwencje regulujące (takie jak promotory CMV), które kierują replikacja i ekspresją heterologicznych sekwencji DNA w wybranych komórkach gospodarza. Wektory te zawierają opisane powyżej sekwencje DNA, które kodują utworzone technikami

PL 202 396 B1 inżynierii genetycznej przeciwciało lub region kodujący zmienioną immunoglobulinę. Ponadto, wektory mogą zawierać wybrane sekwencje immunoglobuliny zmodyfikowane przez wstawienie pożądanych miejsc restrykcyjnych dla umożliwienia manipulacji.

Wektory ekspresyjne mogą również charakteryzować geny, odpowiednie do wzmacniania ekspresji heterologicznych sekwencji DNA, np. ssaczy gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Inne korzystne sekwencje wektora obejmują sekwencję sygnału poliA, taką jak z genu bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) oraz sekwencję promotora betaglobiny (betaglopro). Użyteczne w niniejszym opisie wektory ekspresyjne można syntetyzować technikami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie.

Składowe takich wektorów, np. replikony, geny selekcyjne, sekwencje wzmacniające, promotory, sekwencje sygnałowe i podobne do kierowania ekspresją i/lub wydzielaniem produktu zrekombinowanego DNA w wybranym gospodarzu można otrzymywać ze źródeł komercjalnych lub naturalnych, bądź syntetyzować zgodnie ze znanymi procedurami. Do tego celu można również wybrać inne odpowiednie wektory ekspresyjne, których liczne typy znane są w tej dziedzinie do ekspresji w komórkach ssaczych, bakteryjnych, owadzich, drożdżowych i grzybowych.

Niniejszy wynalazek obejmuje również linię komórkową stransfekowaną zrekombinowanym plazmidem zawierającym sekwencje kodujące utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała lub ich zmienione cząsteczki immunoglobulin. Do klonowania i innych manipulacji tymi wektorami klonującymi użyteczne są konwencjonalne komórki gospodarza. Jednakże, najbardziej pożądane do replikacji wektorów klonujących i innych etapów konstruowania zmienionych przeciwciał, według tego wynalazku, są komórki różnych szczepów E. coli.

Odpowiednie komórki gospodarza lub linie komórkowe do ekspresji utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała lub zmienionego przeciwciała według wynalazku są korzystnie komórki ssacze, takie jak komórki CHO, COS, komórki fibroblastów (np. 3T3) i komórki szpiku, a korzystniej komórki CHO lub komórki szpiku. Można stosować komórki ludzkie, umożliwiając w ten sposób modyfikację cząsteczki zgodnie z ludzkimi wzorami glikozylacji. Alternatywnie, można wykorzystywać inne eukariotyczne linie komórkowe. Zasady wyboru odpowiednich ssaczych komórek gospodarza i metod transformacji, hodowli, amplifikacji, przeszukiwania i wytwarzania produktu są znane w tej dziedzinie. Patrz np. cytowany powyż ej Sambrook i in.

Komórki bakteryjne mogą być użyteczne jako komórki gospodarza odpowiednie do ekspresji zrekombinowanych Fab według niniejszego wynalazku (patrz, np., Ptockthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)). Jednakże, z powodu tendencji białek ulegających ekspresji w komórkach bakteryjnych przybierania postaci nieufałdowanej lub niewłaściwie ufałdowanej, bądź postaci niezglikozylowanej, każdy Fab wytwarzany w komórkach bakteryjnych powinno się przeszukiwać pod kątem zdolności wiązania antygenu. Jeśli cząsteczka ulegająca ekspresji w komórce bakteryjnej wytwarzana była we właściwie ufałdowanej postaci, taka komórka bakteryjna będzie pożądanym gospodarzem. Na przykład, jako komórki gospodarza w dziedzinie biotechnologii dobrze znane są różne szczepy E. coli stosowane do ekspresji. W metodzie tej można również wykorzystywać różne szczepy B. subtilis, Streptomyces, innych laseczek i podobne.

Jeśli jest to pożądane, jako komórki gospodarza dostępne są także znane specjalistom w tej dziedzinie szczepy komórek drożdżowych, jak również komórki owadów, np. Drosophila i Lepidoptera, oraz wirusowe układy ekspresyjne. Patrz, np., Miller i in., Genetic Engineering, 8, 277-298, Plenum Press (1986), oraz cytowane tam odnośniki.

Ogólne metody, którymi można konstruować wektory według wynalazku, metody transfekcji wymagane do tworzenia komórek gospodarza oraz metody hodowli konieczne do wytwarzania zmienionego przeciwciała według wynalazku w takich komórkach gospodarza, są konwencjonalnymi technikami. Podobnie, po wytworzeniu, zmienione przeciwciała według wynalazku można oczyszczać z zawartości hodowli komórkowej zgodnie ze standardowymi procedurami tej dziedziny, włącznie z wytrącaniem siarczanem amonowym, kolumnami powinowactwa, chromatografią kolumnową, elektroforezą żelową i podobnymi. Takie techniki pozostają w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie i nie ograniczają tego wynalazku.

W jeszcze innej metodzie ekspresji humanizowanych przeciwciał można wykorzystywać ekspresję w zwierzęciu transgenicznym, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 873 316. Dotyczy on układu ekspresji z zastosowaniem zwierzęcego promotora kazeiny, który, po transgenicznym wprowadzeniu do ssaka umożliwia wytwarzanie przez samicę pożądanego zrekombinowanego białka w mleku.

PL 202 396 B1

Po ekspresji pożądaną metodą, utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało sprawdza się następnie pod względem aktywności in vitro, stosując odpowiednie oznaczenie. Obecnie do jakościowej i ilościowej oceny wiązania utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała z IL-18 wykorzystuje się oznaczenia ELISA. Ponadto, można również stosować inne oznaczenia in vitro do weryfikacji skuteczności neutralizacji przed późniejszymi badaniami klinicznymi na ludziach prowadzonymi do oceny trwałości utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała w organizmie pomimo zwykłych mechanizmów usuwania z organizmu.

Postępując zgodnie z ogólnymi procedurami opisanymi do przygotowywania przeciwciał humanizowanych, specjalista w tej dziedzinie może również konstruować humanizowane przeciwciała z innych opisanych w niniejszym opisie przeciwciał donorowych skierowanych przeciw IL-18, sekwencji regionów zmiennych oraz peptydów CDR. Przeciwciała wytwarzane technikami inżynierii genetycznej można tworzyć ze zrębami regionów zmiennych, potencjalnie rozpoznawanymi jako „własne” przez biorców utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała. W celu osiągnięcia dużego zwiększenia wiązania antygenu bez znacznego zwiększania immunogenności dla biorcy, do zrębów regionów zmiennych można wprowadzać niewielkie modyfikacje. Takie utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała mogą skutecznie leczyć u ludzi stany chorobowe, w których uczestniczy IL-18.

VII. Zastosowania terapeutyczne/profilaktyczne

Wynalazek ten dotyczy również sposobu leczenia ludzi doświadczających objawów związanych z chorobami autoimmunologicznymi, takich jak MS, który obejmuje podawanie skutecznej dawki przeciwciał, obejmującej jedno lub więcej opisanych w niniejszym opisie utworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał lub zmienionych przeciwciał, bądź ich fragmentów.

Lecznicza odpowiedź indukowana przez zastosowanie cząsteczek według tego wynalazku wywoływana jest dzięki wiązaniu z IL-18 człowieka, z zatem blokowaniu występującej następnie stymulacji Th1. Zatem, cząsteczki według niniejszego wynalazku, gdy znajdują się w preparatach i postaciach odpowiednich do stosowania terapeutycznego, są bardzo pożądane dla osób cierpiących na chorobę autoimmunologiczną, taką jak, ale nie ograniczającą się do MS, RA, IDDM, IBD i łuszczycy.

Zmienione przeciwciała, przeciwciała i ich fragmenty według tego wynalazku można również stosować łącznie z innymi przeciwciałami, szczególnie ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi reaktywnymi wobec innych markerów (epitopów) odpowiedzialnych za stan, przeciw któremu skierowane jest utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało według wynalazku.

Uważa się, że czynniki terapeutyczne według tego wynalazku będą wskazane do leczenia stanów autoimmunologicznych od około 2 dni do 6 miesięcy, bądź tak długo jak będzie istniała potrzeba. Na przykład, dłuższe leczenie może być pożądane w przypadku leczenia MS lub podobnych stanów. Dawka i czas trwania leczenia zależy od względnego czasu trwania cząsteczek według niniejszego wynalazku w krążeniu człowieka, i specjalista w tej dziedzinie może je dobrać w zależności od leczonego stanu i ogólnego stanu zdrowia pacjenta.

Czynnik terapeutyczny według wynalazku można podawać jakąkolwiek odpowiednią drogą, która dostarczy czynnik do gospodarza. Zmienione przeciwciała, przeciwciała, utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciała i ich fragmenty oraz kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są szczególnie użyteczne do podawania pozajelitowego, tj. podskórnie, domięśniowo, dożylnie lub donosowo.

Czynniki terapeutyczne według wynalazku można przygotowywać jako kompozycje farmaceutyczne, zawierające skuteczną ilość utworzonego technikami inżynierii genetycznej (np. humanizowanego) przeciwciała według wynalazku jako składnika aktywnego w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku. W przypadku czynnika profilaktycznego według wynalazku, korzystna jest wodna zawiesina lub roztwór zawierający utworzone technikami inżynierii genetycznej przeciwciało, korzystnie zbuforowane w fizjologicznym pH, w postaci gotowej do iniekcji. Kompozycje do podawania pozajelitowego będą zwykle zawierać roztwór utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku lub ich mieszaninę rozpuszczoną w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Można wykorzystywać szereg nośników wodnych, np. 0,4% sól fizjologiczną, 0,3% glicynę i podobne. Roztwory te są jałowe i generalnie wolne od makrocząstek. Roztwory te można wyjaławiać konwencjonalnymi, dobrze znanymi technikami wyjaławiania (np. przez sączenie). Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, wymagane do zapewnienia warunków zbliżonych do fizjologicznych, takie jak czynniki doprowadzające pH i buforujące itd. Stężenie przeciwciała według wynalazku w takiej postaci farmaceutycznej może być znacznie zróżnicowane, tj. od mniej niż około 0,5%, zazwyczaj lub co najmniej wynoszące około 1%, do tak dużych

PL 202 396 B1 jak 15 lub 20% wagowych i będzie dobierane przede wszystkim w oparciu o objętości płynu, lepkości itp., zgodnie z określonym wybranym sposobem podawania.

A zatem, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku do iniekcji domięśniowej można przygotować tak, aby zawierała 1 ml jałowej zbuforowanej wody oraz pomiędzy około 1 ng a około 100 mg, np. od około 50 ng do około 30 mg lub, korzystniej, od około 5 mg do około 25 mg utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Podobnie, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku do infuzji dożylnej można przygotować tak, aby zawierała około 250 ml jałowego roztworu Ringera oraz od 1 do około 30, a korzystnie od 5 do około 25 mg utworzonego technikami inżynierii genetycznej przeciwciała według wynalazku. Aktualne metody przygotowywania kompozycji do podawania pozajelitowego są dobrze znane lub będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie i bardziej szczegółowo opisano je w, na przykład, Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 15, Mack Publishing Company, Easton, Pensylwania.

Korzystne jest, aby czynnik terapeutyczny według wynalazku, jeśli znajduje się w kompozycji farmaceutycznej, był obecny w postaci do dawkowania jednostkowego. Specjalista w tej dziedzinie może łatwo określić odpowiednią dawkę skuteczną terapeutycznie. Do skutecznego leczenia zaburzenia zapalnego u człowieka lub innego zwierzęcia, powinno się podawać pozajelitowo jedną dawkę od około 0,1 mg do około 20 mg białka lub przeciwciała według wynalazku na 70 kg wagi ciała, korzystnie dożylnie lub domięśniowo. Dawkę taką można, jeśli jest to konieczne, powtarzać w odpowiednich odstępach czasu, wybranych jako właściwe przez lekarza podczas choroby.

Zmienione przeciwciała i przeciwciała utworzone technikami inżynierii genetycznej według tego wynalazku można również stosować w układach diagnostycznych, takich jak do wykrywania zaburzeń, w których uczestniczy IL-18 lub śledzenia postępów leczenia takich zaburzeń. Jako odczynniki diagnostyczne, te zmienione przeciwciała można konwencjonalnie znakować do stosowania w ELISA i innych konwencjonalnych układach oznaczeń do pomiaru poziomów IL-18 w surowicy, osoczu lub innej odpowiedniej tkance, lub jej uwalniania przez komórki ludzkie w hodowli. Charakter oznaczeń, w których stosuje się zmienione przeciwciała, jest taki jak zazwyczaj i nie ogranicza tego ujawnienia.

A zatem, jedno rozwiązanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wspomagania rozpoznawania choroby autoimmunologicznej i innych stanów związanych z nadmiernym wytwarzaniem komórek Th1 u pacjenta, który obejmuje etapy określania ilości ludzkiej IL-18 w próbce (osocza lub tkanki) otrzymanej od rzeczonego pacjenta oraz porównywania rzeczonej określonej ilości ze średnią ilością ludzkiej IL-18 w normalnej populacji, przy czym obecność znacząco zwiększonej ilości IL-18 w próbce pacjenta stanowi wskazanie choroby autoimmunologicznej i innych stanów związanych z nadmiernym wytwarzaniem komórek T Th1.

Opisane w niniejszym opisie przeciwciała, zmienione przeciwciała lub ich fragmenty można liofilizować w celu przechowywania i rekonstytucji w odpowiednim nośniku przed stosowaniem. Wykazano, że technika ta jest skuteczna dla konwencjonalnych immunoglobulin i można wykorzystywać znane w tej dziedzinie techniki liofilizacji i rekonstytucji.

Poniższe przykłady ilustrują różne aspekty tego wynalazku, włącznie z konstruowaniem przykładowych utworzonych technikami inżynierii genetycznej przeciwciał i ich ekspresją w odpowiednich wektorach i komórkach gospodarza, i nie są skonstruowane jako ograniczające zakres tego wyniku. Wszystkie aminokwasy określa się konwencjonalnymi kodami trzyliterowymi lub jednoliterowymi. Wszystkie konieczne enzymy, plazmidy i inne odczynniki oraz materiały otrzymano, o ile nie wskazano inaczej, ze źródeł komercjalnych. Wszystkie ogólne procedury klonowania i inne metody rekombinacji DNA prowadzono jak w cytowanym powyżej T. Maniatis i in., lub drugim wydaniu (1989), red. Sambrook i in., tego samego wydawcy („Sambrook i in.”).

P r z y k ł a d 1 - Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw IL-18

A. Tworzenie przeciwciał monoklonalnych

Myszy (pokolenie F1 hybryd Balb/c i C57BL/6) lub szczury (Sprague Dawley) immunizowano 30 μg zrekombinowanej IL-18 w adiuwancie i po 4 tygodniach 30 μq IL-18 w adiuwancie. Na podstawie dobrego miana przeciwciała skierowanego przeciw IL-18 w surowicy, zwierzęta immunizowano dalej 10-30 μg IL-18 (dootrzewnowo w soli fizjologicznej). Trzy dni po ostatniej immunizacji wycinano śledzionę. Komórki śledziony myszy lub szczura stosowano do przygotowania hybrydom, zgodnie ze standardowymi procedurami. (Zola, H., red., Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc. 1987). Dodatnie hybrydomy klonowano metodą ograniczonych rozcieńczeń.

PL 202 396 B1

B. Oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych

Przeciwciała monoklonalne oczyszczano przez chromatografię na ProsepA (Bio Processing, Consett, Wielka Brytania) zgodnie z instrukcjami podanymi przez producenta. Według SDS-PAGE, przeciwciała monoklonalne były czyste w >95%.

C. Określanie izotypów przeciwciał monoklonalnych

Wszystkie przeciwciała monoklonalne szczurów i myszy poddawano określaniu izotypów stosując komercjalnie dostępne zestawy (Zymed, Amersham) i stwierdzono, że są izotypu IgG1 kappa.

P r z y k ł a d 2 - Oznaczenia

A. Biotynylacja IL-18

IL-18 biotynylowano stosując zestaw zakupiony w Molecular Probes Inc., stosując stosunek 1:10 odczynnika biotynylującego. Biotynylacja nie miała żadnego wpływu na aktywność biologiczną IL-18.

B. Oznaczenie przeszukiwania hybrydom

96-studzienkowe płytki opłaszczano streptawidyną (2 μg/ml, 100 μl/studzienkę w PBS) przez inkubację w ciągu nocy w temperaturze 4°C. Następnie roztwór odsysano i miejsca niespecyficznego wiązania blokowano 250 μl/studzienkę 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02% Kathon, pH 7,4) w ciągu 5-60 minut w temperaturze pokojowej. Po tym i po każdym z następnych etapów, płytkę przemywano 4 razy buforem do przemywania (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% Kathon, pH 7,4). Do każdej studzienki dodawano 100 μl biotyny-IL-18 (100 ng/ml) w buforze do oznaczania (0,5% BSA, 0,05% bydlęca gamma-globulina, 0,01% Tween 40, 20 μM kwas dietylenotriaminopentaoctowy w buforze TBS) i płytki inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej w inkubatorze z wytrząsaniem. Do każdej studzienki następnie dodawano 50 μl podłoża hybrydom i 50 μl buforu do oznaczania i inkubowano w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnie do każdej studzienki dodawano 100 μl wyznakowanego Eu³⁺ przeciwciała skierowanego przeciw immunoglobulinom myszy lub szczura o stężeniu 0,5 μg/ml w buforze do oznaczania. W końcu dodawano 200 μl/studzienkę czynnika wzmacniającego i inkubowano w ciągu 5 minut w temperaturze pokojowej i mierzono fluorescencję czasów życia stanów wzbudzonych. Hybrydomy wykazujące zliczenia >100K namnażano w 24-studzienkowych płytkach.

C. Oznaczenie immunologiczne.

Dla określania specyficzności utworzonych przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw IL-18, 96-studzienkowe płytki opłaszczano, blokowano i inkubowano z biotyną-IL-18 jak powyżej. Wszystkie późniejsze inkubacje prowadzono w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Po przemywaniu studzienek, dodawano 50 μl IL-18 (3 μg/ml) lub buforu do oznaczania oraz 50 μl przeciwciała monoklonalnego i inkubowano w ciągu 60 minut. Po przemywaniu studzienek, dodawano na 60 minut 100 μl wyznakowanego Eu³+ przeciwciała skierowanego przeciw immunoglobulinom myszy lub szczura o stężeniu 0,5 μg/ml w buforze do oznaczania, studzienki przemywano, a następnie dodawano 100 μl/studzienkę czynnika wzmacniającego i inkubowano w ciągu 5 minut w temperaturze pokojowej i mierzono fluorescencję czasów życia stanów wzbudzonych. Wszystkie dodatnie hybrydomy wykazywały współzawodnictwo przeciwciał o wiązanie z IL-18.

D. Oznaczenie neutralizacji

PBMC od zdrowych dawców izolowano w gradiencie Ficol-Paque (Pharmacia) i hodowano w 96-studzienkowych płytkach w podłożu 10% FBS DMEM/F12 z 1 μg/ml ConA (Sigma) w obecności IL-18 (5 ng/ml) i/lub przeciwciał monoklonalnych. Po hodowli w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C, 5% CO₂ w powietrzu, 90% wilgotności, pobierano 25 μl i mierzono stężenie interferonu gamma (IFNg) w oznaczeniu immunologicznym. Wyniki, otrzymane jako średnie z trzech doświadczeń, podsumowano w Tablicy I.

E. Pomiary powinowactwa przeciwciała monoklonalnego

Powinowactwo oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych mierzono w biosensorze optycznym BIAcore (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Szwecja) stosując szybkość przepływu 30 μl/minutę. Dane kinetyczne oszacowywano stosując zależność opisaną uprzednio (Karlsson i in., J. Immunol. Meth., 145: 229-240 (1991), którą w całości włączono do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy). Przeciwciało monoklonalne (rozcieńczone w buforze HBS, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,01% Tween 20, pH 7,4) wstrzykiwano nad powierzchnię z króliczym przeciwciałem skierowanym przeciw Fc IgG myszy lub kozim przeciwciałem skierowanym przeciw Fc IgG szczura, po czym następował przepływ buforu i rejestrowano RU. Następnie w ciągu 180 sekund wstrzykiwano IL-18, po czym następował przepływ buforu w ciągu 500 sekund i rejestrowano RU. Powierzchnię chipu sensora regenerowano przez wstrzyknięcie 0,1 M kwasu fosforowego. Szybkości wiązania (Kass) i szybkości dysocjacji

PL 202 396 B1 (Kdiss) dla wiązania obliczano stosując oprogramowanie BIAcore i łącznie pozwalały one na uzyskanie obliczonej stałej równowagi (KD), wynoszącej 12 x 10^-9 M dla przeciwciała monoklonalnego 13G9, 3 x 10^-11 M dla przeciwciał a monoklonalnego 2C10 i 1,5 x 10^-10 M dla przeciwciał a monoklonalnego 14B7. Patrz Tablica I.

F. Analiza epitopów przeciwciała monoklonalnego

Analizę epitopów oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych przeprowadzano przez pomiar z zastosowaniem BIAcore. Stosując szybkość przepływu 10 μΙ/minutę, pierwsze przeciwciało monoklonalne (rozcieńczone w buforze HBS) wstrzykiwano nad powierzchnię z króliczym przeciwciałem skierowanym przeciw Fc IgG myszy lub kozim przeciwciałem skierowanym przeciw Fc IgG szczura, po czym następowało wstrzykiwanie IL-18 w ciągu 240 sekund, wstrzykiwanie blokujących przeciwciał monoklonalnych w ciągu 48 sekund i wstrzykiwanie drugiego przeciwciała monoklonalnego w ciągu 240 sekund. Powierzchnię regenerowano przez wstrzyknięcie 0,1 M kwasu fosforowego i po każdym wstrzyknięciu rejestrowano RU. Stwierdzono, że przeciwciała monoklonalne 13G9, 2C10 i 14B7 posiadają podobne lub pokrywające się epitopy.

TABLICA I

Powinowactwo i aktywność neutralizująca przeciwciał monoklonalnych reaktywnych wobec IL-18 człowieka

mAb	Kd (pM)a	Neutralizacja IC50 (nM)b
2C10 (szczura	39	0,1
14B7 (szczura	150	0,2
13G9 (myszy)	12000	3,0

^a Określona przez analizę z zastosowaniem biosensora optycznego (BIAcore) (25°C) ^b Hamowanie wytwarzania IFN gamma (w nM) przez PBMC w odpowiedzi na 5 ng/ml IL-18 człowieka

P r z y k ł a d 3 - Sekwencje CDR

Klonowanie genów i analiza sekwencji

Geny regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich sklonowano z komórek hybrydom stosując standardowe metody biologii molekularnej, opisane krótko poniżej. Z komórek hybrydom wyizolowano całkowity RNA stosując odczynnik TRIzol (Life Technologies, nr kat. 15596-026) zgodnie z protokołem producenta. RNA poddano odwrotnej transkrypcji stosując zestaw do RT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta (Boehringer Mannheim, nr kat. 1483-188) stosując oligonukleotyd poli-dT jako starter. Po syntezie pierwszej nici cDNA, regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich zamplifikowano przez PCR stosując 3'-końcowe startery specyficzne wobec regionu stałego i zdegenerowane startery 5'-końcowe. Sekwencje zdegenerowanych starterów 5'-końcowych zaprojektowano tak, aby kodowały określone uprzednio N-końcowe sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego lub lekkiego. W każdej PCR otrzymano pełnej długości sekwencje wielu klonów i przyporządkowano je wzajemnie dla uzyskania konsensu. A zatem, pierwszych 17 zasad sekwencji DNA dla zarówno łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego zostało utworzonych przez starter PCR, jednak sekwencja białka ulegającego translacji jest natywna.

Sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe przeciwciał hybrydom 2C10, 13G9 i 14B7 przedstawiono na Figurach 1-6. W każdym przypadku CDR i kodujące je sekwencje nukleotydowe otoczono ramkami. Sekwencje zdegenerowanych starterów pogrubiono.

PL 202 396 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Holmes, Stephen D.

Ho, Yen Sen Taylor, Alexander Abdel-Mequid, Sherin S.

<120> Zrekombinowani antagoniści IL-18 użyteczni w leczeniu zaburzeń, w których uczestniczy IL-18 <130> P50897 <140> 60/125 299 <141> 1999-03-19 <160> 48 <170> FastSEQ for Windows, wersja 3,0 <210> 1 <211> 324 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1) ... (324) <223> region V łańcucha lekkiego <400> 1

PL 202 396 B1

gac

att

caa

atg

acc

cag

tct

cca

get

tcc

ctg

tct

gca

tct

ctg

gga

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

gaa

act

gtc

tcc

atc

gaa

tgt

ctg

gca

agt

gag

gac

ata

tac

act

tat

Gin

Thr

Val

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Thr

Tyr

20

25

30

tta

aca

tgg

tat

cag

cag

aaa

cca

ggg

aa a

tct

cct

caa

ctc

ctg

atc

Leu

Thr

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

tat

ggt

gca

aat

aag

ttg

caa

gat

ggg

gtc

cca

tea

cgg

ttc

agt

ggc

Tyr

Gly

Ala

Asn

Lys

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

55 60

144

192

agt

gga

tct

ggc aca

cag

tat

tct

ctc

aag

atc

agc

ggc

ata caa

cct

Ser

Gly

Ser

Gly Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Gly

Ile Gin

Pro

65

70

75

00

240

gaa

gat

gaa

ggg

gat

tat

ttc

tgt

eta

cag

ggt

tcc

aag

ttt

ccg

ctc

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Gly

Ser

Lys

Phe

Pro

Len

85

90

95

acg

ttc

ggt

tct

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

cgg

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

<210>	2
<211>	108
<212>	białko
<213>	Rattus	norvegicus
<400>	2
Asp Ile Gin Met	Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

5 10 15

PL 202 396 B1

Glu

Thr

Val

Ser 20

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala 25

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr 30

Thr

Tyr

Leu

Thr

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Asn

Lys

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Gly

Ile

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Gly

Ser

Lys

Phe

Pro

Leu

8 5

90

95

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(33) <223> CDR I łańcucha lekkiego VK2C10 <400> 3 ctg gca agt gag gac ata tac act tat tta aca

Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr

10 <210> 4 <211> 11 <212> białko

PL 202 396 B1 <213> Rattus norvegicus <400> 4

Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Tyr Leu Thr

10 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(21) <223> CDR II łańcucha lekkiego VK2C10 <400> 5 ggt gca aat aag ttg caa gat

Gly Ala Asn Lys Leu Gin Asp

5 <210> 6 <211> 7 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 6

Gly Ala Asn Lys Leu Gin Asp

5 <210> 7

PL 202 396 B1 <211> 27 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(27) <223> CDR III łańcucha lekkiego VK2C10 <400> 7 eta cag ggt tcc aag ttt ccg ctc acg

Leu Gin Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr , 5 <210> 8 <211> 9 <212> białko · <213> Rattu's norvegicus <400> 8

Leu Gin Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr

5 <210> 9 <211> 378 <212> DNA <213> Rattus noruegicus <220>

<221> sekwencja kodująca

PL 202 396 B1 <222> (1) ... (378) .

<223> region V łańcucha ciężkiego <400> 9

gag

gtc

cag

ct.a

cag

cag

tct

ggg

get

gag

ctt

gtg

aga

cct

ggg

acc

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala

alu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Thr

1

c

10

15

tct

gtg

aag

tta

tct

tgc

aaa

gtt

tct

ggc

gaa

ata

ag t

aca

gga

tac

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

fal

Ser

Gly

Glu

I ’ e

Ser

Thr

Gly

Tyr

20

25

30

tst

ttc

cac

ttt.

gtg

agg

ega

agg

cct

gga

cag

ggt

ctg

gaa

tgg

ata

Tyr

Phe

His

Phe

fal

Arg

Arg

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

gga

agg

att

gat

cct

gag

gat

gat

agt

ac'

aaa

tat

gc“

gag

agg

tcc

Gly

Arg

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Asp

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Arg

Phe

50

5 5

60

aaa

gac

agg

gcg

acg

ctc

act

gca

caa

aca

tcc

tcc

aac

aca

gee

tac

Lys

Asp

Arg

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Gin

Thr

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

ctg

aac

ctc

agc

agc

ctg

acc

tct

gag

gac

act

gca

act

tat

ttt

tgt

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

acc

aca

tgg

cgg

ata

Lac

ega

gat

agt

tct

ggc

ege

ccc

ttc

tat

gtt

Thr

Thr

Trp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Asp

Ser

Ser

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Val

100

105

110

atg

gat.

gcc

tgg

ggt

caa

gga

get

tea

gtc

act

gtc

tcc

tea

Met

Asp

Ala

Trp

Gly

Gin

Gly

Ala

Ser

Val

Thr

fal

Ser

Ser

115 120 125 <210> 10

PL 202 396 B1 <211> 126 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 10

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys VaL Ser Gly Glu Ile Ser Thr Gly Tyr

25 30

Tyr Phe His Phe Val Arg Arg Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Tle 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe

55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gin Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

70 75 80

Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

90 95

Thr Thr Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val

100 105 110

Met Asp Ala Trp Gly Gin Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(15)

PL 202 396 B1 <223> CDR I łańcucha ciężkiego VH2C10 <400> 11 gga tac tat ttc cac

Gly Tyr Tyr Phe His

5 <210> 12 <211> 5 .

<212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 12

Gly Tyr Tyr Phe His

5 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(51) <223> CDR II łańcucha ciężkiego VH2C10 <400> 13 agg att gat cct gag gat gat agt act aaa tat gct gag agg ttc aaa Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys

10 15 gac

PL 202 396 B1 <210> 14 <211> 16 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 14

Arg Ile Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys 15 10 15 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus norregicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1) ... (51) <223> CDR III łańcucha ciężkiego VH2C10 <400> 15

tgg

cgg

ata

tac

ega

gat

agt

tet ggc

ege ccc

ttc

tat

gtt

atg

gat

Trp

Arg

Tle

Tyr

Arg

Asp

Ser

Ser Gly

Arg Pro

Phe

Tyr

Val

Met

Asp

1

5

10

15

<210> 16 <211> 16 <212> białko <213> Rattus norvegicus

PL 202 396 B1 <400> 16

Trp Arg Ile Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg' Pro Phe Tyr Val Met Asp 15 10 15 <210> 17 <211> 342 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1) . . .(342)

<22,

3> regi

on' '

V łańcu

cha

lekkie

go

<40

0> 17

gac

gtt

gtt

atg

act

caa

act

cct

ctc

tcc

ctg

cct

gtc

agt

ctr

gga

48

Asp

Val

Va 1.

Met

Thr

Gin

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Ser

Leu

Gly

1

5

10

15

gat

caa

gcc

tcc

atc

tct

tgc

aga

tct

agt

cag

agc

ctt

gta

cac

agt

96

Asp

Gin

Ala

Ser

Ile

Ser

Cys

Arg

Ser

Ser

Gin

Ser

Leu

Val

His

Ser

20

25

30

aat

gga

aac

acc

tat

tta

cat

tgg

tac

erg

cag

aag

cca

ggc

cag

tct

144

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Leu

His

Trp

Tyr

Leu

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

35

40

45

cca

aag

ctc

ctg

atc

tac

aaa

gtt

tcc

aac

ega

ttt

tct

ggg

gtc

cca

192

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

Ser

Gly

Val

Pro

50

55

60

gac

agg

ttc

agt

ggc

agt

gga

tca

ggt

aca

gat

ttc

aca

ctc

aag

atc

240

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

C-ly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Lys

Ile

65

70

75

80

PL 202 396 B1

agc

aga

gtg

gag

gct

gag

gat

ctg

gga

gtt

tat

ttc

tgc

tct

caa

agt

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Leu

Gly

Val

Tyr

Phe

Cys

Ser

Gin

Ser

85

90

95

aca

cal

gtt

cct

ccg

tac

acg

ttc

gga

ggg

ggg

acc

aag

ctg

gaa

ata

Thr

His

Val

Pro

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

100

105

110

aaa cgg

Lys Arg <210 18 <211> 114 <212> białko <213> Mus musculus <400 18

Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95

Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 HO

Lys Arg

PL 202 396 B1 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(48)

<223>	CDR	1 łańcucha	lekkiego	VK13G9
<400>	19
aga ret	agt	cag age ctt	gta cac	agt	aat	gga	aac	acc	tat	tta	cat
Arg Ser	Ser	Sin Ser Leu	Val His	Ser	Asn	Gly	Asn	Thr	Tyr	Leu	His
1		5			10					15
<210>	20
<211>	16
<212>	białko
<213>	Mus	musculus
<400>	20
Arg Ser	' Ser	Gin Ser Leu	Val His	Ser	Asn	Gly	Asn	Thr	Tyr	Leu	His
1		5			10					15

<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

PL 202 396 B1 <221> sekwencja kodująca <222> (1)...(21) <223> CDR II łańcucha lekkiego VK13G9 <400> 21 aaa gtt tcc aac ega ttt tet 21

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

5 <210> 22 <211> 7 <212> białko <213> Mus musculus <400> 22

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

5 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(30) <223> CDR III łańcucha lekkiego CK13G9 <400> 23

PL 202 396 B1

tct	caa	agt	aca cat	gtt	cct	ccg	tac	acg	30
Ser	Gin	Ser	Thr His	Val	Pro	Pro	Tyr	Thr
1			5					10

<210> 24 <211> 10 <212> białko <213> Mus musculus <400> 24 ,

Ser Gin Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr

5 10 <210> 25 <211> 369 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(369) <223> region V łańcucha ciężkiego <400> 25

caa

gtt

act

ctt

aag

gag

tct

ggc

cct

ggg

ata

ttg

aag

ccc

tea

cag

48

Gin

Val

Thr

Len

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ile

Leu

Lys

Pro

Ser

Gin

1

5

10

15

acc

ctc

agt

ctg

act

tgt

tct

ttc

tct

ggg

ttt

tct

ctg

agc

act

tct

96

Thr

Len

Ser

Len

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Ser

20

25

30

PL 202 396 B1

ggt

atg

ggL

att

gcc tgg

gtt

cgt

cag

cct

tca

ggg

aag

ggt

ctg

gag

Gly

Met

Gly

Ile

Ala Trp

Val

Arg

Gin

Fro

Ser

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

35

40

45

tgg

ctg

gca

gac

att tgg

tgg

gat

gat

aat

aag

tat

tat

aat

cca

tcc

Trp

Leu

Ala

Asp

Ile Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

ctg

gag

agc

cag

ctc aca

atc

tcc

aag

gat

acc

tcc

aga

aac

cag

gta

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

Asn

Gin

Val

65

. 70

75

80

ttc

ctc

acg

atc

acc agt

gtg

gac

act

gca

gat

tet

gcc

act

tat

tac

Phe

Leu

Thr

Ile

Thr Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

tgt

gct

cgt

cat

cat tac

gac

ggt

agt.

agc

ctc

ctg

cct

atg

gac

tac

Cys

Ala

Arg

His

His Tyr

Asp

Gly

Ser

Ser

Leu

Leu

Pro

Met

Asp

Tyr

100

105

110

tgg

ggt

caa

gga

acc tca

gtc

acc

gtc

tcc

tca

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 <210> 26 <211> 123 <212> białko <213> Mus musculus <400> 26

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

PL 202 396 B1

Gly

Met

Gly 35

Ile Ala

Trp Val

Arg 40

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys 45

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

A^la

Asp

Ile

Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Ser

50

55

60

Leu

Glu

Ser

Gin

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Arg

Asn

Gin

Val

65

70

7 5

80

Phe

Leu

Thr

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

85

90

95

Cys

Ala

Arg

His

His

Tyr

Asp

Gly

Ser

Ser

Leu

Leu

Pro

Met

Asp

Tyr

100

105

110

Trp

Gly

Gin.

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(21) <223> CDR I łańcucha ciężkiego VH13G9 <400> 27 act tct ggt atg ggt att gcc

Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala

5 <210> 28 <211> 7

PL 202 396 B1 <212> białko <213> Mus musculus <400> 28

Thr Ser Gly Met Gly Ile Ala

5 <210> 29 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(48) <223> CDR II łańcucha ciężkiego VH13G9 <400> 29

gac

att

tgg

tgg

gat

gat

aat

aag

tat

tat

aat cca

tcc

ctg

gag

agc

48

Asp

Ile

Trp

Trp

Asp

Asp

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Asn Pro

Ser

Leu

Glu

Ser

1

5

10

15

<210>	30
<211>	16
<212>	białko
<213>	Mus musculus

<400> 30

Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser

10 15

PL 202 396 B1 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)-.. (39)

<223>	CDR	III	łańcucha	ciężkiego	VH13G9
<4 0 0>	31
cat cat	tac	gac	ggt agi agc	ctc ctg cct	atg gac tac
His His	Tyr	Asp	Gly Ser Ser	Leu Leu Pro	Met Asp Tyr
1			5		10
<210>	32
<211>	13
<212>	białko
<213>	Mus	musculus
<400>	32
His His	Tyr	Asp	Gly Ser Ser	Leu Leu Pro	Met Asp Tyr
1			5		10

<210> 33 <211> 324 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca

PL 202 396 B1 <222> (1)...(324) <223> region V łańcucha lekkiego <400> 33 gat att caa atg acg cag tct cca gct tcc ctg tct gca tct ctg gga

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

10 15 gaa act gct tcc atc gaa tgt eta gca agt gag gac ata tac agt tat

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr

25 30

tta

gca

tgg

tat.

caa

cag

aag

cca

ggg

aaa

tct

cct

cag

ctc

ctg

atc

144

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin,

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Prc

Gin

Leu

Leu

Tle

35

4-Gi

45

tat

gee

aca

aaa

agg

ttg

caa

gat

ggg

gtc

cca

tea

cgg

ttc

agt

ggc

192

Tyr

Ala

Thr

Lys

Arg

Leu

Gin

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

agt

gga

tct

ggc

aca

cag

tat

tct

ctc

aaa

ata

agc

gac

atg

caa

cct

240

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

1.] e

Ser

Asp

Met

Gin

Pro

65

70

75

80

gaa

gat

gaa

ggg

gat

tat

ttc

tgt

eta

cag

aat

tcc

aag

ttt

ccg

gtc

288

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Pro

Val

85

90

95

acg

ttc

gqt

tct

ggg

acc

aag

ctg

gag

atc

aaa

cgg

324

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

<210>

34

<211>

108

<212>

bia

łko

<213>

Rat

tus

norveg

icus

PL 202 396 B1

<40i

3> 34

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Leu

Gly

1

' 5

10

15

Glu

Thr

Val

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Asp

Ile

Tyr

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Ala

Thr

Lys

Arg

Leu

Gin

Asp

Gly.

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Asp

Met

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Leu

Gin

Asn

Ser

Lys

Phe

Pro

Val

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100 105 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(33) <223> CDR I łańcucha lekkiego VK14B7 <400> 35 eta gca agt gag gac ata tac agt tat tta gca Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

10

PL 202 396 B1 <210> 36 <211> 11 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 36

Leu Ala Ser Glu Asp Tle Tyr Ser Tyr Leu Ala

5 10 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(21) <223> CDR II łańcucha lekkiego CK14B7 <400> 37 gcc aca aaa agg ttg caa gat

Ala Thr Lys Arg T.eu Gin Asp

5

<400> 38

PL 202 396 B1

Ala Thr Lys Arg Leu Gin Asp

5 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1) ... (27) <223> CDR III łańcucha lekkiego VK14B7 <400> 39 eta cag aat tcc aag ttt ccg gtc acg

Leu Gin Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr

5 <210> 40 <211> 9 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 40

Leu Gin Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr

5 <210> 41 <211> 368 <212> DNA

PL 202 396 B1 <213> Rattus norvegicus <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(368) <223> region V łańcucha ciężkiego <400> 41

gag

gtt

cag

ctt

cag

cag

tct

ggg

get

gag

ctt

gtg

aga

cct

ggg

acc

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Thr

1

5

10

15

tct

gtg

aag

ttt

tct

tgc

aaa

gtt

tct

ggc

gat

acc

cct

aca

aca

tac

Ser

Val

Lys

Phe

Ser

Cys

Lys

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

Thr

Tyr

20

25

30

Lac

gtg

cac

ttt

gtg

aga

caa

agg

cct

gga

cag

ggt

ctg

gaa

tgg

ata

Tyr

val

His

Phe

Val

Arg

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp.

Ile

35

40

45

gga

agg

att

gat

cct

gag

gat

act

agt

act

aaa

tar

get

gag

aag

ttc

Gly

Arg

Tle

Asp

Pro

Glu

Asp

Thr

Ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

aga

aat

aag

gcg

aca

ttc

act

gca

gat

cca

tcc

tcc

aac

aca

gcc

tac

Arg

Asn

Lys

Ala

Thr

Phe

Thr

Ala

Asp

Pro

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

7 0

75

80

eta

aac

ctc

agc

agc

ctg

acc

cct

gag

gac

act

gca

acc

tat

ttt

tgt

Leu

Asn

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Asp

Thr

Al a

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

acc

ata

atg

cgg

tac

cat

agt

acc

tat

agg

gtc

tat

gtt

atg

gat

ttc

Thr

Ile

Met

Arg

Tyr

His

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Tyr

Val

Met

Asp

Phe

100

105

110

tgg

ggt

caa

gga

act

gca

gtc

. act

gtc

tcc

tc

PL 202 396 B1

TRp Gly Gin Gly Thr Ala Val Thr Val Ser

115 120 <210> 42 <211> 122 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 42

Glu Val

Gin

Leu

Gin Gin Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

Pro

Gly

Thr

1

5

10

15

Ser Val

Lys

Phe

Ser Cys Lys

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

Thr

Tyr

20

25

30

Tyr Val

His

Phe

Val Arg Gin

Arg

Pre-

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly Arg

Ile

Asp

Pro Glu Asp

Thr

ser

Thr

Lys

Tyr

Ala

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Arg Asn

Lys

Ala

Thr Phe Thr

Ala

Asp

Pro

Ser

Ser

Asn

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu Asn

Leu

Ser

Ser Leu Thr

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr Ile

Met

Arg

Tyr His Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Tyr

Val

Met

Asp

Phe

100

105

110

Trp Gly

Gin

Gly

Thr Ala. Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210>

43

<211>

15

<212>

DNA

<213>

Rattus

norvegicus

PL 202 396 B1 <220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1)...(15) <223> CDR I łańcucha ciężkiego VH14B7 <400> 43 aca tac tac gtg cac 15

Thr Tyr Tyr Val His

5 <210 44 <211> 5 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 44

Thr Tyr Tyr Val His

5 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220 <221> sekwencja kodująca <222> (1)...(51) <223> CDR II łańcucha ciężkiego VH14B7 <400 45

PL 202 396 B1 agg att gat cct gag gat act agt act aaa tat gct gag aag ttc aga Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg

5 10 15 aat <210> 46 <211> 16 <212> białko <213> Rattus norvegicus

<400> 46 Arg Ile Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg
1	5	10 15
<210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus	norvegicus

<220>

<221> sekwencja kodująca <222> (1) ... (42) <223> CDR III łańcucha ciężkiego VH14B7 <400> 47 atg cgg tac cat agt acc tat agg gtc tat gtt atg gat ttc Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe

10 <210> 48

PL 202 396 B1 <211> 14 <212> białko <213> Rattus norvegicus <400> 48

Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe

Claims (7)

1. Neutralizujące monoklonalne przeciwciało szczurze specyficzne dla ludzkiej interleukiny-18 lub jego fragment, znamienne tym, że zawiera region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr: 9.

2. Neutralizujące przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest humanizowanym przeciwciałem zawierającym następujące regiony determinujące komplementarność (CDR);

CDRL1 o sekwencji SEQ ID nr: 4

CDRL2 o sekwencji SEQ ID nr: 6

CDRL3 o sekwencji SEQ ID nr: 8

CDRLH1 o sekwencji SEQ ID nr: 12

CDRLH2 o sekwencji SEQ ID nr: 14

CDRLH3 o sekwencji SEQ ID nr: 16

3. Neutralizujące przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest chimerycznym przeciwciałem zawierającym region zmienny łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

4. Neutralizujące przeciwciało według zastrz. 1, albo 2, znamienne tym, że jego fragment stanowi neutralizujący fragment Fab lub jego fragment F(ab')2.

5. Kwas nukleinowy kodujący przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 1.

6. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub fragment przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

7. Zastosowanie przeciwciała lub fragmentu neutralizującego Fab lub F(ab')2 jak zdefiniowano w zastrz. 1, do wytwarzania leku do leczenia stanów wybranych z grupy obejmującej chorobę autoimmunologiczną, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzycę typu 1, czyli insulinozależną, chorobę zapalną jelit i łuszczycę.