JPWO2007046439A1 - 抗体を産生するトランスジェニックカイコとその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔2〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔3〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔2〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔4〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔2〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔5〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔3〕又は〔4〕に記載の方法。
〔6〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔2〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔6〕に記載の方法。
〔7−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔7〕に記載の方法;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔7−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔7〕に記載の方法;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔8〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔6〕に記載の方法。
〔8−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔8〕に記載の方法;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔9〕シグナル配列を有する組換え抗体。
〔9−1〕シグナル配列が動物由来である、〔9〕に記載の抗体。
〔9−2〕シグナル配列が動物抗体由来である、〔9〕に記載の抗体。
〔9−3〕シグナル配列がヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列、またはマウスIgG1のシグナル配列である、〔9〕に記載の抗体。
〔10〕全長抗体または低分子抗体である、〔9〕に記載の抗体。
〔10−1〕低分子化抗体がscFv型抗体である、〔10〕に記載の抗体。
〔10−2〕一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点として、シグナル配列、VH、リンカー、VL、又はシグナル配列、VL、リンカー、VHの順に並んでいることを特徴とする、〔10−1〕に記載のscFv型抗体。
〔10−3〕抗原がトランスフェリン、CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、アルブミン、プレアルブミン、補体C3、補体C4、α-1 マイクログロブリン、β-2マイクログロブリン、AFP、CA 19-9、CA15-3、PSA、アポリポプロテイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、インターフェロン、オステオポンチン、HBs抗原、RF、HCG、コラーゲン、Hb、HbA1c、HCV抗体、トロポニン、ミオグロビン、FDP、CEA、c-erbB-2、haptoglobinである、〔10〕に記載のscFv型抗体。
〔10−4〕VH、リンカー、VLがそれぞれ、配列番号:6、9、12に記載のアミノ酸配列を含む、〔10−3〕に記載のscFv型抗体。
〔10−5〕シグナル配列が配列番号:3、21、および29のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、〔10−3〕に記載のscFv型抗体。
〔10−6〕配列番号:15に記載のアミノ酸配列を含む、scFv型抗体。
〔10−7〕シグナル配列として配列番号:3、21、および29のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するL鎖、及び、シグナル配列として配列番号:3、21、および29のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔10−8〕シグナル配列として配列番号:3、21、および29のいずれかに記載のアミノ酸配列、L鎖可変領域として配列番号:23に記載のアミノ酸配列、Jκセグメントとして配列番号:25に記載のアミノ酸配列、κ鎖定常領域として配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、及び、シグナル配列として配列番号:3、21、および29のいずれかに記載のアミノ酸配列、H鎖可変領域として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、CH1として配列番号:33に記載のアミノ酸配列、ヒンジ領域として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CH2として配列番号:37に記載のアミノ酸配列、CH3として配列番号:39に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔10−9〕配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、および、配列番号:51に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体。
〔11〕〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体をコードするDNA。
〔11−1〕シグナル配列として配列番号:2、20、および28のいずれかに記載の塩基配列、VHとして配列番号:5に記載の塩基配列、リンカーとして配列番号:8に記載の塩基配列、VLとして配列番号:11に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔11−2〕シグナル配列として配列番号:1、20、および28のいずれかに記載の塩基配列、VHとして配列番号:4に記載の塩基配列、リンカーとして配列番号:7に記載の塩基配列、VLとして配列番号:10に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔11−3〕配列番号:14に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔11−4〕配列番号:13に記載の塩基配列を含む、scFv型抗体をコードするDNA。
〔11−5〕シグナル配列として配列番号:1、2、20、および28のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAであって抗体L鎖をコードするDNA、及び、シグナル配列として配列番号:1、2、20、および28のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAであって抗体H鎖をコードするDNA、を含むDNA。
〔11−6〕シグナル配列として配列番号:1、2、20、および28のいずれかに記載の塩基配列、L鎖可変領域として配列番号:22に記載の塩基配列、Jκセグメントとして配列番号:24に記載の塩基配列、κ鎖定常領域として配列番号:26に記載の塩基配列を有するDNAであって抗体L鎖をコードするDNA、及び、シグナル配列として配列番号:1、2、20、および28のいずれかに記載の塩基配列、H鎖可変領域として配列番号:30に記載の塩基配列、CH1として配列番号:32に記載の塩基配列、ヒンジ領域として配列番号:34に記載の塩基配列、CH2として配列番号:36に記載の塩基配列列、CH3として配列番号:38に記載の塩基配列を有するDNAであって抗体H鎖をコードするDNA、を含むDNA。
〔11−7〕抗体L鎖として配列番号:48に記載の塩基配列を有するDNA、および、抗体H鎖として配列番号:50に記載の塩基配列を有するDNA、を含むDNA。
〔12〕〔11〕〜〔11−7〕のいずれかに記載のDNAを有するベクター。
〔13〕〔12〕に記載のベクターを保持する細胞。
〔14〕シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔15〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔16〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔15〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔17〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔15〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔18〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔16〕又は〔17〕に記載の方法。
〔19〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔15〕〜〔18〕のいずれかに記載の方法。
〔20〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔19〕に記載の方法。
〔20−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔20〕に記載の方法;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔20−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔20〕に記載の方法;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔21〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔19〕に記載の方法。
〔21−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔21〕に記載の方法;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔22〕シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
〔23〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔24〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔23〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔25〕以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔23〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔26〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔24〕又は〔25〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔27〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔23〕〜〔26〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔28〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔27〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔28−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔28〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔28−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔28〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔29〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔27〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔29−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔29〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔30〕転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔31〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔30〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔32〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔33〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔32〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔34〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔32〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔35〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔33〕又は〔34〕に記載の方法。
〔35−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔35〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔36〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔37〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔36〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔38〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔36〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔39〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔37〕又は〔38〕に記載の方法。
〔39−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔39〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔40〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔41〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔40〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。
〔42〕以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔40〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔43〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔41〕又は〔42〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔43−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔43〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔44〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、生体中のトランスフェリンの量を測定する方法;
(a)〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者由来の生体試料を接触させる工程、
(b)生体試料中のトランスフェリンと抗体の結合を検出する工程。
〔45〕正常である対照と比較してトランスフェリンの量が多いときに、糖尿病性腎症に罹患している、又は罹患リスクが高いと判定されることを特徴とする、以下の(a)及び(b)の工程を含む、糖尿病性腎症を診断する方法;
(a)〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
(b)生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔46〕糖尿病性腎症に罹患していることが明らかな対照と比較してトランスフェリンの量が同程度であるときに、糖尿病性腎症に罹患している、又は罹患リスクが高いと判定されることを特徴とする、以下の(a)及び(b)の工程を含む、糖尿病性腎症を診断する方法;
(a)〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
(b)生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔47〕正常である対照と比較してトランスフェリンの量が少ないときに、栄養障害のリスクが高い、または栄養障害に陥っていると判定されることを特徴とする、以下の(a)及び(b)の工程を含む、栄養状態を評価する方法;
(a)〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体と、被検者から得た生体試料を接触させる工程、
(b)生体試料中のトランスフェリンと結合した抗体を検出する工程。
〔48〕〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体を有効成分として含有する、糖尿病性腎症の診断薬。
〔49〕〔9〕〜〔10−9〕のいずれかに記載の抗体、又は、〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔79−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体を有効成分として含有する、栄養状態を評価するための試薬。
〔50〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔51〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔52〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔51〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔53〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔51〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔54〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔52〕又は〔53〕に記載の方法。
〔55〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔51〕〜〔54〕のいずれかに記載の方法。
〔56〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔55〕に記載の方法。
〔56−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔56〕に記載の方法;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔56−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔56〕に記載の方法;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔57〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔55〕に記載の方法。
〔57−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔57〕に記載の方法;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔58〕組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔59〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔60〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔59〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔61〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔59〕に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔62〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔60〕又は〔61〕に記載の方法。
〔63〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔59〕〜〔62〕のいずれかに記載の方法。
〔64〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである〔63〕に記載の方法。
〔64−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔64〕に記載の方法;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔64−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔64〕に記載の方法;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔65〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔63〕に記載の方法。
〔65−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔65〕に記載の方法;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔66〕組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
〔67〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔68〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔67〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔69〕以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔67〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔70〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔68〕又は〔69〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔71〕絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である〔67〕〜〔70〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔72〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔71〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔72−1〕セリシン1タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔72〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:16に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:16に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔72−2〕セリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔72〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:17に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:17に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔73〕絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔71〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔73−1〕フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔73〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(a)配列番号:18に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:18に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔74〕転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔75〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔74〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔76〕以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
〔77〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔76〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔78〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔76〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔79〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔77〕又は〔78〕に記載の方法。
〔79−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔79〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔80〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔81〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔80〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔82〕トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔80〕に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔83〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔81〕又は〔82〕に記載の方法。
〔83−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔83〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔84〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔85〕以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、〔84〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA。
〔86〕以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔84〕に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔87〕転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔85〕又は〔86〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔87−1〕細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)又は(b)である、〔87〕に記載の方法;
(a)配列番号:19に記載の塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号:19に記載の塩基配列において1又は複数の塩基が置換、欠失、付加、及び/又は挿入された塩基配列を含むDNA。
〔88〕〔1〕〜〔8−1〕、〔32〕〜〔35−1〕、〔50〕〜〔57−1〕もしくは〔76〕〜〔87−1〕のいずれかに記載の方法によって製造された抗体。
(a)組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法を提供する。
(a)シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
N末端-シグナル配列-[VH]-リンカー-[VL]-C末端
N末端-シグナル配列-[VL]-リンカー-[VH]-C末端
また本発明の好ましいシグナル配列として、例えば、酸性フォスファターゼのシグナル配列を挙げることも出来る。酸性フォスファターゼの由来は特に制限されず、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫由来の酸性フォスファターゼが挙げられる。
また本発明においては、Transferrin又はCEA、c-erbB-2、haptoglobinに結合する抗体であって、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖、および、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖を含む抗体も特に好ましい。このような抗体は、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を有するL鎖、および、配列番号:51に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体である。また、配列番号:49に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入され、配列番号:49に記載のアミノ酸配列を含む抗体と同等の活性を有するL鎖、および、配列番号:51に記載のアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入され、配列番号:51に記載のアミノ酸配列を含む抗体と同等の活性を有するH鎖を含む抗体も、本発明の抗体として特に好ましい。
また、Transferrinに結合する抗体のL鎖をコードするDNAであって、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAの好ましい態様としては、配列番号:48に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられる。また、配列番号:48に記載の塩基配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入され、配列番号:48に記載のDNAと同等の機能を有するDNAが挙げられる。
さらに、Transferrinに結合する抗体のH鎖をコードするDNAであって、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖をコードするDNAの好ましい態様としては、配列番号:50に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられる。また、配列番号:50に記載の塩基配列において1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入され、配列番号:50に記載のDNAと同等の機能を有するDNAが挙げられる。
なお、本発明の方法によって製造される抗体は、本発明の方法によって製造される限りなんら限定されず、シグナル配列を有していても、有していなくてもよい。即ち、本発明の抗体の製造方法によって製造される抗体には、シグナル配列を有している抗体、シグナル配列を有していない抗体の両方が含まれる。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有するものが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。。
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
また本発明は、以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法に関する。
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程。
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。
なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、シグナル配列を有することが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
なお、本発明の方法によって製造される抗体は、本発明の方法によって製造される限りなんら限定されず、シグナル配列を有していても、有していなくてもよい。即ち、本発明の抗体の製造方法によって製造される抗体には、シグナル配列を有している抗体、シグナル配列を有していない抗体の両方が含まれる。
本発明はさらに、マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖およびマウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖を含む抗体をコードするDNAに関する。マウスイムノグロブリンL鎖κのシグナル配列を有するL鎖をコードするDNAとしては、配列番号:48に記載のDNAが挙げられる。さらに、配列番号:48に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号:48に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。一方、マウスIgG1のシグナル配列を有するH鎖をコードするDNAとしては、配列番号:50に記載のDNAが挙げられる。さらに、配列番号:50に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号:50に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
なお本発明においては、細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするためシグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
なお本発明においては、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は上述の通りである。
なお、転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNA、及び、セリシン又はフィブロインをコードするDNAのプロモーターの下流に、組換え抗体をコードするDNAが機能的に結合したDNAは、抗体の分泌を促進し回収量を多くするため、シグナル配列を有していることが好ましい。シグナル配列の具体的な態様は、上述の通りである。
山口哲司:日本臨床、53(増刊号)、227−229 (1995)
安藤康雄:ホルモンと臨床、42(6)、91−95 (1994)
今野 稔:医学と薬学、32(3)、555−565 (1994)
石橋不可止:糖尿病、35(12)、949−954 (1992)
青木芳和:臨床病理レビュー 特集第127号,12-16,(2003,10)
櫻林郁之介 山田俊幸他:月刊Medical Technology 別冊臨床検査項辞典, (2003)
東高志 五嶋博道他:Medical Technology Vol30 906-911 No8(2002.8)
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕
材料および方法
1.プラスミドベクターの構築
本研究ではヒトTransferrinと反応するマウス抗ヒトTransferrin抗体のscFv型抗体(scFv型anti transferrin antibody:以下aTf)を組換えカイコで生産するため、プラスミドベクターpUASFvaTf(図1)を作成した。この組み換えカイコ作出のためのベクターは、酵母の転写制御因子GAL4の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターUASと融合した抗体タンパク質遺伝子FvaTfを、トランスポゾンpiggyBacの逆位末端反復配列の間に挿入したものである。
ウェスタンブロッティングは次のようにして行った。Ser1GAL4/3XP3DsRed系統とUASFvaTr系統を交配して得られた次世代の産卵後6日目の卵を実体蛍光顕微鏡で観察し、GAL4/UAS個体を同定した(図3)。両方の遺伝子を持つ個体のみ飼育し、5令吐糸0日目、5令吐糸1日目、5令吐糸2日目のカイコから絹糸腺を摘出し、細胞層を2% ドデシル硫酸リチウム 5mM EDTA 50mM Tris-HCl pH7.4で蛋白質を抽出した。同様に、陰性コントロールとしてUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の5令吐糸0日目のカイコについても絹糸腺を摘出し蛋白質を抽出した。この抽出試料2容に対しSDSサンプルバッファー(6% SDS、24%グリセロール、12% 2-メルカプトエタノール、0.1% BPB)を1容加え、SuperSep 5-20%(和光純薬工業社)にてSDS-PAGE後、以下のようにウェスタンブロットを行った。SDS-PAGE終了後、PVDF膜(ミリポア社製)に0.8mA/cm2、 1時間通電することにより蛋白質を転写し、ブロックエース(大日本製薬社)を用いてブロッキングを行った。これをPBS-T(0.05% Tween、 150mM NaCl、10mM リン酸バッファー、pH7.4)で洗浄した後、ウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体(アマシャムバイオサイエンス社)をブロックエースで100倍希釈した溶液を作製し、6時間室温で振とうした。ウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体反応後、上述と同様の洗浄操作を行い、PODイムノステインセット(和光純薬工業社)で検出した。
RT-PCRは以下のように行った。上述した通り、GAL4/UASの両方の遺伝子を持つ個体を飼育し、5令吐糸0日目、5令吐糸1日目、5令吐糸2日目のカイコから中部絹糸腺を摘出した。同様に、陰性コントロールとしてUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の5令吐糸0日目のカイコについても絹糸腺を摘出した。続いて摘出した中部絹糸腺をガラスホモジナイザー(WHEATON社)へ移し、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAをDPEC水で50μg/20μlに調製し、First-strand cDNA Synthesis Kit(アマシャムバイオサイエンス社)を使用し、添付文書に従ってcDNAへの逆転写を行った。この逆転写産物を鋳型として以下のPCRを行った。KODplus(東洋紡社)に添付の10×PCRバッファーを5μl、150μMのプライマー(配列番号:16)、150μMのプライマー(配列番号:17)、1mM MgSO4、0.2mM dNTPs、2単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量50μlとし、eppendorf社のDNAサーマルサイクラーにて94℃ 2min 1回、94℃ 15sec、62℃ 15sec、72℃ 30secのサイクルを35回、72℃ 1min 1回の伸長反応を行った。またPCRの陽性コントロールにはプラスミドベクターpUASFvaTfを鋳型に用いた。
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)による組換え抗体の抗原に対する活性の測定は以下の手順で行った。Ser1GAL4/UASFvaTf系統とUASFvaTfを持たないSer1GAL4系統の5令吐糸0日目のカイコから中部絹糸腺を摘出し、摘出した組織200mg当たり1mlの Trisバッファー(20mM Tris-HCl pH7.4)を添加した。これをガラスホモジナイザーで粉砕し、さらに14000rpm 20分間の遠心後、上清をTrisバッファーで5倍(40mg/ml)と10倍(10mg/ml)に希釈した。これら及び無希釈の試料(原倍;200mg/ml)をELISA測定用試料とした。また、陰性コントロールとしてSer1GAL4系統のカイコについても同様の操作でELISA測定用試料を調製した。予めTransferrin(Biogenesis社)を100μg/wellで感作したマイクロタイタープレート(ヌンク社)に上記で作製したELISA測定用試料の100μL分注し、室温で2時間、振とうさせた。次いで、ELISA測定用試料をwellから捨て200μLのPBS-Tでwellを3回洗浄し、予めウサギ抗マウスIg-HRP標識抗体をPBS(150mM NaCl、10mM リン酸バッファー、pH7.4)で100倍希釈した溶液をwellに100μL分注し、室温で6時間、振とうさせた。続いて洗浄操作を行い100μLの3,3’,5,5’―テトラメチルベンジジン(日本ロシュ社)を加え発色させた。3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンを加えてから正確に3分後に1N硫酸を100μL分注し、発色を停止させた。発色停止後、モデル550マイクロプレートリーダー(BioRad)にて450nmの吸光度を測定した。
上記の方法で作製したプラスミドと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドpA3PIG(Tamura et al., 2000)を一緒に約1000粒の発生初期のカイコ卵に注射し、次世代の胚の単眼におけるGFPの発現を調べた。その結果、表3に示したように、2蛾区においてGFPを発現する個体が出現した。
材料および方法
1.プラスミドベクターの構築
本研究では、ヒトTransferrinと反応するIgG型マウス抗ヒトTransferrin抗体を組換えカイコで生産するため、プラスミドベクターpBacN/lox p UASIgL UASIgH(図7〜9)を作製した。この組換えカイコ作出のためのベクターは、酵母の転写制御因子GAL4の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターUASと融合した抗体タンパク質遺伝子のL鎖およびH鎖をトランスポゾンpiggyBacの逆位末端反復配列の間に挿入したものである。
GAL4/UASシステムにおける遺伝子プラスミドは、図7〜9に示す手順によって構築した。すなわち、制限酵素Bln Iで消化したドナーベクターpBluescript II UAS-SV40へpUC57/IgLから制限酵素Nhe Iで消化したIgLフラグメントを挿入し、pBluescript II/UAS IgL SV40を得た。次いで、制限酵素Bln Iで消化したプラスミドベクターpBacN/lox pへpBluescript II/UAS IgL SV40から制限酵素Spe Iで消化したUAS IgL SV40UTRフラグメントを挿入し、pBacN/ lox p UAS IgL SV40を得た(図7)。また、制限酵素Bln Iで消化したドナーベクターpDNR/UAS-SV40へpUC57/IgHから制限酵素Nhe Iで消化したIgHフラグメントを挿入し、pDNR/UAS IgH SV40を得た(図8)。次いで、Cre Recombinaseを用いてUAS IgH SV40UTRフラグメントをpBacN/lox p UAS IgL SV40へ挿入した(図9:pBacN/loxp UASIgL UASIgH)。
この遺伝子を目的部位に発現させるため、既に系統化されているSer1GAL4/3xP3DsRed系統のカイコ(田村ら、2004)を用いた。この組換えカイコでは中部絹糸腺でのみGAL4遺伝子が発現し、UASに制御される導入遺伝子を発現させることが確認されている(田村ら、2004)。導入したIgG型抗ヒトTransferrin抗体を発現させるため、得られたIgG型抗ヒトTransferrin抗体遺伝子を持つUASIgL-UASIgH系統を上記のGAL4系統と交配した(図10)。
RT-PCRは以下のように行った。上述した通り、GAL4/UASの両方の遺伝子を持つ個体を飼育し、5令吐糸期直前のカイコから中部絹糸腺を摘出した。続いて摘出した中部絹糸腺をガラスホモジナイザー(WHEATON社)へ移し、ISOGEN(ニッポンジーン社)を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAをDEPEC水で50μg/20μlに調製し、First-strand cDNA Synthesis kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を使用し、添付文書に従ってcDNAへの逆転写を行った。この逆転写産物を鋳型として、表6に示すプライマーの組み合わせでIgL、IgH、GAL4、細胞内アクチンについて以下のPCRを行った。TaKaRa Ex Taq Hot Start Version(タカラバイオ社)に添付の10×PCRバッファーを5μl、100μMのForward primer(表6)、100μMのReverse primer(表6)、0.2μM dNTP、2.5単位TaKaRa Ex Taq Hot Start Versionとなるように各試薬を加え、全量50μlとし、eppendorf社のサーマルサイクラーにて、94℃ 2min 1回、94℃ 15sec、60℃ 15sec、72℃ 30secのサイクルを40回、72℃ 1minの伸長反応を行った。
IgG型マウス抗体の検出は次のようにして行った。Ser1GAL4/3xP3DsRed系統とUASIgL-UASIgH系統を交配して得られた次世代の産卵後6日目の卵を実体蛍光顕微鏡で観察し、GAL4/UAS個体を同定した(図11)。両方の遺伝子を持つ個体のみを飼育し、5令吐糸期のカイコから絹糸腺を摘出し、20mM Tris-HCl pH7.4(Trisバッファー)で絹糸腺のタンパク質を抽出した。このタンパク質溶液について、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いて抗体を検出した。具体的にはカイコの絹糸腺から抽出したタンパク質溶液にTyping stickを浸し、室温で18時間振とうした。次いで、添付文書の通り洗浄操作後、Peroxidase labeled anti-mouse antibodyを加え、室温で6時間振とうした。続いて、洗浄操作を行った後、基質溶液に浸しバンドを確認した。
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)による組換えIgG型抗体の抗原に対する反応性の測定は以下の手順で行った。Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH系統とUASIgL-UASIgHを持たないSer1GAL4系統の吐糸期のカイコから中部絹糸腺を摘出し、3mlのTrisバッファーを添加した。これをガラスホモジナイザーで粉砕し、さらに12000rpm 20分間の遠心後、上清を中部絹糸腺抽出試料の原液とした。この原液をTrisバッファーで2倍と4倍に希釈した。これら及び無希釈の試料(原液)をELISA測定用試料とした。また、陰性コントロールとしてSer1GAL4系統のカイコについても同様の操作でELISA測定用試料を調製した。なお、Ser1GAL4/UASIgL-UASIgH系統及びSer1GAL4系統の原液試料について、Bradford法(Quick Start プロテインアッセイ染色液:BIO-RAD社)でタンパク質を定量した(表7)。
上記の方法で作製したプラスミドと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドpA3PIG(Tamura et al., 2000)を一緒に約700粒の発生初期のカイコ卵に注射し、次世代の胚の単眼におけるGFPの発現を調べた。その結果、表8に示したように、7蛾区においてGFPを発現する個体が出現した。
Claims (63)
- 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項2に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項2に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項3又は4に記載の方法。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項6に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項6に記載の方法。
- シグナル配列を有する組換え抗体。
- 全長抗体または低分子抗体である、請求項9に記載の抗体。
- 請求項9又は10に記載の抗体をコードするDNA。
- 請求項11に記載のDNAを有するベクター。
- 請求項12に記載のベクターを保持する細胞。
- シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項15に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項15に記載の方法;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項16又は17に記載の方法。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項15〜18のいずれかに記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項19に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項19に記載の方法。
- シグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
- 以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、請求項23に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - 以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項23に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項24又は25に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項23〜26のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項27に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項27に記載のトランスジェニックカイコ。
- 転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
- 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項30に記載のトランスジェニックカイコ。
- 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項32に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項32に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項33又は34に記載の方法。
- 細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項36に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - トランスジェニックカイコが、以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項36に記載の方法;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項37又は38に記載の方法。
- 細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御されるシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
- 以下の(i)及び(ii)に記載のDNAを有する、請求項40に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNA。 - 以下の(i)及び(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項40に記載のトランスジェニックカイコ;
(i)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ、
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合したシグナル配列を有する組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。 - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項41又は42に記載のトランスジェニックカイコ。
- 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)組換え抗体をコードするDNAが導入されたトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項45に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項46に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項46に記載の方法。
- 組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項50に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項51に記載の方法。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項51に記載の方法。
- 組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を分泌するトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を絹糸腺に分泌するトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺が中部絹糸腺又は後部絹糸腺である請求項55に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質又はセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項56に記載のトランスジェニックカイコ。
- 絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、フィブロインタンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項56に記載のトランスジェニックカイコ。
- 転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
- 以下の(a)及び(b)の工程を含む、組換え抗体の製造方法;
(a)細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程、
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該組換え抗体を回収する工程。 - 細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- 細胞質アクチンタンパク質をコードするDNAのプロモーター、及び該プロモーターによって直接的又は間接的に発現制御される組換え抗体をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該組換え抗体を脂肪体に分泌するトランスジェニックカイコ。
- 請求項1〜8、32〜35、44〜48、もしくは60のいずれかに記載の方法によって製造された抗体。
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