CN102628037A - 家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因组遗传改造系统，该遗传改造系统为剪切家蚕油蚕基因BmBlos2靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；转录激活子样效应因子核酸酶TALEN能够准确识别结构为T(Nn)A的靶序列，并在基因组中实现碱基的缺失、插入或替换，在基因组中实现对目的基因的编辑，还公开了基因组长片段删除系统的制备方法和应用，其制备方法简单，成本低，制得的基因组遗传改造系统能够用于目的基因的遗传改造，获得丰富的遗传资源。

Description

家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统及其制备方法和应用

技术领域                         

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统，还涉及遗传系统的制备方法和应用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业在历史上一直与农并茂，为中华民族经济的发展和文化的弘扬都做出了巨大贡献。蚕丝拥有雍容典雅的光泽、轻盈舒适的触感、良好的衣料悬垂性和曲线性、适中的吸水性以及对人体肌肤的亲和性等固有的优良特性，长久以来都深受广大消费者的喜爱，蚕丝也因此而被誉为“纤维皇后”。目前我国丝绸工业年总产值达1350亿元，占纺织工业总产值的10%以上；茧丝产量和出口量分别占世界总额的70%和80%以上，年创汇超过50亿美元，是在国际市场上处于绝对优势的特色产业。全国共有种桑养蚕农户2000多万户，遍布20余个省区。蚕业是目前我国农村经济中的重要组成部分，其年出口创汇额在农产品中位居前列，是农民收入的重要来源。蚕丝产业在解决“三农”问题，特别是增加农民收入、调整农村产业结构上发挥着越来越重要的作用。

然而，作为一个古老的传统产业，蚕桑丝绸生产技术与水平最近60年来都处于一个平台期。蚕品种的强健性、绢丝品质、产量等主要经济性状差等品种资源问题一直没有取得重大的突破，蚕丝服装易发黄、变皱等固有缺陷没有得到根本的解决。品种资源更新远远跟不上生产需要，蚕丝业整体生产效益低下。这主要是因为：1）经过上百年的挖掘，基于传统育种手段的增产潜力已经发挥到极致，加之自然条件的特殊性和局限性，目前已很难突破品种资源本身的局限。现存的家蚕品种虽然种类和数量颇多，但是其遗传背景单一，相互之间的经济性状和生物学性状并没有显著的差异。家蚕品种经过百年更迭，在经济性状和生物学性状上都没有显著的改进。2）作为纺织纤维，蚕丝因其价格昂贵使得众多消费者望而止步，加之蚕丝具有易发黄、起皱的缺点，使其在各种纺织纤维中并不占有很大的市场份额。在蚕丝产业几乎停滞不前的近几十年中，棉、毛等纺织纤维的研究和利用进展良好，各种人造纤维异军突起，对蚕丝产业造成了比较大的冲击。3）长久以来，人类驯化和饲养家蚕的主要目的是缫丝织绸，所以现存的家蚕品种几乎都是千篇一律的多丝量品种，其茧丝的成分和特性基本上没有什么区别。在蚕业科技日新月异的今天，蚕丝越来越多的作为一种多功能的生物材料而被重新认识。

家蚕是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物和重要的生物反应器。家蚕遗传学和生理学的早期研究成果为昆虫信息素、激素、解剖学、生理学和遗传学等方面的基础发现做出尤为重要的贡献；在家蚕基因组框架图、家蚕基因组精细图、家蚕基因芯片和遗传变异图相继解析之后，家蚕基因组学和功能基因组学研究在现代昆虫生物学研究中也起着举足轻重的作用。作为合成和分泌丝蛋白的唯一器官，家蚕丝腺是昆虫中蛋白质合成能力最强的生物器官，一头家蚕可生产纯蛋白质0.5g以上。无论是在基础研究，还是在药物、化妆品开发领域，提取或表达纯化的蛋白都扮演着极其重要的角色。饲养一头蚕的成本不足1角钱，却能吐0.5g的丝蛋白，而如果能用基因工程手段让家蚕吐出0.5g纯蛋白，这对于蚕丝产业、甚至生物产业都将产生革命性的推动作用。也正是这一奇特的生物学现象和应用前景吸引着众多生物学家自分子生物学发端以来就长期致力于家蚕丝蛋白的表达调控和家蚕生物反应器的开发。

要突破传统育种的局限，获得品种选育的革命性突破；彻底克服蚕丝的固有缺陷，恢复蚕丝的纺织纤维市场中生机；开发新型多功能蚕丝材料，促进单一的蚕丝产业向更为广阔的非绢丝产业扩展，这些都是现代蚕业中亟须解决的关键问题。在分子农业时代，这些问题的解决离不开对家蚕重要经济性状相关基因的功能解析和遗传改造。要最大程度的发挥家蚕在鳞翅目昆虫研究中的模式作用，推动家蚕生物反应器的进一步开发和应用，离不开转基因、基因组编辑和遗传改造等重要的分子工具。尽管转基因和RNAi等目前广泛应用的分子改良工具在家蚕中已经得到了较好的应用，但是转基因和RNAi并不能对基因组中的目的基因进行编辑，并且能直接对家蚕内源基因进行编辑和改造的技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统，能够高效准确实现目的基因的遗传改造，获得遗传变异的家蚕，技术方案为：

家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统，所述遗传改造系统为剪切家蚕油蚕基因BmBlos2靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；

所述靶序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，1-19位核苷酸为识别模块Ⅰ、36-54位核苷酸为识别模块Ⅱ，20-35位核酸序列为间隔序列；

所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块Ⅰ的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块Ⅱ的核酸酶TALEN-R组成；所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4所示核苷酸编码的蛋白质。

本发明目的之二在于提供家蚕基因组遗传改造系统的制备方法，其制备方法简单，技术方案为：

所述家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统的制备方法，具体步骤为：

（1）根据家蚕油蚕基因BmBlos2选择SEQ ID NO.2所示序列为靶序列，SEQ ID NO.2所示序列中1-19位核苷酸为识别模块Ⅰ、36-54位核苷酸为识别模块Ⅱ，20-35位核苷酸为间隔序列；

（2）根据步骤（1）所得靶序列，合成剪切所述靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，得基因组遗传改造系统；所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块Ⅰ的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块Ⅱ的核酸酶TALEN-R组成；

所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4所示核苷酸编码的蛋白质。

进一步，所述步骤（2）中，合成所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的方法，具体为：将编码核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列分别连入原核表达载体pET28a中，经XhoⅠ酶切后体外转录获得TALEN-L mRNA和TALEN-R mRNA用于显微注射靶细胞，靶细胞翻译得转录激活子样效应因子核酸酶TALEN。

进一步，所述步骤（2）中，所述靶细胞为家蚕卵细胞。

本发明目的之三在于提供上述遗传改造系统的应用，技术方案为：

所述遗传改造系统在遗传改造家蚕中的应用。

进一步，所述遗传改造为碱基变异、缺失或插入中的至少一种。

本发明的有益效果在于：本发明利用TALEN技术，通过TALEN具有特异剪切核酸靶序列的特点，在家蚕油蚕基因BmBlos2内部设计含有识别靶序列的蛋白质，并在识别靶序列蛋白质的上游设置有核定位信号NLS和核酸酶FokI，使目标蛋白能够定位于细胞核中，并识别靶序列处通过核酸酶FokI发生剪切，核酸酶FokI二聚体同时作用能够使合成的TALEN准确识别靶序列并发生剪切，实现对家蚕油蚕基因BmBlos2的遗传改造，本发明的方法简单可行，遗传改造效率高，利用本发明提供的方法能够快速、准确在基因组中对家蚕油蚕基因BmBlos2实现遗传改造，还可以利用基因同源性原理同时实现多基因一次性删除，能够获得遗传变异大的家蚕，提供丰富的种质源。

附图说明

图1为本发明TALEN结合到靶标序列的示意图，其中Flag表示Flag标签，NLS表示核定位信号，FokI表示非特异性的核酸酶，下划线表示的序列分别为识别模块Ⅰ和识别模块Ⅱ，中间的序列为间隔序列。

图2为本明p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL重组载体结构示意图，其中p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL分别表示TALEN-L和TALEN-R的两个单体序列的表达载体，MluI、SacI、KpnI和BamHI表示限制性内切酶，CMV promt表示CMV启动子，T7 promt表示T7启动子，3xFlag表示Flag标签，NLS表示核定位信号，FokI表示非特异性的核酸酶切酶。

图3为本发明BmBlos2基因敲除家蚕的表型图，其中WT表示野生型的家蚕个体，Mosaic-1, Mosaic-2和Mosaic-3分别表示不同的嵌合突变体。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

一、家蚕BmBlos2基因的序列分析

从silkDB数据库下载家蚕油蚕基因BmBlos2的序列（编号为BGIBMGA002101）。序列分析显示该基因包括四个长分别为180bp，131bp，112bp和608bp的外显子以及三个长分别为2465bp， 663bp和2703bp的内含子，第一外显子包括125bp的非翻译区和55bp的编码区。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和第三外显子为理想的靶标位点，本实施例以第二外显子靶标位点。

二、家蚕BmBlos2基因特异TALEN序列的设计与合成

根据家蚕BmBlos2基因的序列特征，选择第二外显子上的序列作为TALEN作用的靶序列，家蚕BmBlos2基因第二外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据TALEN原理将结构为T(Nn)A的核苷酸序列为TALEN作用靶序列，其中N为A，G，T和C中的任一碱基，n为24至65之间的任一数字。按照上述原理设计TALEN作用的靶序列为5’-tggatccacatgatcctgt gatcagtcggttagcc acacagctctttaaaaaaa-3’(SEQ ID NO.2)，划线部分为识别模块，黑体部分表示间隔序列，其中5’端划线核苷酸序列为识别模块Ⅰ，对应SEQ ID NO.2所示的1-19位核苷酸，3’端核苷酸序列为识别模块Ⅱ，对应SEQ ID NO.2所示的36-54为核苷酸序列。分别将识别模块Ⅰ和识别模块Ⅱ按照A=NI，T=NG，G=NN，C=HD规律设计识别靶序列的蛋白质的可变氨基酸，并在识别蛋白的上游设置核定位信号NLS，下游设置内切核酸酶FokI，得到由核定位信号NLS、识别识别模块Ⅰ的蛋白质和核酸酶FokI依次串联组成的TALEN-L和由核定位信号NLS、识别识别模块Ⅱ的TALE和核酸酶FokI依次串联组成TALEN-R，如图1所示。根据TALEN-L和TALEN-R氨基酸序列设计编码TALEN-L和TALEN-R核苷酸序列，编码TALEN-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中82-102位核苷酸编码核定位信号NLS，120-2826位核苷酸编码识别识别模块Ⅰ的蛋白质，2833-3420位核苷酸编码核酸酶FokI。编码TALEN-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中76-96位核苷酸编码核定位信号NLS，114-2820位核苷酸编码识别识别模块Ⅱ的蛋白质，2826-3414位核苷酸编码核酸酶FokI。

三、制备编码B2氨基酸的mRNA

分别人工合成编码TALEN-L和TALEN-R核苷酸序列（SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），再用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切后连接经同样酶切的原核表达载体pET28a，然后转化大肠杆菌，并筛选阳性克隆，获得重组载体，分别命名为p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL，重组载体结构如图2所示。将所得重组载体p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL分别用XhoⅠ酶切消化后用MessageMax T7 mRNA体外转录试剂盒（购自Epicentre）进行体外转录，体外转录条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，加1μL DNA酶，再继续孵育15分钟。然后将反应液用Epicentre A-plus加尾试剂盒（购自Epicentre）进行加A反应，反应条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，然后用MEGAClear试剂盒（购自Ambion）进行纯化，得编码TALEN-L和TALEN-R的 mRNA，将所得TALEN-L的mRNA和TALEN-R的mRNA混合物命名B2，于-80℃保存备用。

四、B2的显微注射

选择多化性家蚕品种“N4”，在25℃恒温、相对湿度75%的环境中，用桑叶饲养。羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、在光强为50~155 μmol/m2/s条件下交配4小时后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上产卵，所得蚕卵直接用于显微注射。将浓度为700ng/μL的B2用显微注射仪（FemtoJet 5247 显微注射仪，购自Eppendorf）注射至968粒蚕卵中，每粒蚕卵注射量约10nL。注射后的蚕卵用无毒胶水封住注射口，并用体积百分比为35%的甲醛蒸气中消毒5分钟，置于25℃、相对湿度85%的湿度环境中催青孵化，将孵化的G0代蚁蚕人工饲料收集饲养至化蛾。

五、突变个体的筛选

在968粒注射蚕卵中，孵化获得255个 G0代蚁蚕，经人工饲养获得144头五龄幼虫，其中66头表现出嵌合体的表型，如图3所示。将144头五龄幼虫继续人工饲养至化蛾获得144个G0代蚕蛾，通过自交或回交获得29蛾圈G1代蚕卵，将29个蛾圈催青并单独饲养至G1代三龄幼虫观察，在其中的9个蛾圈中发现630头具有油蚕表型的家蚕个体。

六、遗传突变个体的测序分析

选取表型为油蚕的家蚕突变体75个，提取基因组，选取选取突变位点附近序列设计PCR引物进行PCR扩增。PCR引物：上游引物为B2-F241：5’-ttggtccagtaggtttgaagtaggt-3’（SEQ ID NO.5），下游引物为B2-R176：5’-atcctgattaacctagtttacacacat-3’（SEQ ID NO.6）；PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10 min。同时选取选取突变位点附近序列设计测序引物，测序引物如SEQ ID NO.5所示。PCR产物经电泳检测、纯化，然后进行测序，测序结果如SEQ ID NO:7-27。测序结果表明所选取的75个突变个体在TALEN(B2)靶位点均发生了突变，突变包括变异、缺失或小片段的插入。因此利用本发明公开的方法可以用于家蚕的基因组编辑和遗传改造，制备家蚕突变体。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

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<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

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<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

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<223>  靶序列

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<223>  编码核酸酶TALEN-L核苷酸序列

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gtcttatgtc aagctcatgg tcttactcct cagcaagtgg ttgcaatcgc gagcattggt 1081   

ggaggaaagc aagccttgga gaccgtacag aggttacttc cagtgctgtg ccaagcacac 1141   

ggattgacgc cggaacaggt cgtagctata gcctccaacg gtggaggaaa acaagcgctc 1201   

gagacagttc agagactgtt gcccgtcctc tgtcaagcac atggcttaac accagagcaa 1261   

gttgtcgcaa tcgcgtcgaa tggtggcgga aagcaagccc tggagaccgt acaggcactc 1321   

ttaccagtgc tttgccaagc ccacggtctt actcctgagc aagttgtagc tattgccagt 1381   

aacggtggcg gaaaacaagc gttggagaca gttcaggctc ttctgcccgt cttgtgtcaa 1441   

gctcatggac tcacaccaga acaggtggtt gcaatagcgt caaatatcgg cggtaaacaa 1501   

gccctcgaga ccgtacaggc attgctccca gtgttatgcc aagctcacgg ccttactcct 1561   

gagcaagtgg ttgctattgc ctctaacata ggaggcaaac aagctctgga gacagttcag 1621   

cgcttacttc ccgtcctgtg tcaagcccat ggactgacac cagagcaagt tgtggcaatc 1681   

gcgagcaata ttggtggaaa gcaagcattg gagaccgtac agcgtctgtt gccagtgctc 1741   

tgccaggctc acggattaac tcctcagcaa gttgttgcta tagcctccaa caatggtggt 1801   

aaacaggccc tcgaaacagt tcagaggctc ttacccgtcc tttgtcaagc tcatggcctt 1861   

acacccgagc aggttgtcgc aatcgcgtca aactctggag gcaagcaagc gctggagacc 1921   

gtacaggctc ttctgccagt cttgtgccaa gctcacggtc tcactcctga gcaagtcgta 1981   

gctattgcct cgaataaggg tggaaaacaa gccttggaga cagtgcagag attgctcccc 2041   

gttttatgtc aagctcacgg acttacaccc gagcaggtcg ttgcaatagc gagtcatgat 2101   

ggtggtaaac aagccctgga gaccgtccag cgcttgttgc cagtgctgtg ccaagctcat 2161   

ggcctgactc ctgagcaggt cgtagctatc gcctcaaacg gaggcggtaa acaggctttg 2221   

gagacagttc agcgtttgct gcctgttctc tgtcaagctc acggtttaac acccgaacag 2281   

gtggttgcaa ttgcgtctaa caatggaggc aaacaggctc tggagaccgt gcagagactc 2341   

ttaccagttc tttgccaagc tcatggactg actcctcagc aagtcgtagc tatagcaagc 2401   

aatggtggag gaaggccagc actggaaaca gtccaacgtc ttctgcctgt gttgtgtcag 2461   

gctcacggcc tcactccaga acaagtggtt gcaattgcgt ccaacaatgg tggaaaacag 2521   

gcactggaga ccgttcagcg cttgctcccg gtcttatgcc aggctcacgg acttacgccc 2581   

cagcaagtgg tcgctattgc atcgaacgga ggtggaaggc ctgcactcga atcaatagtg 2641   

gcacaattat ctcgtcccga ccctgccctt gcagcgctga ctaatgatca cttggtcgca 2701   

ctcgcgtgct taggcggtag acctgccctt gatgcagtga aaaagggtct gccacatgct 2761   

cccgcactga taaaacgcac caaccgtcgt attcctgaac gcacctcaca tcgtgtcgca 2821   

ggatcccagc tggtgaagag cgagctggag gagaagaagt ccgagctgcg gcacaagctg 2881   

aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg ccaggaacag cacccaggac 2941   

cgcatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggaaag 3001   

cacctgggcg gaagcagaaa gcctgacggc gccatctata cagtgggcag ccccatcgat 3061   

tacggcgtga tcgtggacac aaaggcctac agcggcggct acaatctgcc tatcggccag 3121   

gccgacgaga tggagagata cgtggaggag aaccagaccc ggaataagca cctcaacccc 3181   

aacgagtggt ggaaggtgta ccctagcagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgagc 3241   

ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 3301   

aatggcgccg tgctgagcgt ggaggagctg ctgatcggcg gcgagatgat caaagccggc 3361   

accctgacac tggaggaggt gcggcgcaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttc       3414

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  突变位点上游引物为B2-F241

<400>  5

ttggtccagt aggtttgaag taggt   25

 

<210>  6

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  突变位点下游引物为B2-R176

<400>  6

atcctgatta acctagttta cacacat   27

 

<210>  7

<211>  413

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-13-11测序结果

<400>  7

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

cagccacaca gctctttaaa aaaacaactg actaccttca ggctgaaatg gttgctggac 300

aggtgagggc ttatcaatat gatacaaacc ataggtcgtg aatacataca tactacagat 360

actttctttg gtattaaata ctgatgatgt gtgtaaacta ggttaatcag gat        413

 

<210>  8

<211>  412

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-13-02测序结果

<400>  8

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga   60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa  120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt  180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt  240

agccacacag ctctttaaaa aaacaactga ctaccttcag gctgaaatgg ttgctggaca  300

ggtgagggct tatcaatatg atacaaacca taggtcgtga atacatacat actacagata  360

ctttctttgg tattaaatac tgatgatgtg tgtaaactag gttaatcagg at          412

 

 

<210>  9

<211>  410

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-13-08测序结果

<400>  9

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagg 240

ccacacagct ctttaaaaaa acaactgact accttcaggc tgaaatggtt gctggacagg 300

tgagggctta tcaatatgat acaaaccata ggtcgtgaat acatacatac tacagatact 360

ttctttggta ttaaatactg atgatgtgtg taaactaggt taatcaggat            410

   

 

<210>  10

<211>  409

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-16-01测序结果

<400>  10

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagc 240

cacacagctc tttaaaaaaa caactgacta ccttcaggct gaaatggttg ctggacaggt 300

gagggcttat caatatgata caaaccatag gtcgtgaata catacatact acagatactt 360

tctttggtat taaatactga tgatgtgtgt aaactaggtt aatcaggat             409

 

 

<210>  11

<211>  413

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-14-10测序结果

<400>  11

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

tagccccaca gctctttaaa aaaacaactg actaccttca ggctgaaatg gttgctggac 300

aggtgagggc ttatcaatat gatacaaacc ataggtcgtg aatacataca tactacagat 360

actttctttg gtattaaata ctgatgatgt gtgtaaacta ggttaatcag gat        413

 

 

<210>  12

<211>  435

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-14-09测序结果

<400>  12

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

ggccacatga tcctgtgatc agtagccaca cagctcttta aaaaaacaac tgactacctt 300

caggctgaaa tggttgctgg acaggtgagg gcttatcaat atgatacaaa ccataggtcg 360

tgaatacata catactacag atactttctt tggtattaaa tactgatgat gtgtgtaaac 420

taggttaatc aggat                                                  435

 

<210>  13

<211>  435

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-14-12测序结果

<400>  13

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcatg 240

tggatccatg tgtgtgtgag attagccaca cagctcttta aaaaaacaac tgactacctt 300

caggctgaaa tggttgctgg acaggtgagg gcttatcaat atgatacaaa ccataggtcg 360

tgaatacata catactacag atactttctt tggtattaaa tactgatgat gtgtgtaaac 420

taggttaatc aggat                                                  435

 

<210>  14

<211>  412

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-15-09测序结果

<400>  14

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcatt 240

agccacacag ctctttaaaa aaacaactga ctaccttcag gctgaaatgg ttgctggaca 300

ggtgagggct tatcaatatg atacaaacca taggtcgtga atacatacat actacagata 360

ctttctttgg tattaaatac tgatgatgtg tgtaaactag gttaatcagg at         412

 

<210>  15

<211>  409

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-15-12测序结果

<400>  15

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

cacacagctc tttaaaaaaa caactgacta ccttcaggct gaaatggttg ctggacaggt 300

gagggcttat caatatgata caaaccatag gtcgtgaata catacatact acagatactt 360

tctttggtat taaatactga tgatgtgtgt aaactaggtt aatcaggat             409

 

<210>  16

<211>  427

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-15-05测序结果

<400>  16

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcaca 240

cacagctctt taaacagcca cacagctctt taaaaaaaca actgactacc ttcaggctga 300

aatggttgct ggacaggtga gggcttatca atatgataca aaccataggt cgtgaataca 360

tacatactac agatactttc tttggtatta aatactgatg atgtgtgtaa actaggttaa 420

tcaggat                                                           427

 

<210>  17

<211>  452

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-15-10测序结果

<400>  17

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcaga 240

tcctgtgtgt gttagcctgt gtgtgtaacc tgtgtgtgtt agccacacag ctctttaaaa 300

aaacaactga ctaccttcag gctgaaatgg ttgctggaca ggtgagggct tatcaatatg 360

atacaaacca taggtcgtga atacatacat actacagata ctttctttgg tattaaatac 420

tgatgatgtg tgtaaactag gttaatcagg at                               452

 

<210>  18

<211>  473

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-15-12测序结果

<400>  18

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

tagccacaca gctctttaaa aaaacaactg actaccttca ggctgaaatg gttgctggac 300

aggtgagggc ttatcaatat gatacaaacc ataggtcgtg aatacataca tactacagat 420

actttctttg gtattaaata ctgatgatgt gtgtaaacta ggttaatcag gat        473

 

<210>  19

<211>  407

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-15-14测序结果

<400>  19

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

cacagctctt taaaaaaaca actgactacc ttcaggctga aatggttgct ggacaggtga 300

gggcttatca atatgataca aaccataggt cgtgaataca tacatactac agatactttc 360

tttggtatta aatactgatg atgtgtgtaa actaggttaa tcaggat               407

 

<210>  20

<211>  425

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-15-13测序结果

<400>  20

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

ctaccacaca cacagccaca cagctcttta aaaaaacaac tgactacctt caggctgaaa 300

tggttgctgg acaggtgagg gcttatcaat atgatacaaa ccataggtcg tgaatacata 360

catactacag atactttctt tggtattaaa tactgatgat gtgtgtaaac taggttaatc 420

aggat                                                             425

 

<210>  21

<211>  439

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-15-22测序结果

<400>  21

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagc 240

cacacactct tacacacaca gccacacagc cacacagctc tttaaaaaaa caactgacta 300

ccttcaggct gaaatggttg ctggacaggt gagggcttat caatatgata caaaccatag 360

gtcgtgaata catacatact acagatactt tctttggtat taaatactga tgatgtgtgt 420

aaactaggtt aatcaggat                                              439

 

 

<210>  22

<211>  444

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-15-20测序结果

<400>  22

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

tacacacaca cacctcttta gcattccact ctagccacac agctctttaa aaaaacaact 300

gactaccttc aggctgaaat ggttgctgga caggtgaggg cttatcaata tgatacaaac 360

cataggtcgt gaatacatac atactacaga tactttcttt ggtattaaat actgatgatg 420

tgtgtaaact aggttaatca ggat                                        444

 

 

<210>  23

<211>  421

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-11-02测序结果

<400>  23

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

tacagtatta gccacacagc tctttaaaaa aacaactgac taccttcagg ctgaaatggt 300

tgctggacag gtgagggctt atcaatatga tacaaaccat aggtcgtgaa tacatacata 360

ctacagatac tttctttggt attaaatact gatgatgtgt gtaaactagg ttaatcagga 420

t                                                                 421

 

<210>  24

<211>  416

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-11-02测序结果

<400>  24

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

cggtagccac acagctcttt aaaaaaacaa ctgactacct tcaggctgaa atggttgctg 300

gacaggtgag ggcttatcaa tatgatacaa accataggtc gtgaatacat acatactaca 360

gatactttct ttggtattaa atactgatga tgtgtgtaaa ctaggttaat caggat     416

 

<210>  25

<211>  414

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-11-03测序结果

<400>  25

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga   60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa  120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt  180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt  240

gtagccacac agctctttaa aaaaacaact gactaccttc aggctgaaat ggttgctgga  300

caggtgaggg cttatcaata tgatacaaac cataggtcgt gaatacatac atactacaga  360

tactttcttt ggtattaaat actgatgatg tgtgtaaact aggttaatca ggat        414

 

<210>  26

<211>  406

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-11-09测序结果

<400>  26

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgttagccac 240

acagctcttt aaaaaaacaa ctgactacct tcaggctgaa atggttgctg gacaggtgag 300

ggcttatcaa tatgatacaa accataggtc gtgaatacat acatactaca gatactttct 360

ttggtattaa atactgatga tgtgtgtaaa ctaggttaat caggat                406

 

<210>  27

<211>  412

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-12-07测序结果

<400>  27

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga  60

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa 120

accattcaca tacagcagta ttattatcta tagtatgaca gttatttttt tgcagagctt 180

gaaatgtcac cgagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagt 240

acccacacag ctctttaaaa aaacaactga ctaccttcag gctgaaatgg ttgctggaca 300

ggtgagggct tatcaatatg atacaaacca taggtcgtga atacatacat actacagata 360

ctttctttgg tattaaatac tgatgatgtg tgtaaactag gttaatcagg at         412

Claims (6)

1.家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统，其特征在于：所述遗传改造系统为剪切家蚕油蚕基因BmBlos2靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；

所述靶序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，1-19位核苷酸为识别模块Ⅰ、36-54位核苷酸为识别模块Ⅱ，20-35位核酸序列为间隔序列；

所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块Ⅰ的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块Ⅱ的核酸酶TALEN-R组成；所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4所示核苷酸编码的蛋白质。

2.权利要求1所述家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）根据家蚕油蚕基因BmBlos2选择SEQ ID NO.2所示序列为靶序列，SEQ ID NO.2所示序列中1-19位核苷酸为识别模块Ⅰ、36-54位核苷酸为识别模块Ⅱ，20-35位核苷酸为间隔序列；

（2）根据步骤（1）所得靶序列，合成剪切所述靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，得基因组遗传改造系统；所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块Ⅰ的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块Ⅱ的核酸酶TALEN-R组成；

所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4所示核苷酸编码的蛋白质。

3.根据权利要求2所述家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，合成所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的方法，具体为：将编码核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列分别连入原核表达载体pET28a中，经XhoⅠ酶切后体外转录获得TALEN-L mRNA和TALEN-R mRNA用于显微注射靶细胞，靶细胞翻译得转录激活子样效应因子核酸酶TALEN。

4.根据权利要求2或3所述家蚕油蚕基因BmBlos2遗传改造系统的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述靶细胞为家蚕卵细胞。

5.权利要求1所述遗传改造系统在遗传改造家蚕中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述遗传改造为碱基变异、缺失或插入中的至少一种。

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