CN103013954A - 水稻基因badh2的定点敲除系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻基因BADH2的定点敲除系统及其应用。所述定点敲除系统为如下a）或b）或c）：a）由T-BADH2b和T-BADH2a组成；b）T-BADH2b；c）T-BADH2a；所述T-BADH2b和T-BADH2a均为特异剪切所述水稻基因BADH2的转录激活子样效应因子核酸酶，二者的靶序列分别为序列表序列1的第1589位至第1640位的核苷酸序列和第273位至第324位的核苷酸序列。实验证明，单独使用T-BADH2b对水稻基因BADH2的突变频率为26.9%；单独使用T-BADH2a对水稻基因BADH2的突变频率为9.2%；同时T-BADH2b和T-BADH2a同时在水稻日本晴愈伤组织中表达获得的抗性愈伤中水稻基因BADH2的突变频率为18.1%，其中大片段删除的发生频率为5.1%。本发明为创制香米种质资源、培育优良香米品种提供了一种高效的育种方式。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻基因BADH2的定点敲除系统及其应用。
背景技术
香味是优质稻米重要特征之一，在世界范围内展开广泛的研究。已将控制米香的基因定位在水稻第8号染色体上，位于分子标记RM515和SSRJ07之间约386kb范围内。Bradbury等（2005）发现在香米和普通米之间一个存在序列差异的基因——BADH2，这一基因编码甜菜碱乙醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase），推测可能与米香的合成有关。Chen等（2008）对通过转基因互补实验证明了BADH2基因控制米香，香米品种BADH2基因的第二个或第七个外显子存在天然突变，没有全长的BADH2转录本，2AP(2-acetyl-1-pyrroline，水稻香米芳香成分之一)大量积累；而只有在普通稻米中存在全长的BADH2转录本，其中2AP含量极低。通过在香米品种中转入全长的BADH2基因，其2AP含量显著降低，香气丢失。证明BADH2是控制米香的主效基因。
TALENs（转录激活子样效应因子核酸酶）是近几年出现的基因定点修饰新技术，在动物、植物和人类等领域都有广泛的研究和应用。转录激活子样效应因子（Transcription Activator-Like Protein Effector,TALE）是黄单胞菌属病原菌分泌到宿主植物细胞中的一种毒性蛋白，可以识别植物DNA，驱动基因表达。TALENs就是利用TALE的DNA结合结构域和Fok I的DNA切割结构域人工合成的核酸酶。两个TALEN单体按照一定方式结合在DNA双链上，形成有切割活性的二聚体将DNA切断，产生DNA双链断裂（DSB），细胞启动修复机制，通过非同源末端连接（NHEJ）这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变，通过同源重组（HR）方式修复可以实现精确的基因定点插入或基因替换。相比锌指核酸酶（ZFNs）和Meganucleases技术，TALENs技术具有设计简单，突变效率高和细胞毒性低等优势。TALENs的优异性取决于TALE独特的DNA识别特性。TALEN的DNA结合结构域包含了一个由数量不等（1.5—33.5）的重复单元组成的串联重复结构域。每一个重复单元通常由33—35个氨基酸组成，重复单元的氨基酸高度保守，但是各个单元的第12和13位两个相邻氨基酸是可变的，这两个氨基酸通常被称为重复可变双残基（Repeat-variable diresidue，RVD）。每个RVD与核苷酸A、T、C、G存在简单对应的关系，最常见的识别密码为NI识别A、HD识别结合C、NG识别结合T和NN识别G（Moscou and Bogdanove.,2009）。
目前，香米品种的培育都是利用杂交方式将香米基因转入普通稻米中，尽管可以借助分子标记进行辅助选择，但这个过程复杂周期较长。通过TALENs定点敲除技术可以直接将优质稻米（非香米）中BADH2基因定点突变或敲除，创制优质香米，大大缩短育种周期。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻基因BADH2的定点敲除系统及其应用。
所述水稻基因BADH2的定点敲除系统，为如下a）或b）或c）：
a）由T-BADH2b和T-BADH2a组成；
b）T-BADH2b；
c）T-BADH2a；
所述T-BADH2b为特异剪切所述水稻基因BADH2内靶序列B的转录激活子样效应因子核酸酶；所述靶序列B由间隔序列b、位于所述间隔序列b 5’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列L-b和位于所述间隔序列b 3’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列R-b组成；所述间隔序列b为水稻基因BADH2中包含序列表序列1第1612位至第1617位（BglⅡ酶切识别序列）的长为15—20bp（如18bp）的序列；所述模块识别序列L-b的长为15—30bp（如17bp）,所述模块识别序列R-b的长为15—30bp（如17bp）；所述T-BADH2b单独使用，可将所述水稻基因BADH2定点剪切并产生定点突变，使所述水稻基因BADH2失去原有的功能；
所述T-BADH2a为特异剪切所述水稻基因BADH2内靶序列A的转录激活子样效应因子核酸酶；所述靶序列A由间隔序列a、位于所述间隔序列a 5’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列L-a和位于所述间隔序列a 3’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列R-a组成；所述间隔序列a为水稻基因BADH2中包含序列表序列1第298位至第303位（BssHⅡ酶切识别序列）的长为15—20bp（如18bp）的序列；所述模块识别序列L-a的长为15—30bp（如17bp），所述模块识别序列R-a的长为15—30bp（如17bp）；所述T-BADH2a单独使用，可将所述水稻基因BADH2定点剪切并产生定点突变，使所述水稻基因BADH2失去原有的功能；
所述T-BADH2b和T-BADH2a共同使用，可将所述水稻基因BADH2在两个位点定点剪切并产生定点突变、大片段删除或颠倒，使所述水稻基因BADH2失去原有的功能。
在上述定点敲除系统中，所述靶序列B为序列表序列1的第1589位至第1640位的核苷酸序列；
和/或，所述靶序列A为序列表序列1的第273位至第324位的核苷酸序列。
在上述定点敲除系统中，所述T-BADH2b由序列表序列2第7位至第2952位所示核苷酸序列和序列表序列2第3085位至第6018位所示核苷酸序列分别编码的蛋白质组成；
和/或，所述T-BADH2a由序列表序列3第7位至第2952位所示核苷酸序列和序列表序列3第3085位至第6018位所示核苷酸序列分别编码的蛋白质组成。
在上述定点敲除系统中，所述水稻BADH2基因为序列表序列1所示基因。
本发明保护含有上述任一所述定点敲除系统编码基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或重组细胞系。
所述重组表达载体为pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a；
所述重组载体pGW3-BADH2b为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入编码所述T-BADH2b的基因的载体；所述编码所述T-BADH2b的基因具体为序列表序列2所示基因；
所述重组载体pGW3-BADH2a为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入编码所述T-BADH2a的基因的载体；所述编码所述T-BADH2a的基因具体为序列表序列3所示的基因；
所述载体pGW3是将载体pMDC32中HindIII和Acc65Ⅰ位点间的片段替换为玉米ubiquitin启动子的重组载体；所述玉米ubiquitin启动子的序列具体为序列表序列4的第7位至第1993位。
本发明的另一个目的是提供一种定点敲除水稻基因BADH2的方法，包括在水稻中表达上述任一所述定点敲除系统的步骤。
在上述方法中，所述T-BADH2b在水稻中表达是通过所述重组载体pGW3-BADH2b将编码所述T-BADH2b的基因导入所述水稻中实现的；
所述T-BADH2a在水稻中表达是通过所述重组载体pGW3-BADH2a将编码所述T-BADH2a的基因导入所述水稻中实现的。
上述方法还可用于提高水稻米香。
实验证明，利用载体pGW3-BADH2b将T-BADH2b导入水稻日本晴愈伤组织中获得的抗性愈伤中水稻基因BADH2的突变频率为26.9%；利用载体pGW3-BADH2a将T-BADH2a导入水稻日本晴愈伤组织中获得的抗性愈伤中水稻基因BADH2的突变频率为9.2%；利用载体pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a将T-BADH2b和T-BADH2a同时在水稻日本晴愈伤组织中表达获得的抗性愈伤中水稻基因BADH2的突变频率为18.1%，其中大片段删除的发生频率为5.1%。本发明为创制香米种质资源、培育优良香米品种提供了一种高效的育种方式。
附图说明
图1为T-BADH2b诱导水稻基因BADH2突变的PCR产物酶切（BglⅡ）电泳图。
图2为T-BADH2a诱导水稻基因BADH2突变的PCR产物酶切（BssHⅡ）电泳图。
图1和图2中，M为Marker（从下至上的片段大小依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000、8000bp），CK1和CK2为转pGW3的抗性愈伤，泳道1-23为待测抗性愈伤。
图3为T-BADH2b和T-BADH2a诱导的水稻基因BADH2突变的PCR产物电泳图。其中，M为Marker（从下至上的片段大小依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000、8000bp），CK2为转pGW3的抗性愈伤，泳道1-3为待测抗性愈伤。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
农杆菌菌株AGL-1（Agrobacterium strain AGL-1）：文献：Hellens,R.,Mullineaux,P.,and Klee,H.(2000).Technical Focus:A guide to Agrobacterium binary Tivectors.Trends in Plant Science 5:446-451.公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻日本晴（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare）：文献：StephenA.Goff et al.A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science.2002,(296):92,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
实施例1、水稻基因BADH2的序列及分析
水稻基因BADH2的序列如序列表序列1所示。序列分析显示，该基因共包括15个外显子，分别为序列表序列1的第1—108位（第一外显子）、第208—351位（第二外显子）、第1404—1485位（第三外显子）、第1581—1729位（第四外显子）、第2427—2519位（第五外显子）、第2651—2775位（第六外显子）、第2860—2923位（第七外显子）、第3114—3180位（第八外显子）、第3873—3949位（第九外显子）、第4305—4418位（第十外显子）、第4819—4896位（第十一外显子）、第4978—5129位（第十二外显子）、第5233—5294位（第十三外显子）、第5566—5672位（第十四外显子）、第5771—5860位（第十五外显子）。
本发明分别以第二外显子和第四外显子上的序列为转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）的靶序列。
实施例2、TALENs设计及其重组表达载体的构建
一、TALENs靶序列的选择
1、靶序列A靶向水稻基因BADH2的第二外显子，序列如下：
5’-GAAGAGGAACCGGGGCCgcgactgggcgcgcgcgcCGGGCGCCGTCCGGGCC-3’（序列表序列1的第273位至第324位）；其中的小写字母为间隔序列，两侧大写字母为TALENs模块识别序列（分别命名为L-a和R-a）；下划线为BssH Ⅱ的酶切识别序列；
2、靶序列B靶向水稻基因BADH2的第四外显子，序列如下：
5’-GCTGGATGCTTTGAGTActttgcagatcttgcagaATCCTTGGACAAAAGGC-3’（序列表序列1的第1589位至第1640位）；其中的小写字母为间隔序列，两侧大写字母为TALEN模块识别序列（分别命名为L-b和R-b）；下划线为BglⅡ的酶切识别序列。
二、TALENs编码基因的设计与合成
将以靶序列A中的L-a为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2a-L，该核酸酶的编码基因序列如序列表序列3中第7—2952位所示，其中，序列表序列3的第7—27位编码核定位信号NLS，第463—2154位编码L-a序列识别模块蛋白，第2350—2952位（603bp）编码内切核酸酶Fok I；
将以靶序列A中的R-a为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2a-R，该核酸酶的编码基因序列如序列表序列3中第3085—6018位所示，其中，序列表序列3的第3085—3105位编码核定位信号NLS，第3541—5232位编码R-a序列识别模块蛋白，第5428—6018位（510bp）编码内切核酸酶Fok I；
序列表序列2中第2953—3006位编码T2A，由18个氨基酸组成，使T-BADH2a-L和T-BADH2a-R在同一表达盒中表达时断开形成两个蛋白。
将以靶序列B中的L-b为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2b-L，该核酸酶的编码基因序列如序列表序列2中第7—2952位所示，其中，序列表序列2的第7—27位编码核定位信号NLS，第463—2154位编码L-b序列识别模块蛋白，第2350—2952位（603bp）编码内切核酸酶Fok I；
将以靶序列B中的R-b为模块识别序列的TALEN命名为T-BADH2b-R，该核酸酶的编码基因序列如序列表序列2中第3085—6018位所示，其中，序列表序列3的第3085—3105位编码核定位信号NLS，第3541—5232位编码R-b序列识别模块蛋白，第5428—6018位（510bp）编码内切核酸酶Fok I；
序列表序列3中第2953—3006位编码T2A，由18个氨基酸组成，使T-BADH2b-L和T-BADH2b-R在同一表达盒中表达时断开形成两个蛋白。
分别合成序列表序列2和3所示的DNA片段。
三、TALENs重组表达载体的构建
将序列表序列2和3所示的DNA片段分别通过Gateway克隆（Invitrogen公司Gateway LR Clonase II Mix克隆酶）方法插入载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游attR1（序列表序列4的第2000-2156位）下，获得重组载体pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a；经测序证实，重组载体pGW3-BADH2b为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入序列表序列2所示的DNA片段；所述重组载体pGW3-BADH2a为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入序列表序列3所示的DNA片段。
所述载体pGW3是将载体pMDC32（Arabidopsis Biological Resource Center，网址：http://abrc.osu.edu/）中HindIII和Acc65Ⅰ位点间的35S启动子替换为序列表序列4第7—1993位所示的玉米ubiquitin启动子。
实施例3、重组根癌农杆菌的获得
将实施例2获得的重组载体pGW3-BADH2b热击转化农杆菌菌株AGL-1，获得含有重组载体pGW3-BADH2b的重组农杆菌，命名为AGL-1/pGW3-BADH2b；
将实施例2获得的重组载体pGW3-BADH2a热击转化农杆菌菌株AGL-1，获得含有重组载体pGW3-BADH2a的重组农杆菌，命名为AGL-1/pGW3-BADH2a。
同时将空载体pGW3热击转化农杆菌菌株AGL-1，获得含有重组载体pGW3-BADH2a的重组农杆菌，命名为AGL-1/pGW3。
实施例4、定点敲除水稻基因BADH2
一、导入单个TALEN的编码基因（农杆菌介导法）
用实施例3的重组农杆菌AGL-1/pGW3-BADH2b、AGL-1/pGW3-BADH2a和AGL-1/pGW3分别侵染水稻日本晴（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Nipponbare）成熟胚诱导的愈伤组织，将获得抗性愈伤组织分别命名为抗性愈伤B、抗性愈伤A和抗性愈伤CK1；实验分三批次进行，每批次为一个重复，每批次同时将上述三种重组农杆菌分别进行侵染，具体方法如下：
1、将重组农杆菌接种于YEB液体培养基（含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平）中，28℃振荡培养至OD600为1.0-2.0；以10,000rpm室温离心1min，用AAM液体培养基（其中，葡萄糖浓度为100g/L，乙酰丁香酮浓度为100μM，pH 5.2）重悬菌体并稀释至OD600为0.1，得到菌悬液。
2、将灭菌后的水稻日本晴种子接种于愈伤诱导培养基M1上，28℃黑暗培养7天，去除芽和残留胚乳后再继代培养4-6周，得到成熟胚愈伤组织。
3、将步骤2得到的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1得到的菌悬液中25—30min后，接种于含有两层滤纸的培养皿上，25℃黑暗下共培养3天。
4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基（在培养基M1中添加50mg/L潮霉素，pH5.7）中28℃黑暗下筛选培养2周，转入新配置的筛选培养基中进行再次筛选培养，如此重复共筛选培养三次，获得存活的抗性愈伤组织。
二、导入两个TALENs的编码基因（基因枪转化法）
将重组载体pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a用基因枪法共同转化水稻日本晴成熟胚诱导的愈伤组织，以转pGW3为对照；将获得的抗性愈伤组织分别命名为抗性愈伤AB、抗性愈伤CK2；实验分三批次进行，每批次为一个重复，具体方法如下：
1、将水稻日本晴成熟种子除去颖壳，在70%乙醇中浸泡30s,无菌水冲洗一次，然后在2.5%次氯酸钠溶液(滴加数滴Tween 20)中摇晃30min。经无菌水冲洗7次,用无菌滤纸吸干后,接种于愈伤诱导培养基M1上，每隔7-10天继代一次，直至得到胚性愈伤组织。
2、转化前4小时,将步骤1获得的胚性愈伤组织转移到含高渗透压培养基（MS基本培养基中添加90g/l甘露醇、30g/l蔗糖、2.0mg/l 2,4-D、3g/l植物凝胶，pH值5.8）的平皿上，每皿约50块愈伤组织放置在平皿中心直径约2.5cm范围内，用基因枪进行轰击。微粒包裹方法为：3mg金粉经无水乙醇消毒后,悬浮于50μl无菌水中，依次加入5μl浓度为1μg/μl的质粒DNA（所述质粒DNA为质量比为1:1的pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a，或为pGW3），20μl 0.1mol/L亚精胺和50μl2.5mol/L CaCl2后，充分混匀，离心，沉淀重悬于60μl无水乙醇。取9μl微粒悬液滴加在载样膜上，选用可裂膜的压力为1100psi，靶材料至载样膜距离为6cm，对靶材料进行轰击，每皿材料轰击一次。
3、将经步骤2轰击后的愈伤组织在原高渗培养基上继续培养16小时后，转至培养基M1上培养一周，转至筛选培养基（在培养基M1中添加30mg/L潮霉素，pH5.7）上筛选培养两周，再转到筛选培养基（在培养基M1中添加50mg/L潮霉素，pH5.7）进行再次筛选培养2周，获得抗性愈伤组织。
上述步骤一和二中的所述培养基M1的配方：N6基本培养基的大量元素，B5基本培养基的微量元素，B5基本培养基的维生素，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2EDTA,2,4-D 2mg/l,肌醇0.1g/l,谷氨酰胺0.5g/l,水解酪蛋白0.5g/l,脯氨酸2.8g/l,蔗糖30g/l,植物凝胶3.75g/l，pH5.8。
三、TALENs的活性检测
从步骤一和二获得的抗性愈伤A、B、AB、CK1和CK2中随机取愈伤，提取每个愈伤组织的基因组DNA，按照下述步骤1—3的方法检测TALENs的活性：
1、T-BADH2b表达的活性检测
以抗性愈伤B、CK1或AB的基因组DNA为模板，用引物BADH324-F（5’-ATCGAGAGGAAATCTGAGCTGG-3’（对应于序列表序列1的第1407—1428位））和BADH324-R（5’-ACCAAGGTGTGATCAACCCAACTAC-3’（对应于序列表序列1的第1730—1706位））进行PCR扩增，将获得的扩增产物用BglⅡ酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。所述扩增产物为324bp，用BglⅡ酶切后的两个片段分别为206bp和118bp；如电泳图显示有206bp和118bp大小的条带，说明该愈伤组织中基因BADH2发生了突变；如无上述两个条带，则说明该愈伤组织中基因BADH2未发生突变，并经测序证实。部分酶切电泳结果如图1所示。统计检测的愈伤数、发生突变的愈伤数及发生突变的愈伤数占检测的愈伤数的百分比即突变效率（%），结果如表1所示。
表1.T-BADH2b诱导水稻基因BADH2发生突变的检测结果
2、T-BADH2a表达的活性检测
以抗性愈伤A、AB、CK1或CK2的基因组DNA为模板，用引物BADH352-F（5’-TCTCCACCCTCTGCTTCTGCCTCTGA-3’（对应于序列表序列1的第128—153位））和BADH352-R(5’-GCATATCGATCGATTTGGGGCTCAAA-3’（对应于序列表序列1的第479—454位）)进行PCR扩增，将获得的扩增产物用BssHⅡ酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。所述扩增产物为352bp，用BssHⅡ酶切后的两个片段分别为181bp和171bp；如电泳图显示有181bp和171bp大小的条带，说明该愈伤组织中基因BADH2发生了突变；如无上述两个条带，则说明该愈伤组织中基因BADH2未发生突变，并经测序证实。部分酶切电泳结果如图2所示。统计检测的愈伤数、发生突变的愈伤数及发生突变的愈伤数占检测的愈伤数的百分比即突变效率（%），结果如表2所示。
表2.T-BADH2b诱导水稻基因BADH2发生突变的检测结果
3、T-BADH2b和T-BADH2a共表达的活性检测
以抗性愈伤AB或CK2的基因组DNA为模板，用引物BADH1874-F5’-GATCCCGCAGCGGCAGCTCTTCGTCG-3’（对应于序列表序列1的第12—37位）和BADH1874-R 5’-GAGGAATAAAATCTCAAATGTCTTCAACTT-3’（对应于序列表序列1的第1885—1856位）进行PCR扩增，将获得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；若获得552bp的扩增条带，说明在基因BADH2上发生大片段删除；若获得1874bp的扩增条带，则未发生大片段删除；并将扩增产物进行测序。部分PCR扩增产物的电泳结果如图3所示。
测序和电泳的结果显示：98个抗性愈伤AB中，5个愈伤检测到大片段删除（频率为5.1%）；1个愈伤中检测到大片段颠倒（频率为1%）。
Claims (10)
1.水稻基因BADH2的定点敲除系统，为如下a）或b）或c）：
a）由T-BADH2b和T-BADH2a组成；
b）T-BADH2b；
c）T-BADH2a；
所述T-BADH2b为特异剪切所述水稻基因BADH2内靶序列B的转录激活子样效应因子核酸酶；所述靶序列B由间隔序列b、位于所述间隔序列b 5’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列L-b和位于所述间隔序列b 3’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列R-b组成；所述间隔序列b为水稻基因BADH2中包含序列表序列1第1612位至第1617位的长为15—20的序列；所述模块识别序列L-b的长为15—30bp，所述模块识别序列R-b的长为15—30bp；
所述T-BADH2a为特异剪切所述水稻基因BADH2内靶序列A的转录激活子样效应因子核酸酶；所述靶序列A由间隔序列a、位于所述间隔序列a 5’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列L-a和位于所述间隔序列a 3’端的转录激活子样效应因子核酸酶的模块识别序列R-a组成；所述间隔序列a为水稻基因BADH2中包含序列表序列1第298位至第303位的长为15—20bp的序列；所述模块识别序列L-a的长为15—30bp，所述模块识别序列R-a的长为15—30bp。
2.根据权利要求1所述的定点敲除系统，其特征在于：
所述靶序列B为序列表序列1的第1589位至第1640位的核苷酸序列；
和/或，所述靶序列A为序列表序列1的第273位至第324位的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的定点敲除系统，其特征在于：
所述T-BADH2b由序列表序列2第7位至第2952位所示核苷酸序列和序列表序列2第3085位至第6018位所示核苷酸序列分别编码的蛋白质组成；
和/或，所述T-BADH2a由序列表序列3第7位至第2952位所示核苷酸序列和序列表序列3第3085位至第6018位所示核苷酸序列分别编码的蛋白质组成。
4.含有上述任一所述定点敲除系统编码基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或重组细胞系。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pGW3-BADH2b和pGW3-BADH2a；
所述重组载体pGW3-BADH2b为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入编码所述T-BADH2b的基因的载体；
所述重组载体pGW3-BADH2a为在载体pGW3的玉米ubiquitin启动子下游插入编码所述T-BADH2a的基因的载体；
所述载体pGW3是将载体pMDC32中HindIII和Acc65Ⅰ位点间的片段替换为玉米ubiquitin启动子的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述编码所述T-BADH2b的基因为序列表序列2所示基因；
所述编码所述T-BADH2a的基因为序列表序列3所示的基因；
和/或，所述玉米ubiquitin启动子的序列为序列表序列4的第7位至第1993位。
7.一种定点敲除水稻基因BADH2的方法，包括在水稻中表达权利要求1—3中任一所述定点敲除系统的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述T-BADH2b在水稻中表达是通过所述重组载体pGW3-BADH2b将编码所述T-BADH2b的基因导入所述水稻中实现的；
所述T-BADH2a在水稻中表达是通过所述重组载体pGW3-BADH2a将编码所述T-BADH2a的基因导入所述水稻中实现的。
9.根据权利要求1—3中任一所述的定点敲除系统或权利要求7—8中任一所述方法，其特征在于：所述水稻基因BADH2为序列表序列1所示基因。
10.权利要求1—3中任一所述的定点敲除系统或权利要求7—9中任一所述方法在提高水稻米香中的应用。
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