CN105087572A - 一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1，分子标记引物的核苷酸序列为：正向引物F：5’-AAACAGGATAGAACTGGCTAC-3’；反向引物R：5’-CATTTACTGGGAGTTATGAAAC-3’；引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，香型水稻扩增出长度211bp条带，非香型水稻扩增出219bp条带，杂合基因型水稻材料同时扩增出211bp和219bp条带；该分子标记引物A-2-1位于Aro2基因的编码区，在遗传上与香味表型共分离，选择效率达到100％，可广泛应用于香型水稻材料的鉴定和/或其后代的香味基因型选择育种。

Description

一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1及其应用

技术领域

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1及其应用。

背景技术

水稻是全球半数多人口的主食，随着人们生活水平的日益提高，消费者对稻米品质也提出了更高要求。水稻香味是高档优质米的一个重要品质性状；香稻米质优良，香味馥郁，兼具食疗保健作用，愈来愈受到消费者的青睐和市场欢迎。

通过气-质联用检测香味主成分及东西方人群对香味感官评估的相关性分析，国际水稻所研究者发现2-乙酰-1-吡咯啉与人们的香味嗅觉呈极显著正相关，目前较为一致的看法认为香稻的芳香主要来自2-乙酰-1-吡咯啉，证实2-乙酰-1-吡咯啉在不同香稻品种之间的浓度存在差异，且在普通大米中的含量不到香米的十分之一。另外，Mahatheeranon等利用气相色谱-质谱法，结合火焰离子化检测仪，对泰国香稻KDML105糙米中2-乙酰-1-吡咯啉进行了定量测定，发现0.5克KDML105糙米即可明显检测到2-乙酰-1-吡咯啉。Wongpornchai等也利用固相微萃取(SPME)及连续蒸馏与液相提取(SDS)等方法，量化了面包花(VallarisglabraKtze)，露兜树(PandanusamaryllifoliusRoxb)和KDML105三个香型植物中2-乙酰-1-吡咯啉成分，发现2-乙酰-1-吡咯啉在干面包花中的比重最大，为26.1mg/kg，其次是新鲜露兜树叶，为10.3mg/kg，KDML105香米为3.0mg/kg。

据国内外学者研究，水稻香味是受细胞核基因控制的遗传性状，与细胞质遗传无关。水稻的无香味表现为胚乳直感现象，香稻叶片的香味受孢子体(2n)基因型决定，稻米的香味受制于胚乳(3n)基因型。如双亲之一为香稻，则F₁叶片无香味，杂交稻米(F₂种子碾米)香味特性为自然参合型；如双亲之一为香稻，且香味基因是等位的，则F₁叶片有香味，杂交稻米为全香型。据有关研究，F₂代香味与无香味的比例有1：3，1：15，9：7，207：49的等分离结果，控制该性状的基因数目有1～4对，其中有单隐性基因、双隐性基因、基因互作和三个显性互补基因的报道；但目前更多学者的研究结果倾向于水稻香味受一对单隐性基因控制。

在香味基因定位方面，在水稻第4，5，8，9，11，12染色体上均有定位研究报道。Dhulappanavar将一香味基因定位于第5连锁群，与颖尖色素P的遗传距离为30.41％，Siddiq等认为印度香稻品种T3香味性状是由双隐性基因控制，并将这两个基因分别定位于第5和第9染色体上。Lorieux等证实了RFLP标记RG28与香味基因fgr紧密连锁(5.8cM)，并将控制香味的两个数量性状位点分别定位于第4和第12染色体上。另外，Tomar和Prassad利用印度地方品种Baspatri定位了一个显性香味基因，位于第11染色体上。目前，水稻第8染色体上的香味研究报道较多。Dong等利用初级三体对三个日本地方香稻品种(Kabashiko、Shiroikichi、Henroyori)进行染色体定位，将单隐性香味基因定位在第8染色体上。Cordeiro等利用微卫星标记将2-乙酰-1-吡咯啉单隐性香味基因定位在第8染色体上。澳大利亚研究人员利用Monsanto水稻SSR序列数据库资料，筛选出14个与第8染色体上香味基因较近的微卫星标记；经过分离群体定位，发掘的SSR标记SCU015RM与香味基因的距离为2cM。Garland等利用微卫星DNA标记(SSR)对14个香稻品种进行基因定位，发现香味基因与第8染色体上的SSR引物RM42、RM223和SCU-SSR-1存在紧密连锁关系。

在基因克隆方面，澳大利亚植物遗传保护中心及中国浙江省农科院作物研究所联合研究，从香稻品种Basmati和Jasmine中克隆了第8染色体上的香味基因(fgr)。该研究发现，编码三甲基甘氨醛脱氢酶(BADH2)的一个基因及其同源物在香稻和非香稻材料编码区表现出显著多态性，证实了fgr是水稻中BADH2突变型。该基因存在细菌人工染色体文库(BAC)AP004463克隆中，其基因产物功能失活的突变可能与2-乙酰-1-吡咯啉的浓度有关。

川香29B是四川省农业科学院作物研究所选育的优质香稻保持系，具有较大生产价值；其香味基因来源于广东地方品种。以川香29B为供体亲本，以非香型的美国光身粳稻Lemont(简写为Le)和非香型恢复系R2为受体亲本分别构建F₂群体，对川香29B香味性状进行了遗传分析和基因定位。川香29B/Le，川香29B/R2两个杂交组合的F₁种子经咀嚼米粒鉴定没有香味，其F₁植株叶片经氢氧化钾法鉴定也没有香味，即川香29B香味性状受隐性基因控制。经χ²测验，两个F₂群体的无香味单株与香味单株分离比符合3:1，该结果由相应F_2:3家系香味表型进一步得到验证，表明川香29B香味性状受一对单隐性基因控制。利用268对在川香29B与Lemont存在多态性的微卫星(SSR)引物对香味基因池和无香味基因池进行分析。其中位于第8染色体上的SSR标记RM23097、RM515、RM8264、RM7049、RM7356和RM7556及本研究新开发的SSR标记Aro1和Aro7与香味性状存在连锁，且香味基因fgr被定位在SSR标记Aro7(0.57cM)和RM515(0.71cM)之间。利用29B/R2的F₂群体，香味基因fgr被定位于微卫星标记RM23120(0.52cM)和RM3459(1.23cM)之间。(参照附图1)。根据水稻物理图谱，RM23120位于Aro7和RM515之间，RM3459位于RM515和RM7049之间，即川香29B香味基因定位于SSR标记RM23120和RM3459之间。分析定位数据及相应物理位置，川香29B香味基因fgr位于水稻第8染色体20117016～20259866bp处，相应的BAC克隆AP005301和AP005537可能含有该基因。由水稻基因组数据库可知，该区域包括19个候选基因，其中包括Bradbury等人所报道的fgr(BADH2)基因，推测川香29B香味基因可能为BADH2基因。2013年国际同行将香味基因定名为Aro2。

根据BADH2基因cDNA序列，分段设计一系列基因特异引物。其中一对引物SF6是根据BADH2基因变异区域序列设计而来；

其中，上游引物序列是：5'-GCCGGTGCTCCTTTGTCATCA-3’；下游是：5'-TGTACCATCCCCACGGCTCAT-3’。以基因组DNA为模板，利用引物SF6对29B、Le、De和Ba的总DNA进行PCR扩增和测序分析，发现香稻材料29B、De和Ba与非香稻材料Le存在一致的序列多态性。3个香稻扩增序列在第7外显子出现8个碱基的连续缺失和3个单核苷酸多态性；而非香稻材料Le在该区域与公布的日本晴基因组序列完全一致，没有变异(参考附图2)。香稻材料中这种碱基缺失和单核苷酸突变，最终导致终止密码子TAA提前出现，从而使该基因编码的蛋白功能丧失。另外，后面两个单核苷酸多态性出现在第8内含子区，是无义突变。

为快速准确鉴定香型水稻材料及有效开展香型水稻育种，本单位根据香型水稻品种的BADH2基因第7外显子8个碱基的缺失设计Indel分子标记引物，并将分子标记引物应用于香型水稻材料的鉴定和/或其后代香味基因型选择育种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1，并提供了该标记引物在香型水稻材料的鉴定和/或其后代香味基因型选择育种中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1，其特征在于，所述分子标记引物的核苷酸序列为：

正向引物F：5’-AAACAGGATAGAACTGGCTAC-3’；

反向引物R：5’-CATTTACTGGGAGTTATGAAAC-3’；

所述引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，香型水稻扩增出长度211bp条带，非香型水稻扩增出219bp条带，杂合基因型水稻材料同时扩增出211bp和219bp条带；

所述211bp条带核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；

所述219bp条带核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。

所述的水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1用于香型水稻材料的鉴定和/或其后代香味基因型选择育种。

所述引物A-2-1在香型水稻材料的鉴定包括如下步骤：

步骤1，选取香型水稻材料和非香水稻材料；

步骤2，提取步骤1所选取材料的DNA；

步骤3，采用标记引物对DNA进行PCR扩增；

步骤4，对扩增结果进行凝胶电泳检测；

步骤5，从电泳检测结果中筛选出现与水稻香味基因Aro2的Indel标记特征条带一致的材料，其中香型水稻材料扩增出长度211bp条带，非香型对照材料扩增出219bp条带。

所述PCR扩增包括：

25μL的PCR反应体系为：100ng/μL的DNA模板2μL，10μmol的正向引物1.25μL，10μmol的反向引物1.25μL，2.5mM/μL的dNTPs2μL，+Mg²⁺的10×Buffer2.5μL，5u/μL的Taq酶0.25μL，双蒸水15.75μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

所述对扩增结果进行凝胶电泳检测具体为：按照每板30mL6％丙烯酰胺胶+0.3mL10％过硫酸铵+14μLTEMD的用量配制胶液；按5μL的量依次点入加了loadingbuffer之后的PCR产物；400V电泳2小时；采用0.1％AgNO₃溶液染色。

所述引物A-2-1在香型水稻后代香味基因型选择育种中的应用具体包括如下步骤：

步骤1，选择香型与非香型水稻材料进行杂交并自交产生后代；

步骤2，提取步骤1所选取材料及后代的DNA；

步骤3，采用所述Indel标记引物对DNA进行PCR扩增；

步骤4，对扩增结果进行凝胶电泳检测；

步骤5，从电泳检测结果中筛选出现与水稻香味基因Aro2的Indel标记特征条带一致的材料，其中，香型水稻材料与纯合香味单株扩增出211bp条带，非香型水稻材料与非香型纯合单株扩增出219bp条带，杂合基因型单株同时扩增出211bp和219bp条带；

步骤6，从香型水稻材料与非香型水稻材料杂交后代选择A-2-1标记扩增出211bp条带的单株或株系，结合田间农艺性状表现、稻米品质分析，培育香型水稻新材料。

本发明的有益效果：

本发明提供的分子标记A-2-1位于Aro2基因的编码区，在遗传上与香味表型共分离，选择效率达到100％。

本发明可广泛应用于香型水稻材料的鉴定和/或其后代的香味基因型选择育种。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为水稻第8染色体上香味基因精细定位图，香味基因Aro2(fgr)被精细定位在标记RM23120和RM3459之间；

图2为SF6引物扩增BADH2基因片段在川香29B(简写为29B)，Lemont(简写为Le)，Della(简写为De)和Basmati370(简写为Ba)中的部分序列比对图，与非香水稻材料Lemont相比，三个香稻材料(川香29B、Della、Basmati370)扩增序列在第7外显子出现8个碱基的连续缺失；

图3为利用Aro2引物对香型水稻材料和非香型对照水稻材料进行鉴定图，1-8分别为香型水稻川香29B，Della，Basmati370，IR58025B，KDML105，Jasmine，宜香1B，川106B，均扩增出211bp条带，9-11分别为非香型水稻Lemont，川345B，成恢727，均扩增出219bp条带；

图4为利用引物A-2-1对香型水稻(川106B)、非香型水稻(川345B)及其杂交F₂代单株进行鉴定图，9为非香型水稻材料川345B，10为香稻材料川106B，1-8及11-21为川106B与川345B杂交F₂代单株，川345B及其纯合非香F₂单株(1，3-5，7，13，14，17)扩增出219bp条带，川106B及其纯合香型F₂单株(11，18-21)扩增出211bp条带，杂合F₂单株(26，8，12，15，16)同时扩增出211bp和219bp条带。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：引物设计

引物SF6是根据BADH2基因变异区域序列设计而来，正向引物序列是：5'-GCCGGTGCTCCTTTGTCATCA-3’；反向引物序列是：5'-TGTACCATCCCCACGGCTCAT-3’。利用引物SF6对川香29B的总DNA进行PCR扩增并测序获得的部分序列(如附图2)，针对香稻品种缺失8个碱基区段设计Indel引物A-2-1。引物序列为：

正向引物F：5’-AAACAGGATAGAACTGGCTAC-3’

反向引物R：5’-CATTTACTGGGAGTTATGAAAC-3’。

实施例2利用分子标记引物A-2-1鉴定水稻材料的香型基因

如附图1所示，水稻第8染色体上香味基因Aro2(fgr)被精细定位在标记RM23120和RM3459之间。

(1)试验材料

香型水稻材料包括：川香29B，Della，Basmati370，IR58025B，KDML105，Jasmine，宜香1B，川106B。

非香水稻材料：Lemont，川345B，成恢727。

(2)DNA提取

取3-5g水稻幼嫩组织，使用组织研磨机研磨成粉末，采用CTAB法提取植物基因组DNA。

(3)PCR扩增体系

采用25μL体系进行PCR扩增，各试剂的具体用量见下表：

(4)PCR扩增反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

(5)24孔小板6％聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照每板30mL6％丙烯酰胺胶+0.3mL10％过硫酸铵+14μLTEMD的用量配制胶液；按5μL的量依次点入加了loadingbuffer之后的PCR产物；400V电泳2小时；采用0.1％AgNO3溶液染色。

(6)扩增结果

8个香型水稻材料(川香29B，Della，Basmati370，IR58025B，KDML105，Jasmine，宜香1B和川106B)均扩增出长度211bp条带，非香型对照材料(Lemont，川345B和成恢727)扩增出219bp条带(参见附图3)。

实施案例3香型水稻材料杂交后代香味基因型选择育种

(1)试验材料

包括香型水稻材料川106B，非香型水稻材料川345B及两个材料的杂交后代(F₁-F₈代)。

(2)田间试验

以香型水稻材料川106B为母本，以非香水稻材料川345B为父本杂交并自交产生F₁-F₈后代。

(3)DNA提取、PCR扩增体系、PCR扩增反应程序、24孔小板6％聚丙烯酰胺凝胶电泳

参照实施例2方法进行。

(4)扩增结果

川106B与纯合香味单株扩增出211bp条带，记为“B”；川345B与非香型纯合单株扩增出219bp条带，记为“A”；杂合基因型单株同时扩增出211bp和219bp条带，记为“H”(参见附图4)。

(5)香型水稻分子标记香味基因型选择育种

从川106B与川345B的杂交后代选择引物A-2-1标记扩增带型为“B”(扩增出211bp条带)单株或株系，结合田间农艺性状表现、稻米品质分析，培育香型水稻新材料。

实施例4比较引物A-2-1分子标记鉴定与叶片和米粒香味表型鉴定

(1)试验材料

香型水稻材料川106B，非香水稻材料川345B及两个材料杂交获得的180个F₂代单株。

(2)叶片和米粒香味表型鉴定

在水稻分蘖期，取2片新鲜叶片(2g左右)，剪碎放入培养皿中，加入1.7％的氢氧化钾溶液10ml，迅速盖好，摇匀后室温放置10min。然后由3-4人组成的鉴定小组逐一评定香味有无，并对有争议的进行重测。米粒香味鉴定由3人组成，每人对同一F₂单株所收种子分别咀嚼鉴定，如连续5粒都有香味，则该F₂单株为有香味单株；否则要咀嚼12粒来判断该F₂单株是香味杂合还是无香味单株。并对有争议的进行重测。

(3)比较A-2-1分子标记鉴定与叶片和米粒香味表型鉴定

A-2-1分子标记鉴定为“B”(扩增出211bp条带)的F₂单株经叶片及米粒香味鉴定均具有香味；A-2-1分子标记鉴定为“A”(扩增出219bp条带)的F₂单株均不具有香味。A-2-1分子标记鉴定为“H”(同时扩增出211bp和219bp条带)的F₂单株叶片无香味，其米粒为25％有香味、75％无香味。这些结果表明：利用香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1鉴定与香味表型鉴定结果一致率达到100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1，其特征在于，所述分子标记引物的核苷酸序列为：

正向引物F：5’-AAACAGGATAGAACTGGCTAC-3’；

反向引物R：5’-CATTTACTGGGAGTTATGAAAC-3’；

所述引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，香型水稻扩增出长度211bp条带，非香型水稻扩增出219bp条带，杂合基因型水稻材料同时扩增出211bp和219bp条带；

所述211bp条带核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；

所述219bp条带核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。

2.权利要求1所述的一种水稻香味基因Aro2的功能性Indel分子标记引物A-2-1在香型水稻材料的鉴定和/或其后代香味基因型选择育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记引物A-2-1在香型水稻材料的鉴定包括如下步骤：

步骤1，选取香型水稻材料和非香水稻材料；

步骤2，提取步骤1所选取材料的DNA；

步骤3，采用所述Indel标记引物对DNA进行PCR扩增；

步骤4，对扩增结果进行凝胶电泳检测；

步骤5，从电泳检测结果中筛选出现与水稻香味基因Aro2的Indel标记特征条带一致的材料，其中香型水稻材料扩增出长度211bp条带，非香型对照材料扩增出219bp条带。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增包括：

25μL的PCR反应体系为：100ng/μL的DNA模板2μL，10μmol的正向引物1.25μL，10μmol的反向引物1.25μL，2.5mM/μL的dNTPs2μL，+Mg²⁺的10×Buffer2.5μL，5u/μL的Taq酶0.25μL，双蒸水15.75μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤4具体为：按照每板30mL6％丙烯酰胺胶+0.3mL10％过硫酸铵+14μLTEMD的用量配制胶液；按5μL的量依次点入加了loadingbuffer之后的PCR产物；400V电泳2小时；采用0.1％AgNO₃溶液染色。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子标记引物A-2-1在香型水稻后代香味基因型选择育种中的应用具体包括如下步骤：

步骤1，选择香型与非香型水稻材料，进行杂交并自交产生后代；

步骤2，提取步骤1所选取材料及后代的DNA；

步骤3，采用分子标记引物A-2-1对DNA进行PCR扩增；

步骤4，对扩增结果进行凝胶电泳检测；

步骤5，从电泳检测结果中筛选出现与水稻香味基因Aro2的Indel标记特征条带一致的材料，其中，香型水稻材料与纯合香味单株扩增出211bp条带，非香型水稻材料与非香型纯合单株扩增出219bp条带，杂合基因型单株同时扩增出211bp和219bp条带；

步骤6，从香型水稻材料与非香型水稻材料杂交后代选择引物A-2-1扩增出211bp条带的单株或株系，结合田间农艺性状表现、稻米品质分析，培育香型水稻新材料。