CN1810974A - 水稻米香基因、包含水稻米香基因表达载体的构建方法及用途 - Google Patents

Abstract

水稻米香基因、包含水稻米香基因表达载体的构建方法及用途，涉及生物技术领域，特别是水稻育种基因技术。水稻米香基因的核苷酸总长为9066个碱基，包括起始密码子ATG上游1242碱基，基因区域5859碱基和终止密码子TAA下游1965碱基，编码区由15个外显子组成，其基因序列为发生改变的编码三甲基甘氨醛脱氢酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外显子发生一个8碱基的缺失。用米香型水稻Badh基因二侧的限制性酶切位点HindIII，将完整的水稻米香基因从阳性BAC克隆中切割下来，再克隆到表达载体pCAMBIA1302中，获得水稻米香基因表达载体，可用于优良水稻品种的培育。

Description

水稻米香基因、包含水稻米香基因表达载体的构建方法及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是水稻育种基因技术。

背景技术

由于香味是优质稻米重要特征之一，在世界范围内开展了广泛的研究。已将控制米香的基因定位在水稻第8号染色体上，位于分子标记RM515和SSRJ07约386kb范围内。通过对这一区域的基因进行测序，Bradbury等人(2005)发现了一个在米香与非香品种间存在序列差异的基因，这一基因编码三甲基甘氨醛脱氢酶(Beitaine Aldehyde dehydrogenase)，推测可能与米香的合成有关。这是目前能见到的有关米香基因最新报道，作者只是推测这一基因可能与米香有关，但是还没有最关键的功能互补证据，也就是说迄今为止还没有克隆到控制米香的基因。

发明内容

本发明针对米香基因研究的现状，克隆了控制水稻米香的基因，发明了包含水稻米香基因的表达载体，为培育具有米香特性的优质水稻提供条件。

本发明之米香基因的核苷酸总长为9066个碱基，包括起始密码子ATG上游1242碱基，基因区域5859碱基和终止密码子TAA下游1965碱基，编码区由15个外显子组成，其基因序列为发生改变的编码三甲基甘氨醛脱氢酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外显子发生一个8碱基的缺失。

本发明在精细定位、功能互补的基础上，首先克隆出了与稻米香味有关的基因，米香基因为编码功能缺陷的三甲基甘氨醛脱氢酶，而非香基因编码正常的三甲基甘氨醛脱氢酶。在序列比对的基础上获得了米香基因特异的分子标记。随着人们生活水平的提高，对稻米的品质提出了更高的要求。米香基因的克隆和相关基因标签标记的发展可以使人们利用遗传手段或分子标记辅助选择来改良水稻品质，在水稻育种单位将会得到广泛应用。用基因标签分子标记在育种过程中检测各个单株的米香基因，选育带米香性状的各种优质品种。因为米香性状准确测定非常困难，在育种上过程中很容易被丢失，用分子标记辅助选择的方法是最简单、可靠的直接培育优良品种的方法。米香是一种非常诱人的香味物质，克隆到米香基因后可以通过生物反应器的方法来大量合成米香物质，这在工业生产米香物质会得到广泛应用。

本发明还提供了控制米香性状表达的水稻米香基因表达载体的构建方法。

用米香型水稻Badh基因二侧的限制性酶切位点HindIII，将完整的水稻米香基因从阳性BAC克隆中切割下来，再克隆到已知的表达载体pCAMBIA1302中，获得水稻米香基因表达载体。

本发明的第三个发明目的还在于提出了上述表达水稻米香基因载体的用途。

用于优良水稻品种的培育。

可用米香基因序列构建RNA干扰载体转化正常水稻，培育香稻品种。

获得控制米香基因后，可以利用已知的米香基因序列构建RNA干扰载体，通过遗传转化将优良水稻品种内源的编码三甲基甘氨醛脱氢酶基因失活，快速培育优质香稻品种。

具体实施方式

按照本发明的技术方法可实现米香等目标基因的克隆，并将克隆到的基因应用到育种等领域上。

1、基因的精细定位：用目标性状(如米香性状)表现差异的籼粳稻杂交，组配F2、F3、BC1等分离后代群体。利用水稻基因组上的SSR分子标记对目标基因进行定位。在定位的基因区域根据籼粳稻基因组序列的差异发展高密度分子标记，对目标基因进行精细定位。本研究中共组配8个分离后代群体，共计2891个单株，通过定位确定米香基因所在区域，在米香基因区域根据籼粳稻的序列发展出了平均物理距离只有30kb的高密度分子标记，最终将米香基因定位在第8号染色体分子标记L02和L06所限定的69kb范围内。另外，对于米香这类测定非常困难的性状需要对关键重组个体进行自交，对自交后代的基因型和表现型进行详细测定，以确保定位的准确性。在米香基因的定位中，对关键重组个体进行自交，用米香基因区域的分子标记分析自交后代的基因型，用高精度GC-MS法直接测定2AP的含量来确定相应的表现型。此项验证确保了基因定位的准确性，在类似米香这样复杂性状的基因克隆中必不可少。

2、定位区域候选基因的确定：水稻中克隆基因的最大优势在于人们已经获得了籼粳稻基因组的全序列，并预测了各种可能的基因，这些信息可以在互联网上随时查询。在获得了目标基因的精细位置后就很容易获得相应区域的候选基因。本发明在确定了米香基因位置后，我们查到了这一区域内籼粳稻的序列信息，通过相互比较分析确定了三个米香的候选基因，分别控制真核类碳酸酐酶(Eukaryotic-type carbonic anhydrase)、3-甲基丁酰辅酶A羧化酶，β链(3-Methylcrotonyl-CoA carboxylase，beta chain)和三甲基甘氨醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase)。

3、表达载体的构建：候选基因确定后，需要将它们克隆到表达载体中用于基因功能互补鉴定。候选基因分离最好从基因组BAC库中分离，这样可以确保基因的完整性。另外，也可以通过长距离PCR的方法获得，这样在PCR过程中可能会产生碱基错配，影响鉴定结果。表达载体可分为基于农杆菌转化和基因枪转化的表达载体，在水稻上一般都采用农杆菌表达载体，这类载体中目前用得比较多的是pCAMBIA系列载体。在克隆米香基因时，分别构建香米品种苏御糯和非香品种南京11基因组大片段BAC库。利用紧密连锁和共分离的分子标记分别从二个BAC库中获得了4个和2个覆盖候选基因区域的阳性BAC克隆。通过亚克隆方法将苏御糯BAC克隆中的三个米香候选基因以及南京11BAC克隆中的三个非香候选基因分别克隆到表达载体pCAMBIA1302中。这一方法最关键的环节是根据已测序的水稻籼粳亚种基因组序列选定候选基因两侧的酶切位点，通过相应的限制性内切酶将候选基因直接从阳性BAC克隆中切割下来，并克隆到表达载体中。最后将克隆到的候选基因测序，获得全长序列。

4、转基因功能互补鉴定：从候选基因中确定哪个是真正的基因必须通过转基因功能互补鉴定，也就是将克隆到表达载体中的候选基因通过农杆菌导入到性状为隐性的受体中，如在转基因植株中表现出显性的性状，对应的候选基因就是我们所要克隆的基因。考虑到非香对香为显性，将三个来自于南京11的非香候选基因通过农杆菌介导导入到香米品种苏御糯和武香粳中。米香性状测定表明，导入了编码三甲基甘氨醛脱氢酶的转基因植株失去了米香特征，此互补试验结果表明三甲基甘氨醛脱氢酶与米香性状有关。对此基因的序列分析后表明，在非香品种中编码三甲基甘氨醛脱氢酶的基因正常，而在香米品种苏御糯及其他米香品种中此基因在编码区的第七外显子区域出现8个碱基的缺失和3个碱基的变异，翻译提前终止，产生截短的蛋白。至此，转化鉴定结合序列分析最终确定了序列发生变异的编码三甲基甘氨醛脱氢酶的基因是控制米香的基因。

米香基因是序列发生变异的Badh基因，其核苷酸序列包括起始密码子ATG上游1242碱基，基因区域5859碱基和终止密码子TAA下游1965碱基，总长为9066个碱基，编码区由15个外显子组成。与正常的Badh基因序列相比最显著的特征是第7外显子发生一个8碱基的缺失。如图1所示。

5、基因标签标记的发展：克隆到基因后可根据基因序列发展基因标签分子标记用于分子标记辅助育种。在实际应用中这种标记非常实用，可大大提高常规育种的效率。克隆到米香基因后，发展基因特异的标签标记，这一标记的引物序列为：左引物：5′-GTTGGTCTTCCTTCAGGTGT-3′；右引物：5′-CATAGCAAGTGGCATGTACC-3′。扩增产物香米中为508bp；非香水稻中为516bp。这一标记可在分离后代中直接显示带有米香基因的个体，从而选育带米香性状的优良水稻品种。

6、获得控制米香基因后，可以利用米香基因序列构建RNA干扰载体，通过遗传转化正常水稻，将正常水稻品种内源的编码三甲基甘氨醛脱氢酶基因失活，快速培育优质香稻品种。

                                    序列表

aagcttctct agatacgttt ccatcaaacg aagcccacgg tcaattggtt aacccagcaa     60

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taacaataaa tcaaatgata aaaaaaaatt aataattact taaaattttt taaataagat    900

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cccccccccc aacgcgaccc gcgtgcgtgt gttccgtaca gggggaggag ctccgcgtgg   1680

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tggccatagg ttgatcgaca gttcgagtat tctgcttctg tttggaataa gttggaagca   1920

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tgcacatttg attggtgcgc aacaacaagt gtatattgtg tgtgcttcgt tagttggcag   2100

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gatggatccc tttaatttct agtgccaaat gcatgctaga tttctcacag tttttctctt   2280

caggttatat ttctcgtatt tccttttcct aaaggattgc tttttcatgt attttctggc   2340

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atttatttat gacccaagca tggtactaaa tagtactagt aacatgcata tactgaatga   3060

gtttacaact ttacatgatt tttttgaact atgaaagttg aagacatttg agattttatt   3120

cctcttctct tgtgcaaaca tattattgtc tcacaaattg tacctagcag ctactctctc   3180

cgtttcatat tataagtcgt ttgacttttt tcctagtcaa aatgtgttaa gtttgaccaa   3240

gtttatagaa aaatttagca acatctaaaa tatcaaagtc atgttttagt gttttttcag   3300

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gttaacttgt taatgtcata cccatgctag ttgcaatgac atttgatttt aaaatgttgt   3840

ggcatgtcca tgctgcaagc aatgtaattt gaaatctctc tctatcatta attaccagga   3900

cttgtttgga gcttgctgat gtgtgtaaag aggttggtct tccttcaggt gtgctaaaca   3960

tagtgactgg attaggttct gaagccggtg ctcctttgtc atcacaccct ggtgtagaca   4020

aggtacagct attcctcctg taatcatgta taccccatca atggaaatga tattcctctc   4080

aatacatggt ttatgttttc tgttaggttg catttactgg gagttatgaa actggtatat   4140

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ctttctacta actctctatt atcaattctc aatgttgtcc ttttctttta actcctttac   4260

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cccaaaagcc ctttttggtg tcttgggctt gttgcagaaa tactggtccc agacgagcag   4560

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cgttgttagt gaaggacagg taccacatgt aaactttttc taaattcaaa aaagaaatgc   5700

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gtggtacagg gtcttcctac tttgagcaaa ttcgtgttaa aatgcattga tgaaaaggcc   5880

acctttccgt aggtttatct tgtcataatt taaaccccaa taaaatttta attttttgtt   5940

ttgaccccat ggcactttaa tgaaatcact tagccatgag cttttgtata tattttcaaa   6000

gcaccagaat gtttagatgg tttgttggaa atcttacaca tcctattgcc ttgtgtcagt   6060

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atgtatatac tctgtggcat atgaacttat tctgctacta ctacttttga tagttatggt   6480

ctggctggtg ctgtgctttc cggtgaccgc gagcgatgcc agagattaac tgaggtatat   6540

ccaagtgaag ggggttggca ttgtttgatt catatgacat ggttgcatca agctgatatt   6600

caagaatctc atttattact tgcattctat gcatctccag ttcttccctg gactccggtc   6660

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cacatcatct gatccatgac tttatatttg accccttttt tttgcaaaag aaagggaaat   6780

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tcctatatat aaatgactat tgatatgagc atgagaagtt ttaagggttt atttcaaata   7800

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aagtccaact atagccagag tttgggggag cttaagattc tgagaagcag ctggttggta   8280

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Claims (4)

1、水稻米香基因，其特征是其核苷酸总长为9066个碱基，包括起始密码子ATG上游1242碱基，基因区域5859碱基和终止密码子TAA下游1965碱基，编码区由15个外显子组成，其基因序列为发生改变的编码三甲基甘氨醛脱氢酶基因Badh，同正常的Badh基因相比第7外显子发生一个8碱基的缺失。

2、一种包含如权利要求1所述水稻米香基因表达载体的构建方法，其特征在于用米香型水稻Badh基因二侧的限制性酶切位点HindIII，将完整的水稻米香基因从阳性BAC克隆中切割下来，再克隆到表达载体pCAMBIA1302中，获得水稻米香基因表达载体。

3、一种如权利要求2所述水稻米香基因表达载体的用途，其特征在于用于优良水稻品种的培育。

4、根据权利要求3所述水稻米香基因表达载体的用途，其特征在于用米香基因序列构建RNA干扰载体转化正常水稻，培育香稻品种。