CN1821269A - 一种小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的小麦籽粒硬度相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：1)序列表中的SEQID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。本发明的小麦籽粒硬度相关蛋白编码基因表达friabilin蛋白量减少，由此而导致小麦籽粒SKCS硬度提高，含有该基因的突变型小麦的籽粒硬度与野生型同品种小麦相比有较大提高，籽粒硬度达可达68。Pinb－D1r将在小麦籽粒硬度的基因工程改良和优良小麦品种的培育中起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究。

Description

一种小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种小麦籽粒硬度Pinb蛋白及其编码基因与其在小麦品质改良中的应用。

背景技术

籽粒硬度是国际上小麦市场分级和定价的重要依据，影响小麦的润麦加水量、出粉率、面粉颗粒大小、破损淀粉粒数量和食品加工品质等，是重要的育种目标之一。按胚乳质地可把普通小麦分为硬质麦、混合麦和软质麦。籽粒硬度主要由位于染色体5D短臂(5DS)上的一对主效基因Pina和Pinb(统称为puroindoline)控制。自从1986年Greenwell和Schofield从小麦籽粒中提取出一组分子量约为15kD的蛋白多肽，命名为friabilin蛋白后，籽粒硬度在分子水平上研究进程大大加快。研究表明，Puroindoline蛋白是friabilin蛋白的主要成分，是决定小麦籽粒硬度的基础，主要由两种蛋白组分puroindoline a(PINA)和puroindoline b(PINB)组成，其编码基因分别命名为Pina和Pinb。当Pina和Pinb同为野生型(即为Pina-D1a/Pinb-D1a)时，籽粒表现为软质，Pina和Pinb中的任一基因缺失或突变，籽粒表现为硬质，硬粒小麦没有D组染色体，籽粒硬度最大。Pina-D1a具有序列表中序列3的核苷酸序列，编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的PINA；序列4中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signalpeptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第28位氨基酸残基为N端终止序列(N-terminal end of PINA)；自氨基端的第29位至第148位氨基酸残基为PINA的成熟蛋白序列(Gautier M F，Aleman M E，Guirao A，Marion D，Joudrier P.1994.Triticum aestivum puroindolines，two basiccycteine-rich seed proteins：cDNA sequence analysis and developmental geneexpression.Plant Mol Biol，25：43-57)。Pinb-D1a具有序列表中序列5的核苷酸序列，编码具有序列表中序列6的氨基酸残基序列的PINB；序列6中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signalpeptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第29位氨基酸残基为N端终止序列(N-terminal end of PINB)；自氨基端的第30位至第148位氨基酸残基为PINB的成熟蛋白序列(Gautier M F，Aleman M E，Guirao A，Marion D，Joudrier P.1994.Triticum aestivum puroindolines，two basiccycteine-rich seed proteins：cDNA sequence analysis and developmental geneexpression.Plant Mol Biol，25：43-57)，软质麦淀粉表面puroindoline蛋白含量较高，硬质麦puroindoline含量较低，而缺少了D组染色体的硬粒小麦则没有发现这种蛋白。Giroux等对两个硬麦品种进行研究，发现Pinb基因中有一位点发生了突变，导致成熟蛋白氨基酸序列中第46位(自序列6的氨基端第75位)的Gly变为Ser，将此突变类型命名为Pinb-D1b。此后，相继有多种Pinb突变类型被发现。Lillemo和Morris发现了Pinb基因两种新的突变类型，一个是成熟蛋白氨基酸序列第60位(自序列6的氨基端第89位)的Leu变为Pro，将此突变类型命名为Pinb-D1c，另一个是成熟蛋白氨基酸序列第44位(自序列6的氨基端第73位)氨基酸由Trp变为Arg，将此突变类型命名为Pinb-D1d。Morris等发现，一种硬红春小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第39位(自序列6的氨基端第68位)氨基酸Trp的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1e；在一种硬红冬小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位氨基酸(自序列6的氨基端第73位)Trp的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1f；在另一种硬红冬小麦的Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第56位(自序列6的氨基端第85位)氨基酸Cys的密码子突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1g。最近，Massa等和Gedye等在山羊草中新发现了六种Pina基因和四种Pinb基因的等位变异，但均表现为软质。Chen等在我国冬麦品种京冬11中发现Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位(自序列6的氨基端第73位)色氨酸变成了亮氨酸的新变异类型，命名为Pinb-D1q，将其与已知的各种突变类型比较后，发现Pinb成熟蛋白氨基酸序列中第44位氨基酸突变频率较高，先前报道的Pinb-D1d和Pinb-D1f也发生在这个位点。

有关Pinb基因及其突变型的总结如表1所示：

表1已知的Pinb基因的表现型、突变类型、分子变化及参考文献

Pinb	表现型	分子变化	参考文献
				Pinb-D1a	软质	野生型	Giroux M J and C.F Morris A glycine to serine change in puroindoline b isasssociated with wheatgrain hardness and low levels of starch-surface friabilinTheoretical Applied Genetics，1997，95：857-864
Pina-D1b	硬质	Pina缺失	Giroux M J and Morris C F.Wheat grain hardness results from highlyconserved mutations in friabilin components puroindoline a and b.Proceedings of National Academic Science of USA，1998，95：6262-6266
				Pinb-D1b	硬质	Gly-46突变为Ser-46，GGC→AGC	Giroux M J and C.F Morris.A glycine to serine change in puroindoline b isasssociated with wheatgrain hardness and low levels of starch-surface friabilin.Theoretical Applied Genetics，1997，95：857-864
Pinb-D1c	硬质	Leu-60突变为Pro-60，CTG→CCG	Lillemo M，Morris C F.Aleucine to proline mutation in puroindoline b isfrequently present in hard wheats from Northern Europe.Theoretical Applied Genetics，2000，100：1100-1107

Pinb-D1d	硬质	Trp-44突变为Arg-44，TGG→AGG	Lillemo M，Morris C F.Aleucine to proline mutation in puroindoline b isfrequently present in hard wheats from Northern Europe.Theoretical Applied Genetics，2000，100：1100-1107
				Pinb-D1e	硬质	Trp-39突变为终止子TGG→TGA	Morris C F，Lillemo M，Simeone M C，Giroux M J，Babb S L，Kimberlee K K.Prevalence of puroindoline grain hardness genotypes among historicallysignificant North American spring and winter wheats.Crop Science，2001.41：218-228
Pinb-D1f	硬质	Trp-44突变为终止子TGG→TGA	Morris C F，Lillemo M，Simeone M C，Giroux M J，Babb S L，Kimberlee K K.Prevalence of puroindoline grain hardness genotypes among historicallysignificantNorth American spring and winter wheats.Crop Science，2001，41：218-228
				Pinb-D1g	硬质	Cys-56突变为终止子TGC→TGA	Morris C F，Lillemo M，Simeone M C，Giroux M J，Babb S L，Kimberlee K K.Prevalence of puroindoline grain hardness genotypes among historicallysignificantNorth American spring and winter wheats.Crop Science，2001，41：218-228
Pinb-D1l	硬质	Lys-45突变为Glu-45AAG→GAG	Pan Z，Song W，Meng F，Xu L，Liu B，Zhu J.Characterization of GenesEncoding Wheat Grain Hardness from Chinese Cultivar GaoCheng 8901.Cereal Chemistry，2004，81(2)：287-289
				Pinb-D1p	硬质	碱基A缺失	Xia L Q，Chen F，He Z H，Chen X M，Morris C F.Occurrence of puroindolinealleles in Chinese winter wheat.Cereal Chemistry，2005，82(1)：38-43
Pinb-D1q	硬质	Trp-44突变为Leu-44TGG→TTG	Chen F，He Z H，Xia X C，Lillemo M，Morris C F.A new puroindoline bmutationpresent in Chinese winter wheat cultivar Jingdong 11.Journal ofCereal Science，2005，in press

Pina-D1b突变型先前被认为与PINA蛋白缺失完全等同，随着最近PINA蛋白缺失多种原因的发现，将其中最为普遍的因Pina基因缺失而导致PINA蛋白缺失类型命名为Pina-D1b(Gazza L，Nocente F，Ng PKW，Pogna NE.Genetic and biochemicalanalysis of common wheat cultivars lacking puroindoline a.Theor Appl Genet，2005，110：470-478)

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的小麦籽粒硬度相关蛋白，名称为PINB-D1R，来源于小麦，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

序列表中的SEQ ID №：1由148个氨基酸残基组成，序列1中，自氨基端的第1位至第19位氨基酸残基为信号肽，信号肽的切割位点(cleave site of the signalpeptide)在自氨基端的第19位和第20位氨基酸残基之间；自氨基端的第20位至第29位氨基酸残基为N端终止序列(N-terminal end of PINB)；自氨基端的第30位至第148位氨基酸残基为PINB的成熟蛋白序列。与野生型PINB相比，自序列1的氨基端的第76位(成熟蛋白序列的第47位)Arg由Gly突变而来。

上述小麦籽粒硬度相关蛋白PinB-D1r的编码基因(Pinb-D1r)也属于本发明的保护范围。

小麦籽粒硬度相关蛋白PINB-D1R的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质；与未发生突变的Pinb-Dla的编码基因相比，它的核苷酸序列自5’端第226位碱基由G变成了C，使Gly的密码子GGC突变成了Arg的密码子CGC。

上述与小麦籽粒硬度相关基因Pinb-D1r的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增小麦籽粒硬度相关基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的Pinb-D1r基因表达friabilin蛋白量减少，由此而导致小麦籽粒SKCS硬度提高，Pinb-D1r突变型小麦的籽粒硬度与野生型小麦(籽粒硬度为22，野生型小麦籽粒硬度指数的范围一般为0-40)相比有较大提高，籽粒硬度达可达68。Pinb-D1r将在小麦籽粒硬度的基因工程改良和优良小麦品种的培育中起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由北京奥科公司合成。

实施例1、小麦Pinb-D1r的获得及Puroindoline基因型分析

小麦材料：小麦品种光头线麦(ZM8714)和红麦(ZM8712)、Pinb-D1b突变型品种济南17、Pinb-D1c突变型品种青春533、Pina-D1b突变型品种Falcon、野生型小麦品种中国春(上述品种购自中国农业科学院作物科学所品种资源库；ZM8714，ZM8712等为小麦品种在中国农业科学院作物科学所品种资源库的编号(ZM即为地方品种，是按品种收集时间先后顺序编的号)。

一、籽粒硬度测定

将光头线麦和红麦、野生型小麦品种中国春、Pinb-D1b突变型品种济南17、Pinb-D1c突变型品种青春533、Pina-D1b突变型品种Falcon样品在同一条件下放置3d，使小麦籽粒的含水量控制在11-13％之间。用单粒谷物硬度仪(SKCS 4100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。

SKCS分析结果表明，光头线麦和红麦的SKCS硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为68±16、64±15和03-09-13-75、03-06-23-68，级别分类均为1级，属于硬质麦；野生型小麦品种中国春硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为20±13和95-4-1-0；Pinb-D1b突变型品种济南17硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为62±15和3-5-14-78、Pinb-D1c突变型品种青春533硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为73±16和2-6-6-86、Pina-Dlb突变型品种Falcon硬度指数(±标准差)和硬度分布分别为74±13和0-4-5-91。

二、新突变Pinb-D1r的获得

对步骤一经SKCS分析的光头线麦和红麦样品、Pinb-D1b突变型品种济南17、Pinb-D1c突变型品种青春533、Pina-D1b突变型品种Falcon中的puroindoline(包括PinA和PinB)进行分析，具体方法包括以下步骤：

1、提取小麦籽粒基因组DNA

选取一粒有代表性的种子(将其切割后根据其角质率判断是否与SKCS分析结果吻合)，提取小麦籽粒基因组DNA，具体方法为：1)用锤子砸碎后放入1.5mL离心管中，加入1mL样品提取液(含288mM NaCl，200mM Tris-HCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH8.0)，摇30分钟，使其充分混匀；2)在4℃、12,000rpm下离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)；3)12,000rpm离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入0.5倍上清体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分摇匀；4)12,000rpm离心10分钟，移上清至另一新的2mL离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH＝5.2)和0.6倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀；5)12,000rpm离心15分钟，弃上清，加入0.5mL 70％乙醇，静置5min；6)12,000离心5min，弃上清。真空干燥后加入100μL TE溶解沉淀，沉淀即为小麦籽粒基因组DNA。最后，用紫外分光光度计检测小麦籽粒基因组DNA的浓度，-20℃下保存备用。

2、用PCR方法鉴定光头线麦和红麦是否为Pinb-D1b突变型(以济南17为对照)

鉴定光头线麦和红麦是否为Pinb-D1b变异类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第46位(自序列6的氨基端第75位)是否由甘氨酸的密码子(GGC)变为丝氨酸的密码子(AGC)所用的引物序列如下：

鉴定Pinb-D1b突变型的特异引物系列为：

引物1(上游)：5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’

引物2(下游)：5’-CTCATGCTCACAGCCGCT-3’

鉴定非Pinb-Dlb类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第46位点甘氨酸未发生变化的类型，所用的引物序列为：

引物1(上游)：5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’

引物3(下游)：5’-CTCATGCTCACAGCCGCC-3’

分别以步骤1获得的光头线麦，红麦，Pinb-D1b突变型品种济南17的籽粒基因组DNA为模板，分别在Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)和Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系的组成均为：1.5mmol/LMgCl₂，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5U Taq酶，加1×PCR缓冲液(含10mmol/L Tris-HCl，pH 9.0，50mmol/L KCl，1.0％Triton X-100)定容至25μL。PCR反应程序为：先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，58℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸5min。PCR扩增结束后，取上述PCR扩增产物各10μL分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(采用1×TAE缓冲液；溴化乙锭(EB)染色，160V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius GelDocumentation and Analysis System)扫描成像并用计算机进行分析，分析结果表明光头线麦和红麦用Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)扩增出了250bp的DNA片段，而用Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)未扩增出250bp的DNA片段；Pinb-D1b突变型品种济南17用Pinb-D1b非特异引物(引物1和引物3)未扩增出250bp的DNA片段，而用Pinb-D1b特异引物(引物1和引物2)扩增出了250bp的DNA片段。证明光头线麦和红麦不是Pinb-D1b突变型。

3、用PCR及酶切的方法鉴定光头线麦和红麦是否为Pinb-D1c突变型(以青春533为对照)。

鉴定光头线麦和红麦是否为Pinb-D1c变异类型，即检测PINB成熟蛋白氨基酸序列中第60位点是否由亮氨酸(密码子为CTG)变为脯氨酸(密码子为CCG)。首先扩增Pinb全长序列，所用的引物序列如下：

引物1(上游)：5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’

引物4(下游)：5-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’

分别以步骤1获得的光头线麦和红麦、Pinb-D1c突变型品种青春533的籽粒基因组DNA为模板，在Pinb全长序列引物(引物1和引物4)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序与步骤2相同。然后，对PCR产物用PvuII限制性内切酶进行酶切，酶切体系为，3μL 10×NE缓冲液2(NEB公司)，0.2U PvuII内切酶(NEB公司)，20μL PCR产物，加ddH₂O定容至30μL；酶切条件为：37℃酶切2h。酶切后，取酶切产物10μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭(EB)染色，80-100V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius Gel Documentation and AnalysisSystem)扫描成像并用计算机进行分析，分析结果表明，光头线麦和红麦的扩增产物能被PvuII切割成264bp和183bp两个片段，Pinb-D1c突变型品种青春533的扩增产物不能被PvuII切割，证明光头线麦和红麦不是Pinb-D1c突变型。

4、用SDS-PAGE鉴定光头线麦和红麦是否为Pina-D1b(PINA缺失)突变型(以Falcon作为对照)。

包括以下步骤：

(1)提取籽粒蛋白

分别选取一粒光头线麦、红麦和Pina-D1b突变型品种Falcon，按下述步骤提取籽粒蛋白：1)研磨后放入一个2mL离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液(Tris-bufferedsaline，Tris缓冲盐溶液，pH8.0)和0.15mL 12％Triton-X114(Sigma公司)，混合后4℃放置12-24h；2)12000rpm离心3分钟，移上清至1.5mL离心管中，37℃温育半小时；3)12000rpm离心5min，弃上清，移下层至一新的离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液，37℃温育30min；4)12000rpm离心3min，弃上清，加入900μL预冷的丙酮，涡旋后在-20℃冰箱中放置30min；5)12000rpm离心2min，弃上清，用丙酮再洗一遍后置于空气中进行干燥，得到小麦籽粒蛋白。

(2)SDS-PAGE电泳鉴定

1)向步骤1提取的籽粒蛋白中加入150μL样品缓冲液(含7.57mg/mL Tris，10％甘油，0.02mg/mL SDS，0.0125mg/mL溴酚兰，pH8.0)；2)将加入样品缓冲液的籽粒蛋白在70℃下温育15min，取25μL进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为：用浓缩胶(浓度T为4％，胶联度C为2.67％)在40mA下电泳，待指示剂到达分离胶(浓度T为13.5％，胶联度C为2.6％)后将电压功率转换成12W，待指示剂到达分离胶底部后再电泳30min。为减少蛋白的扩散，用10％甘油代替水配制分离胶。凝胶配制时用PDA(Piperiazinediacrylamide)代替甲叉以使背景更为清晰，胶更加结实和富有弹性。按Morris等(Morris C F，Massa A N.Puroindoline genotype of the U.S.national instituteof standards & technology reference material 8441，wheat hardness.CerealChemistry，2003，80：674-678)的方法进行染色(用三氯乙酸和甲醇固定、银染显色，用柠檬酸停止显色)。SDS-PAGE电泳结果表明光头线麦和红麦中均表达有约15kDa的PINA，Pina-D1b突变型品种Falcon无约15kDa的PINA，证明光头线麦和红麦也不是Pina-D1b突变型。

5、测序鉴定光头线麦和红麦基因型

扩增Pinb的全长引物序列为：

引物1(上游)：5’-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3’

引物4(下游)：5’-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3’

扩增Pina的全长引物序列为：

引物5(上游)：5’-ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3’

引物6(下游)：5’-TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3’

经上述步骤2-4鉴定，证明经SKCS检测的光头线麦和红麦不是Pinb-D1b、Pinb-D1c和Pina-D1b(PINA缺失)突变型，为确证其硬度基因的变异类型，从光头线麦和红麦每一小麦样品中分别选取10粒种子，以其基因组DNA为模板，分别在Pinb全长引物(引物1和引物4)和Pina全长引物(引物5和引物6)的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件与步骤2相同，然后将PCR产物送至博亚和奥科公司测序。测序结果表明：光头线麦和红麦的Pinb具有序列表中的SEQ ID №：2的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №：2由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。将测序结果分别与已知的野生型Pina和Pinb的序列进行比较发现：光头线麦和红麦中的Pina为野生型Pina-D1a，而Pinb的核苷酸序列中自5’端第226位碱基，由碱基G突变为C，从而导致Pinb编码的成熟蛋白氨基酸残基序列中第47位氨基酸由Gly突变为Arg。上述突变类型与先前所有报道的已知突变类型不同。根据McIntosh等在Genebank上公布的硬度基因排名，将该Pinb突变型命名为Pinb-D1r，其编码蛋白为PINB-D1R。而且分别从光头线麦和红麦中选出的10粒硬粒种子测序结果一致，均为Pinb-D1r突变类型，从而进一步证实了上述结果的可靠性。

                序列表

<160>6

<210>1

<211>148

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>1

Met Lys Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr

1               5                   10                  15

Thr Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Gly Gly Trp Tyr Asn Glu Val Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Cys Pro Gln Glu Arg Pro Lys Leu Ser

        35                  40                  45

Ser Cys Lys Asp Tyr Val Met Glu Arg Cys Phe Thr Met Lys Asp Phe

    50                  55                  60

Pro Val Thr Trp Pro Thr Lys Trp Trp Lys Gly Arg Cys Glu His Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Glu Lys Cys Cys Lys Gln Leu Ser Gln Ile Ala Pro Gln Cys

                85                  90                  95

Arg Cys Asp Ser Ile Arg Arg Val Ile Gln Gly Arg Leu Gly Gly Phe

            100                 105                 110

Leu Gly Ile Trp Arg Gly Glu Val Phe Lys Gln Leu Gln Arg Ala Gln

        115                 120                 125

Ser Leu Pro Ser Lys Cys Asn Met Gly Ala Asp Cys Lys Phe Pro Ser

    130                 135                 140

Gly Tyr Tyr Trp

145

<210>2

<211>447

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>2

atgaagacct tattcctcct agctctcctt gctcttgtag cgagcacaac cttcgcgcaa    60

tactcagaag ttggcggctg gtacaatgaa gttggcggag gaggtggttc tcaacaatgt    120

ccgcaggagc ggccgaagct aagctcttgc aaggattacg tgatggagcg atgtttcaca    180

atgaaggatt ttccagtcac ctggcccaca aaatggtgga agggccgctg tgagcatgag    240

gttcgggaga agtgctgcaa gcagctgagc cagatagcac cacaatgtcg ctgtgattct    300

atccggcgag tgatccaagg caggctcggt ggcttcttgg gcatttggcg aggtgaggta    360

ttcaaacaac ttcagagggc ccagagcctc ccctcaaagt gcaacatggg cgccgactgc    420

aagttcccta gtggctatta ctggtga                                        447

<210>3

<211>447

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>3

atgaaggccc tcttcctcat aggactgctt gctctggtag cgagcaccgc ctttgcgcaa    60

tatagcgaag ttgttggcag ttacgatgtt gctggcgggg gtggtgctca acaatgccct    120

gtagagacaa agctaaattc atgcaggaat tacctgctag atcgatgctc aacgatgaag    180

gatttcccgg tcacctggcg ttggtggaaa tggtggaagg gaggttgtca agagctcctt    240

ggggagtgtt gcagtcggct cggccaaatg ccaccgcaat gccgctgcaa catcatccag    300

gggtcaatcc aaggcgatct cggtggcatc ttcggatttc agcgtgatcg ggcaagcaaa    360

gtgatacaag aagccaagaa cctgccgccc aggtgcaacc agggccctcc ctgcaacatc    420

cccggcacta ttggctatta ctggtga                                        447

<210>4

<211>148

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>4

Met Lys Ala Leu Phe Leu Ile Gly Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr

1               5                   10                  15

Ala Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Val Gly Ser Tyr Asp Val Ala Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Ala Gln Gln Cys Pro Val Glu Thr Lys Leu Asn Ser Cys

        35                  40                  45

Arg Asn Tyr Leu Leu Asp Arg Cys Ser Thr Met Lys Asp Phe Pro Val

    50                  55                  60

Thr Trp Arg Trp Trp Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Gln Glu Leu Leu

65                  70                  75                  80

Gly Glu Cys Cys Ser Arg Leu Gly Gln Met Pro Pro Gln Cys Arg Cys

                85                  90                  95

Asn Ile Ile Gln Gly Ser Ile Gln Gly Asp Leu Gly Gly Ile Phe Gly

            100                 105                 110

Phe Gln Arg Asp Arg Ala Ser Lys Val Ile Gln Glu Ala Lys Asn Leu

        115                 120                 125

Pro Pro Arg Cys Asn Gln Gly Pro Pro Cys Asn Ile Pro Gly Thr Ile

    130                 135                 140

Gly Tyr Tyr Trp

145

<210>5

<211>447

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>5

atgaagacct tattcctcct agctctcctt gctcttgtag cgagcacaac cttcgcgcaa    60

tactcagaag ttggcggctg gtacaatgaa gttggcggag gaggtggttc tcaacaatgt    120

ccgcaggagc ggccgaagct aagctcttgc aaggattacg tgatggagcg atgtttcaca    180

atgaaggatt ttccagtcac ctggcccaca aaatggtgga agggcggctg tgagcatgag    240

gttcgggaga agtgctgcaa gcagctgagc  cagatagcac  cacaatgtcg ctgtgattct  300

atccggcgag tgatccaagg caggctcggt ggcttcttgg gcatttggcg aggtgaggta    360

ttcaaacaac ttcagagggc ccagagcctc ccctcaaagt gcaacatggg cgccgactgc    420

aagttcccta gtggctatta ctggtga                                        447

<210>6

<211>148

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum aestivum L.)

<400>6

Met Lys Thr Leu Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Val Ala Ser Thr

1               5                   10                  15

Thr Phe Ala Gln Tyr Ser Glu Val Gly Gly Trp Tyr Asn Glu Val Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gln Cys Pro Gln Glu Arg Pro Lys Leu Ser

        35                  40                  45

Ser Cys Lys Asp Tyr Val Met Glu Arg Cys Phe Thr Met Lys Asp Phe

    50                  55                  60

Pro Val Thr Trp Pro Thr Lys Trp Trp Lys Gly Gly Cys Glu His Glu

65                  70                  75                  80

Val Arg Glu Lys Cys Cys Lys Gln Leu Ser Gln Ile Ala Pro Gln Cys

                85                  90                  95

Arg Cys Asp Ser Ile Arg Arg Val Ile Gln Gly Arg Leu Gly Gly Phe

            100                 105                 110

Leu Gly Ile Trp Arg Gly Glu Val Phe Lys Gln Leu Gln Arg Ala Gln

        115                 120                 125

Ser Leu Pro Ser Lys Cys Asn Met Gly Ala Asp Cys Lys Phe Pro Ser

    130                 135                 140

Gly Tyr Tyr Trp

145

Claims (8)

1、一种小麦籽粒硬度相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。

2、权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：1多肽序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因的细胞系。

6、含有权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因的宿主菌。

7、扩增权利要求2或3所述的小麦籽粒硬度相关蛋白的编码基因中任一片段的引物。

8、权利要求1所述的小麦籽粒硬度相关蛋白及其编码基因在小麦品质改良中的应用。