CN1566344A

CN1566344A - 一种棉纤维特异表达基因GhRLK1的cDNA序列及用途

Info

Publication number: CN1566344A
Application number: CN 03141157
Authority: CN
Inventors: 夏桂先; 李园莉; 孙杰
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2005-01-19

Abstract

本发明涉及一新发现的cDNA序列，其基因在棉花纤维细胞内特异表达。本发明从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一个类受体蛋白激酶(receptor－like protein kinase)基因，命名为GhRLK1。Northern分析表明GhRLK1基因在纤维细胞中特异表达，其表达从初生壁向次生壁合成转化阶段开始，在次生壁纤维素合成速度最快时达到高峰。表明GhRLK1基因的表达与纤维素的生物合成密切相关。这方面的研究结果目前尚未见任何报道。GhRLK1的发现可为利用基因工程方法控制纤维生长发育和改良纤维品质提供一种新的目的基因和表达调控元件。

Description

一种棉纤维特异表达基因GhRLK1的cDNA序列及用途

技术领域：

本发明属于植物分子生物学领域。具体涉及一新发现的棉纤维特异表达基因GhRLK1的cDNA序列，该基因在培育优质棉花纤维品种中有重要的意义。

技术背景：

棉花是最重要的天然纤维作物。棉纤维是由胚珠外珠被表皮层分化而来的单细胞，其形成和发育可分为四个时期：起始期、伸长期(初生壁合成)、次生壁合成期和成熟期，各个时期的发育分别决定着纤维的不同品质性状，其中在延伸阶段的发育关系到纤维的长度品质，在次生壁合成阶段的发育则与纤维的强度品质密切相关。分离鉴定控制纤维细胞延伸和次生壁合成的基因，是了解棉纤维细胞发育的分子机理及其调控的关键，也是通过基因工程方法定向改良纤维度和强度品质的核心技术环节。

迄今为止，已经报道了30多个在纤维细胞中特异或优先表达的棉花基因。为了了解这些基因与纤维发育和品质形成的关系，美国Monsanto公司对其中的多个基因，分别用antisense方法进行了功能鉴定，但发现其表达水平的改变与纤维发育和品质性状没有明显的相关性。因此，他们认为纤维发育和品质形成可能受到另外一些尚未分离鉴定的基因的控制，而只有继续寻找并获得这些基因，特别是那些参与基因表达调控和信号转导的重要功能基因，才有可能在阐明棉纤维发育和品质形成的分子调控机理方面取得突破，从而为棉纤维品质改良基因工程提供有用目标基因和表达调控元件。

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，细胞壁的生物合成是保证植物细胞生长的前提。然而，植物在其生长发育过程中如何感应细胞内外信号，从而控制细胞壁纤维素的生物合成，有关这方面的信号转导和分子调控机理目前还知之甚少。棉纤维是单细胞，成熟棉纤维含90％以上的纤维素，在纤维发育中期和后期，其细胞内的生化过程几乎纯是纤维素的合成。因此，棉纤维细胞被认为是研究纤维素的生物合成及其调控机理的良好实验体系。

受体蛋白激酶(receptor protein kinase)在动植物细胞信号转导中具有极其重要的作用。在植物细胞中，已发现类受体蛋白激酶(receptor-like kinases：RLKs)能感应细胞外环境，进而激活多种与植物生长发育和逆境胁迫应答(如细胞伸长、细胞分化、花器官的发育、自花授粉的控制和抗病反应等)密切相关的信号转导途径。虽然，已从拟南芥、玉米、大豆等植物中克隆了多个RLKs基因，并发现了它们在植物发育过程中的重要功能，但对RLKs信号转导途径是否参与棉纤维发育还一无所知。因此，研究与棉纤维发育相关的信号转导过程，特别是控制纤维素生物合成的信号转导途径及分子调控机理，具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容：

本发明利用荧光差异显示(FDD)方法，从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆了一个新的类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase)基因的cDNA，它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，命名为GhRLK1。利用基因特异性探针进行Northern分析，发现GhRLK1基因在纤维细胞中特异表达，其表达在初生壁向次生壁合成转化阶段开始，至次生壁纤维素合成速度最快时达到高峰。GhRLK1基因的这一表达特征表明该基因在控制纤维细胞次生壁纤维素合成的信号转导过程中具有重要作用。

本发明发现GhRLK1的表达与纤维次生壁纤维素的合成呈正相关，这方面的研究结果还未见报道。因此，本发明不仅为研究GhRLK1在棉花纤维发育进程中次生壁纤维素合成中的功能奠定了基础，重要的是能为控制植物细胞壁纤维素生物合成的信号转导途径提供一个具有如图1和SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的新基因GhRLK1。应当指出的是，对本发明提供的GhRLK1克隆的核苷酸序列进行修饰，一个或多个核苷酸的替换、插入和/或缺失，所得到的功能类似物也能达到本发明的目的。因此，本发明也包括该类衍生体。

本发明还提供了含有GhRLK1及其衍生体的植物表达载体、原核表达载体和真核表达载体，以及一种含有所述GhRLK1及其衍生体的转化子，所述的转化子，是如图3所示的将GhRLK1的正义和反义cDNA序列分别构建到pPZP111(Peter H，1994)植物表达载体中，将构建好的载体电击转化到农杆菌菌株AGL-1中；或如图4所示的的将GhRLK1基因的激酶结构域cDNA构建到原核表达载体pQE30(QIAGEN)中；或如图6所示的将GhRLK1 cDNA构建到真核生物酵母表达载体pESP-2(Stratagene)中的一种转化子。

本发明的另外一个目的是将上述提供的基因、衍生体、表达载体转化子应用于植物基因工程，为控制纤维生长发育和改良纤维品质提供一种新途径。

附图说明：

图1.GhRLK1 cDNA的核苷酸序列、推导蛋白的氨基酸序列及结构域分析(“—”示信号肽；“黑体”示富含亮氨酸区；“斜体”示富含脯氨酸区；“＝”示疏水区；“——”示激酶区。)

图2.GhRLK1在棉花纤维发育不同时期及不同器官中表达水平的Northern分析(f9、f12、fl8、f24分别代表开花后9、12、18和24天的纤维；R，根；H，下胚轴；L，叶；F，花；18S rRNA为上样量对照。)

图3.pPZP111-GhRLK1植物表达载体的构建

图4.pQE30-GhRLK1原核表达载体的构建

图5.GhRLK1激酶区cDNA在原核生物中的表达：通过电击法将pQE30-GhRLK1转化到大肠杆菌表达菌株M15中，经IPTG诱导，获得一个约32KD的蛋白条带(A)，并通过Ni亲和层析柱获得纯化蛋白(B)。

图6.pESP2-GhRLK1酵母表达载体的构建

具体实施方式：

实施例1.GhRLK1基因cDNA的克隆

选取开花后9天、21天、27天的棉纤维，提取总RNA，利用FDD(荧光差异显示)技术进行分析，从中选出109个表达有差异的cDNA片段，通过两轮反Northern淘汰了假阳性和差异不明显的片段，最后选取8个片段进行了棉花各器官及棉纤维各发育阶段的Northern分析，其中11号cDNA片段在次生壁合成期特异表达，进而通过cDNA文库筛选和5’RACE技术获得含有完整编码区的长度为2539bp的cDNA序列。如图1所示，该cDNA编码688个氨基酸，含有典型的植物类受体激酶的保守结构域，在蛋白的近N端和中部各有一段疏水序列，它们分别是信号肽和跨膜区的候选结构域，位于跨膜区的外侧有富含亮氨酸和脯氨酸的序列，它们是许多RLKs参与感应外界环境因子的典型结构。由于该蛋白与富含亮氨酸的受体类蛋白激酶有很高的同源性和结构相似性，因此将其基因命名为GhRLK1。

实施例2.GhRLK1基因的表达特征分析

以GhRLK1 cDNA的3’非翻译区为基因特异性探针，利用Northern杂交方法，对GhRLK1基因在棉花纤维及不同器官中的表达水平进行了分析。如图2所示，GhRLK1基因在棉纤维细胞次生壁合成期特异表达，在根、下胚轴和花以及早期的纤维中未见杂交信号。在次生壁合成的初始阶段(18DPA)，GhRLK1 mRNA开始积累，到次生壁合成高峰期(24DPA)达到高峰。该实验结果表明GhRLK1的表达与棉纤维细胞的纤维素合成密切相关，这在培育优质棉花新品种中有着重要的应用意义。

实施例3.GhRLK1基因植物表达载体的构建及转化

为了了解GhRLK1基因在植物细胞内的功能，将GhRLK1的正义和反义cDNA序列分别构建到pPZP111(Peter H，1994)植物表达载体中(见图3)，将构建好的载体电击转化到农杆菌菌株AGL-1中。然后，通过农杆菌介导法和真空转化法，分别转化了棉花和拟南芥，现已获得转基因植物的T1代种子。

实施例4.GhRLK1基因原核表达载体的构建及诱导表达

为了进一步分析GhRLK1基因在棉花各器官和纤维不同发育时期的蛋白水平，将GhRLK1基因的激酶结构域的cDNA构建到原核表达载体pQE30(QIAGEN)中(见图4)，通过电击法转化到大肠杆菌表达菌株M15中，经IPTG诱导，获得一个约32KD的蛋白条带(见图5A)，通过Ni亲和层析柱纯化，获得了该蛋白纯品(图5B)，并制备了抗体，将用于免疫印迹分析。与此同时，通过变性—复性及Ni亲和层析柱纯化，获得了活性蛋白，将用其进行激酶活性鉴定。

实施例5.GhRLK1基因酵母表达载体的构建

为了避免实施例4中表达的GhRLK1蛋白可能出现的糖基化问题，将GhRLK1 cDNA构建到真核生物酵母表达载体pESP-2(Stratagene)中(见图6)，利用电击法转化裂殖酵母，获得了转化子。将通过VB1诱导和GST柱纯化获得在真核生物内表达的GhRLK1蛋白。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种棉纤维特异表达基因GhRLK1的cDNA序列及用途

<130>xia

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2539

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum

<400>1

cacacacaag tcgacaaaat gagacaccag cgacatgatt cggacgaaga agcccaaact 60

cagtattcag accgaaaccc aatattacat tcttgatttg ctctttctct atttgttaaa 120

accgttgata gagaaaagct agaaaaaatt cttcttcttt tggacatgta tgggctctgg 180

ggattcgagc ggttgaagct caggatgatg gtggtcatgc tgttaatgct ggttttatca 240

ttgtttgagc agaatatgag cttctcctcg cctttgaacc gtgaaggttt ggctttgttg 300

aggttcaaac agagagtggg gagtgaccct tttggtgctt tatcgaactg gaaggaaatt 360

gatggagaga ttgatccgtg ttcttggttc ggggtcgaat gctctgatga aaaagttgta 420

attttaaatt tgaaagatct ttgccttgtt gggaacctgg gacctgaatt tgggaagctg 480

gagaatttaa aatctattct attgcgcaac aactctttgt ctggaagcat tcctcaagaa 540

attggggaat tgaaggagct ggaggtgttg gatttaggat tcaataactt tagtggacca 600

tttccatctg attttggcaa caatctctcc ttgacaacac ttttacttga caacaatgag 660

tttcttggaa atctagcacc tgaaatatac gaggttaaga tgctttctga atttcaagta 720

gatgagaatc agctaaccga tgctgctact ataccatctt gtaaaagcag tggtttcccc 780

tggaatattg cccagccagg agatatagct tatgggaggc ggctgcagca ggtgtttgta 840

ccctctaaga cagccaatga aagagtttcc caactgtcac catcaccttc gccatcagaa 900

tcctcatttt caccttcaat gtcaccttca ccttcatcgt tgtctccttc agaatccccc 960

tccagtatct ttttgactcc tgcaccttca cctttacctt caccttcacc tgaattagca 1020

ccggctccag ctttacaacc tcctgtagat ccaccagtat ctatctctga accaccccaa 1080

tcacacaatg ccccagccaa ttcccctgct tcaactccaa ggcaaatatc aaatgagaat 1140

tctgattcaa aacatcatat ttttccaatt ttgattgcaa gtattggagg ttccttgatt 1200

gttttggttt cagtccttag cattatcctc ttccgaaata gcaaggtggt ttctgtcaaa 1260

ccttgggcca cgggattaag tgggcagctg cagaaggcat ttgtaacagg tgtaccgaag 1320

ctcaagcgat cagaacttga agcagcttgt gaggatttca gcaatgtaat tggtaccttt 1380

tctgatggaa cagtctacaa ggggacttta tcaagtgggg tcgaaatagc agtgacatca 1440

actgcgattt cgtctcgtga agactggtca aagaatttag agacacaatt tagaaacaag 1500

atagactcgt tgtctaaagt gaaccacaag aatttcgtga acctcattgg ctattgtgaa 1560

gaaaatacgc ctttcacaag aatgatggtt tttgagtatg ttcctaatgg atcactctat 1620

gagcatctac atatacaaga agctgagcac ttggactggg gaatgcgcct aaggatagcc 1680

atgggaataa cgtactgcct tgagcatatg catcagctta ctccccctat agcccataga 1740

aacttgcagt cttgctctgt atatctgact gaagactatg ctgcaaaaat atctgatttc 1800

agcttcttga ataatgctac cgcagccaag gtgggatcgg ctaccatgga gctcttagaa 1860

tctccatcag cagatgcaga gagcaatgtt tacagcttcg gggtaatatt gtttgaaatg 1920

ataactggta ggatcccgta ttcgatagac aatagctcac ttgcagactg ggcctcagac 1980

tacttgaaaa gggaccaacc cttgaaagaa atggtggatc caactcttaa atttttccaa 2040

ggagatgatc tggaaaaatt gtttgaagtg gttaaaactt gtgttaatcc tgatccaaaa 2100

gagagaccaa caatgagaga agttgcagcc aagttaaaag agattacagc aatgggacct 2160

gatggagcaa ctccaaaact ctctcccctt tggtgggctg agcttgaaat attgtctaca 2220

gaaccaagtt aatcagtgaa attgaaattt aacgctaata aatttgcatt ctgttttccc 2280

tgtttctatt gttgggctcc gaagcagcgc agttccaagt agattctgct tctttaatca 2340

aaagcttgga aagagaaatg aatctttgta tataattcat agagaaaaat atttgatgtg 2400

agccttgatt tgctgctgct tctccattct ttgcttgctt ttgtttcctt tccttttcct 2460

catttgttca ttctgattct aaagtggatg gtataaattc cagtagagca acttgggaaa 2520

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2539

<210>2

<211>688

<212>PRT

<213>Gossypium hirsutum

<400>2

Met Tyr Gly Leu Trp Gly Phe Glu Arg Leu Lys Leu Arg Met Met Val

1 5 10 15

Val Met Leu Leu Met Leu Val Leu Ser Leu Phe Glu Gln Asn Met Ser

20 25 30

Phe Ser Ser Pro Leu Asn Arg Glu Gly Leu Ala Leu Leu Arg Phe Lys

35 40 45

Gln Arg Val Gly Ser Asp Pro Phe Gly Ala Leu Ser Asn Trp Lys Glu

50 55 60

Ile Asp Gly Glu Ile Asp Pro Cys Ser Trp Phe Gly Val Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Glu Lys Val Val Ile Leu Asn Leu Lys Asp Leu Cys Leu Val Gly

85 90 95

Asn Leu Gly Pro Glu Phe Gly Lys Leu Glu Asn Leu Lys Ser Ile Leu

100 105 110

Leu Arg Asn Asn Ser Leu Ser Gly Ser Ile Pro Gln Glu Ile Gly Glu

115 120 125

Leu Lys Glu Leu Glu Val Leu Asp Leu Gly Phe Asn Asn Phe Ser Gly

130 135 140

Pro Phe Pro Ser Asp Phe Gly Asn Asn Leu Ser Leu Thr Thr Leu Leu

145 150 155 160

Leu Asp Asn Asn Glu Phe Leu Gly Asn Leu Ala Pro Glu Ile Tyr Glu

165 170 175

Val Lys Met Leu Ser Glu Phe Gln Val Asp Glu Asn Gln Leu Thr Asp

180 185 190

Ala Ala Thr Ile Pro Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Pro Trp Asn Ile

195 200 205

Ala Gln Pro Gly Asp Ile Ala Tyr Gly Arg Arg Leu Gln Gln Val Phe

210 215 220

Val Pro Ser Lys Thr Ala Asn Glu Arg Val Ser Gln Leu Ser Pro Ser

225 230 235 240

Pro Ser Pro Ser Glu Ser Ser Phe Ser Pro Ser Met Ser Pro Ser Pro

245 250 255

Ser Ser Leu Ser Pro Ser Glu Ser Pro Ser Ser Ile Phe Leu Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Ser Pro Leu Pro Ser Pro Ser Pro Glu Leu Ala Pro Ala Pro

275 280 285

Ala Leu Gln Pro Pro Val Asp Pro Pro Val Ser Ile Ser Glu Pro Pro

290 295 300

Gln Ser His Asn Ala Pro Ala Asn Ser Pro Ala Ser Thr Pro Arg Gln

305 310 315 320

Ile Ser Asn Glu Asn Ser Asp Ser Lys His His Ile Phe Pro Ile Leu

325 330 335

Ile Ala Ser Ile Gly Gly Ser Leu Ile Val Leu Val Ser Val Leu Ser

340 345 350

Ile Ile Leu Phe Arg Asn Ser Lys Val Val Ser Val Lys Pro Trp Ala

355 360 365

Thr Gly Leu Ser Gly Gln Leu Gln Lys Ala Phe Val Thr Gly Val Pro

370 375 380

Lys Leu Lys Arg Ser Glu Leu Glu Ala Ala Cys Glu Asp Phe Ser Asn

385 390 395 400

Val Ile Gly Thr Phe Ser Asp Gly Thr Val Tyr Lys Gly Thr Leu Ser

405 410 415

Ser Gly Val Glu Ile Ala Val Thr Ser Thr Ala Ile Ser Ser Arg Glu

420 425 430

Asp Trp Ser Lys Asn Leu Glu Thr Gln Phe Arg Asn Lys Ile Asp Ser

435 440 445

Leu Ser Lys Val Asn His Lys Asn Phe Val Asn Leu Ile Gly Tyr Cys

450 455 460

Glu Glu Asn Thr Pro Phe Thr Arg Met Met Val Phe Glu Tyr Val Pro

465 470 475 480

Asn Gly Ser Leu Tyr Glu His Leu His Ile Gln Glu Ala Glu His Leu

485 490 495

Asp Trp Gly Met Arg Leu Arg Ile Ala Met Gly Ile Thr Tyr Cys Leu

500 505 510

Glu His Met His Gln Leu Thr Pro Pro Ile Ala His Arg Asn Leu Gln

515 520 525

Ser Cys Ser Val Tyr Leu Thr Glu Asp Tyr Ala Ala Lys Ile Ser Asp

530 535 540

Phe Ser Phe Leu Asn Asn Ala Thr Ala Ala Lys Val Gly Ser Ala Thr

545 550 555 560

Met Glu Leu Leu Glu Ser Pro Ser Ala Asp Ala Glu Ser Asn Val Tyr

565 570 575

Ser Phe Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Ile Thr Gly Arg Ile Pro Tyr

580 585 590

Ser Ile Asp Asn Ser Ser Leu Ala Asp Trp Ala Ser Asp Tyr Leu Lys

595 600 605

Arg Asp Gln Pro Leu Lys Glu Met Val Asp Pro Thr Leu Lys Phe Phe

610 615 620

Gln Gly Asp Asp Leu Glu Lys Leu Phe Glu Val Val Lys Thr Cys Val

625 630 635 640

Asn Pro Asp Pro Lys Glu Arg Pro Thr Met Arg Glu Val Ala Ala Lys

645 650 655

Leu Lys Glu Ile Thr Ala Met Gly Pro Asp Gly Ala Thr Pro Lys Leu

660 665 670

Ser Pro Leu Trp Trp Ala Glu Leu Glu Ile Leu Ser Thr Glu Pro Ser

675 680 685

Claims

1.一种在棉纤维细胞中特异表达基因GhRLK1的cDNA，它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种根据权利要求1所述cDNA核苷酸序列产生突变引起核苷酸序列的缺失、增加所形成的具有类似功能的核苷酸序列衍生体。

3.一种含有权利要求1或2所述的核苷酸序列的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的植物表达载体，是一种如图3所示的pPZP111-GhRLK1表达载体。

5.一种含有权利要求1或2所述核苷酸序列的转化子。

6.根据权利要求5所述的转化子，是如图3所示的将GhRLK1的正义和反义cDNA序列分别构建到pPZP111(Peter H.，1994)植物表达载体中，将构建好的载体电击转化到农杆菌株AGL-1中；或如图4所示的将GhRLK1基因的激酶结构域cDNA构建到原核表达载体pQE30(QIAGEN)中；或如图6所示的将GhRLK1 cDNA构建到真核生物酵母表达载体pESP-2(Stratagene)中的一种转化子。

7.根据权利要求1或2所述的核苷酸序列在转基因植物中的应用。

8.根据权利要求3或4所述的植物表达载体，在转基因植物中的应用。

9.根据权利要求5或6所述的转化子，在转基因植物中的应用。