CN103589805A - 赋予玉米斐济病毒抗性的主要qtls - Google Patents

Abstract

本发明涉及赋予玉米斐济病毒抗性的主要QTLS。本发明涉及用于鉴定具有对斐济病毒，尤其是Mal de Río Cuarto病毒(MRCV)和/或玉米粗缩病毒(MRDV)的新赋予的抗性或该抗性增强，或易感该病毒的玉米植物的组合物和方法。该方法使用分子遗传标记鉴定、选择和/或构建抗性植物或鉴定和反选择易感植物。由本发明方法产生的表现出新赋予的斐济病毒抗性或该抗性增强的玉米植物，也是本发明的一方面。

Description

赋予玉米斐济病毒抗性的主要QTLS

本申请为申请号为200880114461.4的分案申请，要求2007年11月1日的优先权。

引用的相关申请

本申请要求2007年11月1日提交的美国临时申请61/001,455号的优先权，将其通过引用整体并入。

发明领域

本申请涉及用于在植物中产生或增强斐济病毒，尤其是Mal de RíoCuarto病毒和/或玉米粗缩病毒抗性的组合物和方法。此外，本发明涉及由本发明组合物遗传转化的植物。

发明背景

在阿根廷，由Malde Río Cuarto病毒(MRCV)造成的疾病是主要的玉米疾病，在大爆发的年份中占到产量损失的70％以上(Rodriguez PE et al.(1998)Plant Dis.82：149-52)。该疾病是斐济病毒(Fijivirus)血清群2的成员，该血清群2包括其他病毒例如玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus)，水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus)，和马唐矮化病毒(pangola stunt virus)(Uyeda I & Milne RG(1995)Semin.Virol.6：85-88)。MRCV的主要载体是Delphacodes kuscheli，但其他Delphacodes种类，例如D.haywardi和D.tigrinus，以及Toya propinqua，已证实可携带该病毒。该病毒未显示出经种子传播至子代。Distéfano et al.，Arch.Virol.147：1699-1709(2002)，分析了MRCV序列，并提出其是一种新的与MRDV(玉米粗缩病毒)相关的斐济病毒种类。在多个欧洲国家(例如，捷克、法国、意大利、挪威、西班牙、瑞典)和中国都发现了MRDV，同时在乌拉圭也检测到MRCV(Ornaghi J.A.，Beviacqua J.E.，Aguirrezabala D.A.，March G.J.and Lenardón S.L1999.Detection of Malde Río Cuarto virus inUruguay.Fitopatologia Brasileira 24：471)。

MRCV感染引起玉米发育异常并明显降低作物产量。易感表型包括生长迟缓，节间缩短，具有散落颗粒的多穗，无花药的畸形雄花穗，叶片背面存在小的突起，退化根，切断和退化叶片。植物症状取决于植物的物候期、植物基因型和环境(Lenardón et al.，“Virus del Mal de Río Cuartoen maíz”，in Proyecto de Investigaciones en Fitovirología(Lenardón ed.)，2：10(1999)。若在胚芽鞘即第一叶阶段感染，会出现非常严重的症状。

在1996-1997年严重的MRCV爆发中，在阿根廷有超过300,000公顷玉米受到感染，造成的损失总计约$120,000,000美元。在2006年，Delphacodes kuscheli数量的增加明显，导致阿根廷玉米植物重新出现病毒疾病，这显著地影响到2007年收成。在易感地区(科尔多瓦省)，易感基因型受到MRCV的强烈感染，而在其他玉米地区，则受到适度感染。

分子遗传标记的开发，已促进玉米中重要农业性状的定位和选择。与抗病性基因紧密连锁的标记，是通过使用标记辅助选择(marker assistedselection，MRS)、根据基因型快速鉴定抗性玉米系的宝贵资源。也可通过使用适宜的DNA标记，促进抗病性基因向所需培育植物的基因渗入。

分子标记和标记辅助选择

遗传图谱(genetic map)是基因组(或基因组的一部分例如单个染色体)的图解表示，其中通过界标之间的重组频率测量染色体界标之间的距离。遗传界标可以是多种已知多态性标记的任何标记，例如但不限于分子标记例如SSR标记，RFLP标记，FLP标记，或SNP标记。而且，SSR标记可以是来自于基因组或表达的核酸(例如ESTs)的。这些物理界标的特性和用于检测它们的方法不同，但基于多核苷酸长度和/或序列，所有这些标记在物理上是相互可区别的(以及在任一具体标记的多个等位基因之间)。

尽管编码蛋白的具体DNA序列在物种之间通常是非常保守的，但DNA的其他区域(通常是非编码区)会累积多态性，因此在同一物种的个体之间是可变的。这些区域为大量分子遗传标记提供了基础。通常，在子代之间分离的任何不同遗传多态性状(包括核酸多态性)都是潜在的标记。基因组可变性可以是任何起源的，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件，或转座元件的存在和序列。在本领域中已知大量的玉米分子标记，且是公开的或可从不同来源获得的，例如MaizeGDB互联网资源。同样，许多检测分子标记的方法也完全建立。

从植物育种者角度来看，发展分子标记技术的主要动机在于，通过标记辅助选择(MAS)提高育种效能。与所需表型性状(例如数量性状位点(quantitative trait locus)，或QTL，例如具体抗病性)表现出连锁不平衡的分子标记等位基因，为在植物种群中选择所需性状提供了可用工具。实行这种方法的关键步骤是：(i)形成分子标记的密集遗传图谱，(ii)根据标记和表型可变性之间的统计关联检测QTL，(iii)根据QTL分析结果，确定一组所需的标记等位基因，和(iv)使用和/或外推这些信息至现有的育种种质(breeding germplasm)中，以使基于标记的选择决定得以进行。

含有增加密度的公共玉米标记的玉米基因组的完整的连锁图的有效性，有助于玉米遗传作图(genetic mapping)和MAS。参见例如万维网上的MaizeGDB资源。

两类标记被频繁用于标记辅助选择方案，即简单重复序列(simplesequence repeat，SSR，也称为微卫星)标记和单核苷多态性(SNP)标记。术语SSR通常指任何类型的导致长度可变性的分子异质性，且最常是含有两个或三个碱基对序列的多倍串联重复的DNA短片段(高达几百个碱基对)。因为复制保真度差，例如由聚合酶滑动引起，这些重复序列会导致长度可变的高度多态DNA区域。SSRs看起来随机分布在整个基因组中，且其侧翼通常为保守区。SSR标记也可来源于RNA序列(采用cDNA、部分cDNA或EST形式)以及基因组物质。

SSR异质性的特征使它们非常适合用作分子遗传标记，即SSR基因组可变性是遗传的、多等位基因的、共显性的并且是重现可检测的。日益尖端的基于扩增的检测技术(例如，基于PCR)的增加，为核苷酸序列异质性检测提供了多种灵敏方法。将设计引物(或其他类型的探针)设计为与位于SSR区侧翼的保守区杂交，从而使可变的SSR区扩增。由SSR区产生的不同大小的扩增子具有特征性和可复制的大小。由同一个体或来自植物种群不同个体的两条同源染色体获得的不同大小的SSR扩增子，通常被称为“标记等位基因”。只要存在至少两个可产生带有至少两个不同大小的PCR产物的SSR等位基因，则该SSRs可以用来作为标记。

依赖单核苷酸多态性(SNPs)的玉米标记也是本领域公知的。已发展多种技术用于检测SNPs，包括等位基因特异性杂交(ASH；参见例如Shattuck-Eidens et al.，(1991)“Rapid detection of maize DNA sequencevariation”，Genet.Anal.Tech.Appl.8：240-245)。也广泛使用其他类型的分子标记，包括但不限于表达的序列标签(ESTs)和来源于EST序列的SSR标记，限制性片段长度多态性(RFLP)，扩增片段长度多态性(AFLP)，随机扩增DNA多态性(RAPD)和同工酶标记。广泛地用于检测这种多变性的方案也是本领域技术人员已知的，且这些方案通常是特异性针对它们设计检测的多态性类型。例如，PCR扩增、单链构型多态性(SSCP)和自主序列复制(self-sustained sequence replication，3SR；参见Chan and Fox，“NASBA and other transcription-based amplification methods for researchand diagnostic microbiology”，Reviews in Medical Microbiology 10：185-196(1999))。

也可产生多种类型的FLP标记。最常见的是，使用扩增引物产生片段长度多态性。这种FLP标记在许多方面都类似于SSR标记，除了引物所扩增的区域通常不是高重复区之外。扩增的区域或扩增子在种质之间仍旧会具有足够的可变性，通常是由于插入或缺失引起的，使得由扩增引物产生的片段可在多态个体中区别出来，已知在玉米中经常发生这种插入缺失(indels)(Bhattramakki et al.(2002)Plant Mol Biol 48，539-547；Rafalski(2002)Plant Sci 162：329-333)。术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中一条链相对于第二条链称为具有插入，或第二条链相对于第一条链称为具有缺失。本文公开的MZA标记是已经过选择的扩增的FLP标记的实例，因为它们非常接近主要染色体2的QTL。

一个分子标记与另一分子标记的连锁作为重组频率来测量。通常，两个位点(例如两个SSR标记)在遗传图谱上越近，它们在物理图谱上也相互越近。相对遗传距离(由交换频率测定，以厘摩衡量；cM)与在染色体上两个连锁位点彼此相隔的物理距离(由碱基对衡量，例如千碱基对(kb)或兆碱基对(Mbp))通常是成比例的。cM和物理距离之间的精确比例的缺乏，可由在不同染色体区重组频率的变化获得，例如某些染色体区是重组“热点(hot spot)”，而其他区域未表现出任何重组，或只发生了很少的重组事件。通常，一个标记与另一标记越接近，无论是根据重组或物理距离测量，它们都连锁得越坚固。在某些方面，一个分子标记与编码赋予具体表型(抗病性)的多肽的基因越接近，无论根据重组或物理距离测量，该标记都更好地标记所需表型性状。

遗传作图可变性也可在同一作物物种包括玉米的不同种群之间观察到。尽管这种遗传作图的可变性会出现在种群之间，但是来源于一个种群的遗传图谱和标记信息通常仍然可用于在多个种群间鉴定具有所需性状的植物，反选择具有不需要性状的植物和指导MAS。

QTL作图

植物育种者的目标是为具有所需性状例如病原体抗性的个体选择植物和富集植物种群，从而最终提高农业生产率。很长时间以来已经认识到，可将与具体表型数量相关的具体染色体位点(或区间)绘制在生物体基因组中。这种位点被称为数量性状位点或QTL。植物育种者可有利地利用分子标记通过鉴定标记等位基因来鉴定所需个体，该等位基因显示出在统计上明显可能与所需表型(例如病原体抗性)共分离，从而证明为连锁不平衡。通过鉴定与数量性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种者可鉴定一个QTL。通过鉴定和选择与所需表型相关的标记等位基因(或所需的来自多个标记的等位基因)，植物育种者能够通过选择适当的分子标记等位基因来快速选择所需表型(称为标记辅助选择过程或MAS)。位于遗传图谱上的分子标记越多，图谱适宜进行MAS的潜在有效性就越大。

已发展多个实验范例来鉴定和分析QTL(参见例如Jansen(1996)Trends Plant Sci 1：89)。关于作物物种QTL作图的大部分公开报道是基于使用双亲代杂交(bi-parental cross，Lynch and Walsh(1997)Genetics andAnalysis of Quantitative Traits，Sinauer Associates，Sunderland)。通常，这些范例包括使一个或多个亲代对杂交，它们可以是例如来自两个近交品系的单配对，或不同近交品系或系的多个相关或无关亲代，它们都表现出与感兴趣表型性状相关的不同特征。通常，这些实验范例包括由两个歧化近交系的单交(例如经选择系之间使表型和分子标记差异最大)获得100-300个分离的子代。在亲代和分离子代中对多个标记位点进行基因分型并对一个至多个数量性状(例如抗病性)进行评估。而QTL鉴定为在分离子代中基因型值和表型可变性之间的明显统计关联。这些实验方案的强度来自于近交后代杂交(inbred cross)的利用，因为获得的F1亲代都具有相同的连锁相。因此，F1亲代自交后，所有分离子代(F2)是有信息的且连锁不平衡达到最大，连锁相是已知的，只有两个QTL等位基因，而且除回交子代之外，每个QTL等位基因的频率是0.5。

用于测定标记是否与QTL(或与另一标记)遗传连锁的许多统计方法是本领域技术人员已知的，包括例如标准线性模型，例如ANOVA或回归作图(Haley and Knott(1992)Heredity69：315)，最大可能性方法例如期望-最大化算法(如Lander and Botstein(1989)“Mapping Mendelian factorsunderlying quantitative traits using RFLP linkage maps”，Genetics121：185-199；Jansen(1992)“A general mixture model for mappingquantitative trait loci by using molecular markers”，Theor.Appl.Genet.，85：252-260；Jansen(1993)“Maximum likelihood in a generalized linear finitemixture model by using the EM algorithm”，Biometrics 49：227-231；Jansen(1994)“Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers：anoverview of biometrical models”，In J.W van Ooijen and J.Jansen(eds.)，Biometrics in Plant breeding：applications of molecular markers，pp.116-124，CPRO-DLO Metherlands；Jansen(1996)“A general Monte Carlo method formapping multiple quantitative trait loci”，Genetics 142：305-311；and Jansenand Stam(1994)“High Resolution of quantitative trait into multiple loci viainterval mapping”，Genetics 136：1447-1455)。示例性统计方法包括单点标记分析、区间作图(interval mapping，Lander and Botstein(1989)Genetics121：185)、复合区间作图(complex interval mapping)、惩罚回归分析(penalized regression analysis)、复合系谱分析(complex pedigree analysis)、MCMC分析、MQM分析(Jansen(1994)Genetics 138：871)、HAPLO-IM+分析、HAPLO-MQM分析、HAPLO-MQM+分析、贝叶斯MCMC、岭回归(ridge regression)、血统同一性分析(identity-by-descent analysis)、Haseman-Elston回归，以上任何都适用于本发明。此外，在美国专利No.6,399,855和WO 0149104中描述了有关可用于鉴定和定位QTLs的适用于复合育种种群(complex breeding populations)的可选统计方法的其他细节。这些方法中的任何方法都是高度运算的，通常在计算机系统和专门软件的辅助下进行。适宜的统计软件包可从多个公共和商业来源获得，这是本领域技术人员已知的。

Sala等在阿根廷专利申请ARP20030100125号中公开了与玉米植物MRCV抗性相关的三个QTL等位基因的组合。该位点与bnlg1017，bnlg2277，bnlg125，bnlg381，和bnlg180的偏好抗性标记等位基因相连，其中存在所有赋予抗性的等位基因时，出现抗性。

在本领域中需要可抵抗斐济病毒尤其是MRCV和MRDV和它们的致病剂例如Delphacodes kuscheli感染的改良玉米品系。在本领域中需要鉴定表现出斐济病毒抗性的玉米植物或种群(种质)的方法。本领域需要鉴定与斐济病毒抗性位点连锁的分子遗传标记，促进MAS，并也需要赋予斐济病毒抗性的基因等位基因的基因发现和克隆。这些标记可用于在玉米种群中选择显示出偏好标记等位基因的个体植物和植物种群，然后用其选择抗性表型，或可选地用于反选择显示出斐济病毒易感性表型的植物或植物种群。本发明提供了这些和其他优势。

发明概述

提供了用于鉴定具有新赋予的或增强的斐济病毒抗性的玉米植物或种质的组合物和方法。还提供了产生抵抗斐济病毒的玉米植物或种质的方法，例如通过所需抗性标记等位基因的基因渗入和/或通过转基因产生方法，以及通过这些方法产生的植物和种植。选择抗性植物和种质的系统和试剂盒，也是本发明的一部分。

在一些方面，本发明提供了鉴定具有对MRCV的新赋予的抗性、抗性增强或易感性的第一玉米植物或种质(例如系或品种)。在这些方法中，在第一玉米植物或种质中，检测至少一个或多个与新赋予的抗性、抗性增强或易感性相关的标记位点(例如，多个标记位点)的至少一个等位基因。可从表1和2所提供的位点，包括MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105，以及任何与这些QTL标记连锁的其他标记(例如这些位点约10cM之内的)中选择标记位点。表1和2显示了通过结合作图分析和QTL区间作图(包括单标记回归分析)方法确定的证实与MRCV抗性表型连锁不平衡的玉米标记。该表表明，基因组-SSR或EST-SSR标记型(所有简单重复序列)，或SNP或MZA标记，定位有标记的染色体及其相对于其他已知标记的大概遗传图谱位置，以cM表示，在染色体上的零位置是第一(最末端)标记。还显示了用于标记随机分离分析和统计概率的玉米种群，和考虑了多检验的可变性和假阳性作为调整概率(adjusted probability)给出的抗性/易感性表型。还显示了单标记回归的概率值。

本发明也提供了与MRCV相关的染色体QTL区间。这些区间位于连锁组2上。发现位于这些区间之内的任何标记也可作为MRCV抗性标记，这也是本发明的一部分。这些区间包括：

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a。

在同一植物中可选择多个标记位点。组合选择哪些QTL标记是没有特别限制的。组合使用的QTL标记可以是表1和2所列的任何标记，与表1和2中的标记连锁的任何其他标记(例如由MaizeGDB资源确定的连锁标记)，或本文所述QTL区间内的任何标记。

表2

与表1和2的QTL标记连锁的标记可以紧密连锁，例如距表1和2的QTL标记约10cM之内。在一些实施方案中，连锁位点表现出距QTL标记9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25或更小厘摩的遗传重组距离。

在一些实施方案中，优选QTL标记选自MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105。最优选的QTL标记选自MZA15490和MZA2038。

在一些实施方案中，种质是玉米系或品种。在一些方面，玉米植物对MRCV的新赋予的抗性、抗性增强或易感性，可采用任何适宜方式量化，例如1-9级(MRCV得分)，其中，1表示高度易感基因型，而9为完全抗性基因型；4表示具有最小抗性水平的基因型，以便产生商业杂种。

评估MRCV抗性的第二种方式是通过评估高度易感植物占具体基因型的百分比。例如，基因型排列在完全随机区组设计中，每个试验单元由4米田列表示，且每列种植大约20个植物的田间试验。通过观察每个试验单元并进行田间评分(1-9分)来评估MRCV抗性增强。同时，检测每个试验单元中高度易感植物的百分比。有关表现MRCV症状的玉米实例，参见图3A，而图3B是表现MRCV易感性的玉米实例。

可采用多种技术中的任何技术鉴定标记等位基因。等位基因检测方法不受任何限制。等位基因检测方法通常包括分子鉴定方法，例如标记扩增子的扩增和检测。例如，通过例如基于扩增的技术，可检测多态简单重复序列(SSR)或单核苷酸多态性(SNP)形式的等位基因。在这些和其他基于扩增的检测方法中，标记位点或一部分标记位点被扩增(例如通过采用从感兴趣玉米植物分离的核酸作为模板进行的PCR、LCR或转录)，并检测获得的扩增标记扩增子。这种方法的一个实例中，将扩增引物或扩增引物对与从第一玉米植物或种质分离的基因组核酸混合，其中引物或引物对与至少一部分标记位点互补或部分互补，并能够使用玉米基因组核酸作为模板，通过DNA聚合酶，启动DNA聚合。在具有DNA聚合酶和模板基因组核酸的DNA聚合反应中引物或引物对(例如表3提供的引物对)被延伸，产生至少一个扩增子。

表3

表3列出了基因组标记和SSR标记，包括经显示与MRCV抗性表型连锁不平衡(直接或通过遗传图谱外推的)的标记。表3提供了SSR标记位点基因分型分析所用的左、右PCR引物序列。也显示了右引物5’端所用的尾巴序列，和SSR中串联重复元件的核苷酸数。

在任何情况中，表示检测的等位基因的数据，可被传递(例如电子地或经红外、无线或光传播)至计算机或计算机可读取介质中，用于分析或存储。在一些实施方案中，植物RNA是扩增反应的模板。在其他实施方案中，植物基因组DNA是扩增反应的模板。在一些实施方案中，QTL标记是SNP型标记，而检测的等位基因是SNP等位基因(参见例如表4(显示在QTL位置的SNP标记和具体PH7WT(＝630＝PH14J)和PH9TJ单元型))，检测方法是等位基因特异性杂交(ASH)。

在一些实施方案中，被检测的等位基因是与新赋予的抗性或抗性增强正相关的偏好等位基因。可选地，被检测的等位基因可以是与疾病易感性或抗病性降低相关的等位基因，且该等位基因是反选择的。例如，可被选择(偏好等位基因，例如PH7WT和PH9TJ(参见表5))或剔除(非偏好等位基因，例如PH3DT、PH890和PH6KW(参见表5))的等位基因。

若选择多个标记，则为每个标记选择等位基因；从而选择两个或多个等位基因。在一些实施方案中，可以是标记位点具有超过一个优势等位基因的情况，在这种情况下，可选择任一等位基因。

应当认识到，鉴定与对MRCV的新赋予的抗性、抗性增强或易感性相关的QTL标记位点的能力，也提供了选择具有偏好标记位点的植物的方法。即，被鉴定包含所需标记位点(例如与抗性正相关的标记等位基因)的任何植物可被选择，而缺乏该位点或具有与抗性负相关的位点的植物可被剔除。从而，在一个方法中，鉴定标记位点之后，该方法包括选择(例如分离)第一玉米植物或种质，或选择第一植物或种质的子代。在一些实施方案中，获得的所选的第一玉米植物或种质可与第二玉米植物或种质杂交(例如原种或外来玉米，取决于子代所需的特征)。

同样，在其他实施方案中，如果等位基因与对MRCV的新赋予的抗性或抗性增强相关，该方法可包括等位基因向第二玉米植物或种质的基因渗入，以产生基因渗入的玉米植物或种质。在一些实施方案中，第二玉米植物或种质与第一玉米植物或种质相比，通常会显示出MRCV抗性降低，而基因渗入的玉米植物或种质与第二玉米植物或种质相比，通常会显示出MRCV抗性增强。由这些方法产生的基因渗入的玉米植物或种质也是本发明的一部分。(在一些实施方案中，偏好基因渗入的等位基因是PH7WT/PH9TJ，参见表5)。

在其他方面，不同作图种群可用于测定本发明的连锁标记。在一个实施方案，所用的作图种群是来源于杂交PH7WTxPH3DT或PH9TJxPH890的种群。在其他实施方案中，可使用其他种群。在其他方面，可使用多种软件测定连锁标记位点。例如，TASSE、MapManager-QTX和GeneFlow都可用于本发明。在一些实施方案中，例如，若在连锁分析中使用软件，检测的等位基因信息(例如数据)被电子传送或电子存储在例如计算机可读介质中。

在其他方面，可用不同作图种群测定用于构建转基因植物的连锁标记。在一个实施方案中，所用的作图种群是来源于杂交PH7WTxPH3DT或PH9TJxPH890的种群。在其他实施方案中，可使用其他种群。在其他方面，在测定构建转基因植物所用的连锁标记位点中可使用多种软件。例如，TASSEL、MapManager-QTX和GeneFlow都可用于本发明。

用于鉴定预期具有对MRCV的新赋予的抗性或抗性增强的玉米植物的系统，也是本发明的一方面。通常，该系统包括一组标记引物和/或探针，其经配置，检测与对MRCV的新赋予的抗性或抗性增强相关的一个或多个标记位点的至少一个等位基因，其中标记位点或位点选自MZA7588、MZA8381、MZA3105、MZA482、MZA16531、MZA14553、MZA4305、MZA625、MZA15451、MZA9105、MZA11826、MZA15490、MZA16656、MZA2038、MZA2803、MZA18224、MZA2349、MZA564、MZA11066、MZA18180、MZA8442、MZA15563、MZA18036、MZA15264、MZA10384、MZA12874、MZA12454、MZA8926和MZA5057，以及与这些QTL标记连锁(或在一些实施方案中，是紧密连锁的，例如被证实不大于10％的重组频率)的任何其他标记；以及，此外，位于染色体QTL区间之内的任何标记位点，其包括：

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a。

在一些实施方案中，所用的优选的QTL标记选自MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105。

在所需的实施标记检测或关联的系统中，该系统也可包括经配置检测一个或多个来自标记探针或引物组或其扩增子的信号输出由此鉴定等位基因的存在或缺失的检测器，和/或使偏好等位基因的存在或缺失与预期抗性关联的系统指令。检测器的精确配置取决于用于检测标记等位基因的标记类型。典型实施方案包括光检测器、射线检测器等。光发射或其他探针标记的检测，可指示标记等位基因的存在或缺失。同样，精确形式的指令可依据系统组成而变化，例如它们可作为系统软件而存在于系统的一个或多个集成单元中，或存在于可与检测器关联操作的一个或多个计算机或计算机可读介质中。在一个典型实施方案中，系统指令包括至少一个包括偏好等位基因的存在或缺失与预期的新赋予的抗性、抗性增强或易感性之间的关联的查询表。

在一些实施方案中，系统可由分离元件组成或可以整合成便于检测标记等位基因和用于进行标记抗性性状关联的单独单元。在一些实施方案中，该系统也可包括样品，例如来自玉米或所选玉米植物组织的基因组DNA，扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA或扩增的RNA。

试剂盒也是本发明的一部分。例如，试剂盒可包括用于检测抗性相关标记位点的适宜引物或探针，以及使用引物或探针检测标记位点和使位点与预期MRCV抗性关联的说明。试剂盒还可包括包装探针、引物或说明的包装材料，对照物例如包括用于扩增的探针、引物或模板核酸的对照扩增反应，分子大小标记等。

本发明包括如下技术方案：

1.鉴定表现出对里奥夸尔托病毒(Mal de Río Cuarto Virus，MRCV)或玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus，MRDV)的新赋予的抗性或抗性增强的第一玉米植物或种质的方法，该方法包括，在所述第一玉米植物或种质中检测侧翼为MZA8381和MZA18180并包括MZA8381和MZA18180的染色体区间内的单元型，其中：

a.对于MZA8381的共有序列是SEQ ID NO：2和对于MZA18180的共有序列是SEQ ID NO：36；

b.所述单元型包含：

i.在MZA16656-19-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ ID NO：20的位置218；在MZA15490-801-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ IDNO：22的位置96；在MZA15490-137-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：24的位置84；在MZA2038-71-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：17的位置258；在MZA2038-76-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：16的位置277；在MZA11826-801-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：26的位置89；在MZA11826-803-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：27的位置701，以及在MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：12的位置123；或

ii在MZA16656-19-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：20的位置218；在MZA15490-801-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ IDNO：22的位置96；在MZA15490-137-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：24的位置84；在MZA2038-71-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：17的位置258；在MZA2038-76-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：16的位置277；在MZA11826-801-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ ID NO：26的位置89；在MZA11826-803-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：27的位置701，以及在MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：12的位置123；以及

c.如果检测到所述单元型，选择所述第一玉米植物或种质作为表现出对里奥夸尔托病毒(MRCV)或玉米粗缩病毒(MRDV)具有新赋予的抗性或抗性增强。

2.如第1项的方法，所述方法还包括将所述第一玉米植物或种质中的单元型渗入至第二玉米植物或种质，以产生基因渗入的玉米植物或种质。

定义

在详细描述本发明之前，应该理解的是，本发明不限于具体实施方案，本发明当然可以变化。还应理解的是，本文所用术语仅用于描述具体实施方案，而不对其构成限定。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的术语“一个(a)”“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非另有明确的相反指示。因而，例如“植物(plant)”“该植物(theplant)”或“植物(a plant)”的涵义，也包括多个植物；而且，根据内容，使用术语“植物”也可包括该植物的遗传上类似或相同子代；使用术语“核苷酸”任选地包括，如实际情况，该核酸分子的多个拷贝；同样，术语“探针”任选地(和通常)包含多个类似或相同的探针分子。

除非另有指出，否则核酸是以5’至3’的方向从左往右书写。说明书中所述的数值范围，包括定义范围的数值，并包括所定义范围之内的每个整数或任何非整数的分数。除非另有指出，本文所用的所有技术和科技术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。尽管类似或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，但本文描述了优选材料和方法。在本发明的描述和权利要求中，所用的以下术语符合以下给出的定义。

“植物”可以是整株植物，其任意部分，或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”是指任何整株植物、植物组分或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其子代。植物细胞是取自植物或来源于其中植物的细胞的培养物的植物的细胞。因此，术语“玉米植物”包括整株玉米植物、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、可再生玉米植物的玉米植物细胞或玉米植物组织培养物、玉米植物愈合组织，玉米植物或玉米植物的部分例如玉米种子、玉米穗轴、玉米花、玉米子叶、玉米叶片、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等中完好的玉米植物团和玉米植物细胞。

“种质”是指个体(例如植物)、一组个体(例如植物系、品种或族)的遗传材料，或来自系、品种、物种或培养物的克隆。种质可以是生物体或细胞的一部分，或可从生物体或细胞分离。通常，种质提供了具有具体分子组成的遗传材料，其为生物体或细胞培养物的一些或所有遗传性质提供物理基础。如本文所用的，种质包括可生长成新植物的细胞、种子或组织，或可培养成整株植物的植物部分，例如叶、茎、花粉或细胞。

术语“等位基因”是指存在于具体位点的两个或多个不同核酸序列之一。例如，第一等位基因可存在于一条染色体上，而第二等位基因可存在于第二同源染色体上，例如存在于杂合个体的不同染色体，或种群中不同纯合或杂合个体之间。“偏好等位基因”是在具体位点上的等位基因，该位点赋予或有助于农艺所需表型例如MRCV抗性，或可选地是可以鉴定可从育种程序或种植中剔除的易感植物的等位基因。标记的偏好等位基因是与偏好表型分离或可选地与易感植物表型分离从而提供鉴定疾病倾向植物的益处的标记等位基因。偏好等位基因形式的染色体片段是包括在物理上位于染色体片段的一个或多个基因位点上有助于优良农艺性能的核酸序列的染色体片段。“等位基因频率”是指等位基因出现在个体、系或系种群之内位点上的频率(比例或百分比)。例如，对于等位基因“A”，基因型“AA”、Aa”或“aa”的二倍体的等位基因频率分别为1.0、0.5或0.0。通过对来自该系内的个体样品的等位基因频率进行平均，可估算该系内的等位基因频率。同样，通过对构成种群的品系的等位基因频率进行平均，可计算系种群的等位基因频率。对于具有有限数量的个体或品系的种群，等位基因频率可表达为含有该等位基因的个体或品系(或任何其他指定定集合)的计数。

当等位基因与性状连锁，且等位基因的存在是所需性状或性状形式会出现在含有该等位基因的植物上的指示器时，等位基因与性状“正”相关。当等位基因与性状连锁，且等位基因的存在是所需性状或性状形式不会出现在含有该等位基因的植物上的指示器时，等位基因与性状“负”相关。

如果个体在给定位点上仅具有一种类型的等位基因(例如，二倍体个体在两个同源染色体上都在一个位点具有一拷贝的同一等位基因)，则该个体是“纯合的”。如果在给定位点存在超过一个的等位基因类型(例如两个不同等位基因都具有的一个拷贝的二倍体个体)，则个体是“杂合的”。术语“同源性”是指一组成员在一个或多个具体位点具有相同基因型。相反，术语“异源性”用于指示组内的个体在一个或多个具体位点基因型不同。

“位点”是多态核酸、性状决定簇、基因或标记所在的染色体区域。因此，例如，“基因位点(gene locus)”是在物种基因组上可发现具体基因的具体染色体位置。

术语“数量性状位点”或“QTL”是指在至少一个遗传背景例如在至少一个育种种群或子代中具有至少一个与表型性状的差异表达相关的等位基因的多态基因位点。QTL可通过单基因机制或通过多基因机制起作用。

术语“标记”、“分子标记”、“标记核酸”和“标记位点”，是指在鉴定连锁位点时作为参照点的核酸序列或其编码产物(例如蛋白)。标记可来源于基因组核酸序列或来源于表达的核酸序列(例如，来源于剪接的RNA或cDNA)，或来源于编码的多肽。该术语也表示与标记序列互补或位于标记序列侧翼的核酸序列，例如作为能够扩增标记序列的探针或引物对的核酸。“标记探针”是可用于鉴定标记位点的存在的核酸序列或分子，例如与标记位点序列互补的核酸探针。可选地，在一些方面，标记探针是指能够区别(即基因分型)存在于标记位点上的具体等位基因的任何类型的探针。如果核酸能在溶液中根据如沃森-克里克碱基配对规则特异性杂交，则它们是“互补的”。“标记位点”是可用于追踪第二连锁位点存在的位点，例如编码或有助于表型性状的表达的连锁位点。例如，标记位点可用于监测在一个与标记位点基因或物理连锁的位点上的等位基因的分离，例如QTL。因此，“标记等位基因”，可选地“标记位点的等位基因”，是在具有标记位点多态性的种群中在标记位点上发现的多个多态核酸序列之一。在某些方法，本发明提供了与玉米中MRCV抗性相关的标记位点。预期每个所鉴定的标记与有助于抗性的基因元件例如QTL具有紧密的物理或基因亲近度(导致物理和/或遗传连锁)。

“遗传标记”是在种群中多态的核酸，其中，可通过一种或多种分析方法，例如RFLP、AFLP、同工酶、SNP、SSR等，检测并区别出它的等位基因。该术语还表示与基因组序列互补的核酸序列，例如用作探针的核酸。

可通过本领域建立已久的方法检测与种群成员之间遗传多态性对应的标记。这些包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(RFLP)的检测、同工酶标记的检测，通过等位基因特异性杂交(ASH)的多核苷酸多态性的检测、扩增的植物基因组可变序列的检测、自主序列复制的检测、简单重复序列(SSRs)的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的检测，或扩增片段长度多态性(AFLPs)的检测。已知建立已久的方法用于检测表达的序列标签(ESTs)和来源于EST序列的SSR标记和随机扩增DNA多态性(RAPD)。

“遗传图谱”是在给定物种内的一个或多个染色体(或连锁群)上的位点之间遗传连锁关系的描绘，通常以图标或表格形式描绘。“遗传作图”是通过使用遗传标记、标记的种群隔离和重组频率的标准遗传原理确定位点连锁关系的过程。“遗传图谱位置”是遗传图谱中相对于相同连锁群中周围遗传标记的位置，在该连锁群中，在给定物种内可发现具体标记。相反的，基因组的“物理图谱”是指绝对距离(例如，以碱基对测量或分离和重叠邻近基因片段，例如重叠群)。基因组的物理图谱不考虑进物理图谱不同点之间的遗传行为(例如重组频率)。

“遗传重组频率”是两个基因位点之间交换事件(重组)的频率。通过追随减数分裂之后的标记和/或性状分离，可观察到重组频率。遗传重组频率可以厘摩(cM)表示，其中一cM是表现出1％重组频率(即，每100次细胞分裂中出现一次这两个标记之间的交换事件)的两个遗传标记之间的距离。

如本文所用的，术语“连锁”用于描述一个标记位点与另一标记位点或一些其他位点(例如抗性位点)相关的程度。

如本文所用的，术语“连锁平衡”描述两个标记独立分离的情况，即在子代中随机分配。表现出连锁平衡的标记被认为是不连锁的(无论它们是否位于同一染色体上)。

如本文所用的，术语“连锁不平衡”描述两个标记以非随机方式分离的情况，即具有小于50％的重组频率(经定义，在相同连锁群上以小于50cM分离)。表现出连锁不平衡的标记被认为是连锁的。当标记位点和相连的位点被发现共同在子代植物中比不共同在子代植物更频繁时则发生连锁。如本文所用的，连锁可在两个标记之间，或可选地在标记和表型之间。标记位点可与性状相关(连锁)，例如当标记位点与抗性性状连锁不平衡时，标记位点可与对植物病原体的新赋予的抗性或抗性增强相关。可测量分子标记与表型性状的连锁程度，表示为例如分子标记与表型共分离的统计概率。

如本文所用的，以“概率”或“调整概率”给出分子标记与表型之间的连锁关系。概率值是随机的表型与具体标记等位基因的存在或缺失的具体组合的统计学可能性。因而，概率值越低，表型与具体标记共分离的可能性越大。在一些方面，概率值被认为“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，随机分配的概率值0.05(p＝0.05，或5％概率)被认为共分离的显著指示。但是，本发明不限于这个具体标准，可接受的概率可以是小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15或小于0.1。

术语“物理连锁”有时用于表示，两个位点例如两个标记位点是物理存在于同一染色体上。

有利的是，两个连锁位点是紧密接近的，以便同源染色体对之间的重组不会在减数分裂期间高频率地发生在两个位点之间，例如以便连锁位点至少约90％的时间，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.75％或更多时间共分离。

在本申请中短语“紧密连锁”表示两个连锁位点之间的重组以等于或小于约10％的概率发生(即在遗传图谱上以不大于10cM分离)。换句话说，紧密连锁位点至少90％的时间共分离。当被证实具有与所需性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，该标记位点尤其可用于本发明中。例如，在一些方面，这些标记可称为连锁QTL标记。在其他方面，特别有用的分子标记是那些连锁或紧密连锁的标记。

在一些方面，连锁可表示为任何所需限度或范围。例如，在一些实施方案中，两个连锁位点是以小于50cM图谱单位分离的。在其他实施方案中，连锁位点是以小于40cM分离的两个位点。在其他实施方案中，两个连锁位点是以小于30cM分离的两个位点。在其他实施方案中，两个连锁位点是以小于25cM分离的两个位点。在其他实施方案中，两个连锁位点是以小于20cM分离的两个位点。在其他实施方案中，两个连锁位点是以小于15cM分离的两个位点。在一些实施方案中，连锁的囊括范围确定在例如10-20cM之间，或10-30cM之间，或10-40cM之间是有利的。

一个标记与第二位点连锁得越紧密，标记越成为更好的第二位点指示器。因此，在一个实施方案中，紧密连锁的位点，例如标记位点和第二位点表现出10％或更小，优选约9％或更小，还更优选约8％或更小，还更优选约7％或更小，还更优选约6％或更小，还更优选约5％或更小，还更优选约4％或更小，还更优选约3％或更小，还更优选约2％或更小的位点间重组频率。在高度优选的实施方案中，相关位点表现出约1％或更小，例如约0.75％或更小，更优选约0.5％或更小，或还更优选0.25％或更小的重组频率。位于同一染色体上且两者距离会使两个位点之间以小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更小)的频率发生重组，则两个位点称为相互“接近”。在一些情况中，两个不同标记可具有相同的遗传图谱坐标(genetic mapcoordinates)。如果这样，两个位点是相互紧密接近的以使它们之间的重组以不可检测的低频率发生。

当涉及两个基因元件例如有助于抗性的基因元件和接近的标记之间的关系时，“偶联”相连锁表示在抗性位点上的“偏好”等位基因在同一染色体链上作为各自连锁的标记位点的“偏好”等位基因是物理相关的状态。在偶联相中，这两个偏好等位基因是通过继承那条染色体链的子代共同遗传的。在“排斥”相连锁中，感兴趣位点上的“偏好”等位基因与在接近标记位点上的“非偏好”等位基因物理连锁，而这两个“偏好”等位基因不共同遗传(即两个位点是彼此“不同相”)。

如本文所用的，术语“染色体区间”或“染色体片段”指示位于单个染色体上的基因组DNA的连续直线跨度。位于单个染色体区间上的基因元件或基因是物理连锁的。染色体区间的大小没有具体限制。

在一些方面，例如本发明的全文中，通常位于单个染色体区间内的基因元件也是遗传连锁的，通常在例如小于或等于20cM，或可选地，小于或等于10cM的遗传重组距离之内。即，单个染色体区间内的基因元件以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

在一方面，本发明的任何标记是与在或小于50cM距离内的任何其他标记连锁的(基因或物理地)。在另一方面，本发明的任何标记是与紧密接近例如在或小于10cM距离内的任何其他标记紧密连锁的(基因或物理地)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标记可以互相距离9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。

短语“由Mal de Río Cuarto病毒引起的疾病”或“由MRCV引起的疾病”是指由植物感染MRCV引起的植物疾病。

玉米植物对MRCV的“新赋予的抗性”或“抗性增强”表示，在导入该疾病的致病剂之后，玉米植物在产量和/或存活率或其他相关农艺测量方面受到更小影响。抗性是相对的术语，表示受感染植物比另一同样处理的更易感植物获得更好的玉米产量。即，相对于易感玉米植物，这种状况在抗性玉米植物上造成玉米存活和/或产量降低减少。

技术人员应认识到玉米植物对MRCV的抗性可宽泛变化，可表示成更强抗性或更小抗性表型的谱，并会依据感染严重度而变化。但是，通过简单观察，技术人员可测定不同植物、植物系或植物族对MRCV的相对抗性或易感性，而且也可认识到“抗性”表型等级(如以下实施例7所列的示例性评分体系)。如本领域所用的，“抗性”有时称为“一般抗性”，“减级抗性”，或“部分抗性”。

本发明上下文中的术语“杂交的”或“杂交”表示配子经授粉融合，产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物与另一株的授粉)和自交(自花授粉，例如花粉和胚珠来自同一植物)。

术语“基因渗入”是指所需的基因位点的等位基因从一个遗传背景传递到另一遗传背景。例如，在指定位点的所需的等位基因的基因渗入可以是经同一物种的两个亲代之间的有性杂交传递给至少一个子代，其中至少一个亲代在其基因组具有所需的等位基因。可选地，例如等位基因的传递可通过例如在融合原生质体中的两个供体基因组之间的重组而发生，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需的等位基因可以是例如所选标记的等位基因，QTL，转基因，等等。在任何情况中，含有所需的等位基因的子代可与具有所需的遗传背景的系重复回交，并选择所需的等位基因，以使等位基因固定在所选的遗传背景中。

“系”或“品系”是通常近交至一定程度和通常在大部分位点上纯合和均质的相同来源的一组个体(等基因或接近等基因)。“亚系(subline)”是指后代的近交子集，该后代在基因上区别于从相同祖先遗传下来的其他类似近交亚系。

“祖先系”是作为基因来源的亲代系，例如用于发展原种系(eliteline)。“祖先种群”是有助于大部分用于发展原种系的遗传变异的一组祖先。“后代(descendant)”是祖先的子代，且通过育种多个世代可从它们的祖先分离。例如，原种系是它们祖先的后代。“系谱结构(pedigree structure)”定义了后代和产生该后代的每个祖先之间的关系。系谱结构可跨越一个或多个世代，描述后代和其亲代、祖亲代、曾祖亲代等之间的关系。

“原种系(elite line)”或“原种品系(elite strain)”是经多轮育种和对优良农艺性能选择而获得的农艺优良系。多个原种系是玉米育种领域技术人员已知并可获得的。“原种种群”是原种个体或系的分配，可用来表示在给定作物物种例如玉米的农艺优良基因型方面的现有技术。同样地，“原种种质”或种质的原种品系是通常来源于和/或能够产生具有优良农艺性能的植物的农艺优良种质，例如现存或新开发的玉米原种系。

相反，“外来玉米品系”或“外来玉米种质”是来源于不属于可用的原种玉米系或种质品系的玉米的品系或种质。在两株玉米植物或种质品系之间杂交的环境中，外来种质和与其杂交的原种种质的子代并非密切相关。大多数情况，外来种质不是来源于任何已知的玉米原种系，而是经选择，向育种程序中引入新的基因元件(通常是新的等位基因)。

在本文核酸扩增环境中的术语“扩增”，是所选核酸(或其转录形式)产生另外拷贝的任何过程。典型的扩增方法包括各种基于聚合酶的复制方法，包括聚合酶链式反应(PCR)，连接酶介导的方法例如连接酶链式反应(LCR)和基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。“扩增子”是扩增的核酸，例如通过任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)，通过扩增模板核酸而产生的核酸。

“基因组核酸”是在序列上对应细胞中可遗传的核酸的核酸。常见实例包括核基因组DNA和其扩增子。在一些情况中，基因组核酸不同于剪接的RNA，或相应的cDNA，因为剪接的RNA或cDNA通过例如剪接机制得以加工，去除内含子。基因组核酸任选地包括非转录(例如，染色体结构序列、启动子区域或增强子区域)和/或非翻译序列(例如内含子)，而剪接的RNA/cDNA通常不具有非转录序列或内含子。“模板核酸”是在扩增反应中作为模板的核酸(例如，基于聚合酶的扩增反应例如PCR、连接酶介导的扩增反应例如LCR，转录反应等)。模板核酸可以是基因组来源的，或可选地来源于表达的序列，例如cDNA或EST。

“外源核酸”是在序列、基因组位置或两者上非原产于指定的体系(例如种质、植物或品种)的核酸。如本文所用的，术语“外源”或“异源”当应用于多核苷酸或多肽时，通常表示人为提供给生物体系(例如植物细胞、植物基因、所研究的具体植物物种或品种或植物染色体)而非原产于指定的生物体系的分子。该术语可表示源自于除了天然存在来源外的来源的相关材料，或可表示具有部分非天然结构、基因位置或排列的分子。

相反的，例如“天然”或“内源”基因是不含有由除了染色体或正常天然存在的其他基因元件之外的来源所编码的核酸元件的基因。内源基因、转录物或多肽是由其天然染色体位点编码的，而不是人为提供给细胞的。

关于核酸或多肽的术语“重组体”表示，材料(例如重组核酸，基因，多核苷酸，或多肽)经人干涉而改变。通常，重组分子的部分排列不是天然结构，或重组多核苷酸或多肽的原始序列通过某些方式已受到操作。产生重组材料的改变，可在其天然环境或状态下进行或从其天然环境或状态中去除。例如，如果通过在原始细胞内实施人为干涉的方式而改变，或由改变的DNA进行转录，可将天然存在的核酸变成重组核酸。如果基因序列远离其天然环境而被克隆至任何人工核酸载体上，则该核酸序列可读框是重组的。产生重组分子特别是重组核酸的方案和试剂在本领域常见且常规的。在一个实施方案中，可形成人工染色体并通过本领域已知的任何方法(例如直接转移法，例如PEG-诱导DNA摄取、原生质体融合、微注射、电穿孔和微粒轰击)将其插入到玉米植物中。人工染色体是可稳定复制并随内源染色体分离的一段DNA。其具有调节和表达插入其中的异源基因的能力。异源DNA整合至兆复制区(megareplicator region，着丝点的主要复制起始位点)或与其紧密接近，启动了兆碱基大小的染色体片段的大规模扩增，这导致染色体重新形式。参见例如美国专利6,077,697号，其被全文引入作为参考。

术语重组体也表示包含重组材料的生物体，例如包含重组核酸的植物被认为是重组植物。在一些实施方案中，重组生物体是转基因生物体。

术语“导入”在涉及异源或外源核酸转运至细胞时，表示采用任何方法使核酸并入细胞中。该术语包括核酸导入方法，例如“转染”，“转化”和“转导”。

如本文所用的，术语“载体”用于表示将核酸片段转移至细胞的多核苷酸或其他分子。术语“媒介”有时与“载体”交替使用。载体任选地包含介导载体维持并激活其预期用途(例如复制必需的序列、赋予药物或抗生素抗性的基因、多克隆位点，或能使克隆的基因表达的可操作连接的启动子/增强子元件)的部分。载体通常来源于质粒、噬菌粒或植物或动物病毒。“克隆载体”或“穿梭载体”或“亚克隆载体”含有促使亚克隆步骤的可操作连接部分(例如含有多个限制性内切酶位点的多克隆位点)。

本文所用的术语“表达载体”是指含有促进具体宿主生物体内编码序列表达的可操作连接的多核苷酸序列的载体(例如细菌表达载体或植物表达载体)。促进原核生物中表达的多核苷酸序列通常包括，例如启动子、操作子(任选地)，和核糖体结合位点，其常与其他序列连在一起。真核细胞可使用启动子、增强子、终止和多腺苷酸化信号，以及通常不同于原核细胞所用的其他序列。

术语“转基因植物”是指在其细胞内含有异源多核苷酸的植物。通常，该异源多核苷酸在基因组内被稳定地整合，以使该多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可单独或作为重组表达盒的一部分被整合至基因组。本文使用“转基因”表示因异源核酸的存在而基因型发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些初始即被改变的转基因生物体或细胞，以及那些由初始转基因生物体或细胞的杂交或无性繁殖而产生的。本文所用的术语“转基因”不包括由常规植物育种方法(例如杂交)或由天然发生的事件例如随机异体受精、非重组体病毒感染、非重组体细菌转化、非重组体转座或自发突变引起的基因组(染色体的或染色体外的)改变。

“定位克隆”是通过与标记核酸的基因组接近度鉴定并分离靶核酸的克隆程序。例如，基因组核酸克隆可包括彼此接近的部分或全部两个或更多染色体区域。如果标记可用于从基因组文库中鉴定基因组核酸克隆，则可使用标准方法，例如亚克隆或测序，鉴定和/或分离位于标记附近的克隆的子序列。

当使用给定的核酸序列进行构建时，或当使用给定核酸构建指定的核酸时，即指定的核酸“来源于”给定的核酸。例如，cDNA或EST来源于表达的mRNA。

术语“基因元件”或“基因”是指具有功能意义的可遗传的DNA序列，即基因组序列。术语“基因”也可用于表示例如由基因组序列编码的cDNA和/或mRNA，以及该基因组序列。

术语“基因型”是个体(或个体集合)在一个或多个基因位点的基因组成，与可观察到的性状(表型)相对。基因型被定义为由亲代遗传至个体的一个或多个已知位点的等位基因。术语基因型可用于表示在单个位点、多个位点的个体基因组成，更普遍的是，术语基因型可用于表示在基因组上所有基因的个体基因构成。“单元型”是在多个基因位点上的个体基因型。通常，由单元型描述的基因位点是物理和基因连接的，即在同一染色体片段上。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”，指生物体的一个或多个性状。表型是可通过肉眼或通过本领域已知的任何其他评估方法，例如显微镜法、生物化学分析、基因组分析或具体抗病性的分析所可观察到的。在一些情况中，表型受单个基因或基因位点的直接控制，即“单基因性状”。在其他情况中，表型是几个基因作用的结果。

“分子表型”是在一群(一个或多个)分子水平上可检测的表型。这种分子可以是核酸，例如基因组DNA或RNA，蛋白，或代谢物。例如，分子表型可以是例如在植物发育的特定阶段、应对环境状况或应激等的一个或多个基因产物的表达谱。通常在RNA或蛋白水平上评估表达谱，例如在核酸阵列或“芯片”上或使用抗体或其他结合蛋白。

术语“产量”是指单位面积的具有商业价值的具体植物产物的生产率。例如，通常以每英亩的蒲式耳种子或每个季节每公顷的公吨种子来度量玉米产量。产量受到基因和环境因素两方面的影响。“农艺”，“农艺性状”，和“农艺性能”指在生长季节过程中有助于给定植物品种产量的性状(和潜在基因元件)。个体农艺性状包括显现势、营养势、胁迫耐受、抗病性或耐病性、除草剂抗性、分枝、开花、种组(seed set)、种子大小、种子密度、直立性、脱粒性等。因此产量是所有农艺性状的最终顶点。

一“组”标记或探针是指用于普通目的例如鉴定具有所需性状(例如对MRCV的抗性)玉米植物的标记或探针的集合或群，或由此衍生的数据。对应标记或探针的数据，或源自它们应用的数据，经常被存储在电子介质中。当组内每个成员具有对应指定目的的用途时，选自组中以及包括部分但非全部标记的亚组中的单个标记，也可有效地实现特定目的。

“查询表”是将一种数据形式与另一种，或一种或多种数据形式与数据相关的预期结果关联的表格。例如，查询表可包括等位基因数据和包含给定等位基因的植物可能显现的预期性状之间的关联。这些表可以是，且通常是多维的，例如在进行性状预测时同时考虑多个等位基因，和任选地考虑其他因素，例如遗传背景。

“计算机可读介质”是使用可用或用户界面由计算机访问的信息存储介质。实例包括存储器(例如ROM、RAM或闪存)、光学存储介质(例如CD-ROM)、磁存储介质(计算机硬盘，软盘等)、穿孔卡片，和许多其他商业可供介质。信息可在感兴趣的系统和计算机之间传递，或为存储或访问存储信息而传递至计算机和计算可读取介质中或从其中传送出来。这种传递可以是电传递，或可由其他可用方法进行，例如IR连接，无线连接等。

“系统指令”是可部分或全部由系统执行的指令组。通常地，该指令组作为系统软件而存在。

附图和序列的简要说明

图1A显示了阿根廷组的结构关联分析。注意：65.99-85.84的显著区间(p值：小于0.00005)。X轴：以cM表示距Chr2末端的距离。Y轴：概率值。图1B显示了SS组的结构关联分析。注意：在位置54.62的MRCV1，MZA1525和在位置65.99的MZA11826的主要显著标记。X轴：以cM表示距染色体2末端的距离。Y轴：概率值。图1C显示了另一SS组的结构关联分析。注意：在染色体2短臂上的最相关标记是在位置53.83的MZA12899(p＝0.000298)。X轴：以cM表示距染色体2末端的距离。Y轴：概率值。

图2显示了PH3DTxPH7WT杂交的区间作图。染色体2，LOD得分峰值：位置65.89，46％的表型变异。

图3A显示了表现出MRCV症状的玉米照片。图3B显示了具有MRCV易感性的玉米照片。

图4A显示了来自杂交PH3DTxPH7WT的高分辨率作图BC5F3种群的一组重组体在QTL区域的基因型和平均表型(MRCVSC)图。显示了进入易感背景的抗性亲代片段和重组区域。该区域包括位于MZA1525-98-A和MZA10094-9-A之间的重组体。图4B显示了来自杂交PH3DTxPH7WT的高分辨率作图BC5F3种群的一组重组体在QTL区域的基因型和平均表型(MRCVSC)图。显示了进入易感背景的抗性亲代片段和重组区域。该区域包括位于MZA15490和MZA18224之间的重组体。它也包括在区间MZA11826至MZA9105基因表征的三个重组体。表型以图右面的圆圈表示(黑圈：易感；白圈：抗性；对角线圈：抗性和易感的混合；灰圈：未知)。

图5显示了PH3DTxPH7WT杂交的区间作图。染色体2，LOD得分峰值：位置65.99(MZA2038)。MZA11826和MZA9105不包括在分析中，因为在该具体种群中不存在有关MZA2038的重组体。注意：调整遗传图谱以实现在位置65.99的区间作图；标记MZA16656、MZA15490和MZA2038在0.5cM之下的距离是高度连锁的，但在这个具体分析中它们被人为定位成0.5cM的距离。

图6显示了PH9TJxPH890杂交在Chr2和Chr5的具体QTL区域的区间作图分析。染色体2、LOD得分峰值：位置65.99-68.8。在优选标记和位置68.8标记之间不存在重组体；因而，仅包括MZA9105，作为该分析的代表性优选标记。

图7显示了受MRCV严重影响的植物图片；它对应于在含有来自杂交PH3DTxPH7WT的易感单元型的优选标记上的等基因系(isoline)。图7B显示了并排种植在阿根廷Río Cuarto易感地区的两排，其中左边的一排对应于含有易感单元型的等基因系，而右边的一排对应于在优选的标记上含有抗性等位基因的等基因系。这些等基因系来源于在来自杂交PH3DTxPH7WT的优选标记上是杂合的单个BC5F2植物。

图8显示了在标记MZA15490和MZA2038之间的染色体2QTL区域。

图9显示了在MZA15490-MZA2038区间上的区域图，其中标明了在一组代表性易感和抗性近交后代(inbreds)中具体测序片段的位置。

图10显示了在MZA15490-MZA2038区间上重组体的示意图。重组点位于PCO644442内部，从自抗性(PH7WT)和易感(PH3DT)亲代产生quimeric基因。在序列区域标明了SNPs和插入缺失的位置。

图11显示了感染MRDV的在优选的标记区域基因型类别间的玉米杂种的性能(MRDV得分)。在x坐标(基因型类别)上才“-2”、“0”和“2”分别代表易感单元型、杂合单元型和纯合抗性单元型的基因型类别。

图12是关于PH7WTxPH3DT作图种群在三个作物季中的平均表型分的区间图谱。应该注意的是LOD得分峰值靠近umc1756。

图13是关于PH7WTxPH3DT作图种群在三个作物季中的平均表型得分的复合区间图谱。应该注意的是LOD得分峰值靠近umc1756-umc1518区间。

图14是PH9TJxPH890作图种群的复合作图图谱。MRCV1 QTL的LOD得分峰值位于位置65.99-68.8。

图15是在SEQ ID NO：211(来自PH7WT的pco644442启动子)和SEQID NO：212(来自PH3DT的pco644442启动子)之间的Clusta1W序列比对。

图16是SEQ ID NOs：213-236之间的ClustalW序列比对。

以下序列描述概括了所附的序列表。序列表含有核苷酸序列的单字母密码和在Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal 219(2)：345-373(1984)中描述的IUPAC-IUB标准所定义的单和三字母密码。

SEQ ID NOs：1-5、8-11、14、15、18、21、25、29、30、32、34-37、39以及42-48是表6中MZA标记的共有序列。

SEQ ID NOs：6、7、12、13、16、17、19、20、22-24、26-28、31、33、38、40以及41是表7中SNP标记的SNP共有序列。

SEQ ID NOs：49-56是表3中公共标记的左和右引物序列。

SEQ ID NOs：57-172是表6中MZA标记的正向外部、正向内部、反向内部以及反向外部引物。

SEQ ID NOs：173-210是表7中SNP标记的正向和反向引物。

SEQ ID NO：211是玉米近交系PH7WT的PCO644442启动子区域。

SEQ ID NO：212是玉米近交系PH3DT的PCO644442启动子区域。

SEQ ID NO：213是玉米近交系PH3DT的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：214是玉米近交系AP19506160的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：215是玉米近交系AP19506157的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：216是玉米近交系AP19506156的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：217是玉米近交系PH7WT的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：218是玉米近交系630的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：219是玉米近交系PHG63的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：220是玉米近交系PHK09的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：221是玉米近交系PHR33的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：222是玉米近交系501的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：223是玉米近交系157的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：224是玉米近交系PHK56的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：225是玉米近交系661的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：226是玉米近交系PHR03的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：227是玉米近交系1047的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：228是玉米近交系PHJ40的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：229是玉米近交系274的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：230是玉米近交系165的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：231是玉米近交系B73的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：232是玉米近交系PHN47的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：233是玉米近交系PH26N的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：234是玉米近交系PHDG9的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：235是玉米近交系ST10H60的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

SEQ ID NO：236是玉米近交系PHKP5的包括MRQV8381和MRQV10673的序列区域。

发明的详细描述

使用MAS鉴定和选择表现出MRCV抗性的玉米植物，可提供克服该疾病所造成的损失的有效且环境友好的方法。本发明提供了在统计上表现出与MRCV抗性显著共分离的玉米标记位点。这些位点或其他连锁位点的检测，可用于标记辅助的玉米育种程序，产生抗性植物，或MRCV抗性或相关斐济病毒抗性获得改善的植物。本文鉴定的连锁的SSR和SNP标记提供于表1和2中。这些标记包括MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826以及MZA9105。

每个SSR型标记都表现出可显现成不同大小PCR扩增子的多个等位基因。用于产生SSR标记扩增子的PCR引物如表3所列。使用本领域已知的等位基因特异性杂交方案测定SNP型标记的等位基因。用于扩增SNP结构域的PCR引物和用于对位点进行基因分型的等位基因特异性探针如表6和7所列。

表6和7列出了表现出与MRCV抗性基因型连锁不平衡的SNP标记。这些表格提供了用于产生含有SNP的扩增子的PCR引物序列，和用于在等位基因特异性杂交试验(ASH试验)中鉴定SNP等位基因的等位基因特异性探针。

如本领域所公认的，与QTL标记连锁的任何其他标记(例如抗病性标记)也发现可用于相同目的。提供了与本文所述的抗病性标记连锁的其他标的记实例。例如由表8所提供的紧密连锁的标记确定连锁的标记。

表8

然而发现可用于本文的连锁标记并不限于表8所列的那些。

本发明也提供了与MRCV抗性关联的染色体QTL区间。这些区间位于连锁群2。位于这些区间内的任何标记可用作MRCV抗性的标记。这些区间包括：

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a。

鉴定携带抗性标记位点的优选的等位基因的玉米植物或种质的方法是本发明一方面。在这些方法中，根据标记位点的类型，可使用任何多种标记检测方案鉴定标记位点。用于标记检测的典型方法包括通过例如PCR、LCR、基于扩增方法的转录等扩增并检测所获的扩增标记。这些方法包括ASH、SSR检测、RFLP分析以及多种其他方法。

尽管具体标记等位基因可表现出与抗病性或疾病易感性表型的共分离，但应该重点注意的是，标记位点并非负责抗性或易感性的QTL位点的必需部分。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予抗病性的基因的一部分(例如，基因可读框的一部分)。具体标记等位基因与抗性或易感性表型之间的关联是由于，在产生抗性或易感性等位基因的祖先玉米系中，标记等位基因和QTL抗性或易感性等位基因之间的原始“偶联”连锁相造成的。最终，通过重复重组，标记和QTL位点之间的交换事件可改变这种方向。为此，根据存在于用于产生分离种群的抗性亲代内的连锁相，可改变偏好标记等位基因。这不会改变遗传标记可用于监测表型分离的事实。它仅改变哪个标记等位基因在给定的分离种群中被认为是偏好的。

鉴定包括标记位点或与抗性性状或性状连锁的标记位点的玉米植物或种质，为实施玉米的标记辅助选择提供了基础。可选择包含偏好标记或偏好等位基因的玉米植物，而可剔除包含与抗性负相关的标记或等位基因的玉米植物。所需的标记和/或等位基因可被基因渗入至具有所需(例如原种或外来)的遗传背景的玉米，以产生基因渗入的抗性玉米植物或种质。在一些方面，构想多个抗性标记被依次或同时选择和/或基因渗入。选择用于单个植物的抗性标记组合是没有限制的，可包括表1和2所述标记的任何组合，与表1和2所述标记连锁的任何标记，或位于本文所定义的QTL区间内的任何标记。

作为将感兴趣的性状导入玉米的标准育种方法(例如基因渗入)的可选方案，也可使用转基因方法。在这些方法中，将编码与标记连锁的性状的外源核酸导入靶植物或种质。例如，通过例如定位克隆克隆编码抗性性状的核酸，并将其导入靶植物或种质。

通过可用的抗性方案进行抗性验证(参见例如实施例10)。抗性试验可用于在任何具体植物或种群中验证抗性性状与标记的分离，从而测定通过将性状基因渗入或重组导入所需背景所实现的抗性改善程度。

系统，包括用于选择包含感兴趣的标记的植物和/或用于使标记的存在与抗性关联的自动系统，也是本发明的一方面。这种系统可包括与标记位点检测相关的探针、检测探针标记的检测器、适宜的流体处理元件和混合探针和模板和/或扩增模板的温度控制器，以及使标记检测与具体标记位点或等位基因的存在关联的系统指令。

试剂盒也是本发明的一方面。例如，试剂盒可包括用于检测抗性相关标记位点的适宜引物或探针和使用引物或探针检测标记位点并使该位点与预期MRCV抗性关联的说明。该试剂盒还可包括用于包装探针、引物或说明的包装材料，控制器例如控制包括用于扩增的探针、引物或模板核酸的扩增反应，分子标记等。

抗性标记和偏好等位基因

在传统的连锁分析中，不需要直接认识染色体上的基因的物理关系。孟德尔第一法则是成对特征的因子是分离，意味着二倍体性状的等位基因分离至两个配子中然后进入不同的子代。经典的连锁分析可被认为是不同性状共分离相对频率的统计描述。连锁分析被很好地表征为在共同分离频率基础上性状如何集合的描述性框架。即，如果两个非等位性状以高于随机频率而共同遗传，则它们被称为“连锁的”。性状共同遗传的频率是性状连锁紧密程度的主要测量手段，即以更高频率共同遗传的性状比以更低频率(但仍高于随机)共同的性状连锁的更紧密。性状之所以连锁是因为性状所依赖的基因存在于同一染色体上。基因在染色体上相距越远，它们共同分离的可能性越小，因为在减数分裂期间同源染色体会重组。从而，基因在染色体上相距越远，减数分裂期间出现会造成两个基因分别分离至子代的交换事件的可能性越大。

连锁的常用测量手段是性状共分离的频率。这可表达成共分离的百分比(重组百分比)或也通常表达成厘摩(cM)。cM以先驱遗传学家托马斯亨特摩根命名的，是遗传重组频率的测量单位。一cM等于在一个基因位点上的性状与在另一基因位点上的性状由于单代交换而有1％的机会分离(意即性状99％的时间都共同分离)。因为染色体距离与性状之间交换事件频率近似成比例，存在与重组频率相关的近似物理距离。例如，在玉米中，1cM平均与大约2,140,000个碱基对(2.14Mbp)相关。

标记位点是性状本身，并可通过在分离期间追踪标记位点的标准连锁分析进行分析。因此，在本发明上下文中，一cM等于标记位点与另一位点(其可以是任何其他性状，例如另一标记位点，或另一编码QTL的性状位点)由于单代交换而有1％的机会分离。发现本文的标记如表1和2所述的，例如MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105，以及任何染色体区间，

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a；

与玉米中对MRCV的新赋予的抗性、抗性增强或易感性关联。这意味着这些标记相当接近抗性性状，因而它们可用作抗性性状的预测器。这对本文中详细讨论的标记辅助选择(MAS)是非常有用的。简而言之，可针对与抗性正相关的标记或标记等位基因而选择玉米植物或种质，而无需实际种植玉米和测量新赋予的抗性或抗性增强(或相反，如果玉米植物拥有与新赋予的抗性或抗性增强负相关的标记，则可剔除它们)。MAS是可选择所需表型和将所需性状基因渗入至玉米培育种(例如将所需性状基因渗入至原种系中)的有利捷径。MAS可便利地适用于高通量分子分析方法，并且比种植和观察植物可见性状更加经济，所述高通量分子分析方法可以快速筛选大量感兴趣标记的植物或种质遗传物质。

在一些实施方案中，最优选的QTL标记是表1和2所列标记的子集。例如，最优选的标记是MZA15490和MZA2038。

当涉及两个基因元件例如有助于抗性的基因元件和接近标记之间的关系时，“偶联”相连锁表示，在抗性位点上的“偏好”等位基因在同一染色体链上作为各自连锁的标记位点的“偏好”等位基因是物理相关的状态。在偶联相中，两个偏好等位基因是通过继承那条染色体链的子代共同遗传的。在“排斥”相连锁中，感兴趣位点(例如抗性的QTL)上的“偏好”等位基因与在接近标记位点上的“非偏好”等位基因是物理连锁的，而两个“偏好”等位基因不共同遗传(即两个位点是彼此“不同相”)。

标记的偏好等位基因是与所需的表型(例如抗病性)共分离的标记等位基因。如本文所用的，QTL标记具有一个偏好等位基因的最少值，尽管该标记可能具有在种群中发现的两个或多个偏好等位基因。该标记的任何偏好等位基因可优选用于鉴定和构建抗性玉米系。任选地，在植物中鉴定不同标记的一个、两个、三个或更多偏好等位基因或将它们基因渗入至植物，并在MAS期间进行选择或剔除。理想地，鉴定具有至少一个这种与新赋予的抗性或抗性增强正相关的偏好等位基因的植物或种质。

可选地，与疾病易感性共分离的标记等位基因可用于本发明中，因为该等位基因可用于鉴定和反选择疾病易感植物。这种等位基因可用于育种期间的排除目的，以鉴定与抗性负相关的等位基因，以在后轮育种中排除易感植物或种质。

在本发明的一些实施方案中，可在单个植物或植物种群中同时选择多个标记等位基因。在这些方法中，选择含有来自多个抗性标记的偏好等位基因的植物，或可选地将来自多个抗性标记的偏好等位基因基因渗入至所需的玉米种质中。本领域技术人员应当认识到，从同一植物的多个抗病性标记中同时选择偏好等位基因，可能引发植物的加成(或甚至协同)保护作用。

技术人员可认识到，偏好等位基因的鉴定是种质特异性的。确定哪个标记等位基因与抗性(或易感性)关联，是针对研究的具体种质而确定的。技术人员可认识到，鉴定偏好等位基因的方法是常规的且本领域公知的，而且，这种偏好等位基因鉴定和使用全部处于本发明范围内。另外，在本文所用或所述的种群之外的玉米种群中鉴定偏好标记等位基因全部处于本发明范围内。

用于扩增SSR型标记位点的扩增引物是本发明的一部分。本发明的另一部分是特异性扩增SNP结构域(SNP标记)的引物，和用于对SNP序列进行基因分型的探针。表6和7提供了用于标记位点扩增的特异性引物和用于检测扩增标记位点的探针。但是，技术人员应当立即认识到，给定引物任一侧的其他序列可用于替代给定的引物，只要引物可扩增包括待检测的等位基因的区域。而且，应该理解的是，用于检测的精确探针可以变化，例如可鉴定待检测的标记扩增子的区域的任何探针可被本文提供的那些实例所替换。此外，扩增引物和检测探针的结构当然可以变化。因而，本发明不限于本文具体叙述的引物和探针。

在一些方面，本发明方法利用扩增步骤检测标记位点/对标记位点进行基因分型。但是，应该理解的是，扩增不是标记检测必需的一例如，仅通过在基因组DNA样品中进行DAN印迹法即可直接检测未扩增的基因组DNA。进行DNA印迹法的程序、扩增(PCR、LCR等)和许多其他核酸检测方法，是建立已久的并在例如Sambrook et al.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(3^rdEd.)，Vol.1-3，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，2000(“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(2002年补增)(“Ausubel”)和PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis etal.eds)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(“Innis”)中有教导。有关植物中核酸检测的其他细节也可见于，例如Plant Molecular Biology(植物分子生物学)(1993)Croy(ed.)BIOS Scientific Publishers，Inc.(“Croy”)。

在扩增/检测方法中也可省略单独的检测探针，例如通过实施检测由修饰相关扩增引物并入产物，标记的核苷酸并入扩增子所形成的产物的实时扩增反应，或通过监测扩增子与未扩增的前体相比的分子旋转特性的变化(例如通过荧光偏振)。

通常，可通过本领域已建立的任何可用方法检测分子标记，包括但不限于等位基因特异性杂交(ASH)或检测单核苷酸多态性(SNP)的其他方法，扩增片段长度多态性(AFLP)检测，扩增可变序列检测，随机扩增DNA多态性性(RAPD)检测，限制性片段长度多态性(RFLP)检测，自主序列复制检测，简单重复序列(SSR)检测，单链构型多态性(SSCP)检测，同工酶标记检测等。尽管本文图表中所列的示例性标记是SSR或SNP(ASH)标记，但任何前述标记类型都可用于本发明中，以鉴定包含有助于优良农艺性能(例如新赋予的抗性或抗性)增强的基因元件的染色体片段。

QTL染色体区间

在一些方面，本发明提供了QTL染色体区间，其中与MRCV抗性分离的QTL(或多个QTL)包含在这些区间中。本领域公知的多种方法都可用于鉴定染色体区间(如实施例1和2所详细描述的)。这些染色体区间的边界被拉拽至包含与一个或多个QTL连锁的标记。换而言之，染色体区间被拉拽以使位于该区间(包括定义区间边界的终止标记)内的任何标记都可用作抗病性的标记。每个区间包含至少一个QTL，而且，实际上可包含多于一个QTL。在同一区间上紧密接近的多个QTL可模糊具体标记与具体QTL的关联，因为一个标记可表现出与多于一个QTL的连锁。相反，例如，若紧密接近的两个标记表现出与所需的表型性状的共分离，则每个标记是否鉴定相同QTL或两个不同的QTL有时会不清楚。不管怎样，操作或实践本发明不需要知道在具体区间中有多少QTL。

本发明提供了玉米染色体区间，其中在该区间内的标记表现出与MRCV抗性共分离。因此，每个区间包含至少一个如表9所示的MRCV抗性QTL。

表9

侧翼标记	鉴定方法
		MZA8381和MZA18180	关联分析，血统同一性
MZA4305和MZA2803	关联分析，血统同一性
		MZA15490和MZA2038	关联分析，血统同一性
bnlg1458b和umc1261a	与优选的标记的连锁
		bnlg1458b和umc1262a	与优选标记的连锁
bnlg1327和umc1261a	与优选的标记的连锁
		bnlg1327和umc1262a	与优选的标记的连锁

上述的每个区间表现为与MRCV抗性共分离的成簇标记。这种成簇标记的出现于连锁群上的小结构域中，表明在这些染色体区域上存在一个或多个QTL。QTL区间被拉拽至包含与抗性共分离的标记。由在其末端的标记定义区间，其中区间包括绘制在区间内的所有标记以及定义末端的标记。

在一些情况中，区间可被拉拽为区间由与优选标记的连锁所定义。例如，染色体2上的区间被定义成与标记MZA16656连锁的任何标记都是该区间的成员。例如，如本文所用的，连锁被定义成距MZA16656在25cM之内的任何标记。与MZA16656(例如MZA16656的5cM之内)连锁的标记可通过任何适宜的遗传连锁图谱(例如在MaizeGDB网站上查到的IBM2 2005Neighbors Frame2图谱)测定。这些标记按基因顺序显示。所列的每个标记，包括末端标记pco061820a和sog5758o，都是区间的成员。pco061820a和sog5758o标记是本领域已知的。

如上所述的，区间(例如染色体区间或QTL区间)不需要依赖区间大小的绝对测量值例如厘摩值。区间可通过定义区间端点的末端标记所描述，且通常区间可包括定义区间长度的末端标记。区间可包括位于染色体域内的任何标记，而无论这些标记是目前已知或未知的。本发明提供了定义例如表8连锁标记列表和本文参考文献中的染色体区间的多种方式。

遗传图谱

如本领域技术人员所认为的，任何具体种群内的重组频率(以及作为结果的遗传图谱位置)不是固定的。分离两个标记(或一个标记和一个QTL)的遗传距离，可根据如何测定图谱位置而变化。例如，变量例如所用的亲代作图种群，标记作图或QTL作图所用的软件，和作图软件用户所输入的参数，都对QTL/标记遗传图谱关系有贡献。但是，本发明并不限于任何具体的作图种群，使用任何具体的软件，或任何具体软件参数组，以便确定具体标记或染色体区间与MRCV抗性表型的连锁。本领域普通技术人员完全有能力将本文所述的新特征外推至任何感兴趣的玉米基因池或种群，和使用任何具体软件和软件参数。实际上，使用本发明的教导可容易地做出除本文所述之外的有关种群中抗性标记和染色体区间的观察。

作图软件

多种商业软件可用于遗传作图和标记关联研究(例如QTL作图)。这些软件包括但不限于表10所列的那些。

表10

统一遗传图谱

已产生“统一”，“共有”或“整合”遗传图谱，其可合并来自一个或多个来源的作图数据而形成，包括使用不同作图种群和不同统计分析的来源。遗传图谱信息的合并增加了图谱上的标记密度，以及改善了图谱分辨率。这些改善的图谱可有利地用于标记辅助选择，基于图谱的克隆，为定位新鉴定的分子标记提供了改善的框架，并帮助鉴定QTL染色体区间和成簇的有利连锁标记。

在一些方面，共有图谱是由一个图谱与另一图谱顶部的简单重叠而得到的。在其方面，多种算法例如

分析，可允许来自不同来源的遗传作图数据的组合，并协调原始来源的作图数据之间的偏差。参见Van Ooijen and Voorrips(2001)“JoinMap 3.0 software for the calculation ofgenetic linkage maps”，Plant Research International，Wageningen，theNetherlands；Stam(1993)“Construction of integrated genetic linkage mapsby means of a new computer package：JoinMap”，The Plant Journal3(5)：739-744。

连锁标记

根据本发明和本领域的广泛共识，显然，具有与感兴趣的表型性状(例如在本发明中，新赋予的抗性或抗性增强性状)共分离的显著概率的任何遗传标记，都可用作该性状的标记。本发明所提供的可用QTL标记的列表，如表1和2所述。

除了表1和2注明的QTL标记之外，与QTL标记连锁的其他标记也用于预测玉米植物中新赋予的抗性或抗性增强性状。换而言之，表现出与本发明QTL标记(例如表1和2所述的标记)具有小于50％重组频率(分离的遗传距离小于50cM)的任何其他标记，也是本发明的一方面。与QTL标记连锁的任何标记，也可有利地用于具体性状的标记辅助选择。

若它们与给定的QTL标记足够接近(例如紧密连锁)，以致遗传标记和QTL标记表现出低的重组频率，则与QTL标记(例如表1和2所提供的QTL标记)连锁的遗传标记是特别有用的。在本发明中，这种紧密连锁的标记是本发明的一方面。如本文所定义的，紧密连锁标记表现出大约10％或更低的重组频率(给定的标记在QTL的10cM之内)。换而言之，这种紧密连锁位点至少90％的时间共分离。实际上，标记与QTL标记越紧密，标记越成为所需性状更有效和有利的指示器。

因此，在其他实施方案中，紧密连锁位点例如QTL标记位点和第二位点表现出10％或更小、优选约9％或更小、还更优选约8％或更小、还更优选约7％或更小、还更优选约6％或更小、还更优选约5％或更小、还更优选约4％或更小、还更优选约3％或更小、还更优选约2％或更小的位点间重组频率。在高度优选实施方案中，相关位点(例如标记位点和靶位点例如QTL)表现出约1％或更小，例如约0.75％或更小，更优选约0.5％或更小，或还更优选0.25％或更小的重组频率。因而，位点相距大约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更小。换而言之，位于同一染色体上且两者距离会使两个位点之间以小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更小)的频率发生重组，则两个位点称为相互“接近”。

在一些方面，本发明的连锁标记(包括紧密连锁标记)可通过浏览遗传图谱，例如在MaizeGDB网站上发现的整合遗传图谱来确定。例如，本文显示了连锁群2标记MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826以及MZA9105，与至少一个MRCV抗性QTL关联。与MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826以及MZA9105连锁的标记，可从表8提供的列表中确定(参见表11，显示了MZA625和MZA9105之间遗传标记的水稻位点和工作玉米基因ID)。

例如，连锁群2上的与MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826以及MZA9105连锁的标记包括表12所列的那些。

表12

标记	图谱位置
		pco061820a	148.07
pco116928a	148.07
		sog0930a	148.07
pco102443	148.07
		pco133385a	148.07
sog5467ac	148.07
		c17211_11	148.08
K4-14p	148.08
		pcol35612a	148.08
si687005h09c	148.08
		si707023g07c	148.08
cl15901_1a	148.08
		pco134907	148.08
si660032f12i	148.08
		c17048_1b	148.08
c12578_1	148.09
		c15312_1a	148.09
pco094715	148.09
		sog5829a	148.09
c130_1e	148.09
		pco125905	148.09
sog0690	148.09
		c136282_1b	148.09
pco118508	148.09
		gpm636	148.09
pco066747a	148.09
		pco083425q	148.09
sog5844av	148.09
		bn1g1458b	148.09
si606065e12a	148.09
		c122018_1	148.09
pco091058	148.09
		si946053g10	148.10
sog1265	148.10
		sog0743c	148.10
c19862_1	148.10
		pco114887	148.10
bnlg1327	148.10
		sog5587a	148.10
cl1488_-4a	148.11
		pco085208a	148.11
sog1295c	148.11
		sog5609b	148.11
sog0912a	148.11
		te17sc1ah	148.11
si660060d11b	148.11
		c110933_1d	148.11

c137019_1a	148.11
		sog1856ae	148.11
pco1170071	148.11
		c140761_1a	148.11
siaf099388e	148.11
		pco137067a	148.11
sog2274m	148.11
		c131185_3a	148.11
pco098939a	148.11
		pco150139r	148.11
c111825_1a	148.11
		pco122145b	148.11
c124291_1a	148.11
		si618065g03a	148.11
si707029g03a	148.11
		sog1495a	148.75
umc1262a	153.10
		umc1261a	154.60
sog5758o	154.71

同样，本发明的连锁标记(包括紧密连锁标记)可通过浏览任何适宜的玉米遗传图谱来确定。例如整合遗传图谱可见于MaizeGDB网站。

连锁或紧密连锁标记的确定并不限于使用任何具体的玉米遗传图谱。实际上，大量的玉米遗传图谱是可用的，且是本领域技术人员公知的。可选地，连锁和紧密连锁标记的确定可通过形成实验数据组和连锁分析来进行。

与本文所鉴定的MRCV抗性QTL标记连锁(例如在约50cM之内或在约10cM之内)的标记的鉴定，也不限于任何具体图谱或方法。MaizeGDB网站所提供的整合遗传图谱仅作为鉴定连锁标记的实例。事实上，本文所定义的连锁标记可由本领域已知的任何遗传图谱(实验图谱或整合图谱)确定，或可选地，由任何新作图数据组确定。

应该注意的是连锁和紧密连锁标记的列表可根据不同因素在图谱和方法之间变化。首先，位于任意两个图谱上的标记可以不相同，而且，一些图谱可以具有比其他图谱更大的标记密度。用于构建遗传图谱的作图种群、方法和法也可以不同。本领域技术人员应认识到，一个遗传图谱并不需要比另一个更精确或更不精确，而且，还应认识到，任何玉米遗传图谱都可用于确定与本发明QTL标记连锁和紧密连锁的标记。

标记检测技术

本发明提供了具有与赋予MRCV抗性表型的QTL共分离的显著概率的分子标记。这些QTL标记可用于所需性状(新赋予的抗性或抗性增强)的标记辅助选择，以及其他用途。本发明并不限于检测这些标记的任何具体方法。

对应种群成员之间遗传多态性的标记可通过本领域建立已久的多种方法来检测(例如，基于PCR的序列特异性扩增、限制性片段长度多态性(RFLPs)、同工酶标记、等位基因特异性杂交(ASH)、扩增植物基因组可变序列、自主序列复制、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、随机扩增DNA多态性(“RAPD”)或扩增片段长度多态性(AFLP))。在一另外实施方案中，可简单地通过多态标记区域的核苷酸测序确定分子标记的存在或缺失。本方法可便利地适用于高通量分析，如上述的其他方法，例如使用可用的高通量测序方法，例如杂交测序。

通常，大部分遗传标记依赖于它们所检测的核酸的一个或多个特性。例如，用于检测遗传标记的一些方法是利用探针核酸与对应于遗传标记的核酸的杂交(例如使用玉米基因组DNA作模板所产生的扩增核酸)。杂交形式包括但不限于溶液相、固相、混合相，或原位杂交分析，都可用于等位基因检测。核酸杂交的广泛指南可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes(生物化学和分钟生物学实验技术一核酸探针杂交)Elsevier，New York，以及Sambrook和Ausubel(本文)；和Berger andKimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques(分子克隆技术指南)， Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)。

例如，包含限制性片段长度多态性(RFLP)的标记，可通过例如使通常为待检测核酸的子片段(或对应于该子片段的合成的寡核苷酸)的探针与限制性消化的基因组DNA杂交来检测。选择限制性内切酶，以在不同个体或种群中提供至少两个可选(或多态)长度的限制性片段。产生每次杂交的信息片段的一个或多个限制性内切酶的确定，是一个简单的程序，是本领域公知的。在适当基质(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺)中按长度分离并转移至膜(如硝酸纤维素、尼龙等)之后，在可使探针和靶标平衡结合的条件下，使标记的探针杂交，随后通过洗涤去除过量的探针。

可以克隆和/或合成标记位点的核酸探针。任何适宜标记都可与本发明的探针一起使用。适宜与核酸探针一起使用的可检测标记包括，例如可通过分光镜、放射同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。可用的标记包括以标记的链霉抗生物素偶联物染色的生物素、磁珠、荧光染料、放射标记、酶和显色标记。其他标记包括与标记有荧光团、化学发光剂和酶的抗体结合的配体。探针也可构建用于生成放射标记的扩增子的放射标记的PCR引物。标记核酸的标记策略和相应的检测策略可见于例如Molecular Probes，Inc.(Eugene OR)的Haugland(1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition(荧光探针和化学品研究手册，第6版)；或Molecular Probes，Inc.(Eugene OR)的Haugland(2001)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Eighth Edition(荧光探针和化学品研究手册，第8版以CD ROM提供)。

基于扩增的检测方法

PCR、RT-PCR和LCR是特别可广泛使用的用于扩增感兴趣核酸(例如含有标记位点的那些)，促进标记检测的扩增和扩增检测方法。有关使用这些和其他扩增方法的细节可见于多种标准教科书中的任何教科书，包括例如Sambrook、Ausubel、Berger以及Croy。许多可用的生物学教科书也具有关于PCR和相关扩增方法的广泛讨论。技术人员应当理解，本质上任何RNA都可转化成适宜于限制性消化、PCR延伸和使用逆转录酶和聚合酶的测序(“逆转录PCR”或“RT-PCR”)的双链DNA。还可参见上文的Ausubel、Sambrook以及Berger。

实时扩增/检测方法

在一方面，使用例如分子信标或TaqMan^TM探针，对本文所述扩增混合物进行实时PCR或LCR。分子信标(MB)是在适宜杂交条件下可自杂交形成茎和环结构的寡核苷酸或PNA。MB在寡核苷酸或PNA末端具有标记和淬灭剂；因此，在实现分子内杂交的条件下，标记通常被淬灭剂淬灭(或至少改变其荧光性)。在MB不显示分子内杂交的条件下(如，结合于靶核酸，如在扩增过程中结合于扩增子的区域)，MB标记不被淬灭。制备和使用MBs的标准方法相关细节，在文献中建立已久，且MBs可来源于多种商业试剂源。还参见例如Leone et al.(1995)“Molecular beaconprobes combined with amplification by NASBA enable homogenousreal-time detection of RNA”，Nucleic Acids Res.26：2150-2155；Tyagi andKramer(1996)“Molecular beacons：probes that fluoresce upon hybridization”Nature Biotechnology 14：303-308；Blok and Kramer(1997)“Amplifiablehybridization probes containing a molecular switch”Mol Cell Probes11：187-194；Hsuih et al.(1997)“Novel，ligation-dependent PCR assay fordetection of hepatitis C in serum”J Clin Microbiol 34：501-507；Kostrikis et al.(1998)“Molecular beacons：spectral genotyping of human alleles”Science279：1228-1229；Sokol et al.(1998)“Real time detection of DNA：RNAhybridization in living cells”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：11538-11543；Tyagi et al.(1998)“Multicolor molecular beacons for allele discrimination”Nature Biotechnology 16：49-53；Bonnet et al.(1999)“Thermodynamic basisof the chemical specificity of structured DNA probes”Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.96：6171-6176；Fang et al.(1999)“Designing a novel molecularbeacon for surface-immobilized DNA hybridization studies”J.Am.Chem. Soc.121：2921-2922；Marras et al.(1999)“Multiplex detection ofsingle-nucleotide variation using molecular beacons”Genet.Anal.Biomol. Eng.14：151-156；和Vet et al.(1999)“Multiplex detection of four pathogenicretroviruses using molecular beacons”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：6394-6399。关于MB构建和使用的其他细节，可见于专利文献，例如美国专利5925517、6150097和6037130号。

本发明中也可实施使用双标记荧光寡核苷酸探针通常称为“TaqMan^TM”探针的PCR检测和定量。这些探针可由以两种不同荧光染料标记的短(例如20-25碱基)寡脱氧核苷酸所组成。在每个探针的5’端是报告染料，而在每个探针的3’端是淬灭染料。寡核苷酸探针序列与存在于PCR扩增子中的内部靶序列互补。当探针是完整的，在两个荧光团之间会发生能量转移，且由报告基团的发光被淬灭剂通过FRET所淬灭。在PCR延伸阶段，探针被反应中所用的聚合酶的5’核酸酶活性所切割，因此从寡核苷酸-淬灭剂中释放报告基团并提高了报告发光强度。因此，TaqMan^TM探针是具有标记和淬灭剂的寡核苷酸，其中标记在扩增期间因扩增所用聚合酶的外切核酸酶作用而被释放。这提供了合成期间扩增的实时测量。多种TaqMan^TM试剂是商业可供的，例如来自AppliedBiosystems(在加拿大福斯特市的分部)以及来自多个专业供应商例如Biosearch Technologies(例如，黑洞淬灭剂探针)。

关于扩增可变序列、SSR、AFLP、ASH、SNPs以及同工酶标记的其 他细节

扩增的可变序列指在同一物种的成员之间表现出核酸残基高度可变性的植物基因组的扩增的序列。所有生物体都具有可变基因组序列且每个生物体(除克隆之外)具有不同的可变序列组。一经鉴定，具体可变序列的存在可用于预测表型性状。优选地，来自植物的DNA作为位于DNA可变序列侧翼的引物扩增的模板。扩增可变序列然后对其测序。

可选地，自主序列复制可用于鉴定遗传标记。自主序列复制指使用靶核酸序列的核酸扩增方法，通过使用逆转录病毒复制涉及的三种酶活性(1)逆转录酶，(2)RNA酶H，和(3)依赖DNA的RNA聚合酶，可使所述靶核酸序列在基本等温条件下在体外进行指数复制(Guatelli et al.(1990)Proc NatlAcad Sci USA 87：1874)。通过cDNA中间物的方式模拟逆转录病毒的RNA复制策略，该反应会积累最初靶标的cDNA和RNA拷贝。

扩增片段长度多态性(AFLP)也可用作遗传标记(Vos et al.(1995)Nucleic Acids Res 23：4407)。短语“扩增片段长度多态性”是指经限制性内切核酸酶切割之前或之后扩增的所选的限制性片段。扩增步骤可使特异性限制性片段的检测更容易。AFLP可实现大量多态标记的检测，并可用于植物的遗传作图(Becker et al.(1995)Mol Gen Genet 249：65；和Meksem et al.(1995)Mol Gen Genet 249：74)。

等位基因特异性杂交(ASH)可用于鉴定本发明的遗传标记。ASH技术是基于短的单链寡核苷酸探针与完全互补单链靶核酸的稳定退火。检测凭借附着在探针上的同位素或非同位素标记。

对于每个多态性，两个或多个不同ASH探针被设计成具有相同DNA序列，除了多态核苷酸之外。每个探针都与一个等位基因具有正确的同源性，以便探针的范围可区别所有已知可选的等位基因序列。每个探针与靶DNA杂交。在适宜的探针设计和杂交条件下，探针和靶DNA之间的单碱基错配将阻碍杂交。按这种方式，仅唯一的可选探针会和与等位基因纯合或同质的靶样品杂交。与两个等位基因杂合或异质的样品会和两个可选探针都杂交。

在由唯一探针的杂交或缺乏杂交来确定唯一等位基因的存在或缺失中，用ASH标记作为主要标记。可由缺乏杂交推断可选等位基因。ASH探针和靶分子任选地是RNA或DNA；靶分子是超出与探针互补的序列的任何长度的核苷酸；探针被设计成可与靶DNA任一链杂交；探针大小发生变动，以便符合多种严格杂交条件等。

PCR在相对小体积中由低浓度核酸扩增ASH的靶序列。此外，以限制性内切核酸酶消化来自基因组DNA的靶序列，并通过凝胶电泳按大小进行分离。杂交通常发生在结合到膜表面的靶序列上，或如美国专利5,468,613号所述，ASH探针序列结合到膜上。

在一个实施方案中，通常利用PCR由基因组DNA扩增核酸片段(扩增子)，将扩增子靶DNA转移至点斑点印迹形式的膜上，使标记的寡核苷酸探针与扩增子靶杂交，并通过放射自显影术观察杂交斑点，从而获得ASH数据。

单核苷酸多态性(SNP)是由在单个核苷酸基础上有区别的共享序列组成的标记。通常，这种区别可通过包含SNP的扩增子在例如丙烯酰胺凝胶上的差速迁移模式来检测。但是，可选的检测方式例如杂交，如ASH或RFLP分析也是适宜的。

同工酶标记可用作遗传标记，例如以追踪除本文抗性标记之外的标记，或追踪与本文标记连锁的同工酶标记。同工酶是在其氨基酸序列上和核酸序列上互相区别的多种形式的酶。一些同工酶是包含略有区别的亚基的多体酶。其他同工酶是多体或单体的，但在氨基酸序列的不同位点由酶原切割而得。可在蛋白水平上表征和分析同工酶，或可选地，可测定在核酸水平上有区别的同工酶。在这种情况中，本文所述的任何基于核酸的方法，都可用于分析同工酶标记。

关于核酸扩增的其他细节

应注意，核酸扩增技术，例如PCR和LCR，是本领域已知的，并可用于本发明以扩增和/或检测感兴趣核酸，例如包含标记位点的核酸。足以通过这些体外方法指导技术人员的技术实例，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qββ-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，可见于上文所述的文献中，例如Innis、Sambrook、Ausubel、Berger以及Croy。其他细节可见于Mullis et al.(1987)美国专利4,683,202号；Arnheim & Levinson(October1，1990)C&EN36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；Kwoh et al.(1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86：1173；Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：1874；Lomell et al.(1989)J.Clin.Chem 35：1826；Landegren et al.(1988)Science 241：1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu and Wallace(1989)Gene 4：560；Barringer et al.(1990)Gene 89：117；和Sooknanan and Malek(1995)Biotechnology 13：563-564。在参考的Cheng etal.(1994)Nature 369：684中还进一步概述了通过PCR扩增大核酸的改良方法，其中，可形成高达40kb的PCR扩增子，这可用于本文的定位克隆。

定位克隆标记的检测

在一些实施方案中，核酸探针用于检测包含标记序列的核酸。这种探针可用于例如定位克隆以分离与标记核苷酸序列连锁的核苷酸序列。本发明的核酸探针并不限于任何具体大小。在一些实施方案中，核酸探针的长度是至少20个核苷酸，可选地，至少50个核苷酸，或可选地，至少100个核苷酸，或可选地至少200个核苷酸。

根据待检测的标记，可使用放射自显影术、荧光显影或其他类似检测技术检测杂交探针。特异性杂交方案的实例是本领域中广泛可用的，参见例如本文所的述Berger、Sambrook以及Ausubel。

探针/引物合成方法

通常，制备包括探针、引物、分子信标、PNAs(锁定核酸)等寡核苷酸的合成方法是公知的。例如可根据Beaucage and Caruthers(1981)，Tetrahedron Letts.22(20)：1859-1862所述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用Needham-VanDevanter et al.(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-6168所述的商业可供自动化合成器，化学合成寡核苷酸。寡核苷酸，包括修饰的寡核苷酸，也可从技术人员已知的多种商业来源订购。存在许多提供寡核苷酸合成服务的供应商，因此，这是一种广泛可用的技术。任何核酸都可从任何多种商业来源订购，例如The Midland Certified ReagentCompany，The Great American Gene Company，ExpressGen Inc.，OperonTechnologies Inc.(Alameda，CA)以及其他来源。同样，PNAs可从任何多种商业来源订购，例如PeptidoGenic，HTI Bio-Products，Inc.，BMABiomedicals Ltd(U.K.)，Bio.Synthesis，Inc.以及其他来源。

电子标记检测(in silio marker detection)

在可选实施方案中，电子方法(in silio method)可用于检测感兴趣标记位点。例如，包含感兴趣标记位点的核酸的序列可存储在计算机中。使用以例如易得程序如BLAST或甚至简单的文字处理器所提供的适宜核酸检索法则可鉴定所需标记位点序列或其同源物。

用于标记检测的扩增引物

在一些优选实施方案中，使用适宜的基于PCR的检测方法检测本发明的分子标记，其中PCR扩增子的大小或序列可指示标记(例如具体标记等位基因)的缺失或存在。在这类方法中，PCR引物与位于多态标记区侧翼的保守区杂交。如本领域所用的，用于扩增分子标记的PCR引物有时称为“PCR标记”或简称“标记”。

应该理解的是，尽管本文提供了许多具体引物的实例(参见表3)，但可使用任何适宜的方法设计用于本发明的适宜引物。本发明并不限于具体的引物或引物对。例如，可使用适宜软件程序例如

设计引物。

在一些实施方案中，本发明引物是放射标记的，或任何适宜方法标记的(例如使用非放射活性荧光标签)，以在扩增反应之后快速显现不同大小的扩增子而无需任何其他标记步骤或显现步骤。在一些实施方案中，不标记引物，而根据其大小分辨率，例如根据琼脂糖凝胶电泳，显现扩增子。在一些实施方案中，按大小分辨率以溴化乙啶染色PCR扩增子，可显现不同大小的扩增子。

本发明引物并不限于产生任何具体大小的扩增子。例如，用于扩增本文标记位点和等位基因的引物不限于扩增相关位点的全部区域。引物可以产生任何合适长度的扩增子。在一些实施方案中，标记扩增产生长度为至少20个核苷酸的扩增子，或可选地，至少50个核苷酸，或可选地，至少100个核苷酸，或可选地至少200个核苷酸。

标记辅助选择和植物育种

在作物物种中开发分子标记的主要目的在于，通过标记辅助选择(MAS)有效地提高植物育种效能。遗传标记可用于鉴定在一个或多个位点上含有所需基因型，并预期将所需基因型随所需表型一起转移至它们的子代的植物。遗传标记可用于鉴定在一个位点或在多个非连锁或连锁位点含有所需基因型(例如单元型)，并预期将所需基因型随所需表型一起转移至它们的子代的植物。本发明提供了通过鉴定在这些位点例如MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826或MZA9105之一具有指定的等位基因的植物，鉴定具有对MRCV的新赋予的抗性或抗性增强，或易感性的植物，特别是玉米植物的方式。在一个实施方案中，经鉴定的抗性植物具有单元型：在MRQV_08351-173的C，在MRQV_08351-262的A，在MRQV_08351-280的G，在MRQV_08351-323的G，在MRQV_08351-369的C，在MRQV_08351-372的C。

同样，通过鉴定缺乏所需标记位点的植物，可鉴定并例如从随后的杂交中排除易感或低抗性植物。同样，这些标记位点可被基因渗入至任何所需的基因组背景、种质、植物、系、品种等，如作为设计成增加玉米产量的整体MAS育种程序的一部分。在一个实施方案中，经鉴定的易感植物具有单元型：在MRQV_08351-173的T，在MRQV_08351-262的T，在MRQV_08351-280的A，在MRQV_08351-323的C，在MRQV_08351-369的T，在MRQV_08351-372的T。

本发明也提供了可在MAS等同使用的染色体QTL区间，以选择表现出新赋予的或增强的MRCV抗性的植物。同样，QTL区间也可用于反选择易感MRCV或MRCV抗性降低的植物。绘制在QTL区间内的任何标记(包括区间的端点)可用于本发明。这些区间通过以下成对标记定义：

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umcl261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a。

通常，MAS使用经鉴定具有与抗性性状共分离显著可能性的多态标记。这些标记被假定绘制在赋予植物抗性表型的基因附近，并被认为是所需抗性的指示器，且称为QTL标记。对于QTL标记中所需等位基因的存在，检验植物。最优选标记(或标记等位基因)是与抗性性状具有最强关联的标记。

连锁分析可用于确定哪个标记等位基因表现出与抗性表型共分离的统计概率(因而，“抗性标记等位基因”)。鉴定与抗性表型共分离的标记等位基因之后，可以使用这种标记用于快速、准确地筛选抗性等位基因植物系，而无需使植物生长经过它们的生命周期并等待表型评估，而且，甚至在实际抗性QTL的分子特性还未知时，实现具体抗性等位基因的基因选择。组织样品可取自例如植物的第一叶，并经适当的分子标记筛选，快速确定哪个子代是优良的。连锁标记也可去除通常影响表型表达的环境因素的影响。

多态QTL标记位点可用于选择含有与所需抗性表型关联的标记等位基因的植物，通常称为标记辅助选择(MAS)。简而言之，在来自待选择植物的生物样品中，检测对应于标记核酸等位基因的核酸。这种检测可采取探针核酸与标记等位基因或其扩增子杂交的形式，例如适宜等位基因特异性杂交、Southern分析、northern分析、原位杂交、引物杂交之后标记区域的PCR扩增等。用于检测标记的多种程序在例如标题为“标记检 测技术”的章节中有描述。证实生物样品中存在(或缺失)具体标记等位基因之后，选择植物(例如通过选择性育种用于制备子代植物)。

玉米植物育种者需要抗性位点与高产量和其他所需性状基因的组合，以培育改良的玉米品种。通过非分子方法(例如玉米植物中的性状评估)筛选大量样品是昂贵、耗时且不可靠的。使用本文所述的多态标记，其与抗性位点遗传连锁时，可提供在育种程序中选择抗性品种的有效方法。例如，标记辅助选择在田间抗性评估的优势在于，MAS可在一年中的任何时间进行，而不管生长季节如何。而且，环境作用与标记辅助选择很不相关。

当种群在影响一个或多个性状的多个位点上分离时，例如涉及抗性的多个位点，或每个都涉及对不同抗病性的多个位点，与表型筛选相比MAS效率更高，因为所有位点可和单个DNA样品一起在实验室中评估。在这种情况中，来自单个样品或样品群中的MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105标记，以及任何染色体区间

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umcl261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a，

可同时或依次进行分析。MAS在植物育种中的另一用途是，通过回交育种帮助恢复轮回亲代基因型。回交育种是将子代与其亲代或亲代系回交的过程。通常是为将一个或几个来自供体亲代(例如包含所需抗性标记位点的亲代)的位点基因渗入至另外的来自轮回亲代的所需遗传背景(例如另外的高产玉米系)的目的进行回交。进行回交的轮数越多，轮回亲代对所得的基因渗入品种的基因贡献越大。这通常是必需的，因为抗性植物可能在其他方面是不需要的，例如由于低产量，低生殖力等。相反，经强度育种程序得到的植株可能具有极好的产量、生殖力等，仅缺乏一个所需性状例如MRCV抗性。

植物基因组中的具体遗传标记或等位基因的存在和/或缺失，例如MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105标记，以及任何染色体区间

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlgl458b和umcl261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umcl261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a；

可通过本文所述任何方法可判断。如果来自植物的核酸在所需遗传标记等位基因上是阳性，则该植物可自体受精，产生具有相同基因型的纯育种系(true breeding line)，或它可与具有相同标记或具有其他所需特性的植物杂交，产生两性有性杂交的杂交世代。

偏好等位基因的基因渗入一抗性标记有效回交至原种系

在本发明上下文中，MAS的一个应用是，使用新赋予的抗性或抗性增强的标记提高旨在将抗性QTL导入所需(通常是高产量的)背景的基因渗入或回交的效率。来自供体源的具体标记(和相关QTL)标记辅助回交至例如原种或外来遗传背景中，可在回交子代中选择供体性状然后使用与原种或外来系的重复回交以重构尽可能多的原种/外来背景基因组。

因而，可利用本发明的标记和方法指导标记辅助选择或具有与优良农艺性能(抗性，和任何其他可用产量标记等)相关的染色体片段的等位基因形式的所需成分(组)的玉米品种育种。任何公开的标记等位基因可通过传统育种经基因渗入(或经转导导入，或两者)导入玉米系中，产生具有优良农艺性能的玉米植物。可以导入或存在于本发明玉米植物中的与抗性相关的等位基因数量在1至本文公开的等位基因数量的范围内，其中每个整数都并入文本，如同明确引用。

本发明还扩展至制备子代玉米植物的方法和这些子代玉米植物本身。该方法包括第一亲代玉米植物与第二玉米植物杂交，并在植物生长条件下生长雌性玉米植物，产生玉米植物子代。使玉米植物杂交和生长的方法是本领域普通技术人员完全能实施的。可分析这些玉米植物子代与抗性相关的等位基因，从而选择所需子代。这些子代植物或种子可商业销售，用于玉米生产，用于食物，加工获得所需的玉米成分，或进一步用在后续育种轮回中。第一或第二玉米植物的至少一个是本发明的玉米植物，因为其包含至少一个本发明的等位基因形式的标记，以便子代能够继承该等位基因。

本发明的方法可用于至少一个相关玉米植物，例如来自主题玉米植物系谱的祖先或后代系，以便所需抗性等位基因的遗传可被追踪。经受本发明方法的分离玉米植物的世代数量通常从1-20，一般1-5，且经常是1、2或3个分离世代，非常普遍的是将该玉米植物的直接后代或亲代经受该方法(例如一个分离世代)。

偏好等位基因的基因渗入一并入“外来”种质同时维持育种程序进 步

在任何育种程序中，遗传多样性对长期遗传增益(genetic gain)很重要。受多样性限制，当所有偏好等位基因固定于原种种群内时，遗传增益最终平稳。一个目标是将多样性并入原种池，而不损失已经产生的遗传增益并具有尽可能最小的投资。MAS指示了来自所选择的原始祖先的哪个基因组区域和哪个偏好等位基因被选择并随时间保留，促进尝试将来自外来种质源(与原种基因池无关的亲代)的偏好变异并入，以期望能找到原种基因池中不存在的偏好等位基因。

例如本发明的标记可在涉及原种x外来玉米系的杂交中用于MAS，通过将分离子代进行MAS以与本文的抗性标记等位基因一起，维持主要产量等位基因。

定位克隆

如前所述的，本发明的分子标记位点和等位基因例如MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105标记，以及任何染色体区间

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a；

可用于鉴定抗性QTL，抗性QTL可通过建立已久的程序来克隆，例如在Ausubel、Berger以及Sambrook中所详述的。

首先通过它们与本发明标记的遗传连锁鉴定这些抗性克隆。通过在如本文中的Ausubel，Berger and Sambrook，和Clark，Ed.(1997)Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual Springer-Verlag，Berlin的参考文献中详细讨论的任意数量的方法，可实现感兴趣核酸的分离。

例如，“定位基因克隆”采用抗性标记的接近度物理定义含有抗性QTL基因的分离的染色体片段。分离的染色体片段可通过公知方法产生，如以一种或多种限制性内切酶消化染色体DNA，或在聚合酶链式反应(PCR)中扩增染色体区域，或任何适宜的可选扩增反应。通常将消化或扩增的片段连接到适宜插入的片段复制和例如表达的载体上。邻近与表型性状相关的可读框(ORF)的标记，可与DNA克隆(例如来自基因组DNA文库的克隆)杂交，因此鉴定定位有ORF(或ORF片段)的克隆。如果标记较远，可通过连续轮的筛选和分离共同包含DNA连续序列的克隆来鉴定含有ORF的片段，该过程被称为“染色体步移(chromosome walking)”，获得“重叠群(contig)”或“重叠群图谱”。足以指导技术人员进行分离与连锁标记相关的克隆的方案，见于例如本文所述的Berger、Sambrook和Ausubel中。

转基因细胞和植物的产生

本发明还涉及以对应于根据本发明鉴定的抗性QTL的核酸转化的宿主细胞和生物体。例如，这种核酸包括编码新赋予的抗性或抗性增强性状的染色体区间(例如基因组片段)、ORFs和/或cDNAs。此外，本发明提供了通过重组技术产生可提供新赋予的抗性或抗性增强的多肽。

描述克隆和操作核酸并产生编码的多肽的分子生物技术的一般文献，包括上文的Berger、Sambrook以及Ausubel。这些文献描述了诱变，载体使用，启动子和许多其他涉及例如产生含有感兴趣核酸的克隆，例如标记位点、标记探针、与标记位点分离的QTL等的相关主题。

以本发明载体(例如载体，如包含来源于或与抗性QTL相关的ORF的表达载体)将宿主细胞基因工程化(例如转导、转染、转化等)，载体可以是例如克隆载体、穿梭载体或表达载体。这些载体采用例如质粒、噬菌粒、农杆菌(Agrobacterium)、病毒、裸多核苷酸(线性或环状)，或缀合多核苷酸的形式。也可将载体导入细菌，特别是为繁殖和扩增的目的。也可通过本领域已知的多种标准方法，将这些载体导入植物组织、培养的植物细胞或植物原生质体，包括但不限于电穿孔(From et al.(1985)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 82：5824)，通过感染病毒载体例如花椰菜花叶病毒(CaMV)(Hohn et a1.(1982)Molecular Biology of Plant Tumors(AcademicPress，New York)，pp.549-560；美国专利4,407,956号)，通过在小球或颗粒基质内或在表面上带有核酸的微粒高速冲击穿透(Klein et al.(1987)Nature 327：70)，使用花粉作为载体(WO 85/01856)，或使用携带T-DNA质粒的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或生根农杆菌(A.rhizogenes)，在所述质粒中含克隆DNA片段。通过感染根瘤农杆菌将T-DNA质粒转运至植物细胞，其中一部分稳定整合至植物基因组中(Horsch et al.(1984)Science 233：496；Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803)。关于核酸导入方法的其他细节，可见于上文的Sambrook、Berger以及Ausubel。将本发明核酸导入宿主细胞的方法不是本发明的关键，本发明并不限于将外源遗传物质导入宿主细胞的任何具体方法。因此，可采用任何适宜方法，例如包括但不限于本文所提供的，可有效将核酸导入细胞或原生质体的方法，并用于本发明。

如果对于此类活性，如激活启动子或选择转化体适当可将工程宿主细胞培养于修饰的常规培养中。可将这些任选地培养至转基因植物中。除上文的Sambrook、Berger以及Ausubel之外，在Evans et al.(1983)“Protoplast Isolation and Culture”，Handbook of Plant Cell Cultures 1，124-176(MacMillan Publishing Co.)，New York；Davey(1983)“RecentDevelopments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts”，Protoplasts，pp.12-29，(Birkhauser，Basel)；Dale(1983)“Protoplast Cultureand Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops”，Protoplastspp.31-41，(Birkhauser，Basel)；Binding(1985)“Regeneration of Plants”，Plant Protoplasts，pp.21-73，(CRC Press，Boca Raton，FL)中描述了由培养的原生质体再生植物。关于植物细胞培养和再生的其他细节包括，Payneet al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems(液体系统中植 物细胞和组织培养)John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg andPhillips(eds)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods(植物细胞、组织和器官培养，基本方法)Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和Plant Molecular Biology(植物分子生物学)(1993)R.R.D.Croy，Ed.Bios Scientific Publishers，Oxford，U.K.ISBN0121983706。通常，细胞培养基还列于Atlas and Parks(eds)The Handbook of Microbiological Media(微生物培养基手册)(1993)CRCPress，Boca Raton，FL中。细胞培养的其他信息可见于商业文献，例如来自Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，MO)(“Sigma-LSRCCC”)的Life Science Research Cell Culture Catalogue(1998)和例如也是来自Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，MO)(“Sigma-PCCS”)的the Plant Culture Catalogue andsupplement(例如1997或之后)。

本发明还涉及产生以本发明核酸(例如含有本文所述标记位点和/或QTL的核酸)转导的转基因生物体，其可以是细菌、酵母、真菌、动物或植物。与细菌、单细胞真核生物和细胞培养相关技术的全面讨论，可见于本文所列的参考文献并简单总结如下。将靶核酸导入细菌细胞的几种公知方法是可用的，任意一种都可用于本发明。其包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体的融合，以含DNA的脂质体处理细胞，电穿孔，发射物轰击(生物弹道学)，碳纤维送递，和感染病毒载体(以下将进一步讨论)等。细菌细胞可用于扩增许多含有本发明DNA构建体的质粒。将细菌培养至对数期，和可通过本领域已知的多种方法分离细菌内的质粒(参见例如Sambrook)。此外，很多试剂盒是商购获得，用于从细菌纯化质粒。为了正确使用它们，遵循生产商的说明(参见例如均来自PharmaciaBiotech的EasyPrep^TM，FlexiPrep^TM；来自Stratagene的StrataClean^TM；和来自Qiagen的QIAprep^TM)。然后进一步操作分离和纯化的质粒，产生其他质粒，用于转染植物细胞或并入根瘤农杆菌相关的载体以感染植物。典型的载体含有用于调控具体靶核酸表达的转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及启动子。载体任选地包含含有至少一个独立的终止子序列的基因表达盒，允许该盒再真核生物或原核生物或两者中复制的序列(例如穿梭载体)，以及在原核和真核体系都可用的选择标记。载体适宜在原核生物、真核生物或优选两者中复制和整合。参见Giliman & Smith(1979)Gene 8：81；Roberts et al.(1987)Nature 328：731；Schneider et al.(1995)Protein Expr.Purif.6：10；Ausubel、Sambrook、Berger(都如上文)。用于克隆的细菌和细菌噬菌粒目录由如美国模式培养物保藏所(ATCC)提供，例如ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992)Gherna et al.(eds)。用于测序、克隆和分子生物学其他方面和潜在理论因素的其他基础程序，也可见于Watson et al.(1992)Recombinant DNA，Second Edition，Scientific American Books，NY。此外，本质上任何核酸(和实际上任何标记的核酸，无论是标准或非标准)都可从多个商业来源的任何来源定购或标准定制，例如the Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX)、The Great American Gene Company(Ramona，CA)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)等。

导入核酸至植物

本发明的实施方案涉及转基因植物的产生，所述转基因植物包含编码抗性基因的克隆的核酸，例如分离的ORFs和cDNAs。以核酸转化植物细胞的技术是广泛可用的，并可容易地适用于本发明。除上文的Berger、Ausubel以及Sambrook之外，可用的植物细胞克隆、培养和再生的一般参考文献包括Jones(ed)(1995)Plant Gene Transfer and Expression Protocols--Methods in Molecular Biology，Volume 49 Humana Press TowataNJ(“Jones”)；Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY(“Payne”)；和Gamborg andPhillips(eds)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)(“Gamborg”)。在Atlas and Parks(eds)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL(“Atlas”)中描述了多种细胞培养基。植物细胞培养的其他信息可见于可用的商业文献，例如来自Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，MO)(Sigma-LSRCCC)的Life Science Research Cell Culture Catalogue(1998)和，例如也来自Sigma-Aldrich，Inc.(St Louis，MO)(Sigma-PCCS)的the Plant Culture Catalogue and supplement(1997)。关于植物细胞培养的其他细节可见于Croy。

可通过多种常规技术，将本发明的核酸构建体，例如质粒、粘粒、人工染色体、DNA和RNA多核苷酸，导入在培养物或植物器官中的植物细胞。在序列表达的地方，序列任选地与转录和翻译起始调控序列结合，所述转录和翻译起始调控序列指导外源DNA序列在转化植物的既定组织中的转录或翻译。

按照本领域已知的多种技术中的任何技术，可将本发明分离的核酸导入植物中。用于转化多种高等植物物种的技术也是公知的，并在可用的技术、科技和专利文献中有广泛记载。参见例如Weising et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477。

使用例如电穿孔和植物细胞原生质体微注射技术，可将本发明的DNA构建体例如质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、裸或各种缀合DNA的多核苷酸(例如多赖氨酸缀合的DNA，肽缀合的DNA，脂质体缀合的DNA)，或人工染色体，直接导入植物细胞的基因组DNA中，或使用弹道方法(ballistic method)，例如DNA颗粒轰击，将DNA构建体直接导入植物细胞。

用于注射植物例如细胞、胚芽、愈伤组织和原生质体的微注射技术，是本领域已知的，并在科技和专利文献中描述得很清楚。例如，在Jones以及本文所述得其他参考文献和可用文献中，描述了多种方法。

例如，在Paszkowski et al.，EMBO J.3：2717(1984)描述了使用聚乙二醇沉淀导入DNA构建体。在Fromm et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824(1985)中描述了电穿孔技术。在Klein et al.，Nature 327：70-73(1987)中描述了弹道转化技术(ballistic transformation technique)。其他细节可见于上文的Jones和Gamborg和美国专利5,990,387号。

可选地，并在一些情况中优选地，使用农杆菌介导的转化产生转基因植物。农杆菌介导的转化技术包括消除和使用二元载体，也在科技文献上描述得很清楚。参见例如Horsch，et al.(1984)Science 233：496；Fraleyet al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803；以及Hansen and Chilton(1998)Curr.Top.Microbiol.Immunol.240：21和Das(1998)Subcellular Biochemistry 29：Plant Microbe Interactions，pp.343-363中的综述。

DNA构建体任选地与适宜T-DNA侧翼区组合，并被导入常规的根瘤农杆菌宿主载体中。若细胞被细菌感染，根瘤农杆菌宿主的毒力功能会指导构建体和邻近标记直接插入植物细胞DNA中。参见美国专利5591616号。尽管农杆菌主要用于双子叶植物，但某些单子叶植物也可被农杆菌转化。例如在美国专利5,550,318号描述了农杆菌转化的玉米。

转染或转化的其他方法包括(1)生根农杆菌介导的转化(参见例如Lichtenstein and Fuller(1987)In：Genetic Engineering，vol.6，PWJ Rigby，Ed.，London，Academic Press；和Lichtenstein and Draper(1985)In：DNA Cloning，Vol.II，D.M.Glover，Ed.，Oxford，IRI Press；1988年4月7日公开的WO 88/02405，描述了生根农杆菌株A4及其Ri质粒以及根瘤农杆菌载体pARC8或pARC16的用途)，(2)脂质体介导的DNA摄取(参见例如Freeman et al.(1984)Plant Cell Physiol.25：1353)，以及(3)漩涡方法(参见例如Kindle(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：1228)。

也可通过如Zhou et al.(1983)Meth.Enzymol.101：433；D.Hess(1987)Intern Rev.Cytol.107：367、Luo et al.(1988)Plant Mol.Biol.Rep.6：165所述的将DNA直接转移至花粉，将DNA导入植物。可通过如Pena et al.(1987)Nature 325：274所述的注射DNA至植物生殖器官，实现多肽编码基因的表达。也可如Neuhaus et al.(1987)Theor.Appl.Genet.75：30和Benbrook et al.(1986)in Proceedings Bio Expo Butterworth，Stoneham，Mass.，pp.27-54所述将DNA直接注射至未成熟胚和再水合干燥胚的细胞中。可作为载体的多种植物病毒是本领域已知的，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、双粒病毒组、雀麦草花叶病毒和烟草花叶病毒。

转基因植物的产生/再生

可培养由上述任意转化技术获得的转化植物细胞，以再生拥有转化基因型及其所需表型的完整植物。这种再生技术依赖于对组织培养生长基中某些植物激素的操作，通常依赖于与所需核酸共同导入的生物杀灭剂和/或除草剂标记。由培养的原生质体再生植物描述于Payne；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)；Evans et al.(1983)Protoplasts Isolation and Culture， Handbook of Plant Cell Culture pp.124-176，Macmillian PublishingCompany，New York；和Binding(1985)Regeneration of Plants，Plant Protoplasts pp.21-73，CRC Press，Boca Raton中。也可由植物愈伤组织、外植体、体细胞胚(Dandekar et al.(1989)J.Tissue Cult.Meth.12：145；McGranahan et al.(1990)Plant Cell Rep.8：512)器官或其部分实现再生。在Klee et al.(1987)Ann.Rev.Plant Phys.38：467-486中概要描述了这些再生技术。其他细节可见于上文的Payne和Jones和Weissbach and Weissbach，eds.(1988)Methods for Plant Molecular Biology(植物分子生物学方法)Academic Press，Inc.，San Diego，CA中。这种再生和生长过程包括如下步骤：选择转化细胞和嫩芽，使转化的嫩芽生根，以及使小苗在土壤中生长。这些方法适用于本发明以产生具有按本发明方法分离的QTL和其他基因的转基因植物。

此外，如Horsch et al.(1985)Science227：1229-1231所述，可实现含有本发明多核苷酸的植物的再生，并经农杆菌导入叶片外植体。在这种程序中，将转化体在存在选择剂的培养基中培养，以诱导被转化的植物物种再生嫩芽，如Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)80：4803所述。这种程序通常在两至四周内产生嫩芽，然后将这些转化嫩芽转移至适宜诱导生根的含有选择剂和预防细菌生长的抗生素的培养基中。本发明的转基因植物可以是可育或不育的。

如本发明所提供的，植物转化和提供抗病性的多肽表达并不限于玉米物种。实际上，构想在玉米中提供所需抗性的多肽，当在其他重要的农艺和园艺物种中转化和表达时，也会提供这种抗性。例如，这样的物种包括：大豆、加拿大油菜(canola)、紫花苜蓿、小麦、向日葵以及高粱。

在构建本发明重组表达盒时，该表达盒包括例如包含毒力功能的辅助质粒和包含外源DNA序列例如结构基因的质粒或病毒，任选地使用指导核酸在再生植物的任何和所有组织中表达的植物启动子片段。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域，来源于根瘤农杆菌T-DNA的1′-或2′-启动子，和来自技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区域。可选地，植物启动子可指导本发明多核苷酸在具体组织中的表达(组织特异性启动子)或可以是在更精确的环境控制下(可诱导启动子)。在发育控制下的组织特异性启动子的实例包括，仅在某些组织例如果实、种子或花中启动转录的启动子。

在植物细胞中指导转录的许多启动子中的任何启动子都是适宜的。启动子可以是组成型的或诱导型的。除上述启动子之外，在植物中运转的细菌源启动子包括，章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子和来自天然Ti质粒的其他启动子。参见Herrara-Estrella et al.(1983)Nature303：209。病毒启动子包括花椰菜花叶病毒的35S和19S RNA启动子。参见Odell etal.(1985)Nature 313：810。其他植物启动子包括Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(KTI)、SCPl、SUP、UCD3、核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亚基启动子以及菜豆蛋白启动子。也可使用来自E8基因和其他基因的启动子序列。在Deikman and Fischer(1988)EMBO J.7：3315中具体描述了E8启动子的分离和序列。许多其他启动子是目前采用的并可与外源DNA序列偶联，指导核酸的表达。

如果需要由cDNA表达多肽，则通常在编码区域的3’端具有多腺苷酸化区域。多腺苷酸化区域可来源于天然基因、多种其他植物基因或例如T-DNA。

包含来自编码表达产物的基因和本发明转基因的序列(例如启动子或编码区域)的载体，通常包括核酸子序列，即赋予植物细胞可选择或可选地可筛选表型的标记基因。例如，标记可编码生物杀灭剂耐性，特别是抗生素耐性，例如对卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的耐性，或除草剂耐性，例如氯磺隆(chlorosulforon)或膦丝菌素(在除草剂双丙氨磷(bialaphos)或Basta中的活性成分)耐性。参见例如Padgette et al.(1996)In：Herbicide-Resistant Crops(Duke，ed.)，pp53-84，CRC Lewis Publishers，Boca Raton。例如，通过将编码适宜的来自其他生物体例如微生物的除草剂代谢酶的基因改造进作物中，可赋予作物对具体除草剂的选择性。参见例如Vasil(1996)In：Herbicide-Resistant Crops(Duke，ed.)，pp85-91，CRC Lewis Publishers，Boca Raton)。

技术人员应当认识到，在将重组表达盒稳定并入转基因植物并确认可操作之后，通过有性杂交可将其导入其他植物中。根据待杂交的物种，可使用许多标准育种技术中的任何技术。在种子繁殖作物中，成熟的转基因植物可通过切段获取或组织培养技术繁殖，以产生多个相同的植物。选择所需转基因，获得新品种，并生长繁殖，用于商业用途。在种子繁殖作物中，成熟的转基因植物可以自交以产生纯合近交植物。近交植物产生含有新导入的异源核酸的种子。可培养这些种子，产生会出现所需表型的植物。由再生植物获得的部分，例如花、种子、叶片、分枝、果实等，包括于本发明中，只要这些部分含有包含本发明的分离的核酸的细胞。子代和变体，和再生植物的突变体也包括在本发明范围之内，只要这些部分包含导入的核酸序列。

可通过例如标准核酸检测方法或免疫印迹方案，对表达本发明多核苷酸的转基因或基因渗入植物进行本发明核酸传递的筛选。可测定RNA水平的表达，以鉴定和定量表达阳性的植物。可使用RNA分析的标准技术，包括使用设计成仅扩增异源或基因渗入的RNA模板的寡核苷酸引物的RT-PCR扩增分析和采用标记或连锁QTL特异性探针的溶液杂交分析。也可分析植物的蛋白表达，例如通过使用识别编码多肽的抗体的Western免疫印迹分析(Western immunoblot analysis)。此外，可分别使用异源核酸特异性多核苷酸探针和抗体，进行符合标准方案的原位杂交和免疫细胞化学，以定位转基因组织内的表达位点。通常，筛选并入核酸的多个转基因系，以鉴定和选择具有最适宜表达谱的植物。

本发明的一个实施方案是与添加的异源核酸纯合的转基因植物；例如含有两个添加的核酸序列拷贝的转基因植物，例如在同源染色体对的每条染色体的相同位点处的基因。通过使含有单个添加的异源核酸的杂合转基因植物有性交配(自体受精)，萌发一些所产生的种子，并分析获得的植物，获得纯合的转基因植物，所述获得的植物因为本发明的多核苷酸的表达相对于对照植物(例如天然非转基因植物)发生改变而产生。与亲代植物的回交和与非转基因植物的远交，可用于将异源核酸基因渗入至所选背景中(例如原种或外来玉米系)。

MRCV抗性玉米植物的方法

有经验的植物育种者可识别田间中的抗性玉米植物，并选择抗性个体或种群用于育种目的或繁殖。在本文中，植物育种者可识别“抗性”和“非抗性”，或“易感”玉米植物。

这类植物育种从业者应当理解，植物抗性是含有极端的抗性、易感性和连续的中间抗性表型的表型谱。抗性也会由于环境影响和病原体感染的严重性而变化。用可再现分析的表型评估和抗性评分方法对于寻求例如鉴定赋予抗性的基因位点、实施抗性种群的标记辅助选择，和采用基因渗入技术将抗性性状引入原种玉米系的科学家是很有价值的。

与将植物归类为“抗性”或“易感”的偶然的田间观察相反，已知为植物抗性或易感性程度评分的多种系统。这些技术可用于不同时间的不同地点，并提供近似的抗性得分，以用于表征给定植株而无论生长条件或位置。

本发明的自动检测/关联系统

在一些实施方案中，本发明包括用于检测本发明标记和/或使标记与所需表型(例如抗性)关联的自动系统。因此，典型系统可包括一组标记探针或引物，其经配置检测与对MRCV的新赋予的抗性或抗性增强相关的一个或多个标记位点的至少一个偏好等位基因。这些探针或引物经配置检测本文表格和实施例所述的标记等位基因，例如使用任何可用的等位基因检测模式，例如基于固相或液相阵列的检测，基于微流体样品的检测等。

例如，在一个实施方案中，标记位点是MZA625、MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105或其任意组合，以及任何染色体区间

(i)MZA8381和MZA18180；

(ii)MZA4305和MZA2803；

(iii)MZA15490和MZA2038；

(iv)bnlg1458b和umc1261a；

(v)bnlg1458b和umc1262a；

(vi)bnlg1327和umc1261a；以及

(viii)bnlg1327和umc1262a；或其任意组合，且探针组经配置检测位点。

典型的系统包括经配置检测由标记探针或引物组或其扩增子的一个或多个信号输出的检测器，由此鉴定等位基因的存在或缺失。多种信号检测装置都是可用的，包括光电倍增管(photo multiplier tubes)、分光光度计、CCD阵列、阵列和排列扫描仪、扫描检测器、光电器和光电二极管、显微镜台、检流扫描计、微流体核酸扩增检测器具等。检测器的准确配置将部分取决于用于检测标记等位基因的标记类型，以及用户最方便获得的设备。可使用检测荧光、磷光、放射性、pH、电荷、吸光率、发光、温度、磁性等的检测器。典型检测器的实施方案包括光(例如荧光)检测器或放射性检测器。例如，对光发射(例如荧光发射)或其他探针标记的检测可指示标记等位基因的存在或缺失。荧光检测是特别优选的，通常用于检测扩增核酸(但是，也可对扩增子实施涉及其他检测方法的上游和/或下游操作)。通常，检测器检测由探针标记发射的一个或多个标志(例如光)，其可指示标记等位基因的存在或缺失。

检测器任选地监测来自扩增反应的一个或多个信号。例如，检测器可监测对应于“实时”扩增分析结果的光学信号。

使偏好等位基因的存在或缺失与预期抗性关联的系统说明，也是本发明的一方面。例如，该说明可包括至少一个包括偏好等位基因的存在或缺失与预期新赋予的抗性或抗性增强之间关联的查询表。说明的精确形式可依据系统组成而变化，例如它们可作为系统软件而存在于系统的一个或多个集成单元(例如微处理器、计算机或计算机可读介质)中，或存在于可与检测器关联操作的一个或多个单元(例如计算机或计算机可读介质)中。如上所述，在一个典型的实施方案中，系统说明包括至少一个包括偏好等位基因的存在或缺失与预期新赋予的抗性或抗性增强之间的关联的查询表。该说明还通常包括为系统提供用户界面的说明，例如以允许用户浏览样品分析结果和将参数输入系统。

系统通常包括用于存储或传送表示或指明由本发明方法检测的等位基因的计算机可读数据的部件，例如在自动系统中。计算机可读介质包括高速缓存、主群组和存储器和/或用于存储计算机代码的其他电子数据存储部件(硬驱、软驱、存储驱动等)。表示由本发明方法检测的等位基因的数据也可以以收录在传送介质中的计算机数据信号在网络例如内部网或互联网或其组合中进行电子、光学或磁力传送。系统也可或可选地经无线、IR或其他可用传送供选方案来传送数据。

操作期间，系统通常包括待分析样品，例如植物组织或从组织分离的材料例如基因组DNA、扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA、扩增的RNA等。

本发明上下文中的短语“等位基因检测/关联系统”是指这样一个系统和过程，在该系统中，进入计算机的数据对应于计算机外部的物理客体或物理过程，例如标记等位基因，该程序在计算机内使输入信号物理转化成不同的输出信号。换而言之，输入数据例如具体标记等位基因的扩增被转化成输出数据，例如等位基因形式的染色体片段的鉴定。计算机内的过程是一组指令，或“程序”，集成系统通过它可识别阳性扩增或杂交信号并归于基因型个体样品。其他程序使个体样品的特性与表型值或标记等位基因关联，例如统计方法。此外，存在用于计算的多种C/C++程序，用于GUI界面的Delphi和/或Java程序，和用于作图或生成有关等位基因-性状关联的查询表的产能工具(例如微软Excel和/或SigmaPlot)。本发明集成系统中的其他可用软件工具包括，统计软件包例如SAS、Genstat、Matlab、Mathematica和S-Plus，和基因模型软件包例如QU-GENE。而且，其他程序语言例如Visual Basic也适宜用于本发明集成系统中。

例如，指定给从原种系之间杂交遗传下来的子代种群的抗性标记等位基因值，被记录在计算机可读介质中，由此建立了使子代种群成员的独特标识符与抗性等位基因对应的数据库。适宜用于在计算机可读取介质中记录数据的任何文件或文件夹，作为本发明上下文中的数据库，无论是定制的或商业可供的(例如来自Oracle或Sybase)，都是可接受的。关于一个或多个分子标记例如本文所述的ASH、SSR、RFLP、RAP D、AFLP、SNP、同工酶标记或其他标记的基因型数据，同样可被记录在计算机可存取数据库中。任选地，标记数据的获得可使用集成系统，其可自动将一个或多个方面分析用于测定标记基因型。在这样的系统中，对应于分子标记的基因型的输入数据是由检测器转播的，例如阵列、扫描仪、CCD或直接提交至可存取入中央处理器的计算机可读取介质中的其他检测装置。然后通过计算机装置执行编码抗性和本发明等位基因之间关联的一组系统指令(通常体现为一个或多个程序)以鉴定标记等位基因和预期的性状表型之间的关联。

通常，系统也包括用户输入装置，例如键盘、鼠标、触摸屏等(用于例如选择文件、检索数据、浏览标记信息表)，和输出装置(例如监视器、打印机)用于查看或回收统计分析结果。

因此，在一个方面，本发明提供了包含计算机或计算机可读介质的集成系统，该计算机或计算机可读介质包含具有至少一个对应于本文标记等位基因的数据组的一组文件和/或数据库。该系统也包括允许用户选择性查看一个或多个这种数据库的用户界面。此外，标准文档操作软件例如word处理软件(例如Microsoft Word^TM或Corel WordPerfect^TM)和数据库或电子表格软件(例如例如电子表格软件如微软Excel^TM、Corel QuattroPro^TM或数据库程序例如微软Access^TM或Paradox^TM)可与用户界面(例如标准操作系统如Windows、Macintosh、Unix或Linux系统的GUI)结合使用，以操作对应于等位基因或数据库其他特征的字符串。

系统任选地包括样品操作部件，例如并入机器人装置。例如，可任选地将用于将溶液(例如植物细胞提取液)从一个来源转移至目的地例如从微量滴定板至阵列基质的机器人液体控制臂，操作连接至数字计算机(或集成系统的其他计算机)。将数据输入数字计算机以控制机器人液体控制臂的高通量液体转移和任选地以控制由臂转移至固相载体的输入装置，也是集成系统的常见特征。许多这种自动机器人流体处理系统是商业可供的。例如多种自动系统可从Caliper Technologies(Hopkinton，MA)获得，其利用不同Zymate系统，通常包括例如机器人和流体处理模块。同样，用于多种实验室系统的普通

机器人，例如用于微量滴定架操作，也是商业可供的，例如从Beckman Coulter，Inc.(Fullerton，CA)获得。作为常规机器人的替代方案，用于实施流体处理和检测的微流体系统是可广泛获取的，例如从Caliper Technologies Corp.(Hopkinton，MA)和Agilent Technologies(Palo Alto，CA)。

用于本发明分子标记分析的系统可因此包括，具有一个或多个高通量液体控制软件、用于分析来自标记标签数据的图像分析软件、数据解释软件的数字计算机，可操作地连接至数字计算机的用于将溶液从一个来源转移至目的地的机器人液体控制臂，将数据输入数字计算机以控制机器人液体控制臂的高通量液体转移的输入装置(例如计算机键盘)，和任选地可操作地连接至数字计算机的图像扫描仪，其使来自与例如固体载体上的标记杂交的标记的探针的标记信号数字化。图像扫描仪与图像分析软件连接，以提供例如与排成阵列的样品核酸种群(例如包含一个或多个标记)杂交之后核酸探针标记强度的测量，其中通过数据解释软件解释探针标记强度测量值，以显示标记的探针是否与标记核酸(例如扩增标记等位基因)杂交，和杂交到什么程度。然后将由此派生的数据与样品特性关联，以确定具有具体标记或等位基因的具体基因型的植物的特性，标记或等位基因是例如促成对具有涉及农艺性能(例如新赋予的抗性或抗性增强)的偏好等位基因形式的染色体片段的玉米植物的标记辅助选择。

在本文的任何实施方案中，可通过例如数字化图像和/或在计算机中存储和分析图像，任选地对光学图像，例如由照相机或其他记录装置(例如光电二极管和数据存储装置)查看(和，任选地记录)的杂交模式，作进一步处理。多种商业可供的外围设备和软件可用于数字化、存储和分析数码视频或数码光学图像，例如使用PC(例如基于兼容DOS^TM、OS2^TM、WINDOWS^TM、WINDOWS NT^TM、WINDOWS95^TM、WINDOWS97^TM、WINDOWS 2000^TM、WINDOWS Xp^TM或WINDOWS VISTA^TM的Intelx86或Pentium芯片的机器)，基于MACINTOSH^TM、LINUX或UNIX(例如SUN^TM工作站)的计算机。

实施例

以下实施例用于示例说明，而不限制本发明。应当理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于示例目的，本领域技术人员应当认识到，只要不偏离本发明实质或所附权利要求范围，可改变多个试剂或参数。

通过两种不同的关联分析方法完成本研究：1)基于种群的结构关联分析和2)基于系谱的关联分析。通过鉴定这种遗传标记，标记辅助选择(MAS)可用于提高育种效能，用于改善玉米MRCV感染抗性。关联作图是本领域已知的，在多种来源都有描述，例如Jorde(2000)Genome Res.10：1435-1444；Remington et al.(2001)“Structure of linkage disequilibriumand phenotype associations in the maize genome，”Proc Natl Acad Sci USA98：11479-11484；Weiss and Clark(2002)Trends Genet.18：19-24；和Shu etal.(2003)“Detection Power of Random，Case-Control，和Case-Parent ControlDesigns for Association Tests and Genetic Mapping of Complex Traits”Proceedings of 15th Annual KSU Conference on Applied Statistics inAgriculture 15：191-204。

实施例1：关联作图分析

进行关联作图策略，鉴定与MRCV感染抗性相关的玉米遗传标记，MRCV是“Malde Río Cuarto”的致病剂(causative agent)。

关联作图

对基因组中连锁不平衡(LD)程度和模式的了解，是发展有效关联方法以鉴定和绘制数量性状位点(QTL)的必要条件。连锁不平衡(LD)是指在一组个体中等位基因的非随机关联。若在连锁位点上的等位基因之间观察到LD，则测量为染色体的具体区域之间的LD衰退。LD的范围反映该区域的重组历史。基因组中LD衰退的平均速度可辅助预测进行全基因组关联研究所要求的标记的数量和密度，并提供可预期的分辨率估计值。

关联或LD作图旨在鉴定显著的基因型-表型关联。已经开发出有力工具用于远交物种的精细作图，所述远交物种例如人(Corder et al.(1994)“Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onsetAlzheimer-disease，”Nat Genet 7：180-184；Hastbacka et al.(1992)“Linkagedisequilibrium mapping in isolated founder populatiohs：diastrophic dysplasiain Finland，”Nat Genet2：204-211；Kerem et al.(1989)“Identification of thecystic fibrosis gene：genetic analysis，”Science 245：1073-1080)和玉米(Remington et al.，(2001)“Structure of linkage disequilibrium and phenotypeassociatiohs in the maize genome，”Proc Natl Acad Sci USA98：11479-11484；Thornsberry et al.(2001)“Dwarf8 polymorphisms associatewith variation in flowering time，”Nat Genet 28：286-289；Flint-Garcia et al.(2003)“Structure of linkage disequilibrium in plants，”Annu Rev Plant Biol.54：357-374所做的综述)，其中杂合子之间的重组是频繁的，且造成LD的快速衰退。在纯合基因型之间的重组通常是可检测的近交物种中，LD的程度更大(即更大块的连锁标记是共同遗传的)，且大幅增强关联作图的检测力(Wall and Pritchard(2003)“Haplotype blocks and linkagedisequilibrium in the human genome，”Nat Rev Genet4：587-597)。

种群的重组和突变历史是种群交配习惯以及有效大小和年龄的函数。更大的种群大小提供了检测重组的更大可能性，而更老的种群通常与更高水平的多态性相关，而这两者都有助于LD的衰退明显加速。另一方面，更小的有效种群大小，例如最近经历了遗传瓶颈的那些，倾向于表现出更低速率的LD衰退，造成更广泛的单元型保守(Flint-Garcia et al.(2003)“Structure of linkage disequilibrium in plants，”Annu Rev Plant Biol.54：357-374)。

原种育种系为关联分析提供了重要起点。关联分析在分析中使用定量表型得分(例如将每个玉米系的疾病耐性分成1-9级)(相对于仅关注耐性与组内等位基因分布类型分析中的抗性等位基因频率分布)。从多年育种程序和大量原种系环境中收集的详细表型性能数据的有效性，为遗传标记关联作图分析提供了重要的数据组。这为研究和应用之间的无缝整合奠定了基础，并利用了历史累积数据组。但是，对多态性与重组之间关系的理解，可用于开发适当策略以从这些资源中有效提取最多信息。

这种类型的关联分析既不产生也不需要任何图谱数据，而是不依赖图谱位置。这种分析将植物表型得分与在各种位点的基因型比较。随后，任何适宜的玉米图谱(例如复合图谱)可任选地用于帮助使用之前测定的标记的图谱位置来观察经鉴定的QTL标记和/或QTL标记簇的分布。

玉米系和表型评分

根据对MRCV感染的抗性程度，对玉米系进行表型评分(相对于简单归类为“耐受”或“易感”)。分析所用的植物品种来自多种来源，包括原种种质，商业核发品种(commercially released cultivar)和其他公共品种。收集物包含475个玉米系。研究所用的品系具有较宽的的成熟度范围，从CRM(对照相对成熟度)90-CRM140，表示先锋种质的主要近交后代。

植物对MRCV感染的抗性程度差异很大，如使用从1(高度易感)至9(高度抗性)所衡量的。通常得分为2(2)表示最易感植株，得分为4(4)分指定认定植物易感或抗性的阈值(小于4，易感；4或更高为抗性)，而得分为7(5-7)指定为最抗性系。抗性得分为8(8)和9(9)专指非常罕见的、通常在现有种质中观察不到的抗性水平。如果田间中没有疾病，则不作抗性评分。但是，如果在具体田间位置确实出现疾病，则对该位置所有的系都进行评分。在多个位置和多个年份中对检验植株累积得分，最终的平均(例如共有)得分指定给每个品系。

在几个生长季节中收集了475个近交收集物的抗性得分(在生长季节的同一时间对394个近交后代进行评估)。通常在花期之后在一次评分中进行数据收集。

在耐性与标记连锁的评估中，采用了定量方法，其中评估了每种玉米的抗性得分且并入关联作图统计分析。

玉米基因分型

通过在4000-10000个基因(基因位点)上的DNA测序对一组475个玉米系进行了分析。在近交后代之间每个位点上使用SNP变异产生具体单元型。这些数据用于在基因组水平上鉴定等位基因和MRCV抗性之间的关联。

统计方法

采用标准关联作图方法进行基于结构的关联分析，其中通过使用标记数据控制种群结构。使用Pritchard等开发的基于模型的簇分析软件Structure，和880个原种玉米近交后代在二百个标记上的单元型数据，估算混合系数，并将近交后代分配至七个亚种群(J.K.Pritchard，M.Stephensand P J.Donnelly(2000)“Inference of population structure using multilocusgenotype dara，”Genetics155：945-959)。这降低了由于种群结构对关联作图统计的影响而产生的假阳性的发生。使用检验两个分配是否相同的Kuiper统计检验在给定亚种群中单元型和表型之间的给定标记关联(W.H.Press，S.A.Teukolsky，W.T.Vetterling，B.P.Flannery，2002；NumericalRecipes in C，second edition，Cambridge University Press，NY)。

使用由Shu等(Guoping Shu，Beiyan Zeng，and Oscar Smith，2003；Detection Power of Random，Case-Control，and Case-Parent Control Designsfor Association Tests and Genetic Mapping of Complex Traits.Proceedingsof 15th Annual KSU Conference on Applied Statistics in Agriculture.15：191-204)开发的GPA，进行基于系谱的关联作图。GPA程序是以SAS计算机语言第9.0版(2001，SAS Institute，Cary，North Carolina)执行的基于条件可能性的作图软件。

结果

表1和2提供了使用关联作图方法证实与MRCV表型连锁不平衡的玉米标记列表，这些标记在分离种群上得到验证。表1和2也表明了标记所在的染色体和它们相对于已知标记的大概图谱位置，以cM表示，并以已知在染色体开始端的第一个标记(离着丝粒最远端)的位置为0。这些图谱位置不是绝对的，表示估计的图谱位置。表6和7提供了对SNP标记分型所用的引物和探针序列。

标记等位基因和疾病耐性表型是独立分离的统计概率，反映在表1和2中的关联作图调整概率值中，其是来自于基因型和表型之间关联分析的概率(P)。概率值越低，在位点上的标记基因型和MRCV感染耐性表型之间的关联越显著。

对命名为SS组的非结构关联分析表明，在染色体2的由标记MZA2038(p＝0.00000266)和MZA11826(p＝0.00000179)表示的位置65.99和由标记MZA11806(p＝0.000002)和MZA14212(p＝0.00000327)表示的位置127.18-131.13上的两个概率峰值的存在。非结构分析还表明，基因组上的几个其他关联。由独立方法验证的唯一一致关联，对应于染色体2的位置65.99。非结构分析增强了评估靶区域全体等位基因可变性的能力，但同时增强了假阳性关联的数量，因为种群结构不是由该分析校准的。

图1A显示了一组阿根廷近交后代(用于阿根廷育种程序的近交后代靶标)的结构关联分析，其中在位置65.99-85.84区域上的几个标记的显著性在0.0005p水平，包括MZA16656(P＝0.000194)，MZA18224(p＝0.000066)和MZA5057(p＝0.000045)。图1B显示了SS组的结构关联分析，其中在染色体2短臂上，最相关的标记是位置54.62的MZA1525(p＝0.00043)和位置65.99的MZA11826(p＝0.00168)。在由标记MZA13812表示的位置91.19(p＝0.000299)和由标记MZA10682表示的位置154.06(p＝0.000024)上观察到两个其他关联。

图1C显示了具有不同组表型数据的SS组的结构关联分析。染色体2短臂上的最相关标记是在位置53.83的MZA12899(p＝0.000298)。在染色体2长臂上存在其他关联标记，其中最相关标记是MZA1067(图谱位置：141.9；p＝0.000094)和MZA10832(图谱位置：159.8；p＝0.000086)。

实施例2：QTL区间作图和单标记回归分析

进行QTL区间作图和单标记回归分析(single marker regressionanalysis)，以(分别)鉴定与抗性相关并实现玉米对MRCV感染的植物抗性的玉米染色体区间和遗传标记。QTL作图和标记回归是广泛应用的鉴定与所需表型共分离的基因位点的方法。通过鉴定这些基因位点，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米近交后代和杂种。

玉米系

由近交后代PH7WT(抗性基因型)及PH3DT(高度易感基因型)和PH9TJ(抗性基因型)及PH890(易感基因型)的杂交，产生了MRCV抗性的两个主要作图种群。PH7WTxPH3DT种群由120个F5/F7家族组成而PH9TJxPH890由212个BC2F4/BC2F5家族组成。

表型评分

每个系的表型评分是基于在两个(PH890xPH9TJ杂交)或三个不同作物季节(PH7WTxPH3DT)中从田间收集的表型数据组。

玉米基因分型

使用总共246个多态和优质标记，对玉米PH7WTxPH3DT的F5子代进行基因分型，并以167个多态和优质标记，对PH890xPH9TJ的BC2F4子代进行基因分型。第一轮基因分型包括SSR标记。对F7PH7WTxPH3DT子代用一组101个多态和优质标记进行第二轮基因分型。通过使用在具体基因组区域上的一组标记，对PH890xPH9TJ种群实施第二轮基因分型。

在标记回归分析和QTL区间作图中都使用Windows QTLCartographer(根据QTL作图的日期使用该软件的最新版本)。按照标准QTL作图程序，在基因组间估计LOD得分(优势比的对数)。术语“优势可能性(likelihood of odds)”用于描述性状变异来源的两种或多种解释的相对概率。这些两种不同解释(模型)的概率是可以计算的，并是所选的最可能的模型。如果模型A比模型B更可能1000倍，则优势比值是1000∶1而优势比的对数是3。

个体复制和年份以及平均得分的原始数据都用于QTL区间作图。LOD阈值是2.5。为每个QTL估算置信区间。然后将获得的位置绘制成重叠区间作图图形的柱状图。

结果

QTL区间作图

本研究鉴定了与QTL相关的多个染色体区间，且所述QTL与MRCV感染的抗性/易感性关联。使用田间数据鉴定QTL。一个主要、显著的QTL位于两个作图杂交种的连锁群2上(参见图12-14，也可参见表13，其显示了对PH890xPH9TJ杂交的QTL标记回归分析)。

在连锁群5上的位置150-160鉴定了第二个QTL(PH890xPH9TJ种群)而另一个在连锁群5上的位置200-220(PH7WTxPH3DT种群)。第三个QTL绘制于染色体2的位置165-1850的PH7WTxPH3DT上。

单标记回归

使用单标记回归，如表1和2所示，有多个标记都表现出在P＝0.05或更高置信水平上与抗性表型关联。在标记回归分析中鉴定的一些标记表现出关观察结果与关联作图一致，其中以不同方法鉴定相同标记。例如，在染色体2的55-70cM区域存在由标记回归和关联作图所鉴定的标记。

讨论/结论

本研究鉴定了与MRCV抗性相关的染色体区间和单个标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。

实施例3：通过标记辅助选择的QTL验证

进行QTL区间作图和单标记回归分析，以(分别)鉴定与抗性相关并实现对MRCV感染的抗性的玉米染色体区间和遗传标记。QTL作图和标记回归是广泛应用的鉴定与所需表型共分离的基因位点的方法。通过鉴定这些基因位点，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米近交后代和杂种。

玉米系

由近交后代PH7WT和PH3DT的杂交产生用于MRCV抗性验证和作图的一主要种群。生成其他种群以验证该QTL在背景中的作用。PH7WTxPH3DT种群由82个通过绘制在染色体2上的QTL标记基因渗入至PH3DT生成的BC2F3家族组成。存在由标记辅助选择生成的4个其他BC1F3种群，其由来自PH6KWxPH7WT杂交的24个BC1F3、来自PH6B8xPH7WT杂交的12个BC1F3、来自PHP3P1xPH7WT杂交的3个BC1F3和来自PH6GFxPH7WT杂交的6个BC1F3组成。这些种群通过具体BC3或BC1植物自交生成并衍生在QTL区域具有等位基因变异的BC3F3或BC1F3而产生。

表型评分

每个BC1F3，BC3F3和亲代的表型评分是基于在一个作物季节中从田间收集的表型数据组。

玉米基因分型

采用在QTL区域的多态SNP，对来自不同杂交的玉米BC1F3子代和来自PH7WTxPH3DT杂交的BC3F3进行基因分型。在BC3阶段对BC3F3进行背景清洗，特别是在染色体5QTL。标记包括SNP标记。

在标记回归分析和QTL区间作图中都使用Windows QTLCartographer(根据QTL作图的日期使用最新版本)。按照标准QTL作图程序在基因组上估计LOD分(优势比的对数)。

个体复制和平均得分的原始数据都用于QTL作图。LOD阈值是2.5。为每个QTL估算置信区间。然后将获得的位置绘制成重叠区间作图图形的柱状图。

因为由标记辅助选择生成这些种群(重组的非随机事件)，因而标记回归分析被认为与区间作图分析一样有效。

结果

QTL区间作图

本研究鉴定了与QTL相关的单个染色体区间，且所述QTL与对MRCV感染的抗性/易感性相关。使用田间数据鉴定QTL。一个主要显著的QTL位于主要验证BC3F3种群的连锁群2上。在其他BC1F3子代检查时，主要验证种群的这个QTL上的主要标记证实该QTL对于MRCV感染的抗性/易感性的作用。

单标记回归

使用单标记回归，如表1和2所示，存在多个标记，其在P＝0.05或更高置信水平上都表现出与抗性表型关联。在标记回归分析中鉴定的一些标记表现出观察结果与关联作图一致，其中不同方法鉴定相同标记。例如，在染色体2的55-70cM区域存在标记回归和关联作图所鉴定的标记。对于PH3DTxPH7WT杂交，参见图2的区间作图和表14的标记回归分析。注意复制＃3受除草剂应激的作用。MRCVSC＝MRCV表型得分。Inc.Sev.Symp.＝在每个实验单元中具有严重症状的植物的频率。

通过来自在MRCV1区域具有等位基因变异的BC1F3子代的表型数据，评估了MRCV1等位基因变异对几个背景的作用。MRCV1抗性等位基因显示了在其他4个遗传背景中的正作用(PH6GF、PHP3P1、PH6B8和PH6KW近交后代)。下表15显示了在MRCV1区域具有等位基因变异的BC1F3子代的平均表型得分。

表15

标记位置65.99	近交后代
						PH6GF	PHP3P1	PH6B8	PH6KW
近交分	3.8	2.5	3	3
					BC1F3易感等位基因(AA)	5.00	4.10	4.50	4.19
BC1F3杂合等位基因(AB)	-	3.53	5.17	4.26
					BC1F3抗性等位基因(BB)	6.11	6.17	5.47	5.00
QTL作用	1.11	2.07	0.97	0.81

讨论/结论

本研究鉴定了与MRCV抗性相关的染色体区间和单个标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。

实施例4：对DH近交系群的QTL验证

进行QTL标记回归分析，以(分别)鉴定与抗性相关并实现对MRCV感染的抗性的玉米染色体区间和遗传标记。QTL作图和标记回归是广泛应用的鉴定与所需表型共分离的基因位点的方法。通过鉴定这些基因位点，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米近交后代和杂种。

玉米系

标记增强型系谱选择(marker enhanced pedigree selection，MEPS)种群是育种种群示意图，MRCV抗性种群由不同近交后代的杂交形成。杂交包括：a)具有固定MRCV1的杂交：PHKEFxPHBNA、PHKEFxPHS2G、PHKFDxPHS3J、PHKFAxPHBNA、PHKFAxPHKEF、PHS2YxPHKEF，和b)具有分离MRCV1的杂交：PH3DTxPHKEF、PHKEFxPH9PR、PHKEFxPH9PR、PHKEFxPHKDK、PHKDNxPHKFD、PHKDNxPHS3J、PHKFDxPHC0G、PHKDKxPHKFA、PHKDNxPH9PH。

表16

种群	＃Ind	MRCV1
			PHKEF/PHBNA	9	固定
PHKEF/PHS2G	13	固定
			PHKFD/PHS3J	12	固定
PHKFA/PHBNA	12	固定
			PHKFA/PHKEF	34	固定
PHS2Y/PHKEF	12	固定
			PH3DT/PHKEF	11	分离
PHKEF/PH9PR	12	分离
			PHKEF/PHKDK	18	分离
PHKDN/PHKFD	30	分离
			PHKDN/PHS3J	11	分离
PHKFD/PHC0G	9	分离
			PHKDK/PHKFA	15	分离
PHKDN/PH9PH	8	分离

通过重双单倍体过程生成这些种群。表16中包括一定数量的具有MRCV抗性特征的个体。使用在主要QTL区域的指纹数据和血统同一性信息以确定QTL分离和QTL固定的种群。

表型评分

每个DH MEPS种群的表型评分是基于在一个作物季节中从田间收集的表型数据组。

玉米基因分型

使用分布在玉米基因组中的一组756个SNP，对来自不同杂交的玉米DH子代进行基因分型。然后将获得的位置绘制成与区间作图图形重叠的柱状图。

结果

QTL区间作图

若来自SS杂交抗性x易感(Resistant x Susceptible)并在染色体2上的MRCV主要QTL分离被选择为“先验(priori)”2时，本研究鉴定了与QTL相关的单个主要染色体区间，所述QTL与对MRCV感染的抗性/易感性相关，。使用田间数据鉴定QTL。一个主要显著的QTL位于连锁群2上。在染色体2上含有主要QTL的阳性等位基因(由亲代固定QTL)的近交后代之间的遗传杂交显示了大部分子代具有4或更高的田间MRCV得分。

单标记回归

使用单标记回归，如表1和2所示，有多个标记在P＝0.05或更高置信水平上表现出与抗性表型关联。在标记回归分析中鉴定的一些标记表现出观察结果与关联作图一致，其中不同方法鉴定相同标记。例如，在染色体2的55-70cM区域存在由标记回归和关联作图鉴定的标记。在一组SS近交后代中，主要关联位于MZA10538标记(位置54.5)上。在一组NSS近交后代中，主要关联位于72cM的位置。

讨论/结论

本研究鉴定了与MRCV抗性关联的染色体区间和单个标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。

实施例5：主要的近交后代表征

对一组关键阿根廷遗传材料进行表型和基因型表征，以验证与MRCV抗性相关的玉米遗传标记位点。通过鉴定这些遗传标记，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米的MRCV抗性。

玉米系和抗性评分

分析所用的植物品种来自于多种来源，包括原种种质、商业核发品种和代表宽范围的与阿根廷育种程序相关的种质并包括MRCV抗性的主要来源的其他公共系。

根据对MRCV感染的表型反应，对玉米系分组，进行分析，其中植物被划分为高度易感或高度抗性品种。抗性和易感的归类仅基于在几年的田间检验中对偶尔且天然发生疾病的发病率的观察结果。植物对MRCV感染的抗性程度差异很大，如使用从1(高度易感)至9(高度耐受)的等级所衡量的。通常得分为2(2)表示最易感植株，得分为4(4)被指定为认定植物易感或抗性的阈值(小于4，易感；4或更高为抗性)而得分为7(5-7)指定为最抗性品系。抗性得分为8(8)和9(9)专指非常罕见的通常在现有种质中观察不到的抗性水平。如果田间中没有疾病，则不作抗性评分。但是，如果在具体田间位置确实出现疾病，则对该位置所有系都进行评分。在多个位置和多个年份中对检验植株累积得分，最终的平均得分(例如共有)被分配给每个系。

通常，在一次评分时间中完成数据收集。评分时间在花期之后。

评估抗性与标记的关联中，使用了单回归方法的对比。通过血统同一性方式检查等位基因起源。使用这种方法，这些被认定为代表抗性或易感类别的玉米系被用于评估关联。构建了抗性系列表，其中具有4或更高的抗性得分的近交后代被认定为“抗性”。同样，具有3或更低分的玉米系都被认定为易感。仅使用可被确定置入两个组中的系。一旦一个系被归入“抗性”或“易感”组，其作为该组的等同物被处理。实际定量分级也用于关联检验。除该检验之外，血统同一性信息也用于证实在最相关标记中抗性等位基因的起源。

在研究中，鉴定了在表型谱中认为是抗性的85个玉米系；这些植物形成“抗性”组。此外，鉴定了被判断为易感MRCV的35个玉米系；这植株形成“易感”组。

玉米基因分型

使用本领域公知的技术，用跨越染色体2的QTL区域的一组63个SNP标记对每个耐受和易感系进行基因分型。基因分型方案由收集嫩叶组织并从每个近交的混合组织中分离基因组DNA组成。通过如Maroof etal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：8014-8018所述的CTAB方法，提取玉米基因组DNA。

将分离的基因组DNA用在使用对涵盖QTL区域的大量标记具有特异性的扩增引物的PCR反应中。使用ASH方案对SNP型标记进行基因分型。

基本的逻辑是，在抗性和易感组之间具有明显不同等位基因分布(即非随机分布)的标记，可能与性状相关，并出于标记辅助选择具有之前未表征或表征的MRCV抗性或易感性的玉米系的目的，可用来对它们进行分离。本分析检测了一次检查一个标记并测定了在抗性组内部的等位基因分布是否明显不同于易感组内的等位基因分布。该分析将植物表型得分与靶位点基因型进行了比较。

结果

表1和2列举了表现出与MRCV抗性/易感性表型连锁不平衡的玉米标记。这些表也表明，标记所在位置和它们相对于已知标记的大概图谱位置，以cM表示，并以已知在染色体开始端的第一个标记(离着丝粒最远端)的位置为0。这些图谱位置不是绝对的，表示估计的图谱位置。标记等位基因和耐性表型独立分离的统计概率反应在调整概率值中。

表6和7提供了这些标记位点定型所用的PCR引物序列。

抗性和易感植物组之间的等位基因在表1和2的各种标记位点的非随机分布很好地证明了，影响MRCV抗性的QTL与这些标记位点连锁。考虑到大部分该组的近交后代对应于具体育种程序(阿根廷育种程序)，可以预期的是，申请人已发现与在该基因的侧翼区域的其他标记连锁不平衡。最相关的标记对应于之前认为的优选标记。

如本领域公知的，靶标记与感兴趣性状的关联水平，可通过在具体组遗传材料中靶区域的连锁不平衡水平来测定。下表17显示了SNP标记的基因型数据和对MRCV的反应之间靶区域的关联水平。

表17

染色体	位置	标记	b0	b1	F(1，n-2)	pr(F)	MRCV性状
								2	64.05	MZA625-29-A	1.612	-0.322	95.712	0	****
2	64.05	MZA625-30-A	1.602	-0.326	92.373	0	****
								2	65.99	MZA16656-8-A	1.613	-0.255	44.107	0	****
2	65.99	MZA16656-19-A	1.571	-0.344	105.781	0	****
								2	65.99	MZA15490-137-A	1.724	-0.189	23.834	0	****
2	65.99	MZA15490-138-A	1.731	-0.179	20.667	0	****
								2	65.99	MZA15490-801-A	1.727	-0.172	19.222	0	****
2	65.99	MZA2038-71-A	1.702	-0.045	1.095	0.298
								2	65.99	MZA2038-76-A	1.691	-0.063	1.987	0.161
2	65.99	MZA11826-801-A	1.673	-0.098	4.614	0.034	*
								2	65.99	MZA11826-27-A	1.681	-0.092	4.315	0.04	*
2	65.99	MZA11826-803-A	1.673	-0.113	6.286	0.014	*
								2	65.44	MZA9105-8-A	1.576	-0.226	22.461	0	****
2	65.44	MZA9105-6-A	1.681	-0.081	3.452	0.066

为评估在杂交水平上该QTL的等位基因变异的作用，根据来自亲代系的一个(QTL杂合的)或两个抗性等位基因(QTL纯合的)的存在，表征一组371个杂种(异源遗传背景)。在杂种组合中，观察到在主要QTL的抗性等位基因的正作用和加成作用；未观察到母体作用。下表18显示了在主要QTL具有不同基因型的杂种的田间性能。

表18

在主要QTL处的杂交基因型	杂种数量	MRCVSC	类别
				AA，纯合易感等位基因	65	3.8	易感
BA，杂合，雌性抗性等位基因	121	4.41	抗性

AB，杂合，雄性抗性等位基因	96	4.46	抗性
				BB，纯合抗性等位基因	89	4.76	抗性

讨论

存在多种方式使用本分析提供的信息发展改良的玉米品种。一种应用是使用相关标记(或更基于更高概率截断值)作为具体种群作图QTL的候选者，该种群对于具有MRCV感染耐性的植物而言是分离的。在该应用中，在分离种群中继续进行常规QTL作图，但关注与MRCV感染耐性相关的标记，以替代使用跨越整个基因组的标记。通过大幅降低项目所涉及的实验室资源，使得作图努力具有更高性价比。例如，替代用跨越整个基因组的一大组标记筛选分离种群，仅用在等位基因关联研究中满足一定统计截断的那几个标记筛选。这不仅会降低作图成本还可清除在大组标记中不可避免会出现的假性。在任何给定杂交中，可能仅有一小组关联标记实际上是与对MRCV感染的耐性相关。一旦在任何耐受亲代中鉴定了几个相关标记，以后的标记辅助选择(MAS)努力就可仅关注对耐性来源至关重要的那些标记。通过经MAS预选择具有与耐性相关的等位基因的系，可清除非期望的易感系，并将昂贵的田间检验资源集中于具有更高的抗MRCV感染概率的品系。

实施例6：对F3育种种群的QTL评估

标记关联是广泛使用的鉴定与所需表型共分离的基因位点的方法。通过鉴定这些基因位点，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米近交后代和杂种。

玉米系

旧的育种方案是以使F1杂交并衍生出几个自交世代(F2、F3、F4等)的基于传统系谱的方法为基础的。为了在具体阿根廷育种材料组中检验在主要QTL上的阳性和阴性等位基因对MRCV抗性的重要性，步骤如下：a)选择预期其抗性是基于主要MRCV1的抗性亲代；b)选择源于多个育种杂交的总计2372个F3家族；c)制成两组F3族，第一组，基于不具有主要QTL阳性等位基因的亲代之间的杂交，第二组具有双方亲代都在主要QTL上含有阳性等位基因。使用在主要QTL区域的指纹数据和血统同一性信息以确定QTL分离和QTL固定种群(阳性/阴性)。MZA16656和/或侧翼标记是确定MRCV1阳性等位基因存在的关键标记。

位于这些组中的总个体数量是2372。使用在主要QTL区域的指纹数据和血统同一性信息以确定QTL分离和QTL固定种群。

表型评分

每个F3种群的表型评分是基于在一个作物季节中从田间收集的表型数据组。

玉米基因分型

个体F3族不进行基因分型。根据亲代双方的具体等位基因估计每个F3个体在主要QTL的基因型。如果具体F3种群中亲代双方在MRCV1含有阳性等位基因，则来自该杂交的所有子代都被认为具有阳性等位基因。如果具体F3种群中亲代双方在MRCV1含有阴性等位基因，则来自该杂交的所有子代都被认为具有阴性等位基因。将标准软件用于标记ANOVA分析。

结果

QTL标记分析

本研究支持以下结论：当“先验”选择来自在染色体2上的MRCV主要QTL固定的的杂交的种群时，主要染色体区间与QTL相关，该QTL与对MRCV感染的抗性/易感性相关。

单标记ANOVA

使用单标记ANOVA，如表1和2所示，有许多标记都在P＝0.05或更高置信水平上表现出与耐性表型关联。在标记ANOVA分析中鉴定的一些标记表现出观察结果与关联作图的一致，其中不同方法鉴定相同标记。例如，在染色体2的55-70cM区域存在由标记回归和关联作图都鉴定出的标记。

讨论/结论

本研究已鉴定了与MRCV抗性相关的染色体区间和单个标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。在该实施例中，申请人评估了对在MRCV1上等位基因变异的MRCV抗性的作用，在该等位基因变异和在大量F3子代的预期表型之间存在清楚的关联。

下表19显示了模型的F检验，其中来源(Source)是QTL，并考虑两个水平的来源：水平AA：在靶区域(位置65.99或由侧翼标记推断)具有固定的易感等位基因的F3种群，和水平BB：在靶区域(位置65.99或由侧翼的标记推断)具有固定的抗性等位基因的F3种群。

表19

S＝1.094；R-Sq＝36.87％；R-Sq(adj)＝36.84％

参照符：

DF：自由度；SS：平方和；MS：方差；F：F值；P：概率值。

下表20显示了平均检验，其中水平AA和水平BB代表靶QTL上的等位基因变异并符合表19所包括的模型。水平AA表型均值是3.42(MRCV易感类别)而水平BB表型均值是5.138(MRCV抗性类别)。

表20

混合StDev＝1.094

参照符：

N：F3族数量；Mean：每个水平的表型均值；StDev：标准差。

实施例7：高分辨率遗传作图和近-等基因系(near-isogenic line)

通过纯合重组植物的子代检验，进行高分辨率遗传作图，用于MRCV抗性基因的高分辨率定位。进行QTL区间作图和单标记回归分析，以(分别)鉴定与抗性相关并增强对MRCV感染的抗性的玉米染色体区间和遗传标记。QTL作图和标记回归是广泛应用的鉴定与所需表型共分离的基因位点的方法。通过鉴定这些基因位点，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米近交后代和杂种。

玉米系

用于MRCV高分辨率遗传作图的一个主要种群是由近交后代PH7WT和PH3DT的杂交产生的。另一用于在独立来源中精细作图的种群是由近交后代PH9TJ和PH890的杂交产生的。PH7WTxPH3DT种群由256个BC5F3家族组成，该家族由自交和从在染色体2的50-80cM区域含有杂合片段的总共3000个BC5植物中固定所选的重组BC5植物产生。该策略允许整个QTL区域的重组体的覆盖(表7和8，和图4A和图4B)。PH9TJxPH890种群由245个BC3F3家族组成，其由以下生成：a)将所选的在染色体2和5的主要QTL是纯合的BC2F4植物与PH890(易感亲代)杂交；b)产生两个自交世代以促进固定的BC3F3家族。

表21显示了由杂交PH3DTxPH7WT产生的BC5F3重组数量。也包括每个标记区间的预期Kb大小。表22显示了由杂交PH3DTxPH7WT产生的BC5F3重组数量。包括与基因含量的第一估计值的比较。

由标记辅助选择从PH7WTxPH3DT杂交生成，在优选的标记(MZA16656、MZA15451、MZA15490、MZA2038、MZA11826和MZA9105)区域含有等位基因变异的BC5F3近-等基因系(NIL)。该NIL是由PH7WT的QTL区基因渗入至PH3DT，清洗遗传背景，并在优选标记区选择具体重组体而产生的。通过使在优选标记区含有杂合片段的个体BC5F2植物的自交，衍生出阴性或阳性近-等基因系，而QTL被认为是单个孟德尔因子。

表型评分

来自PH7WTxPH3DT杂交的每个BC5F3家族和来自PH9TJxPH890杂交和亲代的245个BC3F3家族的表型评分，是基于在一个作物季节中从田间(在自然感染下的田间试验，科尔多瓦省(Córdoba Province)，阿根廷)收集的表型数据组。

除表型评分之外，在优选标记区的具体等基因系由在阿根廷布宜诺斯艾利斯进行的病毒ELISA检验表征。

玉米基因分型

使用在染色体2QTL区域上的多态SNP，对来自PH7WTxPH3DT杂交的玉米BC5F3子代和来自PH9TJxPH890杂交的BC3F3进行基因分型(参见实施例2)。此外，设计了两个CAPS标记以用于对BC5F3子代的基因分型；将这两个CAPS标记定位于区间MZA9105-MZA18224。如果是PH9TJxPH890杂交，其他标记位于染色体5的QTL上。在BC3阶段对来自PH7WTxPH3DT杂交的BC5F3进行背景清洗，特别是在染色体5QTL。在BC2阶段对来自PH9TJxPH890杂交的BC3F3进行背景清洗。

在标记回归分析和QTL区间作图中都使用Windows QTLCartographer(根据QTL作图的日期使用最新版本)。按照标准QTL作图程序，在靶区域上估计LOD得分(优势比的对数)。

将平均得分用于QTL区间作图。LOD阈值是2.5。为每个QTL估算置信区间。然后将获得的位置绘制成与区间作图图形重叠的柱状图。

因为由标记辅助选择产生这些种群(重组的非随机事件)，因而标记回归分析被认为与区间作图分析一样有效。

结果

QTL区间作图

本研究鉴定了与QTL相关的单个染色体区间，且所述QTL与对MRCV感染的抗性/易感性相关。使用田间数据鉴定QTL。一个主要显著的QTL位于来自PH7WTxPH3DT和PH9TJxPH890杂交的高分辨率作图种群的“优选标记”位置上的连锁群2。来自PH9TJxPH890杂交的染色体5上的其他QTL在本分析中不明显。

单标记回归

使用单标记回归，如表23和24所示，有多个标记都在P＝0.05或更高置信水平上表现出与抗性表型关联。在标记回归分析中鉴定的一些标记显示了靶QTL的高分辨率基因位置，这与优选的标记的位置一致。参见表23为标记回归分析(MRCVSC＝MRCV表型分)和图5为PH7WTxPH3DT杂交的区间作图。对于PH9TJxPH890杂交在染色体2和5的具体QTL上的QTL标记回归(MRCVSC＝MRCV表型得分)参见表24，和对于PH7WTxPH3DT杂交的区间作图，参见图6。

表23

标记	位置	b0	b1	F(1，n-2)	pr(F)	MRCVSC
							MZA1525-98-A	54.62	3.423	-0.330	9.144	0.003	**
MZA8381-801-A	63.47	3.337	-0.429	15.852	0	***
							MZA625-29-A	64.05	3.362	-0.422	16.218	0	***
MZA16656-19-A	65.99	3.300	-0.589	38.934	0	****
							MZA15490-137-A	65.99	3.331	-0.597	42.193	0	****
MZA2038-71-A	65.99	3.377	-0.628	51.838	0	****
							MZA11826-801-A	65.99	3.377	-0.628	51.838	0	****
MZA9105-8-A	65.44	3.377	-0.628	51.838	0	****
							AC208537_003		3.448	-0.257	5.276	0.025	*
AC197085_003		3.472	-0.135	1.331	0.253
							MZA18224-801-A	68.80	3.403	0.095	0.595	0.443

表24

近等基因系

在优选的标记区含有等位基因变异的近等基因系，在对科尔多瓦省的疾病的反应上表现出显著差异(图7A和图7B)。表25显示了近等基因系在优选的标记区上的SNP基因型(阴性等基因系＝易感单元型；阳性等基因系＝抗性单元型)；基因渗入的片段是由MZA16656-19-A至MZA9105-8-A的标记处的SNP多态所代表，而侧翼单态标记MZA625-30-A和MZA18224-801-A代表在两个近等基因系上的易感单元型。病毒的ELISA检验(来自布宜诺斯艾利斯省的样品)显示了在含有抗性等位基因的等基因系中0％的植物是病毒阳性，而在含有易感性等位基因的等基因系中，38％的植物是病毒阳性。

注意：不对种植在科尔多瓦省的材料实施ELISA检验(其疾病压力高于布宜诺斯艾利斯省)。但是，在科尔多瓦省的抗性和易感材料中都存在突起(斐济病毒的具体症状)表明了植物中存在病毒。

讨论/结论

本研究鉴定了与MRCV抗性关联的染色体区间和个体标记。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。高分辨率基因定位促进了靶QTL的克隆。

实施例8：基因定位、测序和候选基因

整合优选标记区的测序、基因和物理信息，以表征靶区域。来自独立方法的信息(重组数据、关联分析和保守片段)用于鉴定生成其他测序数据的具体区间。

玉米系和表型评分

根据对MRCV感染的抗性程度，对玉米系进行表型评分(相对于简单归类为“耐受”或“易感”)。分析所用的植物品种来自于多种来源，包括原种种质、商业核发品种和其他公共品种。收集物包含883种玉米系。研究所用的系具有从CRM(对照相对成熟度)90-CRM140的较宽成熟度范围，表示先锋种质的主要近交后代。

植物对MRCV感染的抗性程度差异很大，如使用从1(高度易感)至9(高度抗性)等级所衡量的。通常得分为2(2)表示最易感植株，得分为4(4)被指定为认定植物易感或抗性的阈值(小于4，易感；4或更高为抗性)而得分为7(5-7)指定为最抗性系。抗性分值8(8)和9(9)专指非常罕见的通常在现有种质中观察不到的抗性水平。如果田间中没有疾病，则不作抗性评分。但是，如果在具体田间位置确实出现疾病，则对该位置所有系都进行评分。在多个位置和多个年份中对检验植株累积评分，最终的平均分(例如共有)指定为每个品系的分值。

在几个生长季节中收集了883个近交收集物的部分抗性得分(在生长季节的同一时间对394个近交后代进行评估)。通常在花期之后在一次评分中进行数据收集。

玉米基因分型

通过在4000-10000个基因(基因位点)上的DNA测序，对一组883个玉米系进行分析。在每个位点的近交后代之间，使用SNP变异产生具体单元型。这些数据用于在基因组水平上鉴定等位基因和MRCV抗性之间的关联。

玉米系谱-抗性来源

使用先锋系谱数据库理解近交后代和单元型之间的关系。这个数据库含有1919以来的先锋近交后代之间的系谱关系。对于公共近交后代，并入有关系谱和起源的公共信息，以理解近交系和单元型的关系。通过使用系谱、表型和基因型数据，产生表示在先锋种质(包括公共系)中对MRCV的抗性和易感性来源的关键创立者列表。大部分易感近交后代可追溯至来自美国种质(公共系如B37、B73、B14、OH07、C103，和先锋近交后代165和938)的一组具体单元型；一个例外是来自热带种质的PH26N。

基因定位

标记MZA15490和MZA2038之间的区间(图8)被认定为是研究抗性基因区域上的等位基因多样性的候选区。通过使用来做以下的信息选择这个区域：

a)重组体。重组体的定位如实施例7所示。MZA16656至MZA15490区间的两个重组体和MZA15490至MZA2038区间的一个重组体的表型数据，用于对基因位置的左侧定界。在重组种群中，在MZA2038-MZA11826-MZA9105区域不存在可用的重组体。

b)用先锋种质近交后代中的基因型信息和表型信息检测抗性/易感近交后代中的保守片段。若在独立创建者中有足够的保守SNP，则在具体系谱内和多个独立创建者中实施保守片段的检测。

天然等位基因的多样性和创建者关系

选择区间MZA15490至MZA2038，进行等位基因多样性分析，因为其很可能含有候选基因或与候选基因高度连锁不平衡。在MZA15490至MZA2038区间的全序列对于B73是可用的(B73＝274)，一组13个小序列片段被靶向，用于一组检验系(tester's line)的测序中。检验系(表26)包括：a)一些关节的抗性和易感的近交后代和单元型；b)来自作图种群PH7WTxPH3DT和PH9TJxPH890的抗性和易感亲代；c)来自近交组和重组种群的关键重组体(PHG63和MZA15490至MZA2038区间的重组体)。

表26显示了包括在先锋种质中的MRCV抗性和易感性来源和MZA15490至MZA2038区间的重组体的检验系的列表。

表26

近交系	表型	预期的单元型	n
				PH9TJ	抗性	PH9TJ	1
PHJ40	抗性	PHJ40	5
				PHGD3	-	PHGD3	2
383	抗性	-	1
				PHG63	抗性	630	14
630	抗性	630	14
				PH7WT	抗性	630	14
PHR33	抗性	PHR33	1
				501	-	501	-
PH467	抗性	PH467	1
				PHDG9	抗性	PHDG9	1
PHK09	抗性	PHK09	1
				274	易感	274	47
1047	易感	1047	23
				PH26N	易感	PH26N	1
PH3DT	易感	274	47
				PH890	易感	1047	23
165	易感	165	33
				661	易感	PHAN0	93
PHR03	易感	PHAN0	93
				PHK56	易感	PHAN0	93
PHN47	易感	PHN47	1
				PHNV8	易感	PHNV8	1
ap19506156	易感	重组体	1
				ap19506157	易感	重组体	1
ap19506160	易感	重组体	1
				157	易感	625	7
625	易感	625	7
				PHKP5	-	PHKP5	1

图9显示在MZA15490至MZA2038区间中的靶向片段的位置和候选基因的位置。获得命名为以下的序列的测序结果：MRQV_00005-1；MRQV_1318-1；MRQV_02352-1；MRQV_03828-1；MRQV_06374-1；MRQV_08351-1；MRQV_09551-1-1；MRQV_10673-1和MRQV_11074-1。本文提供了用于片段MRQV_08351-1和MRQV_10673-1的检验近交后代组之间的序列，包括多态SNP，以表征单元型(参见图16)。在MZA15490至MZA2038区间的序列位置包括在图9中。

用序列数据通过抗性和易感性独立来源之间的血统片段(descentsegments)鉴定假定的同源物。MRQV_00005-1至MRQV_08351-1区域对于大部分易感性独立来源而言是共享的。关键重组的数据(来自高分辨率作图种群；对疾病易感)表明，该遗传材料的重组点位于假定的Myb转录因子(PCO644442)内部，且产生抗性的序列变异应该位于从该候选基因的位置至MZA2038。在PCO644442区域或附近的抗性独立来源之间也存在预期的IBD(血统同一性)关系如：

a)PHR33和PH467。

b)PHR33，PH9TJ，PHJ40和PHDG9。

c)表现出具体单元型的PHK09。

d)表现出具体单元型的630。

在MRQV_08351-1的一组靶SNP对大部分抗性来源是非常特异性的。但是，重组数据表明，靶序列应该位于从MRQV_08351-1(位于PCO644442)至MZA2038。

考虑到在MRQV_08351-1的SNP的特异性，在来自先锋种质的共625个近交后代中对该具体片段进行测序。通过使用来自以下的组合信息发展了关于部分先锋种质的MRCV抗性的基因描述：a)该区间的侧翼标记(MZA15490和MZA2038)，b)625个近交后代和检验系的序列数据，c)近交后代之间的系谱关系，和d)这些近交后代的表型数据。

在MRQV_08351-1的或结合MRQV_10673-1和MZA2038的单元型信息的一组具体单元型，用于增强在先锋种质中主要抗性来源的表征和血统同一性信息，并考虑靶区域的假定的变体。表27显示了具体单元型的描述和在材料之间单元型对疾病的预期反应和观察结果。包括了作为参考的代表性来源。

使用MRQV_08351-1的信息或结合侧翼序列(MRQV_10673-1和MZA2038)，申请人作出了以下推断：

a)抗性来源1。来源PHR33和PH467可能在MRQV_08351-1共享共同祖先。与来自LACAUNE开放式授粉品种的欧洲材料的共享区，支持可能共同起源于单个单元型区域。

b)抗性来源2。来源PHR33，PH9TJ，PHJ40和PHDG9可能在MRQV_08351-1侧翼区共享共同祖先。此外，推断PHP51可能是该组的一部分。与来自LACAUNE开放式授粉品种的欧洲材料的共享区，支持可能共同起源于单个单元型区域。

c)抗性来源3。PHK09表现出与PHBD6在MRQV_08351-1的共享单元型，且它们应该是共享了来自Tuxpen种质的共同起源。

d)抗性来源4。630表现出具体单元型，以及其他来源中不存在确定的IBD关系。

根据作图种群结果，申请人由此证实了在这些独立来源中优选区的QTL：

-630。

-PH9TJ.与630等位。

-PHP51.与630等位。

-PHBD6.与630等位。

重组、序列和系谱分析的整合和独立来源之间预期IBD关系的推论，使申请人认识到两个优选标记区(MZA15490和MZA2038)的四种主要单元型可用于表征先锋种质中的大部分抗性来源。这四种主要单元型可分成以下种质来源：

(a)抗性来源1和2。与来自欧洲flint LACAUNE开放式授粉种群的材料共享同源区的Flint SWAN种质。

(b)抗性来源3。来自TUXPEN起源的材料。

(c)抗性来源4。具体来源，630是代表性近交。该近交的发展包括宽泛的基因基础，其包括TUXPEN和MEXICAN JUNE种质。

PCO644442(图8，假定的Myb转录因子)看起来是最可能的对MRCV抗病性的候选基因。与PCO644442紧密连锁的序列应该也被认为是基因克隆的靶点，包括假定是EPSIN1和区间MZA11826至MZA9105的侧翼序列。

表征了在来自杂交PH3DT和PH7WT的MZA15490至MZA2038的单个重组体，且重组点位于PCO644442内。从PCO644442的内含子3至PCO644442启动子序列的区域，被认为是验证变异对于基因型之间抗性/易感性反应影响的关键靶点。图10显示了在MZA15490至MZA2038重组体的特征；quimeric PCO644442是源于PH3DT和PH7WT基因型。PH3DT(SEQ ID NO：212)和PH7WT(SEQ ID NO：211)的PCO644442的启动子区序列也包括在本文中，显示了多态位点(参见表15为序列排列)。

实施例9：MRDV-主要杂交系表征-欧洲

对一组关键的欧洲遗传材料进行表型和基因型表征，以确认与MRDV抗性相关的玉米遗传标记位点。通过鉴定这些遗传标记，可使用标记辅助选择(MAS)提高育种效能，用于改善玉米对MRDV的抗性。

玉米杂种和抗性评分

分析所用的植物品种来自于多种来源，包括原种种质、商业核发品种和代表宽范围的与欧洲育种程序相关的种质的预商业化杂种。

将玉米杂种组在田间实验中种植在西班牙。抗性和易感的归类仅基于田间检验中对偶尔且天然发生疾病的发病率的观察结果。植物对MRDV感染的抗性程度差异很大，如使用MRDV症状发病率的等级所衡量的。

通常在一次评分时间中完成数据收集。评分时间在花期之后。

在标记与抗性关联的评估中，采用通过使用亲代系的IBD信息的对比。通过血统同一性方法检查等位基因起源。使用这种方法，用被认为是代表任一基因型类别的那些玉米系评估关联和预测杂种水平的性能。

玉米基因分型

对这些杂种的每个亲代系进行基因分型，并为每个系估算IBD计算值。

基本的逻辑是，在抗性和易感组之间具有明显不同的等位基因分布(即非随机分布)的标记，可能与性状相关，并出于标记辅助选择具有之前未表征或表征为MRDV抗性或易感的玉米系的目的，可用来对它们进行分离。本分析检测了在优选的标记区基因位置上的IBD信息，并测定了在抗性组内部的等位基因分布是否明显不同于易感组内的等位基因分布。该分析比较了植物表型得分与在靶位点的基因型；该基因型是由IBD预测的。

结果

为在杂交水平上评估该QTL的等位基因变异的作用，根据存在来自亲代系的一个(QTL杂合的)或两个抗性等位基因(QTL纯合的)，表征一组212个杂种(异源遗传背景)。在杂种组合中，观察到主要QTL的抗性等位基因的正作用和加成作用。表28显示在主要QTL具有不同基因型的杂种的田间性能。田间性能表征为MRDV_得分，类似于MRCV得分方案。

表28

在主要QTL的杂交基因型	＃杂种	平均MRDV得分	STD Dev
				AA，纯合易感等位基因	163	4.25	0.92
BA，杂合、雌性抗性等位基因	37	5.45	1.01
				BB，纯合抗性等位基因	3	6.00	0.88

图11表示在MRDV感染时玉米杂种的性能。田间性能以MRDV_得分表示。

讨论/结论

该实施例鉴定了与MRDV抗性关联的染色体区间。位于这些区间内的标记可用于MAS，以及其他目的。通过使用MRCV抗性的优选标记预测MRDV抗性增强，表明这些标记可用于不同斐济病毒的MAS。由此预期了优选标记对其他斐济病毒例如水稻黑条矮缩病毒抗性的正作用。

实施例10：MRCV抗性表型分析

是什么：Mal de Río Cuarto病毒的得分1-9，1表示无抗性(矮小、节间缩短、无穗)，而9表示该遗传材料对疾病有抗性(无症状)。

什么时候：从开花至收获

检查已知易感系的得分，以观察它们的现有分级是否符合历史分级。

怎么办：1.将目前给予少数已知易感系的分级与它们的历史分级进行比较，看两者是否相符。

2.如果分级太高，则没有对此位置评分的足够的疾病压力。但是，注意比易感检查具有更多疾病的任意图。

3.在图基础上的得分。图内的植物症状由于感染时长而可以变化，或某些植物可以避开疾病(天然感染取决于载体的种群)。

4.考虑症状的严重性和具有症状的植物的频率。得分1-3属于易感类别；4-6是抗性类别；7-9是高度抗性类别。

田间评分的描述：

a)得分1-3，易感类别。症状包括严重矮小、节间严重缩短、无穗或穗的发育非常差，植物过早死亡。

b)得分4-6，抗性类别。植物具有突起和轻微的节间缩短的症状。具有严重症状的植物频率较低。

c)得分7-9，高度抗性类别。健康植物。存在突起或无症状。

Claims (2)

1.鉴定表现出对里奥夸尔托病毒(Mal de Río Cuarto Virus，MRCV)或玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus，MRDV)的新赋予的抗性或抗性增强的第一玉米植物或种质的方法，该方法包括，在所述第一玉米植物或种质中检测侧翼为MZA8381和MZA18180并包括MZA8381和MZA18180的染色体区间内的单元型，其中：

a.对于MZA8381的共有序列是SEQ ID NO：2和对于MZA18180的共有序列是SEQ ID NO：36；

b.所述单元型包含：

i.在MZA16656-19-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ ID NO：20的位置218；在MZA15490-801-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ IDNO：22的位置96；在MZA15490-137-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：24的位置84；在MZA2038-71-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：17的位置258；在MZA2038-76-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：16的位置277；在MZA11826-801-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：26的位置89；在MZA11826-803-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：27的位置701，以及在MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：12的位置123；或

ii.在MZA16656-19-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：20的位置218；在MZA15490-801-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ IDNO：22的位置96；在MZA15490-137-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：24的位置84；在MZA2038-71-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：17的位置258；在MZA2038-76-A的“C”，其中所述“C”位于SEQ ID NO：16的位置277；在MZA11826-801-A的“G”，其中所述“G”位于SEQ ID NO：26的位置89；在MZA11826-803-A的“T”，其中所述“T”位于SEQ ID NO：27的位置701，以及在MZA9105-8-A的“A”，其中所述“A”位于SEQ ID NO：12的位置123；以及

c.如果检测到所述单元型，选择所述第一玉米植物或种质作为表现出对里奥夸尔托病毒(MRCV)或玉米粗缩病毒(MRDV)具有新赋予的抗性或抗性增强。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述第一玉米植物或种质中的单元型渗入至第二玉米植物或种质，以产生基因渗入的玉米植物或种质。

Images