BRPI0818409B1 - Método de identificação de uma planta de milho ou germoplasma que apresenta resistência recém- conferida ou resistência aumentada a um membro do sorogrupo 2 de fijivirus, ou suscetibilidade a um membro do sorogrupo 2 de fijivírus, método de produção de uma planta de milho apresentando resistência recém-conferida ou resistência aumentada a um membro do sorogrupo 2 de fijivírus e método de seleção de pelo menos uma planta de milho através de seleção assistida por marcador de um lócus de traço quantitativo associado com a resistência recém-conferida ou resistência aumentada a um membro do sorogrupo 2 de fijivírus - Google Patents

Description

(54) Título: MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO OU GERMOPLASMA QUE APRESENTA RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVIRUS, OU SUSCETIBILIDADE A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO APRESENTANDO

RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS E MÉTODO DE SELEÇÃO DE PELO MENOS UMA PLANTA DE MILHO ATRAVÉS DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR DE UM LÓCUS DE TRAÇO QUANTITATIVO ASSOCIADO COM A RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS (51) Int.CI.: C12Q 1/68; C12N 15/87 (30) Prioridade Unionista: 01/11/2007 US 61/001,455 (73) Titular(es): PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.. E.l. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (72) Inventor(es): TERESITA MARTIN; GUOPING G. SHU; JOSE ALEJANDRO FRANCHINO; ENRIQUE DOMINGO KREFF; ANA MARIA PROCOPIUK; ADRIANA TOMAS; STANLEY D. LUCK

1/213

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO OU GERMOPLASMA QUE APRESENTA RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS, OU SUSCETIBILIDADE A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO APRESENTANDO RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS E MÉTODO DE SELEÇÃO DE PELO MENOS UMA PLANTA DE MILHO ATRAVÉS DE SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR DE UM LÓCUS DE TRAÇO QUANTITATIVO ASSOCIADO COM A RESISTÊNCIA RECÉM-CONFERIDA OU RESISTÊNCIA AUMENTADA A UM MEMBRO DO SOROGRUPO 2 DE FIJIVÍRUS

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDO RELACIONADO

Esse pedido reivindica o benefício de U.S. Provisional Application No. 61/001.455, depositado em 1° de novembro de 2007, o qual está incorporado aqui por referência na sua íntegra.

CAMPO DA INVENÇÃO

O presente pedido se refere a composições e métodos úteis na criação ou melhoramento de resistência em plantas ao Fijivírus, particularmente Mal de Río Cuarto Virus e/ou Maize Rough Dwarf Virus. Adicionalmente, a invenção se refere a plantas que foram transformadas geneticamente com as composições da invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A doença causada pelo Mal de Río Cuarto Virus (MRCV) é uma doença do milho de grande importância na Argentina, sendo responsável por perdas de produtividade maiores que 70% em anos de epidemia severa (Rodriguez PE et al. (1998) Plant Dis. 82:149-52). A doença é um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, que inclui outros vírus tais como maize rough dwarf virus, rice black streaked dwarf virus, e pangola stunt virus (Uyeda

Petição 870170065684, de 04/09/2017, pág. 13/20

2/213

I & Milne RG (1995) Semin. Virol. 6:85-88). O principal vetor para o MRCV é Delphacodes kuscheli, porém outras espécies de Delphacodes, tais como D. haywardi e D. tigrinus,

Toya propinqua foram mostrados a carregar vírus

O vírus não parece ser transmitido para a prole através das sementes. Distéfano et al. , Arch. Virol. 147:1699-1709 (2002), analisaram a seqüência de MRCV e propuseram que ele é uma nova espécie de Fijivírus relacionados ao MRDV (Maize Rough Dwarf Virus) . MRDV é encontrado em vários países europeus (ex. , República Tcheca, França, Itália, Noruega, Espanha e Suécia) e na China, enquanto o MRCV também foi detectado no Uruguai (Ornaghi J. A., Beviacqua J. E., Aguirrezabala D. A., March G. J. e Lenardón S. L. 1999. Detection of Mal de Rio Cuarto virus in Uruguay. Fitopatologia Brasileira 24: 471).

Infecção por MRCV causa desenvolvimento anormal do milho e redução significativa do rendimento do plantio. O fenótipo suscetível inclui bloqueio do desenvolvimento, redução do tamanho dos entrenós, múltiplas espigas com grãos escassos, órgãos masculinos deformados sem anteras, presença de pequenas protusões na superfície inferior das folhas, raízes reduzidas, folhas cortadas e reduzidas. Sintomas nas plantas dependem do estágio fenológico da planta, genótipo da planta, e ambiente (Lenardón et al. , Virus dei Mal de Rio Cuarto en maíz, in Proyecto de Investigaciones en Fitovirología (Lenardón ed.), 2:10 (1999). A maior parte dos sintomas severos ocorre quando infectados no coleóptilo - o primeiro estágio foliar.

Na epidemia severa de MRCV em 1996-1997, mais de 300.000 hectares de milho na Argentina foram afetados, resultando em perdas totalizando aproximadamente 120 milhões de dólares. Populações aumentadas de Delphacodes kuscheli em 2006 aparentemente levaram a uma recorrência da doença viral em plantas de milho argentinas, o que afetou significativamente a colheita de 2007. Genótipos suscetíveis foram fortemente

3/213 afetados pelo MRCV na região endêmica (Província de Córdoba) e moderadamente afetada em outras regiões de plantação de milho.

O desenvolvimento de marcadores genéticos moleculares facilitou o mapeamento e seleção de traços de importância agrícola em milho. Marcadores fortemente ligados a genes de resistência a doença são um recurso valioso na rápida identificação de linhagens de milho resistentes com base no genótipo através do uso da seleção assistida por marcador (MAS) . A introgressão de genes de resistência a doenças em uma cultivar desejada também seria facilitada através do uso de marcadores de DNA apropriados.

MARCADORES MOLECULARES E SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR

Um mapa genético é uma representação gráfica de um genoma (ou uma porção de um genoma tais com um cromossomo único) onde as distâncias entre marcadores no cromossomo são medidas através das freqüências de recombinação entre esses marcadores. Um marcador genético pode ser qualquer um dentre uma variedade de marcadores polimórficos conhecidos, por exemplo, porém não limitado a, marcadores de SSR, marcadores de RFLP, marcadores de FLP, ou marcadores de SNP. Além disso, podem ser derivados a partir de ácidos nucléicos genômicos ou expressos (ex., ESTs). A natureza desses marcadores físicos e os métodos usados para detectá-los variam, porém todos esse marcadores são fisicamente distinguíveis um dos outros (assim como a pluralidade de alelos de qualquer marcador em particular) com base no comprimento e/ou sequência polinucleotídica.

Apesar de seqüências específicas de DNA que codificam proteínas serem geralmente bem conservadas ao longo de um espécie, outras regiões de DNA (tipicamente não-codificante) tendem a acumular polimorfismos e, portanto, podem ser variáveis entre indivíduos da mesma espécie. Tais regiões

4/213 provêm a base para inúmeros marcadores genéticos moleculares. Em geral, qualquer traço polimórfico diferencialmente herdado (incluindo polimorfismos de ácido nucléico) que segrega na prole é um marcador potencial. A variabilidade genômica pode ser de qualquer origem, por exemplo, inserções, deleções, duplicações, elementos repetitivos, mutações pontuais, eventos de recombinação, ou a presença e seqüência de elementos de transposição. Um grande número de marcadores moleculares de milho são conhecidos na arte, e foram publicados ou estão disponíveis através de várias fontes, tais como o recurso da internet MaizeGDB. Similarmente, numerosos métodos para detectar marcadores moleculares também estão bem estabelecidos.

A motivação primária para o desenvolvimento de tecnologias de marcadores moleculares pelo ponto de vista dos criadores de plantas vem sendo a possibilidade de aumentar a eficiência de melhoramento através de seleção assistida por marcadores (MAS). Um alelo marcador molecular que demonstra desequilíbrio de ligação com um traço fenotípico desejado (ex., um lócus de traço quantitativo, ou QTL, tal como resistência a uma doença particular) provê uma ferramenta útil para a seleção de um traço desejado em uma população vegetal. Os componentes-chaves à implementação dessa abordagem são: (i) a criação de uma mapa genético denso de marcadores moleculares, (ii) a detecção do QTL baseado em associações estatísticas entre marcador e variabilidade fenotípica, (iii) a definição de um conjunto de alelos marcadores desejados baseado nos resultados da análise de QTL, e (iv) o uso e/ou extrapolação dessa informação para o conjunto atual de germoplasma de melhoramento para permitir que decisões baseadas em marcadores sejam feitas.

A disponibilidade da mapas de ligação integrados do genoma de milho contendo densidades crescentes de marcadores

5/213 públicos de milho tem facilitado o mapeamento genético de milho e MAS. Veja, ex., o recurso MaizeGDB na internet.

Dois tipos de marcadores ao freqüentemente usados em protocolos de seleção assistida por marcador, chamados marcadores de repetições de seqüência simples (SSR, também conhecido como microssatélite) e marcadores de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). 0 termo SSR se refere geralmente a qualquer tipo de heterogeneidade molecular que resulta na variabilidade de comprimento, e mais tipicamente é um segmento curto (até várias centenas de pares de bases) de DNA que consiste de múltiplas repetições in tandem de uma seqüência de dois ou três pares de base. Essas seqüências repetitivas resultam em regiões de DNA altamente polimórficas de comprimento variável devidos à baixa fidelidade de replicação, ex. , por causa de escorregamento da polimerase. SSRs parecem estar dispersos aleatoriamente ao longo do genoma e são geralmente flanqueados por regiões conservadas. Marcadores SSR podem também ser derivados a partir de seqüências de RNA (na forma de um cDNA, um cDNA parcial ou um EST) assim como de material genômico.

As características de heterogeneidade de SSRs fazem deles bem apropriados para uso como marcadores genéticos moleculares; sendo elas o fato da variabilidade genômica ser herdável, multialélica, co-dominante e ser detectável de maneira reprodutível. A proliferação de técnicas de detecção baseadas em amplificação crescentemente sofisticadas (ex., baseadas em PCR) provê uma variedade de métodos sensíveis para detecção de heterogeneidade de seqüência nucleotídica. Oligos (ou outros tipos de sondas) são desenhadas para hibridizar com regiões conservadas que flanqueiam o domínio SSR, resultando na amplificação da região SSR variável. Os amplicons de tamanho diferentes a partir de uma região SSR apresentam tamanho característico e reprodutível. Os amplicons SSR de

6/213 tamanhos diferentes observados a partir de dois cromossomos homólogos em um indivíduo, ou a partir de diferentes indivíduos na população vegetal, são geralmente denominados alelos marcadores. Contanto que existam pelo menos dois alelos SSR que produzam produtos de PCR com pelo menos dois tamanhos diferentes, os SSRs podem ser empregados como marcadores.

Marcadores de milho que dependem de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) são também bem conhecidos na arte. Várias técnicas foram desenvolvidas para a detecção de SNPs, incluindo hibridização específica de alelos (ASH; veja, ex. , Shattuck-Eidens et al. , (1991) Rapid detection of maize DNA sequence variation, Genet. Anal. Tech. Appl. 8:240-245). Tipos adicionais de marcadores moleculares são também amplamente usados, incluindo, porém não limitado a, ESTs e marcadores SSR derivados de sequências ESTs, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) e marcadores de isoenzimas. Uma grande variedade de protocolos são conhecidos por aqueles versados na arte para detectar essa variabilidade, e esses protocolos são frequentemente específicos para o tipo de polimorfismo que eles são desenhados para detectar. Por exemplo, amplificação por PCR, polimorfismos de conformação de fita simples (SSCP) e replicação de sequência auto-sustentável (3SR; veja Chan e Fox, NASBA and other transcription-based amplification methods for research and diagnostic microbiology, Reviews in Medicai Microbiology 10:185-196 (1999) ) .

Vários tipos de marcadores FLP podem também ser gerados. Mais comumente, oligos de amplificação são usados para gerar polimorfismos de comprimento de fragmento. Tais marcadores FLP são de muitas maneiras similares aos marcadores SSR, exceto

7/213 que a região amplificada pelos oligos não são tipicamente uma região altamente repetitiva. Ainda, a região amplificada, ou amplicon, terá variabilidade suficiente dentre o germoplasma, geralmente devido a inserções ou deleções, de modo que os fragmentos gerados pelos oligos de amplificação podem ser distinguidos dentre indivíduos polimórficos, e tais indels são sabidos de ocorrer freqüentemente em milho (Bhattramakki et al. (2002) Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002) Plant

Sei 162:329-333) . O termo indel se refere a uma inserção ou deleção, onde uma linhagem pode ser referida como contendo uma inserção relativa a uma segunda linhagem, ou a segunda linhagem pode ser referida como contendo uma deleção relativa à primeira linhagem. Os marcadores MZA revelados aqui são exemplos de marcadores FLP amplificados que foram selecionados devido sua grande proximidade com o principal QTL do cromossomo 2.

Ligação de um marcador molecular a outro marcador molecular é medido como uma freqüência de recombinação. Em geral, o mais perto que dois loci se encontram (ex. , dois marcadores SSR) no mapa genético, o mais perto eles se localizam no mapa físico. Uma distância genética relativa (determinada através de freqüências de Crossing over, medidas em centimorgans; cM) é geralmente proporcional à distância física (medida em pares de base, ex. pares de quilobases (kb) ou pares de megabases (Mpb) ) que dois loci ligados estão separados um do outro em um cromossomo. Uma falta de proporcionalidade precisa pode resultar da variação em freqüências de recombinação para diferentes regiões cromossômicas, ex. , algumas regiões cromossômicas são hot spots de recombinação, enquanto outras regiões não apresentam recombinação alguma, ou somente apresentam raros eventos de recombinação. Em geral, o quanto mais perto um marcador está de outro marcador, tanto medido em termos de recombinação

8/213 quanto de distância física, mais fortemente eles estão ligados. Em alguns aspectos, o quanto mais perto um marcador molecular está de um gene que codifica um polipeptídeo que confere um fenótipo particular (resistência a doença), tanto medido em termos de recombinação quanto de distância física, melhor o marcador serve para mapear o traço fenotípico desejado.

Variabilidade de mapeamento genético pode também ser observada entre diferentes populações da mesma espécie de cultivo, incluindo milho. Apesar dessa variabilidade no mapa genético que pode ocorrer entre populações, informação de mapa genético e marcador derivada a partir de uma população geralmente permanece útil ao longo de múltiplas populações na identificação de plantas de traços desejados, contra-seleção de plantas com traços indesejados e no direcionamento de MAS.

MAPEAMENTO DE QTL

É o objetivo do criador de plantas selecionar plantas que enriquecem a população vegetal de indivíduos que apresentam traços desejados, por exemplo, resistência a patógenos, levando ultimamente a uma produtividade agrícola aumentada. É reconhecido já há algum tempo que loci cromossômicos específicos (ou intervalos) podem ser mapeados no genoma de um organismo que correlaciona com fenótipos quantitativos particulares. Tais loci são denominados loci de traço quantitativo, ou QTL. A criador de planta pode vantajosamente usar marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados através de identificação de alelos marcadores que apresentam uma probabilidade estatisticamente significativa de co-segregação com um fenótipo desejado (ex., resistência a patógenos), manifestados com desequilíbrio de ligação. Através da identificação de um marcador molecular ou aglomerados de marcadores moleculares que co-segregam com um traço co-segregam com

9/213 quantitativo, o criador identifica então um QTL. Através da identificação e seleção de um alelo marcador (ou alelos desejados de múltiplos marcadores) que se associam com o fenótipo desejado, o criador de planta está apto a rapidamente selecionar um fenótipo desejado através da seleção de alelo marcador molecular apropriado (um processo chamado de seleção assistida por marcador, ou MAS). Quanto mais marcadores moleculares são posicionados na mapa genético, mais potencialmente útil o mapa se torna para se conduzir MAS.

Múltiplos paradigmas experimentais foram desenvolvidos para identificar e analisar QTL (veja, ex., Jansen (1996) Trends Plant Sei 1:89). A maioria dos artigos publicados em mapeamento de QTL em espécies de plantas de cultivo foram baseados no uso de cruzamento bi-parental (Lynch e Walsh (1997) Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland). Tipicamente, esses paradigmas envolvem o cruzamento de um ou mais pares parentais, que podem ser, por exemplo, um único par derivado de duas cepas endocruzadas, ou múltiplos parentais relacionados ou não relacionados de diferentes cepas ou linhagens endocruzadas, nas quais cada exibem diferentes características relativas ao traço fenotípico de interesse. Tipicamente, esse protocolo experimental envolve a derivação de 100 segregantes de um único cruzamento entre endocruzadas divergentes (ex., selecionadas diferenças fenotípicas e de marcador molecular entre as linhagens). Os parentais e prole segregante são genotipados para múltiplos loci marcadores e avaliados em relação a um ou vários traços quantitativos (ex., resistência a doença). QTLs são então identificados como significativas entre valores fenotípica dentre a prole segregante. O ponto forte desse protocolo experimental é a utilização de cruzamento de a 300 proles duas linhagens a maximizar as associações estatisticamente genotípicos e variabilidade

10/213 endocruzados, porque todo o parental Fl resultante apresenta a mesma fase de ligação. Logo, após auto-cruzar as plantas Fl, toda a prole resultante (F2) é informativa e o desequilíbrio de ligação é maximizado, a fase de ligação é conhecida, existem somente dois alelos QTL, e, exceto pela prole cruzada com o parental (backcross), a freqüência do alelo QL é 0,5.

Numerosos métodos estatísticos para determinação de quando marcadores são geneticamente ligados a um QTL (ou a outro marcador) são conhecidos daqueles versados na arte e incluem, ex. , modelos lineares padrão, tais como ANOVA ou mapeamento de regressão (Haley e Knott (1992) Heredity 69:315), métodos de máxima semelhança tal como algoritmos de maximização de expectativa, (ex., Lander e Botstein (1989) Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps, Genetics 121:185-199; Jansen (1992) A general mixture model for mapping quantitative trait loci by using molecular markers, Theor. Appl. Genet. , 85:252-260,Jansen (1993) Maximum likelihood in a generalized linear finite mixture model by using the EM algorithm, Biometrics 49:227-231; Jansen (1994) Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers: an overview of biometrical models, In J.W. van Ooijen e J. Jansen (eds.), Biometrics in Plant breeding: applications of molecular markers, pp. 116-124,

CPRO-DLO Metherlands; Jansen (1996) A general Monte Cario method for mapping multiple quantitative trait loci, Genetics 142:305-311; e Jansen e Stam (1994) High Resolution of quantitative trait into multiple loci via interval mapping, Genetics 136:1447-1455). Métodos estatísticos exemplares incluem análise de marcador de ponto único, mapeamento de intervalo (Lander e Botstein (1989) Genetics 121:185), mapeamento de intervalo composto, análise de estirpe complexo, análise MCMC, análise MQM (Jansen (1994) Genetics 138:871), análise HAPLO-IM+, análise HAPLO-MQM, análise HAPLO-MQM+,

11/213

Bayesian MCMC, identidade por regularização de Tikhonov, análise de descendência, regressão de Haseman-Elston, qualquer uma das quais são apropriadas no contexto da presente invenção. Em adição, detalhes adicionais a respeito de métodos estatísticos aplicáveis a populações de criação complexas que podem ser usadas para identificar e localizar QTLs são descritos em U.S. Patent No. 6.399.855 e W00149104. Qualquer uma dessas abordagens são computacionalmente intensivas e são geralmente desempenhadas com a assistência de um sistema baseado em computador e programa de computador especializado. Pacotes estatísticos apropriados estão disponíveis em uma variedade de fontes públicas e comerciais, e são conhecidos daqueles versados na arte.

Sala et al. , no pedido de patente argentina No. ARP20030100125, revela uma combinação de três alelos QTL relacionados a resistência de plantas de milho ao MRCV. Os loci estão ligados aos alelos de resistência favoráveis dos marcadores bnlgl017, bnlg2277, bnlgl25, bnlg381, e bnlgl80, todos os alelos onde resistência é encontrada quando conferindo resistência estão presentes.

Existe uma necessidade na arte de cepa melhoradas de milho que são resistentes ao fijivírus, particularmente MRCV e MRDV, e seus agentes causadores, ex. infecção por Delphacodes kuscheli. Existe uma necessidade na arte de métodos que identifiquem plantas de milho ou populações (germoplasma) que apresentam resistência ao fijivírus. O que é necessário na arte é identificar marcadores genéticos moleculares que estão ligados aos loci de resistência ao fijivírus com o intuito de facilitar a MAS, e também para facilitar a descoberta gênica e clonagem de alelos de gene que conferem resistência ao fijivírus. Tais marcadores podem ser usados para selecionar plantas individuais e populações vegetais que apresentam alelos marcadores favoráveis em populações de milho e então

12/213 e

serem empregados para selecionar o fenótipo resistente, serem usados para contra-selecionar plantas ou populações vegetais que apresentem um fenótipo de suscetibilidade ao fijivírus. A presente invenção provê essas e outras vantagens.

RESUMO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para identificação de plantas de milho ou germoplasma apresentando resistência recém-conferida ou resistência aumentada ao fijivírus são providos. Métodos de milho ou germoplasma que são ex., através da introgressão de obtenção de plantas de resistentes ao fijivírus, alelos marcadores de resistência desejados e/ou através de métodos de produção germoplasma obtidos providos. Sistemas transgenicas, assim através desses e kits para resistentes também são como plantas e métodos, são também selecionar plantas e parte integrante da germoplasma invenção.

Em alguns aspectos, a invenção provê métodos para identificar uma primeira planta de milho ou germoplasma (ex., uma linhagem ou variedade) que apresenta resistência recémconferida, resistência aumentada ou suscetibilidade ao MRCV. Nos métodos, pelo menos um alelo de um ou mais loci marcadores (ex. , uma pluralidade de loci marcadores) que está associado com a resistência recém-conferida, resistência aumentada, ou suscetibilidade são detectadas na primeira planta de milho ou germoplasma. 0 loci marcador pode ser selecionado a partir dos loci providos nas Tabelas 1 e 2, incluindo MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105, assim com qualquer outro marcador que está ligado a esses marcadores de QTL (ex. , a menos de por volta de 10 cM desses loci) . Tabelas 1 e 2 apresentam marcadores de milho que demonstram desequilíbrio de ligação com o fenótipo de resistência a MRCV como determinado pelos métodos de análise de mapeamento por

13/213 segregação aleatória do resistência/suscetibilidade fenótipo de probabilidade associação e mapeamento por intervalo de QTL (incluindo análise de regressão de marcador único). A tabela indica o tipo de marcador genômico-SSR ou EST-SSR (todos de repetição de seqüência simples) ou marcadores SNP ou MZA, o cromossomo no qual o marcador está localizado e sua posição aproximada do mapa genético relativo a outros marcadores conhecidos, dados em cM, com a posição zero sendo o primeiro (mais distal) marcador no cromossomo. Também são mostradas as populações de milho usadas na análise e a probabilidade estatística de marcador e o dado como uma ajustada levando-se em consideração a variabilidade e falsos positivos de testes múltiplos. Valores de probabilidade da regressão de marcador único também são mostrados.

A invenção também provê intervalos de QTL cromossomais que correlacionam com MRCV. Esses intervalos estão localizados no grupo de ligação 2. Qualquer marcador localizado dentro desses intervalos encontram uso como um marcador para resistência ao MRCV e é também parte integrante da invenção. Esses intervalos incluem:

(i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a.

Uma pluralidade de loci marcadores podem ser selecionados na mesma planta. Quais marcadores QTL são selecionados em combinação não é particularmente limitado. Os marcadores QTL usados em combinações podem ser qualquer um dos marcadores listados nas Tabelas 1 e 2, qualquer outro marcador que está ligado aos marcadores das Tabelas 1 e 2 (ex., os marcadores

14/213 ligados determinados pelo recurso MaizeGB) , ou qualquer outro marcador dentro dos intervalos de QTL descritos aqui.

Ο !φ α

ο !<ΰ ι>

Φ •Η ο

ο (Ώ (Λ

Φ

Ό

Φ

Η

Φ

4J

Η

4J ω

φ

15/213 <Τί

Ό

Φ t^-1 φ

Λ

Φ

Η

Φ

Λ

Ο

Η

CM

Φ Ρ Φ 4-> ω Φ ι—I

Φ τ!

Φ

Η

Φ

4-)

Φ

Η

4-) ω

φ ο

ίΦ ο

Φ

Ή ο

ο ω

SNPs de Análise de associação em MRCV1. Endocruzad os Argentinos		menos que 0,001
Conjunto de Análise de Associação 1 (SS) Endocruzad os	0,00067691 7	0,00019819 1
Análise de Associação II Montante de Endocruzad os SS	0,742	0,0044
Análise de Associação I Montante de Endocruzad os SS	0,341	0,0037
Análise de Associação Montante de Endocruzad os Argentinos	0,12	0,002
Conjunto Gênico Analisado / População de Mapeamento	Broad Pioneer i germoplasm a	Broad Pioneer
Método de Identificaç ão	Análise de associação, identidade por descendênci a	Análise de associação,
!<0 -rt Λ» O -p ,2 10 · o M· 3 o 5 ’ 9 s ã 4 2 2 S a £ “ ►	63,17	63,47
Marcado r	MZA7588	MZA8381

16/213

	0,064 I
		0,00217249 9	0,05508889 4
		0,197	0,0282
		0,0958	0,174
	0,0412	0,551
germoplasm a _	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a
identidade por descendênci a	Análise de associação, identidade por descendênci a	Análise de associação, identidade por descendênci a	Análise de associação, identidade por descendênci
	63,55	63,64	63,83
	MZA3105	MZA482	MZA1653 1

<0 o

o o

O

O

LD m

t—i co co r* <0 <0

O

ΟΊ

CO o

r* co <0 co l>

LD

CO <0

17/213 <0 <ο

Γ ο

ο g

ω

Ό Φ Ο β	β Φ Φ β Ο	ω Φ 1—I a ο çS
PQ	Η	β φ
		a

g ω

φ ο β	β φ φ β ο	ω Φ §* * çí
m	-Η	ti β φ
		a

Ό

Φ

Ο β

(Ώ β

Φ φ

β ο

β (β o

ίφ a

Φ •H υ

o ω

ω

Φ ω

Ό

Φ

Ό

Η

4-1 β

Φ

Ό

-Η <φ β

φ υ

ω φ

φ τ!

Φ ω

τ3

Ο ίφ

Φ

Φ •Η

U ο

ω ω

Φ φ

Ό

Φ

Τ3

4-) β

Φ

Ό •Η <φ υ

ω φ

Ό

Φ

'Φ %

Ο !Φ

Ο φ

•Η υ

ο ω

ω

Φ

Φ

Ό

Φ

Ό β

4J

Ό η

=j νο <ο <φ β

φ υ

ω φ

Ό ο

4-) β

Φ g

Φ

Φ a

φ g

a

Η ο

β ο

a <ο

147

LT» τ-l m

Csl

S ιη ο

σ~ι

Ν

147

C7

V£>

18/213

menos que

0,001

menos que

0,001

r-

in

τ—1

in

CN

16

£ -

τ—1

O

LO

O

*.

o

o

CN

ro

<£> O

LO

O

o

00 CO

<D

o

ΓΩ

o

O

LD

<£>

o

CN

v—1

CN

O

O

O

o

ε

S

ε

ε

τ) (ΰ ο Η ffl

Η o ω α Ο •Η

ω π3 ι—1 a ο ε Η <ϋ

(ΰ

Ό (ΰ ο Η m

Η ο ο tí ο •Η ΡΜ

ω (0 I- a ο ε Η ω

Π3

Ό π3 ο Η pq

Pioneer ermoplas a

Broad Pioneer

ω (ΰ 1—1 a ο ε Η ω

Οι

a

O)

Οι

Identidade

por

descendênci

(ΰ

mapeamento

por QTL

Identidade

por

descendênci

ÍÜ

mapeamento

por QTL

Análise de

associação,

identidade por descendênci a

Análise de associação,

identidade

τ—1

τ—!

ΓΌ

*·

X

3»

in

LO

VD

kO

LD

kO

1

1

LO

LD

ιη

Lf)

o

Γ4

LO

τ—1

Ν

Ο CQ

Ν

σ> CN

ZA1 1

ZA9

a

a

a

a

&

ω	ο ο
ο	-
β	ο
φ g

<£>

<£>

Ο

Ο

I

Η 04 00 τ—I θ' κο οο

-3* χο

19/213 ο

Ο

	β
Ό	φ
β	φ
ο	β
β	ο
pq	Η
	Pb

g ω β I—ι a

ο g

Μ

Φ tn β

Ο β

CQ β

Φ

Φ (4

Ο

Ή

ΡΜ

Las:	Τ)	β Φ
ο 1:3	oa	φ β
¢2	β	ο
en	PQ	-Η ΡΜ
&>

g ω Φ 1—ι Λ ο g β Φ Ο) (ti υ

£ <φ

Ό β

φ υ

ω φ

Ό φ

Ό (ti

Ό

Η

4->

β

Φ

Ό

Η

Ή υ

β <φ

Τ) β

Φ υ

ω φ

τ!

ο

4-1 β

Φ g

β

Φ a

β g

Η

ΟΙ β

ο a

φ

Ό β

-Η

4-) β

Φ

Ό

H υ

β <φ

Ό β

φ ϋ

ω

Φ

Ό

Ο

4->

β

Φ g

β

Φ a

β g

j

Η

ΟΙ β

Ο a

φ

Ό

Φ ω

-Η ι—I 'β

Ο ίβ ο

β •Η υ

ο ω

ω β

φ

Ό β

Ό

-Η

4-1 β

Φ

Ό υ

β <φ τ5 β

φ υ

ω φ

LD kO ιη

U3 κο <ο

LD Ο .—I σ>

Ν

S <

I

I

LD Ο τ—I σχ

C0

S

I

20/213

	0,014	0,034	0,04
				0,4067326
				0,523
				0,186
				0,0079
	Broad Pioneer germoplasm a _______________1	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad
mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Análise de
	66,0	O	66,0	66,0
	MZA1182 6-803-A 1	MZA1182 6-801-A	MZA1182 6-27-A	MZA1549

21/213

	menos que 0,001	menos que 0,001	menos que 0,001
Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a
associação, identidade por descendênci a	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a,
	66,0	66,0	66,0
O	MZA1549 0-801-A	MZA1549 0-138-A	MZA1549 0-137-A

22/213

		menos que 0,001	menos que 0,001
	0,01151416 2 I
	0,474
	0,452
	0,000194
	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a
mapeamento por QTL	oro 'd o !(ΰ tf F g h! * £ I L % J S Ή 4-1 2 § O (β M d O S ο H ό ~ ο H a 2 G $ ό ο ío a < $ -η $ ε	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento
	66,0	0'99	66,0
	MZA1665 6	MZA1665 6-8-A	MZA1665 6-19-A

23/213

		0,161	0,298
	2,66345E- 06			0,11631839 8
	0,391			0,0916
	0,104			0,0728
	0,0035			0,404
	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer germoplasm a	Broad Pioneer
por QTL	Análise de associação, identidade por descendênci a	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Identidade por descendênci a, mapeamento por QTL	Análise de associação,
	66,0	66,0	66,0	66,0
	MZA2038	MZA2038 -76-A	MZA2038 -71-A	MZA2803

24/213

cn

r~-

LC3

Γ

O

CN

o

o

CN

in

03

C0

rH

CN

cn

<0

03 <-H 03

CN rH

03

o

O

o

C3

o

O

τ—1

lf)

00

o

C—1

o

C3

CPt

00

CO

CO

o

CN

o

O

<o

C0

00

O

cr»

O

O

o

o

«·.

o

o

g

g

g

g

ω (ti I—I a o g d ω

<tí

Ό (ti O d PQ

d £ d) <2 o t: £ o 2 e o

(0

Ό (0 o d m

d d) (D d o H CM

03 (0 f-H a o g d ω

(0

Broad

d d) d) d o •H CM

ω d I—1 a o g d ai

iJ)

Oi

a

a

identidade

por

descendênci a

Análise de

associação,

identidade

por descendênci

(ti

mapeamento

por QTL

Identidade

por

descendênci

(ti

mapeamento

por QTL

Análise de 1

associação,

identidade

03

00

00

«»

03

00

00

<0

<0

<0

CN

CN

03

CN

CN

1

^P

03

03

T—

CO

T-Η

<—1

O

CN

00

ISI

N

1

N

S

s

S

25/213

0,005

kO

00

σ>

o

o

o

LD

o

00

s <»

s -

rH rH

o

m

σ>

o

m

o

*

«.

X.

o

o

o

524 í

,786

204

O

O

o

O

o

r-~

σ>

C—1

k£>

o

τ—1

CO

CN O

O

o

O

<o

CM

in

[>

C

LO

CN

O

O

o

*

O

ε

ε

ε

(ti

Ti ftí o d m

d ES Φ L d Λ § ε ri 5 * φ

(ti

Ti (ti o d PQ

d Eo φ d § 1 » s

(ti

Ti (ti o d m

d a φ

(ti

ijl

Cn

Cn

-Η υ β

φ Ti

o í(ti

φ Ti (0

H c d

φ Ti

ó ((ti

φ Ti (ti

nci

φ Ti

o ((ti

Φ Ti (ti

H c d

d

<φ τ!

knálise

o (0

<Φ Ti

uiálise

o (ti

<φ Ti

φ

O fü

<φ Ti

Ο Λ

escen a

•H c o ω ω

d a Φ Ti

escen a

•H υ o w w

H É â d a φ Ti

d (0 φ c ω φ

U) -H i—1 £

•H c o ω ω

É ° d a φ Ti

d φ c ω Φ

(ti

Ti

(ti

Ti

(0

•H

Ti

(ti

•H

Ti

CO

Γ

m

«X

X»

X»

00

o

T—1

kO

r-

<o

00

kO

o

T—1

i n

τ-Η

00

t<l

I-I vo

rd O

£

N £

N £

r-

CM

o

ιη

o

*.

ο

o

CO

m

00

O

Γ

CO

τ—1

<O

C0

Γ-

o

m

σι

CM

r-

CO

ιη ο

Γ

K#

Ch CO '

tH O

vo

ο

τ—I

o

o

ο

τ—1

o

CM

*»

«»

ο

O

o

o

CM

cn

sí

xf

Ο

o

o

vo

Ο

o

o

vo

«»

*

•

ο

o

o

o

00

σ>

CM

LD

r*.

00

CO

o

t—1

o

Ο

o

τ—1

vo

·*

Ο

o

o

o

CO

00

5—

CO

co

'M1

CN

CN

LO

VO

Ο

I>

o

O

Ο

o

o

Γ-

CM

ο

o

o

o

ο

o

ε

ε

ε

ε

Φ

Ρ ns ο Η PQ

Η 0) φ α ο •Η Λ

ω π3 —ι α ο ε Η φ

(ΰ

Ρ (ΰ ο Η m

φ 23 2 a d o ° e * φ

fO

P fO o PQ

φ *5 2 a d o ° e φ

(ΰ

Broad

Φ Φ d O •H

ω fO rH η ο ε Η φ

0ι

0i

O)

Οι

de

Ο !(ΰ

identidade

-Η ο α

φ Ρ

ão,

identidade por

nci

Φ P

ão,

identidade por

nci

φ P

o ifÜ

identidade

I Análise

associaç

por

descendê a

Análise

associaç

descendê a

Análise

associaç

descendê: a

Análise

associaç

m

00

σι

*

*»

«w

V—1

r—)

t—1

\—1

[

[>

o

CM

VO

co

vo

=tf

in

o

CM

in

00

in

00

τ—1 CO

ι—1 MO

<!

<

<

Ν

N

ΟΙ

N

S

S

S

S

26/213

27/213

0,059

CPl

τ—1

00

C0

Η

ο

CO

C0 οί rH

LO

η θ 1X1 °

ο

ο

ο

ο

Γ*

ο

ο

LT)

CXI SP

ΙΌ ν—1

00 00

ο

CN

ο

ο

Ο

ο

CO

<—1

<ο

CO

sP

(Μ

S—1

τ—1

τ—1

ο

Ο

ο

sp

VD Ο

σχ CN 00

Μ0 Ο Ο Ο

Ο

ο

Ο

ο

ε

g

g

(ti

Ρ (ti Ο d

d φ 2 a ° g

(ti

ρ (0 ο Μ

d φ φ ro φ d ο ο 2

(ti

Ρ (0 ο d

d φ φ ro Φ Ρ ΰ ο ο §

(0

PQ

* φ

m

._Ι G * &

PQ

η q φ

Οι

a

Οι

Η ο d

ω Ό

ão,

Ídade r

-Η υ ό

φ Ρ

ão,

φ ρ (ΰ Η *

nci

φ Ρ

ão,

Φ Ρ (ti

-Η ο d

d

<φ Ρ

ω ω -Η 1—1 'fÜ £

a (ti

<φ Ρ

knálise

a (ti

<φ Ρ

φ

a (ti

<φ Ρ

Ο a

escen a

•Η ο ο ω ω

Β â β a φ Ρ

escen a

•Η ο ο ω ω

a Ο d η φ Ρ

d (ti φ ο ω φ

Ή (—1 '(ΰ

Η ο ο ω ω

Ή <0 ϊ â φ Ρ

d φ φ ο ω φ

Ρ

Φ

Ρ

(ti

•Η

Ρ

<ti

•Η

Ρ

(Μ

CO

sP

CN

d

CN

Γ-

ο

Γ

00

[>

ΙΓ)

CO

00

SP

ο

<Ν

(Μ

rd sP

r-1 SP

γΗ

<

<

Ν

Ν

£

£

£

ω	O o
o
β	o
d) ε

η

CN ^ρ oo

CO ^ρ co cn

CN cn

LD cn o

LD

O cn co cn o

o o

co

CN o

28/213 cn oo o

o o

LO o

i

W x—I co CN LD ε

ω

P	β d)	ω (ti
(ti o β	tu α o	i—1 a o f-j
PQ	•H PU	R β d)
		O)

ε

Ui

P	β d)	Ui β
(ti o β	d) β O	1—1 a o ιβ
PQ	•H PU	R β d)
		a

a	<u
β		P
I—1	β
o	O	o
a	a	(β
β		a
β	o	-H
4J	(β	ω
X		o
H		a

(ti a

(ΰ ε

a ns rH ο

a (0 β

4->

X ω

Η

Ο a

ο i(C cu p

o ((ti a

-H ω

o a

ω

Ρ ω Ui •H i—I '(ti

O í(ti o

(ti

-H ü

o ω

Ui β

ω

P <ü

P

-H

4J α

d)

P cn

CN a

co

CN cn co tu υ

ω ω

Ρ (ti ω

p <υ

Ui o

!(tí a

(ti •H υ

o ω

ω (ΰ ω

Ρ (tí

Ρ

-Η

4-)

Ρ

-Η co a

i>

LO o

LD «υ ρ

υ m

<u p

	dJ
o (β	o	(ti a (ti c	β
a	d)	d)
(ΰ	β	dJ
a	4->	β
-H	β	P4	O
a	d)		•Η PU

ω (ΰ a

res ε

cn co co

CN CO ϊ—I O

PQ ω

ο υ

•Η ο

ρ a

(ti tn

-Η

J ο

«υ β

4-)

LD

-ϊΡ (β a

(0 ε

m

29/213

Φ a

φ ε

a		φ		a		φ
Φ		Ό		Φ		Ό
1-	β			t—I	β
ο	Ο	ο	φ	ο	ο	ο
a	a	;φ	a	a	a	ίφ
φ		a	φ	φ		a
β	ο	•γΗ	ε	β	ο	Η
4-)	!Φ	ω		4-)	ϊφ	ω
X		ο		X		ο
Η		a		W		a

φ a

Φ ε

φ

Η φ

φ £

Ο •Η

Λ ω

Φ £

Φ ε

Λ 'Φ a

ο !Φ a

φ a

φ η

4J β

Φ

Φ a

φ ε

φ η

φ φ

α ο

•Η

ΓΜ ω

Φ a

φ ε

ω ο

υ •Η ί^-1

Λ 'β a

ο !Φ a

Φ a

φ β

η β

φ φ

a φ

ε φ

β φ

φ β

ο

-Η a

ω

Φ a

Φ ε

ω ο

ο •Η ι—I

Λ 'β a

C4 ο

ι>

Ο

Γ— <£> 04 ΐ—I

Ο <Ο 04 ΐ—ι

Ο /VL

CM (0 r—f (D

Λ (0 dl

E-i

Of

Mapeamento de (0

Φ »0 oid

4J o

s

Φ

		P
(0		(ti
Φ		P
10		rl
a	w	rH
(ti	04	rl
i—1		33
3	§	(ti
&		33
0		0
cu		d
		ft

(ti

P <d

4J in r» <d n

W

Oi

X l>

K

Oi &

CU &

0<

d

O

Pi m

h n

U n

o

4J d

Φ

O

U α

φ φ

Pi g

d

O

P (ti

O d

<d

S o

cn oo &

o<

s

Ei σι »

0i m

W

Oi

X

C» a

Oi

O

Of

O j<d a

H ω

o cu o

P (Λ 'Φ >

(ti d

4J (ti <1>

P

O ω

d <ti dl

E-i (ti OI P o

1(0 a

rl cn o

cu cti

I—I o

&

cti d

4-Ϊ

X

0) cn

CN

LO <

C0 g

o (ti o

«ti o· (ti g

d

O m

d o

p d

rl

4-Ϊ d

cti a

<d

P o

Cn d

o dl

E4

OI o

ÍCti o

-H cn o

pu o

P o

o

-rl a

ω

Φ

4-) d

ω d

ω

-H

P (D

P cn (U cn •H i—I

P d

co

LO o

o

Hti a

(ti

-H

O

O cn cn cti (D d

σ cn o

d ω

g

CD

P cn o

P d

4J cn (D (D

P

O

4J d

(D g

cti ω

a cti g

ω

E-i

Of (D p

cti

P

H

4_>

d (D

P

-rl φ

P o

«ti a

d g

d o

4-1 d

d •H o

d «D

P d

φ o

cn

CD

P

O	cn	CD			..
P	(D	4J			Q
d	d	d	cn		O
ω	O	(D	(D P	dl
P d	P cti	g (ti	o P cti	o	O
o	υ	4-í	z-\	ICti	T-1
a	d	i—1	rl υ	u υ	a
cn	(ti	(ti	cti	Λ
CD d	g	cn	o cn	-rl Pu	d 4->
d	cn	d	cn cti		d
O	O	cti		o
υ	cti	g			a

o

ICO a

cti d

4J d

o a

ω p

o o

-H cu

Q

O dl

O

ICti a

cti d

4-) d

o a

o

CN

Q

O dl

CO o

l(ti CO a LO •rl cn o

cu

I cn cn

LO

LO cn (D d

O

P cti

O d

cti g

cn

Φ d

o

P cti

CD d

cti

I—i 44

I

LD

CN

LO

CO g

Ν’ CN CN 00 x—I < CO g

dl E-<	cti cti	O		o	(D P	O	kO	CO
Oi	P	P	CD	«ti		ICO	LT)
	cti		P	a	kj	a		LO
O	I—1	d		(0	kj	cti	A
l(ti	o	-rl	o	d	-H π,	d		O
a	a	4-)	υ	4-)	l-M	4->		ICti
•H	cti	d	-H	d		d	P	a
cn o PU	d 4-> X CD	cti a	a	o a	Q O dl	o a	kj dl	rl cn o PU

cn

Q) d

o

P cti o

d (ti g

cn

CD d

o

P cti (D

I

LO cn o

T—t o

LO d

(0

X—1

LD Ν’ ID x—I < CO g cn o τ—I cr»

CO g

LO

CN <

CO g

O cn Ν’ in x—i < CO g

LO LD LO LO x—I < 00 g co o

CN <

g

CO o

CN g

π3

[fl o			ω Ό	ro a <ü	ω
		(0		o
O	fO	1-1	o	£5	u
Ό	H	o		ω o	•H
nJ	fO	a	o	ι—1
υ	a	tü	-H	Λ
			ω	>-l
ctí S		JJ X d)	o a	J H O	a

31/213 [-CN co *—I ο

J

S m

m
00	T—1	CN
in	MD	MD
	CN	CN
τ—1	r~H	T—1
o	u	o
		Jyj
s	5	5
m

32/213

Os marcadores que estão ligados aos marcadores de QTL das Tabelas 1 e 2 podem estar fortemente ligados, por exemplo, a menos de por volta de 10 cM dos marcadores de QTL das Tabelas 1 e 2. Em algumas concretizações, o lócus ligado apresenta uma distância de recombinação genética de 9 centiMorgans, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25, ou menos de um marcador de QTL.

Em algumas concretizações, os marcadores de QTL preferenciais são selecionados dentre MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105. Os marcadores de QTL mais preferenciais são selecionados dentre MZA15490 e MZA2038.

Em algumas concretizações, o germoplasma é uma linhagem ou variedade de milho. Em alguns aspectos, a resistência recém-conferida, resistência aumentada, ou suscetibilidade de uma planta de milho ao MRCV pode ser quantificada usando qualquer meio apropriado, por exemplo escala de 1 a 9 (pontuação MRCV), onde 1 representa um genótipo altamente suscetível e 9, um genótipo completamente resistente; 4 representa um genótipo com o nível mínimo de resistência para gerar um híbrido comercial.

Uma segunda maneira de avaliar a resistência MRCV é através da avaliação do percentual de plantas altamente suscetíveis em um genótipo específico. Por exemplo, um experimento de campo onde os genótipos estão arranjados em um bloco desenhado de maneira completamente aleatória e cada unidade experimental é representada por um corredor de 4 metros e aproximadamente 20 plantas são plantadas em cada corredor. A resistência aumentada ao MRCV é avaliada através da observação de cada unidade experimental e designação de uma pontuação de campo (escala de 1 a 9) . Ao mesmo tempo, a porcentagem de plantas altamente suscetíveis em cada unidade experimental é avaliada. Veja FIG. 3A para exemplos de milho

33/213 apresentando sintomas de MRCV e FIG. 3B para exemplos de milho apresentando suscetibilidade ao MRCV.

Qualquer uma das variedades de técnicas podem ser usadas para identificar um alelo marcador. Não é a intenção que o método de detecção de alelo seja limitante de qualquer forma. Métodos para detecção de alelo tipicamente incluem métodos de identificação molecular tais como amplificação e detecção do amplicon marcador. Por exemplo, uma forma alélica de uma repetição de seqüência simples polimórfica (SSR) ou de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) pode ser detectado, ex., através de tecnologia baseada em amplificação. Nesses e em outros métodos de detecção baseados em amplificação, o lócus marcador ou uma porção do lócus marcador é amplificado (ex. , via PCR, LCR ou transcrição usando um ácido nucléico isolado a partir de uma planta de milho de interesse como molde), e o amplicon marcador amplificado resultante é detectado. Em um exemplo de tal abordagem, um oligo de amplificação ou par de oligo de amplificação é adicionado ao ácido nucléico genômico isolado a partir da primeira planta de milho ou germoplasma, onde o oligo ou par de oligos é complementar ou parcialmente complementar a pelo menos uma porção do lócus marcador, e é capaz de iniciar polimerização de DNA através do uso de uma DNA polimerase usando o ácido nucléico genômico de milho como molde. O oligo ou par de oligo (ex. , um par de oligo da Tabela 3) é extendido em uma reação de polimerização de DNA contendo uma DNA polimerase e um ácido nucléico genômico molde para gerar pelo menos um amplicon.

Tabela 3

Nome do Marcador	Seqüência do Oligo Esquerdo	Seqüência do Oligo Direito	Repetição	Também conhecido como
BNLG1327	SEQ ID NO:49	SEQ ID NO:50	CT(25)	bmcl327, A4615G09, p-

34/213

				bnlgl327, A4615G10, bnlgl327, LGI456705
BNLG1458B	SEQ ID NO:51	SEQ ID NO:52	-	bnlgl458, p- bnlgl458, A4651C06, bmcl458, A4651C05
UMC1261	SEQ ID NO:53	SEQ ID NO:54	(TG) 8	A1987278
UMC1262	SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:56	(GTC)4	A1987278

A tabela 3 lista marcadores genômicos e SSR, incluindo aqueles marcadores que demonstraram desequilíbrio de ligação com o fenótipo de resistência ao MRCV (diretamente ou por extrapolação do mapa genético). A tabela 3 provê as seqüências dos oligos esquerdo e direito de PCR usados na análise de genotipagem de lócus marcador SSR. Também é mostrado a seqüência extra usada na ponta 5' do oligo direito, e o número de nucleotídeos no elemento de repetição in tandem no SSR.

Em qualquer caso, dados representando o(s) alelo(s) detectado(s) pode(m) ser transmitido(s) (ex., eletronicamente ou via infra-vermelho, transmissão sem fio ou óptica) para um computador ou meio capaz de ser lido por um computador para análise ou armazenamento. Em algumas concretizações, RNA vegetal é o molde para a reação de amplificação. Em outras concretizações, DNA genômico vegetal é o molde para a reação de amplificação. Em algumas concretizações, o marcador de QTL é um marcador do tipo SNP, e o alelo detectado é um alelo SNP (veja, ex., Tabela 4 (apresentando marcadores SNP na posição do QTL e o específico PH7WT (= 63 0 = PH14J) e haplótipos

PH9TJ)), e o método de detecção é a hibridização específica de alelo (ASH).

Tabela

MRCV1	cn CO < PL,	1018	203	65,4	CN	Y-8-S016YZN		<
CO co Cl,	1018	203	65,4	CN	Y-9-S016YZK	O	O
PASS	930	203	66,0	CN	Y-808 -938TTYZW	o	E-i
CO CO P-.	930	203 _i	66,0	CN	Y-T08 ~978TTYZW		O
PASS	930	203	66,0	CN	Y -Í3-9281TYZW	u	Eh
PASS	930	203	66,0	CN	Y-T0-T8000D	&4	X
CO co cu	930	203	66,0	CN	Y-91-8002YZW		O
PASS	897	203	66,0	CN	Y-1A-8COSYZW		Eh
co co CL,			66,0	CN	Y-T08 -06^STYZW	O	O
co co cu			66,0	CN	Y-88T -06VSTYZW	O	O
PASS			66,0	CN	Υ-Δ8Τ -06frSTYZW	O	<
co co 04	897	203	O CD CD	CN	Y -6T-9S99TYZK	o	<
PASS	897	203	66,0	CN	Y-8-9S99TYZW	u
PASS	745	203	64,1	CN	Y-08-SS9YZW	Eh	Eh
co co < 04	745 i	203	64,1	CN	Y-6£-SS9~YZW	u	O
cx	co co	Ctg Pos	Ol 4J o	PHD	Cromossomo	pjqsouiv pp ouion	PH7WT	PH9TJ

36/213

Em algumas concretizações, o alelo que é detectado é um alelo favorável que se correlaciona positivamente com a resistência recém-conferida ou resistência aumentada.

Alternativamente, o alelo que é detectado pode ser um alelo que se correlaciona com suscetibilidade a doenças ou resistência a doenças reduzida, e esse alelo é contraselecionado. Por exemplo, alelos que podem ser selecionados a favor (alelos favoráveis, ex., PH7WT e PH9TJ (veja Tabela 5)) ou contra (alelos desfavoráveis, ex., PH3DT, PH890, e PH6KW (veja Tabela 5)).

37/213

MRCV1	CO CO ft	1018	203	65,4	C4	Y-8-S0T6VZW			ο
CO CO < ft	1018	203	65,4	C4	V-9-S0T6VZW	Ο	Ο
PASS	930	203	66,0	CN	V-808 -9S8TTVZK	ο	ft	ft
PASS	930	203	66,0	C4	V-T08 -9Z8TTVZW		Ο	ο
CO CO ft	930	203	66,0	C4	V -AZ-9Z8TTVZW	ο	ft	ft
CO CO < ft	930	203	66,0	C4	V-T0-T8000D	ft	X	X
CO CO ft	930	203	66,0	C4	V-9/-880ZVZN	ft	υ	ο
CO CO ft	897	203	66,0	C4	γ-ΤΔ-δεοζνζΝ		ft	ft
PASS			66,0	C4	Υ-Τ08 -Oõ^STYZW	Ο	Ο	υ
CO CO ft			66,0	C4	Y-8CT -οδΐ-ςτγζΐΗ	Ο	Ο	υ
CO CO < ft			66,0	CN	γ-Δετ -06t5TYZW	Ο		<
CO CO ft	897	203	66,0	C4	Υ -6T-9599TYZW	Ο
PASS	Γ- 00	203	66,0	C4	Y-8-9S99TYZW	υ	ft	ft
CO CO ft	745	203	64,1	CM	Y-0£-539YZW	ft	ft	ο
CO < CO ft	[>	203	V-I	C4	Y-6Z-S39-YZW	Ο	Ο -	ft
QTL	STARS	Ctg Pos	Ctg	PHD	Cromossomo	TADHW	Efeito Positiv ο	Efeito Positiv ο	Efeito
ejqsourv ep ouion	PH7WT	PH9TJ	PH3DT

38/213

	ο	<
		Ο
	FI	ο
	ο
	Η	υ
	X!	Ρμ
	Ο	F
	Η
	Ο	Ο
	Ο	Ο
		<
	<	<
	Ο	F
	Ο	Ο
	Η	Η
Negativ ο	Efeito Negativ ο	Efeito Negativ ο
	ΡΗ890	PH6KW

39/213

No caso onde mais de um marcador é selecionado, um alelo é selecionado para cada um dos marcadores; logo, dois ou mais alelos são selecionados. Em algumas concretizações, pode haver o caso de que um lócus marcador possua mais de um alelo vantajoso, e nesse caso, qualquer um dos alelos pode ser selecionado.

Será apreciado que a habilidade de identificar loci marcadores de QTL que se correlacionam com resistência recémconferida, resistência aumentada, ou suscetibilidade ao MRCV provê um método para selecionar plantas que apresentam também loci marcadores favoráveis. Isso é, qualquer planta que é identificada como contendo um lócus marcador desejado (ex., um alelo marcador que se correlaciona positivamente com resistência) pode ser selecionado a favor, enquanto plantas que não possuem o lócus, ou que apresentam um lócus que se correlaciona negativamente com resistência, pode ser selecionado contra. Logo, em um método, subseqüente à identificação de um lócus marcador, os métodos incluem selecionar (ex., isolar) a primeira planta de milho ou germoplasma, ou selecionar a prole da primeira planta ou germoplasma. Em algumas concretizações, a primeira planta de milho ou germoplasma selecionados resultantes pode ser cruzado com uma segunda planta de milho ou germoplasma (ex. , um milho elite ou exótico, dependendo das características que são desejadas na prole).

De maneira similar, em outras concretizações, se um alelo está correlacionado com a resistência recém-conferida ou resistência aumentada ao MRCV, o método pode incluir introgressão do alelo em uma segunda planta de milho ou germoplasma com o intuito de produzir uma planta de milho ou germoplasma introgredidos. Em algumas concretizações, a segunda planta de milho ou germoplasma irá tipicamente apresentar resistência reduzida ao MRCV quando comparado com a

40/213 primeira planta de milho ou germoplasma, enquanto a planta de milho ou germoplasma introgredidos irão apresentar uma resistência aumentada ao MRCV quando comparado à segunda planta de milho ou germoplasma. Uma planta de milho ou germoplasma introgredidos produzidos por esses métodos também é uma parte integrante da invenção. (Em algumas concretizações, o alelo favorável introgredido é PH7WT/PH9TJ, veja Tabela 5).

Em outros aspectos, várias populações de mapeamento são usadas na determinação dos marcadores ligados da invenção. Em uma concretização, a população de mapeamento usada é a população derivada a partir do cruzamento PH7WTxPH3DT ou PH9TJxPH890. Em outras concretizações, outras populações podem ser usadas. Em outros aspectos, vários programas de computador são usados na determinação de loci marcadores ligados. Por exemplo, TASSEL, MapManager-QTX, e GeneFlow encontram todos uso com a invenção. Em algumas concretizações, tal como quando o programa de computador é usado na análise de ligação, a informação de alelo detectado (ex., os dados) é eletronicamente transmitida ou eletronicamente armazenada, por exemplo, em um meio capaz de ler um computador.

Em outros aspectos, várias populações de mapeamento são usadas para determinar os marcadores ligados que encontram uso na construção da planta transgênica. Em uma concretização, a população de mapeamento usada é a população derivada a partir do cruzamento PH7WTxPH3DT ou PH9TJxPH890. Em outras concretizações, outras populações podem ser usadas. Em outros aspectos, vários programas de computador são usados na determinação do loci marcador ligado usado para construir a planta transgênica. Por exemplo, TASSEL, MapManager-QTX, e GeneFlow encontram todos uso com a invenção.

Sistemas para identificar uma planta de milho predita a apresentar resistência recém-conferida ou resistência

41/213 aumentada ao MRCV são também parte integrante da invenção. Geralmente, os sistemas incluem um conjunto de oligos e/ou sondas marcadores configurados para detectar pelo menos um alelo favorável de um ou mais loci marcadores associados com a resistência recém-conferida ou resistência aumentada ao MRCV, onde o lócus ou loci marcadores são selecionados dentre: MZA3105, MZA482,

MZA9105,

MZA18224,

MZA7588, MZA4305, MZA16656

MZA11066

MZA10384

MZA8381, MZA625, MZA2038, MZA18180,

MZA15451, MZA2803 , MZA8442 ,

MZA16531, MZA14553,

MZA11826, MZA15490,

MZA2349, MZA564,

MZA15563, MZA18036, MZA15264,

MZA12874, MZA12454, MZA8926, e MZA5057, assim como qualquer outro marcador que esteja ligado (ou em algumas concretizações, fortemente ligados, ex. , demonstrando não mais que 10% de freqüência de recombinação) a esses marcadores de QTL; e além disso, qualquer lócus marcador que esteja localizado dentro dos intervalos de QTL incluindo:

cromossomais (i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a.

Em algumas concretizações, marcadores de QTL preferenciais usados são selecionados a partir de MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105.

Onde um sistema que desempenha detecção ou correlação de marcador é desejada, o sistema pode também incluir um detector que está configurado para detectar um ou mais produtos de sinal dentre o conjunto de sondas ou oligos marcadores, ou amplicon destes, então identificando a presença ou ausência do alelo e/ou instruções de sistema que correlacionam a presença

42/213 ou ausência do alelo favorável com a resistência prevista. A configuração precisa do detector irá depender do tipo de marcação usada para detectar o alelo marcador. Concretizações típicas incluem detectores de luz, detectores de radioatividade, e similares. A detecção da emissão de luz ou outra marcação de sonda é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. De maneira similar, a forma precisa das instruções podem variar dependendo dos componentes do sistema, ex., eles podem estar presentes como programa de computador do sistema em uma ou mais unidades integradas do sistema, ou podem estar presentes em um ou mais computadores ou meio capaz de ler computador operavelmente acoplado ao detector. Em uma concretização típica, as instruções de sistema incluem pelo menos uma tabela de consulta que inclui a correlação entre a presença ou ausência do alelo favorável e a previsão da resistência recém-conferida, resistência aumentada, ou suscetibilidade.

Em algumas concretizações, o sistema pode ser consistido de elementos separados ou pode ser integrado em uma unidade única para detecção conveniente de alelos marcadores e para desempenhar correlações de traços de resistência de marcadores. Em algumas concretizações, o sistema pode também incluir uma amostra, por exemplo, DNA genômico, DNA genômico amplificado, cDNA, cDNA amplificado, RNA, ou RNA amplificado a partir de milho ou a partir de um tecido selecionado de planta de milho.

Kits também são uma parte integrante da invenção. Por exemplo, um kit pode incluir oligos ou sondas apropriados para a detecção de loci marcadores associados à resistência e instruções de uso dos oligos e sondas para a detecção dos loci marcadores e correlação dos loci com a resistência predita ao MRCV. Os kits podem adicionalmente incluir materiais de empacotamento para empacotar as sondas, oligos ou instruções,

43/213 controles tal como reações de controle de amplificações, marcadores de peso molecular, ou similares.

DEFINIÇÕES

Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que essa invenção não está limitada a concretizações particulares, que podem, lógico, variar. Também é para ser entendido que a terminologia usada aqui tem como propósito somente descrever concretizações particulares, e não tem como intuito ser limitante. Como usado nessa especificação e nas reivindicações anexadas, termos no singular e as formas singulares um, uma, o e a, por exemplo, incluem referências plurais salvo quando o conteúdo claramente dita o Logo, por exemplo, referência à planta, a ou uma planta também inclui uma pluralidade de também, dependendo do contexto, o uso do termo contrario. planta plantas;

planta pode também incluir prole da planta geneticamente similar ou idêntica; uso do termo um ácido nucléico opcionalmente inclui, como maneira prática, muitas cópias daquela molécula de ácido nucléico; similarmente, o termo sonda opcionalmente (e tipicamente) engloba muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.

Salvo quando indicado o contrário, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para direita na orientação 5'-3'. Intervalos numéricos recitados dentro da especificação são inclusivos dos números que definem o intervalo e incluem cada número inteiro ou qualquer fração não inteira dentro do intervalo definido. Salvo quando definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui apresentam o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na arte a qual a invenção pertence. Apesar de quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui poderem ser usados na prática para testar a

44/213 presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos aqui. Na descrição e reivindicação da presente invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições estabelecidas abaixo.

Uma planta pode ser uma planta inteira, qualquer parte desta, ou uma célula ou cultura de tecido derivada a partir de uma planta. Logo, o termo planta pode se referir a qualquer um dos seguintes: plantas inteiras, componentes ou órgãos de planta (ex., folhas, caules, raízes, etc.), tecidos vegetais, sementes, células vegetais, e/ou prole da mesma. Uma célula vegetal é uma célula de uma planta, ou derivada através de cultura a partir de uma célula retirada de uma planta. Logo, o termo planta de milho inclui plantas de milho inteiras, células vegetais de milho, protoplasto de planta de milho, célula de planta de milho ou cultura de tecido de milho pelas quais plantas de milhos podem ser regeneradas, calos de plantas de milhos, aglomerados de planta de milho e células de planta de milho que estão intactas em plantas de milho ou partes de plantas de milho, tais como sementes de milho, espigas de milho, flores de milho, cotilédones de milho, folhas de milho, caules de milho, botões de milho, raízes de milho, meristemas radiculares de milho e similares.

Germoplasma se refere ao material genético de ou a partir de um indivíduo (ex., uma planta), um grupo de indivíduos (ex., uma linhagem, variedade ou família de plantas), ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultura. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode ser separado a partir de um organismo ou célula. De maneira geral, o germoplasma provê material genético com um esqueleto molecular específico que provê a fundação física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultura de células. Como usado aqui, germoplasma inclui células, sementes ou tecidos das

45/213 favorável é ο contribui pra, quais novas plantas podem ser formadas, ou partes de plantas, tais como folhas, caules, pólen, ou células, que podem ser cultivados para formar uma planta inteira.

O termo alelo se refere a um de dois ou mais sequências nucleotídicas diferentes que ocorrem em um lócus específico. Por exemplo, um primeiro alelo pode ocorrer em um cromossomo, enquanto um segundo alelo ocorre em um segundo cromossomo homólogo, ex., como ocorrer em cromossomos diferentes de um indivíduo heterozigoto, ou entre diferentes indivíduos homozigotos ou heterozigotos em uma população. Um alelo alelo em um lócus particular que confere, ou um fenótipo agricolamente desejado, ex. , resistência ao MRCV, ou alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas suscetíveis que podem ser removidas a partir de um programa ou plantio de cultivo. Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável, ou alternativamente, que segrega com o fenótipo de planta suscetível, portanto provendo o benefício da identificação de plantas propensas a doenças. Uma forma de alelo favorável de um segmento cromossômico que inclui uma seqüência nucleotídica que contribui para um desempenho agrícola superior em um ou mais loci genéticos localizados fisicamente no segmento cromossômico. Uma freqüência alélica se refere à freqüência (proporção ou porcentagem) na qual um alelo está presente em um lócus dentro de um indivíduo, dentro de uma linhagem, ou dentro de uma população de linhagens. Por exemplo, para um alelo A, indivíduos diplóides com genótipo AA, Aa, ou aa apresentam freqüências alélicas de 1,0,

0,5, ou 0,0, respectivamente. Pode ser estimada a freqüência alélica dentro de uma linhagem através da média das freqüências alélicas de uma amostra de indivíduos daquela linhagem. De maneira similar, pode ser calculada a freqüência alélica dentro de uma população de linhagens através da média

46/213 das freqüências alélicas das linhagens que constituem a população. Para uma população com um número finito de indivíduos ou linhagens, uma freqüência alélica pode ser expressa como uma contagem de indivíduos ou linhagens (ou qualquer outro grupamento especificados) contendo o alelo.

Um alelo se correlaciona positivamente com um traço quando o primeiro está ligado ao segundo e quando a presença do alelo é um indicador de que o traço desejado ou forma de traço ocorre em uma planta contendo o alelo. Um alelo se correlaciona negativamente com um traço quando o primeiro está ligado ao segundo e quando a presença do alelo é um indicador de que o traço desejado ou forma de traço não ocorre em uma planta contendo o alelo.

Um indivíduo é homozigoto se o indivíduo apresenta somente um tipo de alelo em um dado lócus (ex. , um indivíduo diplóide apresenta uma cópia do mesmo alelo em um lócus para cada um dos dois cromossomos homólogos) . Um indivíduo é heterozigoto se mais de um tipo de alelo está presente em um dado lócus (ex., um indivíduo diplóide com uma cópia de cada um dos dois diferentes alelos). O termo homogeneidade indica que membros de um grupo apresentam o mesmo genótipo em um ou mais loci especificados. Em contraste, o termo heterogeneidade é usado para indicar que indivíduos dentro do grupo diferem em genótipo em um ou mais loci especificados.

Um lócus é uma região cromossômica onde um ácido nucléico polimórfico, determinante de traço, gene ou marcador está localizado. Logo, por exemplo, um lócus gênico está em uma localização cromossômica específica no genoma de uma espécie onde um gene específico pode ser encontrado.

O termo lócus de traço quantitativo ou QTL se refere a um lócus genético polimórfico com pelo menos um alelo que correlaciona com a expressão diferencial de um traço fenotípico em pelo menos um background genético, ex. , em

47/213 ácido a uma pelo menos um população ou prole de criação. Um QTL pode agir através de um mecanismo de gene único ou através de um mecanismo poligênico.

Os termos marcador, marcador molecular, nucléico marcador, e lócus marcador se referem seqüência nucleotídica ou produto codificado a partir deste (ex., uma proteína) usado como um ponto de referência na identificação de um lócus ligado. Um marcador pode ser derivado a partir de uma seqüência nucleotídica genômica ou a partir de sequências nucleotídicas expressas (ex., a partir de uma RNA que sofreu splicing ou um cDNA) , ou a partir de um polipeptídeo codificado. O termo também se refere a seqüências de ácido nucléico complementares a ou flanqueando seqüências marcadoras, tais como ácidos nucléicos usados como sondas ou pares de oligos capazes de amplificar a seqüência marcadora. Uma sonda marcadora é um ácido nucléico ou molécula que pode ser usado para identificar a presença de um lócus marcador, ex. , uma sonda de ácido nucléico que é complementar ao uma seqüência de lócus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora se refere a uma sonda de qualquer tipo que é capaz de distinguir (ex., genótipo) o alelo particular que está presente em um lócus marcador. Ácidos nucléicos são complementares quando eles hibridizam especificamente em solução, ex., de acordo com as regras de pareamento de bases de Watson-Crick. Um lócus marcador é um lócus que pode ser usado para rastrear a presença de um segundo lócus ligado, ex., um lócus ligado que codifica ou contribui para a expressão de um traço fenotípico. Por exemplo, um lócus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em um lócus, tal como um QTL, que está geneticamente ou fisicamente ligado a um lócus marcador. Logo, um alelo marcador, alternativamente um alelo de um lócus marcador, é um dentre uma pluralidade de seqüências

48/213 nucleotídicas polimórficas encontrado em um lócus marcador em uma população que é polimórfica para o lócus marcador. Em alguns aspectos, a presente invenção provê loci marcadores correlacionados com a resistência ao MRCV em milho. Cada um dos marcadores identificados é esperado para estar em forte proximidade física e genética (resultando na ligação física e/ou genética) com um elemento genético, ex. , um QTL, que contribui com a resistência.

Marcadores genéticos são ácidos nucléicos que são polimórficos em uma população e onde os alelos dos quais podem ser detectados e distinguidos por um ou mais métodos analíticos, ex., RFLP, AFLP, isoenzima, SNP, SSR, e similares. 0 termo também se refere a seqüências de ácido nucléico complementares a seqüências genômicas, tais como ácidos nucléicos usados como sondas.

Marcadores correspondendo a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados através de métodos bem estabelecidos na arte. Esses incluem, ex., métodos de amplificação específica de seqüência baseados em PCR, detecção de polimorfismos de tamanho de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isoenzimas, polimorfismos de polinucleotídeo através de específica de alelo (ASH), detecção de seqüências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de repetições de seqüência simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs). Métodos bem estabelecidos também são conhecidos para a detecção de ESTs e marcadores SSR derivados de seqüências EST e DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD).

Um mapa genético é uma descrição das relações de ligação genética dentre loci em um ou mais cromossomos (ou detecção de hibridização grupos de ligação) em uma dada especie, geralmente

49/213 representada de forma diagramática ou tabular. Mapeamento genético é o processo de definição de relações de ligação dos loci através do uso de segregando os marcadores, marcadores genéticos, populações e princípios genéticos padrão de freqüência de recombinação. Uma localização de mapa genético é uma localização em um mapa genético relativa aos marcadores genéticos próximos no mesmo grupo de ligação onde um marcadores específico pode ser encontrado dentro de uma dada espécie. Em contraste, um mapa físico do genoma se refere a distâncias absolutas (por exemplo, medida em pares de base ou fragmentos genéticos contíguos isolados e sobrepostos, ex., contigs) . Um mapa físico do genoma não leva em consideração o comportamento genético (ex., freqüências de recombinação) entre diferentes pontos no mapa físico.

Uma freqüência de recombinação genética é a freqüência de um evento de Crossing over (recombinação) entre dois loci genéticos. A freqüência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou traços após a meiose. Uma freqüência de recombinação genética pode ser expressa em centimorgans (cM) , onde um cM é a distância entre dois marcadores genéticos que apresentam uma freqüência de recombinação de 1% (ex., um evento de crossing-over ocorre entre esses dois marcadores uma vez a cada 100 divisões celulares).

Como usado aqui, o termo ligação é usado para descrever o grau com o qual um lócus marcador está associado com outro lócus marcador ou algum outro lócus (por exemplo, um lócus de resistência).

Como usado aqui, equilíbrio de ligação descreve a situação onde dois marcadores segregam independentemente, ex., se distribuem pela prole aleatoriamente. Marcadores que apresentam equilíbrio de ligação são considerados não ligados (estando ou não presentes no mesmo cromossomo).

50/213

Como usado aqui, desequilíbrio de ligação descreve a situação onde dois marcadores segregam de maneira não aleatória, ex., apresentam uma freqüência de recombinação de menos que 50% (e, por definição, estão separadas por menos de cM no mesmo grupo de ligação). Marcadores que apresentam desequilíbrio de ligação são considerados ligados. A ligação ocorre quando o lócus marcador e um lócus ligado são encontrado juntos em plantas da prole mais frequentemente do que separados nas plantas da prole. Como usado aqui, ligação pode ser entre dois marcadores, ou alternativamente entre um marcador e um fenótipo. Um lócus marcador pode estar associado com (ligado a) um traço, ex. , um lócus marcador pode estar associado com a resistência recém-conferida ou resistência aumentada a um patógeno vegetal quando o lócus marcador está em desequilíbrio de ligação com o traço de resistência. O grau de ligação de um marcador molecular com um traço fenotípico é medido, ex., como uma probabilidade estatística de cosegregação daquele marcador molecular com o fenótipo.

Como usado aqui, a relação de ligação entre um marcador molecular e um fenótipo é dada como uma probabilidade ou probabilidade ajustada. O valor de probabilidade é a propensão estatística de que a combinação particular de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador aleatória. Logo, quanto menor o grau de maior a propensão de que um fenótipo e um marcador particular irão co-segregar. Em alguns aspectos, o grau de probabilidade é considerado significativo ou não significativo. Em algumas concretizações, um grau de probabilidade de 0,05 (p=0,05, ou uma probabilidade de 5%) de particular é probabilidade, distribuição aleatória considerado uma indicação significativa de co-segregação. Porém, a presente invenção não está limitada a esse padrão particular, e uma probabilidade aceitável pode ser qualquer probabilidade menor que %0%

51/213 (p=0,5). Por exemplo, uma probabilidade significativa pode ser menor que 0,25, menor que 0,20, menor que 0,15, ou menor que 0,1.

O termo ligado fisicamente é às vezes usado para indicar que dois loci, ex., dois loci marcadores, estão fisicamente presentes no mesmo cromossomo.

De maneira vantajosa, dois loci ligados estão localizados em grande proximidade de modo que a recombinação entre pares de cromossomos homólogos não ocorram entre dois loci durante a meiose com alta freqüência, ex., de modo que loci ligados cosegreguem pelo menos por volta de 90% das vezes, ex., 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.75% das vezes, ou mais.

A frase fortemente ligado, no presente pedido, significa que a recombinação entre dois loci ligados ocorre com uma freqüência de igual ou menos que por volta de 10% estão separados em um mapa genético por não mais que 10 (ex CM) segregam pelo menos especialmente úteis

Em outras palavras, 90% na cosão eles

Em outros aspectos, úteis são aqueles os loci fortemente ligados das vezes. Loci marcadores presente invenção quando demonstram uma probabilidade significativa de co-segregação (ligação) com um traço desejado (ex., resistência patogênica). Por exemplo, em alguns aspectos, esses marcadores podem ser chamados de marcadores de QTL ligados marcadores moleculares especialmente marcadores que estão ligados ou fortemente ligados.

Em alguns aspectos, ligação pode ser expressa como qualquer limite ou intervalo desejado. Por exemplo, em algumas concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que 50 cM de unidades de mapa. Em outras concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que 40 cM. Em outras concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que

52/213 cM. Em outras concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que 25 cM. Em outras concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que 20 cM. Em outras concretizações, dois loci ligados são dois loci que estão separados por menos que 15 cM. Em alguns aspectos, é vantajoso definir um intervalo de ligação, por exemplo, entre 10 e 20 cM, ou entre 10 e 30 cM, ou entre 10 e 40 cM.

O quanto mais fortemente um marcador está ligado a um 10 segundo lócus, melhor indicador do segundo lócus aquele t marcador se torna. Logo, em uma concretização, loci fortemente

	ligados tal como	um	lócus	marcador e	um segundo	lócus
	apresentam uma freqüência de	recombinação	inter-	lócus de 10%
	ou menos, preferencialmente por	volta de	9% ou	menos,	ainda
15	mais preferencialmente	por volta	de 8% ou menos	, ainda	mais
	preferencialmente	por	volta	de	7% ou	menos,	ainda	mais
	preferencialmente	por	volta	de	6% ou	menos,	ainda	mais
	preferencialmente	por	volta	de	5% ou	menos,	ainda	mais
	preferencialmente	por	volta	de	4% ou	menos,	ainda	mais
20	preferencialmente	por	volta	de	3% ou menos, e	i ainda	mais

preferencialmente por volta de 2% ou menos. Em concretizações altamente preferenciais, os loci relevantes apresentam uma freqüência de recombinação de por volta de 1% ou menos, ex. , apor volta de 0,75% ou menos, mais preferencialmente por volta de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente por volta de 0,25%. Dois loci que estão localizados no mesmo cromossomo, e a tal distância de modo que a recombinação entre dois loci ocorre a freqüências de menos que 10% (ex., por volta de 9 %,

8%, 7%,	6%,	5%, 4%, 3%,	2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos)
30 também	são	ditos serem	proximais um ao outro.	Em	alguns
casos,	dois	marcadores	diferentes podem apresentar	as	mesmas

coordenadas de mapa genético. Nesse caso, os dois marcadores

53/213 estão em tal forte proximidade um do outro que a recombinação ocorre entre eles com tal baixa freqüência que é indetectável.

Quando se trata da relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético contribuindo com a resistência e um marcador proximal, o acoplamento da fase de ligação indica o estado onde o alelo favorável no lócus de resistência está fisicamente associado na mesma fita cromossômica da alelo favorável do respectivo lócus marcador ligado. Em fase de acoplamento, ambos alelos favoráveis são herdados juntos pela prole que herdou aquela fita cromossômica. Em fase de ligação de repulsão, o alelo favorável no lócus de interesse está fisicamente ligado com um alelo desfavorável no lócus marcador proximal, e os dois alelos favoráveis não são herdados juntos (ex., os dois loci estão fora de fase um com o outro).

Como usado aqui, os termos intervalo cromossômico ou segmento cromossômico designa um abrangência linear contínua de DNA genômico que reside in planta em um único cromossomo. Os elementos genéticos ou genes localizados em um único intervalo cromossômico estão fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado.

Em alguns aspectos, por exemplo, no contexto da presente invenção, geralmente os elementos genéticos localizados dentro de um único intervalo cromossômico são também geneticamente ligados, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética de, por exemplo, menos que ou igual 2 0 cM, ou alternativamente, menos que ou igual 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um único intervalo cromossômico sofrem recombinação a uma freqüência de menos que ou igual a

20% ou 10%.

Em um aspecto, qualquer marcador da invenção está ligado (geneticamente e fisicamente) a qualquer outro marcador que está a ou menos de 50 cM de distância. Em outro aspecto,

54/213 qualquer marcador da invenção está fortemente ligado (geneticamente e fisicamente) a qualquer outro marcador que está bem próximo, ex., a ou menos que 10 cM de distância. Dois marcadores fortemente ligados no mesmo cromossomo pode estar posicionados 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos um do outro.

A frase doença causada pelo Mal de Rio Cuarto Virus ou doença causada pelo MRCV se refere à doença vegetal causada por uma infecção da planta com MRCV.

Resistência recém-conferida ou resistência aumentada em uma planta de milho ao MRCV é uma indicação que a planta de milho é menos afetada a respeito à produtividade e/ou sobrevivência ou outras medidas agrícolas relevantes, mediante introdução dos agentes causativos dessa doença. Resistência é um termo relativo, indicando que a planta infectada apresentada melhor produtividade de milho que outra planta similarmente tratada, mais suscetível. Isto é, as condições causam um decréscimo reduzido na sobrevivência de milho e/ou produtividade em uma planta resistente de milho, quando comparado com uma planta de milho suscetível.

Alguém versado irá apreciar que resistência de planta de milho ao MRCV varia enormemente, pode representar um espectro de fenótipos mais resistentes ou menos resistentes, e pode variar dependendo da severidade da infecção. Porém, através de simples observação, alguém versado pode determinar a resistência relativa ou suscetibilidade de plantas diferentes, linhagens de plantas ou famílias de plantas ao MRCV, e além disso, irá também reconhecer as gradações fenotípicas de resistente (um sistema de classificação exemplar é apresentado no Exemplo 7 abaixo) . Como usado na arte, resistência é as vezes referido como resistência geral, resistência de redução de taxa, ou resistência parcial.

55/213 termo cruzado ou cruzamento no contexto dessa invenção significa a fusão dos gametas via polinização para produzir prole (ex., células, sementes ou plantas). 0 termo engloba tanto cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) quanto auto-cruzamento (auto-polinização, ex., quando o pólen e o óvulo são da mesma planta).

termo introgressão se refere à transmissão de um alelo desejado de um lócus genético de um background genético para outro. Por exemplo, introgressão de um alelo desejado em um lócus específico pode ser transmitida para pelo j menos uma prole através de um cruzamento sexual entre dois parentais da mesma espécie, onde pelo menos um dos parentais apresenta o alelo desejado em seu genoma. Alternativamente, por exemplo, transmissão de um alelo pode ocorrer através de recombinação entre dois genomas doadores, ex. , em um protoplasto fusionado, onde pelo menos um dos protoplastos doadores apresenta o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, ex., um alelo selecionado de um marcador, um QTL, um transgene, ou similares. Em qualquer caso, prole contendo o alelo desejado pode ser cruzado repetidamente com uma linhagem apresentando um desejado background genético e selecionado para um alelo desejado, com o intuito de resultar no alelo se tornando fixado em um background genético selecionado.

Uma linhagem ou cepa é um grupo de indivíduos de parentesco idêntico que são geralmente endocruzados a um certo nível e que são geralmente homozigotos e homogêneos na maioria dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). Uma sub-linhagem se refere a um subconjunto endocruzado de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos similarmente endocruzados descendentes do mesmo progenitor.

Uma linhagem ancestral é uma linhagem parental usada como fonte de genes, ex. , para o desenvolvimento de linhagens

56/213 elite. Uma população ancestral é um grupo de ancestrais que contribuíram para o conjunto de variação genética que foi usada para desenvolver linhagens elite. Descendentes são a prole de ancestrais, e pode ser separada do seus ancestrais por muitas gerações de criação. Por exemplo, linhagens elite são os descendentes de seus ancestrais. Uma estrutura de estirpe define a relação entre um descendente e cada ancestral que deu origem àquele descendente. Uma estrutura de estirpe pode abranger uma ou mais gerações, descrevendo relações entre o descendente e seus pais, avós, bisavós, etc.

Uma linhagem elite ou cepa elite é uma linhagem agricolamente superior que resultou de muitos ciclos de criação e seleção para desempenho agrícola superior. Numerosas linhagens elite estão disponíveis e são conhecidas daqueles versados na arte de criação de milho. Uma população elite é uma amostra de indivíduos ou linhagens elite que pode ser usada para representar estado da arte nos termos de genótipos agricolamente superiores de uma dada espécie de cultivo, tal como milho. Similarmente, um germoplasma elite ou cepa elite de germoplasma é um germoplasma agricolamente superior, tipicamente derivado a partir de e/ou capaz de dar origem a uma planta com desempenho agricolamente superior, tal como uma linhagem elite de milho existente ou recémdesenvolvida.

Em contraste, uma cepa exótica de milho ou um germoplasma exótico de milho é uma cepa ou germoplasma derivado de um milho não pertencente a uma linhagem ou cepa elite de germoplasma de milho disponível. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou germoplasma, um germoplasma exótico não é relacionado por descendência com o germoplasma elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem elite conhecida de milho, mas ao cepas de fortemente

57/213 invés é selecionado a introduzir elementos genéticos novos (tipicamente alelos novos) em um programa de melhoramento.

termo amplificando no contexto de amplificação de ácido nucléico é qualquer processo onde cópias adicionais de um ácido nucléico selecionado (ou uma forma transcrita deste) são produzidas. Métodos típicos de amplificação incluem vários métodos de replicação baseados em polimerase, incluindo a reação da polimerase em cadeia (PCR), métodos mediados por ligase tal como a reação da ligase em cadeia (LCR) e métodos de amplificação baseada na RNA polimerase (ex., através de transcrição). Um amplicon é um ácido nucléico amplificado, ex., um ácido nucléico que é produzido através de amplificação de um ácido nucléico molde, ex. , um ácido nucléico que é produzido através da amplificação de um ácido nucléico molde por qualquer método de amplificação disponível (ex., PCR, LCR, transcrição, ou similares).

Um ácido nucléico genômico é um ácido nucléico que corresponde em seqüência a um ácido nucléico herdável em uma célula. Exemplos comuns incluem DNA genômico nuclear e amplicons deste. Um ácido nucléico genômico é, em alguns casos, diferentes de um RNA que sofreu splicing, ou um cDNA . correspondente, de modo que RNA processado por splicing ou cDNA é processado, ex. , pela maquinaria de splicing, para remoção dos íntrons. Ácidos nucléicos genômicos opcionalmente consistem de sequências não transcritas (ex., seqüências cromossômicas estruturais, regiões promotoras, ou regiões de intensificador) e/ou seqüências não traduzidas (ex., íntrons), enquanto RNA que sofreu splicing/cDNA tipicamente não apresenta seqüências não transcritas ou íntrons. Um ácido nucléico molde é um ácido nucléico que serve como um molde em uma reação de amplificação (ex., uma reação de amplificação baseada em polimerase tal como PCR, reação de amplificação mediada por ligase tal como LCR, uma reação de transcrição, ou

58/213 similares). Um ácido nucléico molde pode ser genômico em origem, ou alternativamente, pode ser derivado de seqüências expressas, ex., um cDNA ou um EST.

Um ácido nucléico exógeno é um ácido nucléico que não é nativo a um sistema específico (ex., um germoplasma, planta ou variedade), no que diz respeito à seqüência, posição genômica, ou ambas. Como usado aqui, os termos exógeno ou heterólogo quando aplicado aos polinucleotídeos ou polipeptídeos tipicamente se referem a moléculas que foram artificialmente fornecidas a um sistema biológico (ex., uma célula vegetal, um

I gene vegetal, uma espécie ou variedade vegetal ou um cromossomo vegetal sob estudo) e não são nativos àquele sistema biológico particular. Os termos podem indicar que o material relevante é originado a partir de uma fonte outra senão uma fonte que ocorre naturalmente, ou pode se referir a moléculas apresentando uma configuração, localização genética ou arranjo de partes não naturais.

Em contraste, por exemplo, um gene nativo ou endógeno é um gene que não contém elementos de ácido nucléico codificado por fontes outras senão o cromossomo ou outros elementos genéticos nos quais o gene é normalmente encontrado na natureza. Um gene endógeno, transcrito ou polipeptídeo é codificado pelo seu lócus cromossomal natural, e não é artificialmente suprida à célula.

O termo recombinante em referência a um ácido nucléico ou polipeptídeo indica que o material (ex., um ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, ou polipeptídeo recombinantes) foi alterado através de intervenção humana. Geralmente, o arranjo de partes de uma molécula recombinante não é uma recombinação nativa, ou a seqüência primária do polinucleotídeo ou polipeptídeo recombinantes foi de alguma forma manipulada. A alteração para produzir o material recombinante pode ser desempenhado no material em si ou removido de seu ambiente ou

59/213 estado naturais. Por exemplo, um ácido nucléico que ocorre naturaimente se torna um ácido nucléico se ele for alterado, ou se ele é transcrito a partir de DNA que foi alterado, através de intervenção humana desempenhada na célula da qual ele se origina. Uma fase aberta de leitura de sequência gênica é recombinante se aquela sequência nucleotídica foi removida de seu contexto natural e clonado em qualquer tipo de vetor de ácido nucléico artificial. Protocolos e reagentes para produzir moléculas recombinantes, especialmente ácidos nucléicos recombinantes, são comuns e rotineiros na arte. Em | uma concretização, um cromossomo artificial pode ser criado e inserido em plantas de milho através de qualquer método conhecido na arte (ex., processos de transferência direta, tais como, ex., absorção de DNA induzida por PEG, fusão de protoplasto, microinjeção, eletroporação, e bombardeamento de microprojéteis). Um cromossomo artificial é uma peça de DNA que pode replicar estavelmente e segregar juntamente com cromossomos endógenos. O cromossomo artificial tem a capacidade de acomodar e expressar genes heterólogos inseridos nele. Integração de DNA heterólogo em uma região megareplicadora (sítio de iniciação de replicação primária de centrômeros) ou em grande proximidade desta, inicia um amplificação em larga escala de segmentos cromossomais na casa de megabases, que leva à formação de novo de cromossomos.

Veja, ex. , U.S. Patent No. 6.077.697, incorporada aqui por referência.

O termo recombinante pode também se referir a um organismo que carrega material recombinante, ex. , uma planta que contém um ácido nucléico recombinante é considerada uma planta recombinante. Em algumas concretizações, um organismo recombinante é um organismo transgênico.

O termo introduzido quando se referindo à translocação de um ácido nucléico heterólogo ou exógeno para uma célula, se

60/213 refere à incorporação do ácido nucléico na célula usando qualquer metodologia. O introdução de ácidos termo engloba tais métodos de nucléicos como transfecção, transformação, e transdução.

Como usado aqui, o termo vetor é usado em referência a polinucleotídeo ou outras moléculas que transferem segmento(s) de ácido nucléico para uma célula. O termo veículo é às vezes usados intercambiavelmente com vetor. Um vetor opcionalmente consiste de partes que medeiam a manutenção do vetor e permite seu uso intencional (ex., seqüências | necessárias para replicação, genes conferindo resistência a drogas e antibióticos, um sítio múltiplo de clonagem, ou elementos promotores/intensificadores operacionalmente ligado que permitem a expressão de um gene clonado) . Vetores são freqüentemente derivados de plasmídeos, bacteriófagos, ou vírus animal ou vegetal. Um vetor de clonagem ou vetor de transporte contém parte operacionalmente ligada que facilitam etapas de sub-clonagem (ex., sítio múltiplo de clonagem contendo sítios múltiplos de endonuclease de restrição).

O termo vetor de expressão como usado aqui se refere a um vetor contendo seqüências polinucleotídicas operacionalmente ligadas que facilita a expressão de uma seqüência codificante em um organismo hospedeiro particular (ex. , um vetor de expressão bacteriana ou um vetor de expressão vegetal). Seqüências polinucleotídicas que facilitam a expressão em procariotos tipicamente incluem, ex., um promotor, um operador (opcional), e um sítio de ligação de ribossomo, geralmente juntamente com outras seqüências. Células eucarióticas podem usar promotores, intensificadores, sinais de terminação e poliadenilação e outras seqüências que são geralmente diferentes daquelas usadas pelos procariotos.

O termo planta transgênica se refere a uma planta que contém dentro de suas células um polinucleotídeo heterólogo.

61/213 foi alterado incluindo aqueles ácido nucléico heterólogo ou células transgênicos

Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é estavelmente integrado dentro do genoma de modo que o polinucleotídeo é passado para gerações sucessivas. 0 polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado em um genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante. Transgênico(a) é usado aqui para se referira qualquer célula, linhagem de célula, calo, tecido, parte de planta ou planta, o genótipo do qual pela presença de organismos inicialmente alterados, assim como aqueles criados através de | cruzamento ou propagação assexuada a partir de organismo transgênico inicial ou célula. O termo transgênico(a) como usado aqui não engloba a alteração do genoma (cromossomal ou extra-cromossomal) através de métodos convencionais de cultivo de planta (Ex., cruzamentos) ou através de eventos que ocorrem naturalmente tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transposição não recombinante, ou mutação espontânea.

Clonagem posicionai é um procedimento de clonagem no qual o ácido nucléico alvo é identificado e isolado através de sua proximidade genômica com um ácido nucléico marcador. Por exemplo, um clone de ácido nucléico genômico pode incluir parte ou a totalidade de duas mais regiões cromossomais que são proximais um ao outro. Se um marcador pode ser usado para identificar o clone de ácido nucléico genômico de um biblioteca genômica, métodos padrão tais como sub-clonagem e seqüenciamento podem ser usados para identificar e/ou isolar sub-seqüências do clone que está localizado próximo ao marcador.

Um ácido nucléico especificado é derivado de um dado ácido nucléico quando ele é construído usando uma dada seqüência de ácido nucléico, ou quando o ácido nucléico especificado é construído usando o dado ácido nucléico. Por

62/213 traço observável (o alelo(s) de um ou mais exemplo, um cDNA ou EST é derivado a partir de um mRNA expresso.

termo elemento genético ou gene se refere a uma sequência herdável de DNA, ex. , uma sequência genômica, com funcionalidade significativa. 0 termo gene pode também ser usado para se referir a, ex., um cDNA e/ou um mRNA codificado por uma sequência genômica, assim como àquela sequência genômica.

termo genótipo é a constituição genética de um 10 indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos, como contrastado com o fenótipo). Genótipo é definido pelo(s) loci conhecidos que o indivíduo tenha herdado de seus parentais. 0 termo genótipo pode ser usado para se referir a 15 uma constituição genética de um indivíduo em um único lócus, em múltiplos loci, ou, de maneira mais geral, o termo genótipo pode ser usado para se referir a uma constituição genética de um indivíduo em relação a todos os genes em seu genoma. Um haplótipo é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de 20 loci genéticos. Tipicamente, o loci genético descrito por um haplótipo estão fisicamente e geneticamente ligados, ex. , no mesmo segmento cromossômico.

Os termos fenótipo, ou traço fenotípico ou traço se refere a um ou mais traços de um organismo. 0 fenótipo pode ser observável a olho nu, ou através de qualquer outro meio de avaliação conhecido na arte, ex., microscopia, análise bioquímica, análise genética, ou um ensaio para uma resistência de doença em particular. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado através de um único gene ou lócus genético, ex., um traço de gene único. Em outros casos, um fenótipo é o resultado de vários genes.

Um fenótipo molecular é um fenótipo detectável a nível populacional de (uma ou mais) moléculas. Tais moléculas podem

63/213 ser ácidos nucléicos tais como DNA genômico ou RNA, proteínas, ou metabólitos. Por exemplo, um fenótipo molecular pode ser um perfil de expressão de um ou mais produtos gênicos, ex., em um estágio do desenvolvimento vegetal específico, em resposta a uma condição ambiental ou estresse, etc. Perfis de expressão são tipicamente avaliados em nível de RNA ou proteína, ex. , em um arranjo de ácido nucléico ou chip ou usando anticorpos ou outras proteínas ligantes.

termo produtividade se refere à produtividade por 10 unidade de área de um produto vegetal particular de valor comercial. Por exemplo, produtividade de milho é comumente medidas em alqueires de sementes por acre ou toneladas métricas de semente por hectare por temporada. A produtividade é afetada por tanto fatores genéticos quanto fatores ambientais. Agronômicos, traços agrícolas, e desempenho agrícola se refere ao traços (e elementos genéticos referentes) de uma dada variedade vegetal que contribui para produtividade ao longo da temporada de cultivo. Traços agrícolas individuais incluem vigor de brotamento, vigor vegetativo, tolerância a estresse, resistência ou tolerância a doenças, resistência a herbicida, ramificação, floração, produção de sementes, tamanho de semente, densidade de semente, porte, potencial de debulhação e similares. Produtividade é, portanto, a culminação final de todos os traços agrícolas.

Um conjunto de marcadores ou sondas se referem a uma coleção ou grupo de marcadores ou sondas, ou dados derivados destes, usados para propósito comum, ex. , identificação de plantas de milho com um traço desejado (ex., resistência ao

MRCV). Frequentemente, dados correspondendo aos marcadores ou sondas, ou dados derivados de seu uso, é armazenado em mídia eletrônica. Cada um dos membros de um conjunto possui utilidade no que diz respeito ao propósito especificado,

64/213 marcadores individuais selecionados a partir do conjunto assim como subconjuntos incluindo alguns, porém não todos, os marcadores também são efetivos no alcance do propósito especificado.

Uma tabela de consulta é uma tabela que correlaciona uma forma de dados com outra, ou uma ou mais formas de dados com um resultado esperado a qual os dados são relevantes. Por exemplo, uma tabela de consulta pode incluir uma correlação entre dados de alelo e um traço esperado que a planta contendo um dado alelo está propensa a apresentar. Essas tabelas podem ser, e tipicamente são, multidimensionais, ex. , levam múltiplos alelos em consideração, e, opcionalmente, levando outros fatores em conta também, tais como background genético, ex., de modo a fazer uma predição de traço.

Um meio ou mídia capaz de ser lido por computador é um meio de armazenamento de informação que pode ser acessado através de um computador usando uma interface disponível ou feita sob encomenda. Exemplos incluem memória (ex., memórias ROM, RAM, ou flash), mídia de armazenamento óptico (ex., CDROM) , mídia de armazenamento magnético ( disco rígido de computador, disquetes, etc.), cartões perfurados, e muitos outros comercialmente disponíveis. A informação pode ser transmitida entre um sistema de interesse e o computador, ou de ou para o computador e uma mídia capaz de ser lida por computador para armazenamento ou acesso de informação armazenada. Essa transmissão pode ser uma transmissão eletrônica, ou pode ser feita através de outros métodos disponíveis, tais como uma conexão de infravermelho, uma conexão sem fio, ou similares.

Instruções de sistema são conjuntos de instruções que podem ser parcialmente ou completamente executados pelo sistema. Tipicamente, os conjuntos de instruções estão presentes como uma programa de computador do sistema.

65/213

Distância Eixo do Y:

de

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQÜENCIAS

Fig. IA apresentam uma análise de associação estruturada de um grupo argentino. Nota: região significativa (valor de p: menor que 0,00005) da posição 65,99 a 85,84. Eixo do X: Distância expressa em cM a partir do extremo do cromossomo 2. Eixo do Y: valor de probabilidade. Fig. 1B apresenta uma análise de associação estruturada de um grupo SS. Nota: marcador significativo principal em MRCVl, MZA1525 na posição 54,62 e MZA11826 na posição 65,99. Eixo do X:

expressa em cM a partir do extremo do cromossomo 2.

valor de probabilidade. Fig. IC apresenta um análise associação estruturada de outro grupo SS. Nota: O marcador de associação localizado na posição mais alta do braço curto do cromossomo 2 foi MZA12899 na posição 53,83 (p= 0,000298). Eixo do X: Distância expressa em cM a partir do extremo do cromossomo 2. Eixo do Y: valor de probabilidade.

Fig. 2 apresenta um intervalo de mapeamento para o cruzamento PH3DTxPH7WT. Cromossomo 2, pico de pontuação LOD: posição 65,89, 46% de variação fenotípica.

Fig. 3A apresenta fotografias de milho apresentando sintomas MRCV. Fig. 3B apresenta fotografias de milho apresentando suscetibilidade ao MRCV.

Fig. 4A apresenta um gráfico de genótipos na região do QTL e fenó tipos medianos (MRCVSC) para um grupo de recombinantes da população BC5F3 de mapeamento de alta resolução provenientes do cruzamento PH3DTxPH7WT. O pedaço do parental resistente no background suscetível e a região de recombinação é mostrada. A região inclui os recombinantes localizados entre MZA1525-98-A e MZA10094-9-A. Fig. 4B apresenta um gráfico de genótipos da região de QTL e fenótipos medianos (MRCVSC) para um grupo de recombinantes da população BC5F3 de mapeamento de alta resolução provenientes do cruzamento PH3DTxPH7WT. O pedaço do parental resistente no

66/213 background suscetível e a região de recombinação é mostrada. A região inclui os recombinantes localizados entre MZA15490 e MZA18224. Também estão inclusos três recombinantes nos intervalos MZA11826 a MZA9105 geneticamente caracterizado. O fenótipo está indicado através de círculos à direita do gráfico (círculos pretos: suscetíveis; círculos brancos: resistentes; círculo com linhas diagonais: mistura de resistente e suscetível; círculos cinza: desconhecido).

Fig. 5 apresenta um intervalo de mapeamento para o 10 cruzamento PH3DTxPH7WT. Cromossomo 2, pico de pontuação LOD: posição 65,99 (MZA2038). MZA11826 e MZA9105 não estão inclusos na análise porque não existem recombinantes em relação a MZA2038 nessa população específica. Nota: o mapa genético foi adaptado para permitir o mapeamento de intervalo na posição

65,99; marcadores MZA16656, MZA15490 e MZA2038 são altamente ligados em distância menores 0,5 cM, porém eles foram artificialmente posicionados a distâncias de 0,5 cM para essa análise específica.

Fig. 6 apresenta uma análise de mapeamento de intervalo para o cruzamento PH9TJxPH890 em regiões específicas de QTL nos cromossomos 2 e 5. Cromossomo 2, pico de pontuação LOD: posição 65,99-68,8. Não existem recombinantes entre os marcadores preferenciais e marcadores na posição 68,8; logo, somente MZA9105 foi incluído como representante de marcadores preferenciais para essa análise.

Fig. 7A apresenta uma foto de uma planta severamente afetada pelo MRCV; ela corresponde a uma isolinhagem em marcadores preferenciais carregando o haplótipo suscetível provenientes do cruzamento PH3DTxPH7WT. Fig. 7B apresenta uma foto de duas fileiras, lado a lado, plantadas na região endêmica de Rio Cuarto, Argentina onde a fileira da esquerda corresponde à isolinhagem carregando o haplótipo suscetível e a fileira da direita corresponde à isolinhagem carregando o

67/213

alelo resistente nos marcadores preferenciais. Essas isolinhagens foram derivadas de uma única planta heterozigota BC5F2 nos marcadores preferenciais proveniente do cruzamento PH3DTXPH7WT.

Fig. 8 apresenta a região de QTL do cromossomo 2 entre os marcadores MZA15490 e MZA2038.

Fig. 9 apresenta um gráfico da região no intervalo de MZA15490 a MZA2038 onde a posição dos fragmentos seqüenciados específicos em um grupo de endocruzados suscetíveis e resistentes representativos é indicado.

Fig. 10 apresenta uma descrição gráfica de um recombinante no intervalo de MZA15490 a MZA2038 intervalo. O ponto de recombinação foi localizado dentro do PCO644442, gerando um gene quimérico a partir dos parentais resistentes (PH7WT) e suscetíveis (PH3DT). A posição dos SNPs e indels está indicado na região seqüenciada.

Fig. 11 apresenta o desempenho (pontuação MRDV) de híbridos de milho sob infecção de MRDV ao longo de classes genotípicas para a região de marcadores preferenciais. -2, 0 e 2 no eixo de X (classe genotípica) representa classes genotípicas de haplótipo suscetível, haplótipo heterozigótico e haplótipo homozigótico resistente, respectivamente.

Fig. 12 é um mapa de intervalo de pontuação fenotípicas medianas ao longo de três temporadas de cultivo para a população de mapeamento PH7WTxPH3DT. Note que o pico de pontuação LOD está próximo de umcl756.

Fig. 13 é um mapa de intervalo composto de pontuações fenotípicas medianas ao longo de três temporadas de plantio para a população de mapeamento PH7WTxPH3DT. Note que o pico de pontuação LOD está próximo do intervalo umcl756-umcl518.

Fig. 14 é um mapa de intervalo composto da população de mapeamento PH9TJxPH890. O pico de pontuação LOD para o QTL MRCVl localizado na posição 65,99-68,8.

68/213

FIG. 15 é um alinhamento de seqüência do ClustalW entre SEQ ID NO:211 (promotor pco644442 do PH7WT) e SEQ ID NO:212 (promotor pco644442 do PH3DT).

Fig. 16 é um alinhamento de seqüência do ClustalW entre SEQ ID NOs: 213-236.

As seguintes descrições resumem a Listagem de Seqüências anexada aqui. A Listagem de Seqüências contém códigos de uma letra para caracteres de seqüência nucleotídica e códigos e um e três letras para aminoácidos como definido de acordo com os padrões da IUPAC-IUB descrito em Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) e The Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984) .

SEQ ID NOs: 1-5, 8-11, 14, 15, 18, 21, 25, 29, 30, 32, 3437, 39, e 42-48 são seqüências consenso para os marcadores encontrados na Tabela 6.

SEQ ID NOs: 6, 7, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 22-24, 26-28,

31, 33, 38, 40, e 41 são Seqüências SNP consenso para os marcadores SNP encontrados na Tabela 7.

SEQ ID NOs: 49-56 são seqüências dos oligos esquerdos e direitos para os marcadores públicos encontrados na Tabela 3.

SEQ ID NOs: 57-172 são os oligos direto externos, diretos internos, reversos internos, e reversos externos para os marcadores MZA encontrados na Tabela 6.

SEQ ID NOs: 173-210 são oligos diretos e reversos para os marcadores SNP encontrados na Tabela 7.

SEQ ID NO:211 é a região promotora PCO644442 da linhagem de milho endocruzada PH7WT.

SEQ ID NO:212 é a região promotora PCO644442 da linhagem de milho endocruzada PH3DT.

SEQ ID NO:213 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PH3DT.

69/213

SEQ ID NO :214 é a região de seqüência incluindo MRQV83 81 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho AP19506160.

SEQ ID NO:215 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho AP19506157.

SEQ ID NO:216 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho AP19506156.

SEQ ID NO:217 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PH7WT.

SEQ ID NO:218 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 630.

SEQ ID NO:219 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQVl0673 para a linhagem endocruzada de milho PHG63.

SEQ ID NO:220 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQVl0673 para a linhagem endocruzada de milho PHK09.

SEQ ID NO:221 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQVl0673 para a linhagem endocruzada de milho PHR33.

SEQ ID NO:222 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 501.

SEQ ID NO:223 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 157.

SEQ ID NO: 224 is é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQVl0673 para a linhagem endocruzada de milho PHK56.

SEQ ID NO:225 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 661.

SEQ ID NO:226 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PHR03.

SEQ ID NO:227 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 1047.

SEQ ID NO:228 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PHJ40.

SEQ ID NO:229 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 274.

70/213

SEQ ID NO :230 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e

MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho 165.

SEQ ID NO:231 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e

MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho B73.

SEQ ID NO:232 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e

MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PHN47.

SEQ ID NO:233 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PH26N.

SEQ ID NO:234 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e 10 MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PHDG9.

SEQ ID NO:235 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho ST10H60.

SEQ ID NO:236 é a região de seqüência incluindo MRQV8381 e MRQV10673 para a linhagem endocruzada de milho PHKP5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A identificação e seleção de plantas de milho que apresentam resistência ao MRCV usando MAS pode prover uma abordagem efetiva e não prejudicial ao meio ambiente para 20 superar perdas causadas por essa doença. A presente invenção provê loci marcadores de milho que demonstram co-segregação estatisticamente significativa com a resistência ao MRCV. A detecção desses loci ou loci ligados adicionais podem ser usados nos programas de melhoramento assistido de milho com o 25 intuito de produzir plantas resistentes, ou plantas com resistência ao MRCV ou um fijivírus relacionado. Os marcadores SSR e SNP marcados identificados aqui estão providos nas Tabelas 1 e 2. Esses marcadores incluem MZA625, MZA16656,

MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105.

Cada um dos marcadores do tipo SSR apresentam uma pluralidade de alelos que podem ser visualizados como amplicons de PCR de diferentes tamanhos. Os oligos de PCR que são usados para gerar os amplicons de marcadores SSR estão

71/213 providos na Tabela 3. Os alelos dos marcadores do tipo SNP são determinados usando um protocolo de hibridização alelo específico, como conhecido na arte. Os oligos de PCR usados para amplificar o domínio SNP, e as sondas específicas de alelo usadas para genotipar o lócus, são providas nas Tabelas 6 e 7.

Tabela

Consenso

MZA

σι

Q H CN O ··

1 SEQ ID 1

co O £

I SEQ ID I

=* O £

D H O w Ui

N0: 5

ID

σι

SEQ ID

N0:10

SEQ

$—1 o £

O W co

00 O £

OI w co

ΟΊ o £

w Ui

N0

0

β

<1>

O

sT

CO

CM

vo

O

00

4J

vo

vo

vo

l>

CO

00

00

X

··

··

..

..

0)

o

o

o

o

O

o

o

o

o

£

£

£

£

£

£

£

£

to

Q

Q

Q

Q

D

Q

Q

Q

b fli

H

H

H

H

H

H

H

H

Oi

O

O

O

O

o

OI

O

(D

w

H

H

w

W

w

M

w

Pi

Ui

Ui

Ui

Ui

Ui

CO

CO

co

o p

Φ

CT*

CO

Γ

ϊ—1

LD

cr*

co

[>

4J

LD

vo

vo

r-

t-~

o

co

co

tí

··

··

..

..

rl

o

o

o

o

O

o

d

d

o

£

£

£

£

£

£

£

£

α

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

M o)

H

H

H

H

H

H

H

H

!>

O

O

O

O

O

O

oi

O

Φ

w

w

w

H

H

H

ω

w

Pi

Ui

Ui

Ui

Ui

Ui

CO

CO

co

0

fl

M

CO

CN

vo

o

co

CN

vo

Φ

ir>

vo

vo

r-

[>

r-

00

00

U

»·

··

··

··

··

•

fl

o

o

o

o

o

o

o

o

rl

£

£

£

£

£

£

£

£

o

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

4->

H

H

H

H

H

H

H

H

Φ

fl

O

O

O

O

O

O

O

OI

rl

W

M

M

w

H

M

W

w

Q

co

Ui

co

Ui

Ui

CO

CO

co

O tí

H

r-

\—1

Lfl

σ>

co

[—

ΐ”1

LO

Φ

LO

vo

VO

vo

Γ

c-

00

00

*<!

4J

• ·

··

··

..

• ·

··

N

X

o

o

o

o

o

O

o

o

£

Φ

£

£

£

£

£

£

£

£

U)

o

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

o

4->

H

H

H

H

H

H

H

H

0>

Φ

•H

fl

O

O

O

O

O

OI

O

Cd

rd

rl

w

w

w

w

w

w

w

w

o

Q

Ui

co

Ui

Ui

Ui

co

co

co

k

T—1

co

0

00

τ—1

in

CO

LD

LD

Ό

00

00

O

CV

LD

ir>

O

in

(0

in

co

<—1

CO

vo

CM

CO

o

00

CO

τ-1

co

4

<

<

<

<d

N

N

N

N

N

N

N

N

IX]

S

s

£

£

£

£

£

£

£

£

73/213

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Η

x—1

H

=p

H

m

H

00

H

rd

H

in

H

en

H

O

H

CM

H

vP

H

X“d

O

x-d

χ-1

X—l

CM

CM

CM

co

co

CO

Ο

♦·

• ·

O

• ·

O

Ol ··

O

O

»«

O

•.

O

cx

cx

W

o

ω

o

w

o

w

o

w

O

w

O

H

o

H

o

w

o

H

o

w

CO

S

CO

S

co

S

co

S

co

a

co

a

CO

a

CO

a

co

a

CO

a

co

o

•=P

CO

CM

LD

o

CO

CM

CM

ld

o

o

o

Γ—1

x-d

CM

CM

CM

co

cd

CD

x—1

χ—1

χ—1

T—t

rd

x—1

x—1

x—1

o

6

o

o

o

õ

o

o

O

o

o

S

a

S

S

a

a

a

a

a

a

a

Q

o

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

O

O

O

O

O

O

O

O

OI

CX

cx

w

ω

H

w

w

w

w

H

H

w

w

co

CO

CO

co

co

co

co

CO

CO

co

co

co

X“H

LD

CD

co

Γ-

X—1

χ—1

LD

CD

o

o

xd

x—1

x—1

CM

CM

co

CTi

cd

CD

x—l

rH

x—1

x—1

x-d

rd

x—1

x—1

6

o

o

õ

o

o

o

o

o

o

o

a

a

14

a

a

a

a

a

a

a

a

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

D

Q

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

o

o

O

O

O

O

O

o

OI

OI

CX

w

H

w

w

w

w

H

H

H

H

M

CO

co

co

co

co

co

CO

CO

CO

CO

CO

CM

LD

o

<=P

co

CM

LD

O

O

xP

00

O

O

x-d

χ—1

X—1

CM

CM

co

cd

ΟΊ

cd

X—1

x—1

x-d

χ—1

x—1

x—1

x-d

x—1

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

a

S

a

a

a

a

a

a

a

a

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

o

O

O

O

CX

O

O

O

OI

Ol

oi

w

ω

w

w

w

H

H

M

w

H

w

co

co

co

CO

co

CO

co

CO

co

CO

co

x—1

LD

CD

co

r-

X—1

LD

ΟΊ

CD

cn

r—

o

O

O

x-d

rd

CM

CN

CM

03

cd

cd

χ—t

x—1

τ—1

χ—1

rd

x—1

x—l

rd

O

o

o

O

o

õ

o

o

o

o

o

a

S

Ά

a

a

a

a

a

a

a

a

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

H

H

H

H

H

H

H

H

H

(—)

H

O

CX

O

O

O

O

O

O

Cd

Ol

CX

W

W

H

H

M

w

H

H

w

H

w

CO

co

CO

CO

CO

co

CO

CO

co

CO

co

τ—1

LD

o

LD

LD

LT>

m

co

00

LD

CTi

CM

cn

CM

LD

>=P

o

o

CO

LD

V

00

^P

CM

o

LD

x—1

00

O

LD

LD

x—1

LD

CO

co

T—1

cn

CM

CM

xd

χ—1

x—1

LT>

CM

<

<

<

tSl

ISI

N

N

EXJ

N

N

N

tsi

tSJ

a

a

a

a

a

a

a

a

a

a

a

74/213

	Q	Q	Q	o	Q	Q	Q	Q	Q	Q
LT)	H VD	H [>	H <33	H CN	h m	H 'tf	H LT)	H VD	H [>	H C0
CO	CO	cn	cn	'tf	'tf		'tf	^P	'tf	'tf
··	o ··	o ··	o ··	O ··	O ··	o ··	O ··	o ··	o ··	O ··
o	w o	w o	w o	w o	W O	ω o	Μ O	ω o	w o	W O
S	ω s	cn a	cn a	cn a	cn a	cn a	cn a	cn a	cn a	cn a
	VD	o	'P	CO	CN	<0	o	'tf	C0	CN
	CO	'f	'tf	sji	LD	LD	<0	<0	<0	[>
	x~d	X”d	x~i	x—1	x—1	X—1	x—1	x—1	x—1	x—1
	d	o	o	o	d	d	d	o	d	o
	a	a	a	a	a	a	a	a	a	a
	Q	Q	Q	Q	Q	o	Q	Q	Q	Q
	H	H	H	H	H	H	H	H	H	H
	O	O	O	O	O	O	O	O	O	O
	w	w	H	H	w	w	ω	M	w	H
	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn
	LD	CT»	cn	r-	x—1	LD	cr»	cn	r-	X—1
	cn	cn	'tf	'tf	LD	LD	LD	<0	<0	r-
	x—1	x~d	x—1	xH	x—1	X—1	x—1	x—1	x—1	x—1
	o	o	o	o	o	o	o	o	o	o
	S	a	a	a	a	a	a	a	a	a
	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q
	H	H	H	H	H	H	H	H	H	H
	Oi	o	o	O	O	o	o	O	O	O
	w	w	w	W	W	w	w	w	ω	w
	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn
	'tf	00	CN	<0	O	=tf	00	CN	<0	O
	cn	cn	'P	=tf	LD	LD	m	V0	<0	[>
	r—1	5—1	x—1	x—1	T—1	X—1	X—1	x—1	x—1	X—1
	o	O	o	o	d	o	o	o	o	o
	a	a	a	a	a	a	a	a	a	a
	Q	Q	Q	Q	o	Q	Q	Q	Q	o
	H	H	H	H	H	H	H	H	H	H
	O	O	O	O	O	O	O	O	O	O
	w	H	M	H	w	w	w	w	M	H
	Cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn
	cn	o	x-d	ld	03	cn	c—-	x-d	LD	03
	cn	cn	'tf	'tf		LD	LD	L0	L0	<0
	ΐ—1	x“d	x“—i	x—1	x~d	x—1	x—1	x—1	x—1	x—1
	o	o	o	o	d	d	o	o	o	o
	a	a	a	a	a	a	a	a	a	a
	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q	Q
	H	H	H	H	H	H	H	H	H	H
	O	O	o	O	O	O	O	O	O	O
	w	M	W	w	w	w	ω	H	H	w
	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn	cn
	o		cn	L0		'tf	'tf
	00	CN	<0	cn	<0	CO	Γ-	ld	VD	c~~
	x—1	'tf	LD	o	CN	cn	CD	'tf	CN	LD
	00	tP	LD	00	ío	o	CN	CN	03	o
	r-1	03	x—	x-H	x~1	X—	X—		CD	LD
			<:		<					<
	N	IS1	isi	tsi	N	N	t-Ί	N	to	N
	a	a	a	a	a	a	a	a	a	a

Tabela

Ο-

(Ü

φ

φ

(0

β

Φ

(0

£

β

β

β

β

α

α

eu

eu

eu

Ω

Ω

eu

Ω

Ζ

Ζ

Ζ

Ζ

Ζ

Ζ

ζ

ω

Ui

ω

Ui

ω

υι

Ui

----

'—'

&

CN

>—κ

ΓΩ

L0

θ'

σ>

Ζ

V0

<0

ο-

ιο

χ—1

ΓΩ

χ-Η

χ—1

θ'

X—1

03

γΗ

ω

•

00

•

<0

··

CN

··

C0

• ·

ο-

• ·

LO

•»

LO

ο

χ—1

ο

X-i

Ο

χ—1

ο

σ>

ο

οι

ο

OJ

ο

00

0

ζ

ζ

Ζ

ζ

ζ

ζ

ζ

(0

ο

ο

ο

ο

ο

Ο

ο

α

Ω

ιφ

Ω

»0

Ω

ιφ

Ω

Ιφ

Ω

ιφ

Ω

Ιφ

Ω

ιφ

φ

H

Ο

Η

ο

Η

ο

Η

ο

Η

Ο

Η

θ’

H

ι>

(0

Ή

•Η

•Η

•Η

Η

•Η

-Η

β

Ο

ω

Oi

ω

Ο

W

ΟΙ

ω

οι

ω

οι

ω

οι

ω

0

W

ο

W

ο

W

ο

ω

ο

W

ο

W

ο

W

ο

υ

ω

Q

Ui

tt

Ui

a

ω

Q

Ui

α

Ui

tt

Ui

tt

ω

ο

ι—1

φ

eu

Ο

ο

<

ο

<

ο

ΓΗ

s

Ζ

ω

ω

Η

Ε-ι

ο

ο

Ε-<

Η

Η

<0

00

σ

CN

<0

ο-

ο-

ο-

00

00

00

00

χ—1

χ—1

X-1

χ—1

χ—I

X—1

X—1

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ζ

Ζ

ζ

ζ

ζ

ζ

ζ

η

ω

Ω

α

ω

Ω

Ω

Ω

Μ

Η

Η

Η

Η

Η

H

Η

Φ

>

Ο

οι

ΟΙ

ΟΙ

CX

ΟΙ

οι

Φ

Μ

W

W

Μ

Η

ω

ω

Ρί

W

Ui

ω

Ui

ω

m

Ui

ΓΩ

LO

ο-

σ\

X—1

ΓΩ

LO

Γ~

ι>

ο-

ο-

00

00

CO

χ—1

rH

χ—1

χ—1

eu

..

··

..

Ζ

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

Ü3

Ζ

Ζ

ζ

Ζ

Ζ

ζ

ζ

ω

0

Ο

Ω

Ω

Ω

Ω

Ω

Ω

ο

jj

H

Η

Η

H

Η

Η

Μ

tn

φ

•Η

Η

OÍ

ΟΙ

οι

ΟΙ

ΟΙ

ΟΙ

ο

ι—1

Η

W

W

W

W

W

Η

ω

ο

α

W

<Ό

W

ω

ω

ω

ω

<

1

1

1

J

ι

1

ι

L0

X—1

CO

ο

σ>

00

L0

ο

ι>

1

Μ

ΓΩ

οι

1

1

1

1

L0

0

1

1

LO

LO

00

00

LO

Ό

m

LO

Ο

Ο

ΓΩ

ΓΩ

<0

η)

ΟΙ

03

τ—1

χ—1

ο

ο

<0

ϋ

<ο

<0

σι

(Τι

Ο)

οι

Μ

&

<

<

<

<

Φ

Ζ

1X1

Ν

Ν

Ν

Ν

1X1

txi

2

W

2

2

2

2

2

2

2

76/213 ίθ α

λ a

ω ο

Cd d

a α

w cq .—i Cd

O «ΰ o·

-H ω

o a

C0

ΟΙ ω

CQ

ΓΟΟ

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ <ϋ β

a a

CQ

CM

Cd

O a

Oi w

CQ o

ϊπ3

O

Ή ω

ο a

ο σ>

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

Η

CQ cn οο

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

Η

CQ (tí α

Ω a

ω

I

CO ιη CO ΙΟ 1—I

Ν a

I

ΟΊ

I ο

cri ιη ιΗ

Ν a

I

1—I ο 00

CO

CM

Ο a

α

Η

ΟΙ ω

CQ

CO cn ο

ιβ ο

•Η ω

ο a

Cd

ΟΊ cu

Μ

CQ <3Ί

Ο a

Ω

Η

CH

Μ

CQ ο

σϊ ιη ι—ι <

td a

I co ^μ

Cd

Ο a

ω

Η

ΟΙ

W

CQ

I ο cn Μ* ιη τ—I

Ν a

Μ¹

Ο ιβ a

Η ω

ο a

^μ cri

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ

ΓΟ cn

ΟΙ

W

CQ

I

Γόη

(0		β		β		β
β		β		β		β
Ω		Ω		Ω		Ω
a		a		a		a
CQ		CQ		ω		CQ
		'—’		'—
		r-		co	___	C—1
Cd	Cd	cd	----	Cd	Cd	m	cn
♦ ·	O	··	cn	• ·	Cd	• ·	m
o	co	o	00	o	cd	o	T—1
a		a		a		a
	o		o		O		o
Ω	ιβ	Ω	Ιβ	Ω	Ιβ	Ω	ιβ
H	o	H	o	H	a	H	a
	•H		-H		-H		•H
O	ω	Oi	ω	Ol	ω	Ol	ω
w	o	W	o	W	o	W	o
CQ	a	CQ	a	CQ	a	CQ	a

ο

Ε-ι (0 β

Ω a

CQ co η

Ο a

cu

Η

CQ ο

ιβ σ

-Η ω

ο a

β β

Ω a

CQ ro

Ο a

α

Η

ΟΙ

Μ

CQ

Ο

CO

Ο ιβ ο

Η ω

ο a

β β

ω a

CQ

Ο sji

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ

CO cn '—I

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ

LD <3Ί

Ο a

Ω

H

ΟΙ

Η

CQ

I

CO

Cd

CsJ a

I co ο

I co Cd co 1—I 1—I < td a

C0

Ο>

ΟΙ

Η

CQ

Γ— σ>

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ <

I

1—I o 00

I co

Cd co <

Cd a

ο σ

Cd

Ο a

ΟΙ

W

CQ <η cn

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

Μ

CQ

I

Γ—

Cd tI cn =d<

CO

Cd

Cd a

Cd ο

Cd

Ο a

Ω

ΟΙ

W

CQ ^μ ο

CN

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

W

CQ <Ο

Ο

Cd

Ο a

Ω

H

ΟΙ

Η

CQ

Ο

Cd

Ο a

ΟΙ ω

CQ

Ο

Cd

Ο a

ΟΙ

Η

CQ co ο

Cd

Ο a

Ω

Η

CM

Μ ω

ιη ο

Cd

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

Η

CQ

Γ—

Ο

Cd

Ο a

Ω

Η

ΟΙ

Η

CQ

I ^μ cd

Cd oo i—I

Cd a

I i—I o

co

I

CO co in in i—I

Cd

I

Cd rd

I cn i

co CO o 00 1—I

Cd a

(ti α

	Οι £ ω
	—1	___
		ΙΓ)
ο	• ·	C0
σ>	ΝΟ	CN
ο		ο
ίίΟ	α	ί(ϋ
ο	Η	ο
Η		Η
ω	Ο	ω
ο	ω	ο
Ρ.	ω	a

ο

7—I CM

Ο £

Q

Η

Ο

W ω

σ>

ο

CM

Ο £

Q

Η

CX

W ω

<ο
η ο 00 7—f
	1
Ν	CO
£	CN

78/213

As tabelas 6 e 7 listam os marcadores SNP que demonstram desequilíbrio de ligação com o fenótipo de resistência ao MRCV. As tabelas provêm as seqüências dos oligos de PCR usados para gerar um amplicon contendo SNP, e as sondas específicas de alelo que são usadas para identificar o alelo SNP em um ensaio de hibridização específica de alelo (ensaio ASH).

Como reconhecido na arte, qualquer outro marcador que está ligado a um marcador de QTL (ex. , um marcador de resistência a doença) também encontra uso para o mesmo propósito. Exemplos de marcadores adicionais que estão ligados aos marcadores de resistência a doença citados aqui são providos. Por exemplo, um marcador ligado pode ser determinado a partir de marcadores fortemente ligados providos na Tabela 8 .

Tabela 8

Marcadores Ligados pco061820a, pcoll6928a, sog0930a, pcol02443, sog5467ac, cl7211_ll, k4-14p, pcol35612a, pcol01521, si687005h09c, si707023g07c, cll5901_la, pcol34907, si660032f12i, cl7048_lb, cl2578_l, cl5312_la, pco094715, sog5829a, cl30_le, pcol25905, sog0690, cl36282_lb, pcoll8508, gpm636, pco066747a, pco083425q, sog5844av, bnlgl458b, si606065el2a, cl22018_l, pco091058, si946053gl0, sogl265, sog0743c, cl9862_l, pcoll4887, bnlgl327, sog5587a, cll488_-4a, pco085208a, sogl295c, sog5609b, sog0912a, tel7sclah, si66060dllb, cll0933_ld, cl37019_la, sogl856ae, pcoll70071, cl40761_la, siaf099388e, pcol37067a, sog2274m, cl31185_3a, pco098939a, pcol51039r, clll825_la, pcol22145b, cl24291_la, si618065b03a, si707029g03a, sogl495a, IDP4006, umcl262a, umcl261a, sog5758o

79/213

Não é o intuito, porém, que marcadores ligados que encontram uso na invenção sejam limitados àqueles citados na Tabela 8.

A invenção também provê intervalo cromossomais de QTL que se correlacionam com a resistência ao MRCV. Esses intervalos estão localizados no grupo de ligação 2. Qualquer marcador localizado dentro desses intervalos encontram uso como um marcador para a resistência MRCV. Esses intervalos incluem:

(i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a.

Métodos para identificação de plantas de milho ou germoplasma que carregam alelos preferenciais dos loci marcadores de resistência são parte integrante da invenção. Nesses métodos, qualquer uma variedade de protocolos de detecção de marcadores são usados para identificar loci marcadores, dependendo do tipo de loci marcadores. Métodos típicos para detecção de marcadores incluem amplificação e detecção dos marcadores amplificados resultantes, ex., através de PCR, LCR, métodos de amplificação baseados em transcrição, ou similares. Esses incluem ASH, detecção de SSR, análise de RFLP e muitos outros.

Apesar de alelos marcadores particulares poderem apresentar co-segregação com o fenótipo de resistência ou suscetibilidade, é importante notar que o lócus marcador não é necessariamente parte do lócus de QTL responsável pela resistência ou suscetibilidade. Por exemplo, não é um requerimento que a seqüência polinucleotídica marcadora seja

80/213 parte de um gene que confira resistência a doença (por exemplo, seja parte de uma fase aberta de leitura de gene) . A associação entre um alelo marcador específico com fenótipo de resistência ou suscetibilidade acoplada original entre o ancestral de milho suscetibilidade foi recombinação repetida, da qual originado. eventos de é devido à fase de ligação alelo marcador na linhagem o alelo de resistência ou Eventualmente, com a Crossing over entre o Por esse marcador e o lócus QTL pode mudar essa orientação motivo, o alelo marcador favorável pode mudar dependendo da fase de ligação que existe dentro do parental resistente usado para criar populações segregantes. Isso não muda o fato de que o marcador genético pode ser usado para monitorar a segregação do fenótipo. Isso somente muda qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população segregante.

Identificação de plantas de milho ou germoplasma que incluem um lócus marcador ou loci marcadores ligados a um traço ou traços de resistência provê uma base para desempenhar seleção assistida por marcador em milho. Plantas de milho que contêm marcadores favoráveis ou alelos favoráveis são selecionados a favor, enquanto plantas de milho que contêm marcadores ou alelos que estão negativamente correlacionados com resistência podem ser selecionados contra. Marcadores e/ou alelos desejados podem ser introgredidos apresentam um background genético desejado exótico) com o intuito de produzir uma planta de milho ou germoplasma resistentes introgredidos. Em alguns aspectos, é contemplado que uma pluralidade de marcadores de resistência são seqüencialmente ou simultaneamente selecionados e/ou introgredidos. As combinações de marcadores de resistência que são selecionadas para uma única planta não está limitada, e pode incluir qualquer combinação de marcadores citadas nas Tabelas 1 e 2, qualquer marcadores ligados aos marcadores em milho que (ex. , elite ou

81/213 citados nas Tabelas 1 e 2, ou quaisquer marcadores localizados dentro dos intervalos de QTL definidos aqui.

Como uma alternativa para métodos de melhoramento padrão de introdução de traços introgressão), abordagens usadas. Nesses métodos, de interesse em milho (ex. , transgênicas podem também ser ácidos nucléicos exógenos que codificam traços ligados aos marcadores são introduzidos em plantas- ou germoplasma-alvo. Por exemplo, um ácido nucléico que codifica para traços de resistência é cionado, ex., 10 através de clonagem posicionai e é introduzido em uma plantaί ou germoplasma-alvo.

Verificação da resistência pode ser desempenhada através de protocolos de resistência disponíveis (veja, ex., Exemplo 10) . Ensaios de resistência são úteis na verificação de se o traço de resistência ainda segrega com o marcador em qualquer planta ou população particular, e, lógico, na medição do grau de resistência aumentada alcançada através de introgressão ou introdução por meio de recombinação do traço em um background desej ado.

Sistemas, incluindo sistemas automatizados para seleção de plantas que contêm um marcador de interesse e/ou para ί correlacionar a presença do marcador com resistência são também parte integrante da invenção. Esses sistemas podem incluir sondas relevantes à detecção de lócus marcador, detectores para detectar marcações nas sondas, elementos de manuseio de fluido e controladores de temperaturas apropriados que são adicionados às sondas e moldes e/ou moldes amplificados, e instruções de sistema que correlacionam detecção de marcação com a presença de um lócus marcador ou alelo particular.

Kits também são parte integrante da invenção. Por exemplo, um kit pode incluir oligos ou sondas apropriadas para detecção de loci marcadores associados com resistência e

82/213 instruções no uso de oligos ou sondas para detecção dos loci marcadores e correlação dos loci com resistência esperada ao MRCV. Os kits podem adicionalmente incluir material de empacotamento para empacotar as sondas, oligos ou instruções, controles tal como reações de amplificação controle que incluem sondas, oligos ou ácidos nucléicos molde, marcadores de peso molecular ou similares.

MARCADORES DE RESISTÊNCIA E ALELOS FAVORÁVEIS

Em análise de ligação tradicionais, nenhum conhecimento da relação física dos genes em um cromossomo é requerida. A primeira lei de Mendel é que fatores de pares de caracteres são segregados, significando que alelos de um traço diplóide são separados em dois gametas e então em prole diferente. Análise de ligação clássica pode ser pensada como uma descrição estatística das freqüências relativas de cosegregação de traços diferentes. Análise de ligação é uma estrutura descritiva bem caracterizada de como traços são agrupados juntos baseados na freqüência com os quais eles segregam juntos. Isto é, se dois traços não alélicos são herdados juntos com uma freqüência maior que a aleatória, eles são ditos ser ligados. A freqüência com o qual traços são herdados juntos é a medida primária de quão fortemente os traços são ligados, ex., traços que são herdados juntos com uma freqüência maior são mais fortemente ligados do que traços que são herdados juntos com uma freqüência menor (porém, ainda acima da freqüência aleatória). Traços são ligados porque os genes que conferem os traços residem no mesmo cromossomo. O mais distante em um cromossomo que os genes residem, menor a probabilidade de eles segregarem juntos, porque cromossomos homólogos recombinam durante a meiose. Logo, o quão mais longe em um cromossomo os genes residem, maior a probabilidade de

83/213 que haverá um evento de Crossing over durante a meiose que irá resultar em dois genes segregando separadamente na prole.

Uma medida comum de ligação é a freqüência com a qual os expresso como uma traços co-segregam. Isso pode ser porcentagem de co-segregação (freqüência de recombinação) ou, também comumente, em centiMorgans (cM) . 0 cM é nomeado em homenagem um geneticista pioneiro chamado Thomas Hunt Morgan e é a unidade de medida de freqüência de recombinação genética. Um cM é igual a 1% de chance de que um traço em um lócus 10 genético será separado de um traço em outro lócus devido ao ) Crossing over em uma única geração (significando que os traços segregam juntos 99% das vezes). Devido ao fato de que a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à freqüência de eventos de Crossing over entre traços, existe 15 uma distância física aproximada que se correlaciona com a freqüência de recombinação. Por exemplo, em milho, 1 cM se correlaciona, em média, com por volta de 2.140.000 pares de bases (2,14 Mbp).

Loci marcadores são eles próprios traços e podem ser acessados de acordo com análise de ligação padrão através de rastreamento dos loci marcadores durante a segregação. Logo,

I no contexto da presente invenção, um cM é igual a uma chance de 1% de que o lócus marcador será separado de outro lócus (que pode ser qualquer outro traço, ex., outro lócus marcador, ou outro lócus de traço que codifica um QTL), devido ao Crossing over em uma única geração. Os marcadores citados aqui, como descritos nas Tabelas 1 e 2, ex., MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105, assim como qualquer um dos intervalos cromossômicos (i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

84/213 (v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a;

foram observados a se correlacionar com resistência recémconferida, resistência aumentada, ou suscetibilidade ao MRCV em milho. Isso significa que os marcadores são suficientemente proximais a um traço de resistência que podem ser usados como prognosticador para um traço de resistência. Isso é extremamente útil no contexto de seleção assistida por marcador (MAS), discutido em mais detalhes aqui. Em resumo, plantas de milho ou germoplasma podem ser selecionados para marcadores ou alelos marcadores que se correlacionam positivamente com resistência, sem ter que, de fato, cultivar o milho e medir para resistência recém-conferida ou resistência aumentada (ou, contrariamente, plantas de milho podem ser selecionadas contra se eles possuírem marcadores que se correlacionam negativamente com a resistência recémconferida ou resistência aumentada). MAS é um atalho poderoso na seleção por fenótipos desejados e para introgressão de traços desejado em cultivares de milho (ex., introgressão de traços desejados em linhagens elite). MAS é facilmente adaptável a métodos de análise molecular em larga escala que pode rapidamente fazer uma varredura de um grande número de material genético de planta ou germoplasma para marcadores de interesse e é muito mais custo-efetivo que o cultivo e observação de plantas para traços visíveis.

Em algumas concretizações, os marcadores de QTL mais preferenciais são um sub-conjunto de marcadores providos nas Tabelas 1 e 2. Por exemplo, os marcadores mais preferenciais são MZA15490 e MZA2038.

Quando fazendo referência à relação entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético contribuindo para resistência e um marcador proximal, fase de ligação acoplada

85/213 indica estado onde o alelo favorável no lócus de mesma fita associado na resistência está fisicamente cromossômica da alelo favorável do respectivo lócus marcador ligado. Em fase de acoplamento, ambos alelos favoráveis são herdados juntos pela prole gue herdou aquela fita cromossômica. Em fase de ligação de repulsão, o alelo favorável no lócus de interesse está fisicamente ligado com um alelo desfavorável no lócus marcador proximal, e os dois alelos favoráveis não são herdados juntos (ex., os dois loci estão fora de fase um com o outro).

Um alelo favorável de um marcador é aquele alelo do marcador que co-segrega com um fenótipo desejado (ex., resistência a doenças). Como usado aqui, um marcador de QTL possui um mínimo de um alelo favorável, apesar de ser possível que o marcador possua dois ou mais alelos favoráveis encontrados na população. Qualquer alelo favorável daquele marcador pode ser usado de maneira vantajosa na identificação e construção de linhagens resistentes de milho. Opcionalmente, um, dois, três ou mais alelos favoráveis de diferentes são identificados, ou introgredidos para uma podem ser selecionados a favor ou contra durante maneira desejada, plantas ou germoplasma são identificados de modo a possuir pelo menos um dos tais alelos favoráveis que se correlacionam positivamente com resistência recém-conferida ou aumentada.

Alternativamente, um alelo marcador que co-segrega com suscetibilidade a doença também encontra uso na invenção, uma vez que aquele alelo pode ser usado para identificar e contraselecionar plantas suscetíveis a doença. Tal alelo pode ser usado para propósitos de exclusão durante o melhoramento para identificar alelos que negativamente se correlacionam com resistência, para eliminar plantas suscetíveis ou germoplasma de subseqüente rodadas de melhoramento.

marcadores planta, e MAS. De

86/213

Em algumas concretizações da invenção, uma pluralidade de alelos marcadores são simultaneamente selecionados a favor em uma planta única ou uma população de plantas. Nesses métodos, plantas são selecionadas que contém alelos favoráveis de mais de um marcador de resistência, ou alternativamente, alelos favoráveis de mais de um marcador de resistência são introgredidos em um germoplasma de milho desejado. Alguém versado na arte reconhece que a seleção simultânea de alelos favoráveis de mais de um marcador de resistência na mesma planta é propenso a resultar em um efeito protetor aditivo (ou mesmo sinergístico) para a planta.

Alguém versado reconhece que a identificação de alelos marcadores favoráveis é específica de germoplasma. A determinação de quais alelos marcadores se correlacionam com resistência (ou suscetibilidade) é determinado para o germoplasma particular sob estudo. Alguém versado reconhece que métodos para identificação de alelos favoráveis são rotineiras e bem conhecidas na arte, e além disso, que a identificação e uso de tais alelos favoráveis está bem dentro do escopo da invenção. Também além disso, a identificação dos alelos marcadores favoráveis em populações de milho além das populações usadas ou descritas aqui está bem dentro do escopo da invenção.

Oligos de amplificação para amplificar loci marcadores do tipo SSR são parte integrante da invenção. Outra parte integrante da invenção são oligos específicos para a amplificação de domínios SNP (marcadores SNP), e as sondas que são usadas para genotipar as seqüências SNP. As tabelas 6 e 7 provêm oligos específicos para amplificação de lócus marcador e sondas para detecção de loci marcadores amplificados. Porém, alguém versado irá imediatamente reconhecer que outras seqüências de qualquer lado de um dado oligo pode ser usada no lugar dos dados oligos, de modo que os oligos podem amplificar

87/213

Laboratory Manual (3^a Ed.), Laboratory, Cold Spring uma região que inclui o alelo a ser detectado. Adicionalmente, será apreciado que a sonda precisa a ser usada para detecção pode variar, ex., qualquer sonda que pode identificar a região de um amplicon marcador a ser detectado pode ser substituída por aqueles exemplos providos aqui. Além disso, a configuração dos oligos de amplificação e sondas de detecção pode, lógico, variar. Logo, a invenção não é limitada aos oligos e sondas especificamente citados aqui.

Em alguns aspectos, métodos da invenção utilizam uma etapa de amplificação para detectar/genotipar um lócus marcador. Porém, será apreciado que a amplificação não é um requerimento para detecção de marcador - por exemplo, pode-se detectar diretamente DNA genômico não amplificado simplesmente através do desempenho de um Southern blot em uma amostra de DNA genômico. Procedimentos para desempenho de Southern blot, amplificação (PCR, LCR, ou similares) e muitos outros métodos de detecção de ácidos nucléicos são bem estabelecidos e são ensinados, ex. , em Sambrook et al. , Molecular Cloning - A Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Harbor, Nova Iorque, 2000 (Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al. , eds., Current Protocols, um trabalho conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementado até 2002) (Ausubel) e PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Detalhes adicionais a respeito de detecção de ácidos nucléicos podem também ser encontrados, ex., em Plant Molecular Biology (1993) Croy (ed.) BIOS Scientific Publishers, Inc. (Croy).

Sondas de detecção separadas podem também ser omitidas em métodos de amplificação/detecção, ex. , através do desempenho de reação de amplificação em tempo real que detecta a formação do produto através da modificação do oligo de amplificação

88/213 relevante mediante à incorporação em um produto, incorporação de nucleotídeos marcados em um amplicon, ou através do monitoramento de mudanças em propriedades de rotação molecular dos amplicons quando comparado com precursores não amplificados (ex., através de polarização de fluorescência).

Tipicamente, marcadores moleculares são detectados através de qualquer método estabelecido disponível na arte, incluindo, sem limitação, hibridização alelo específica (ASH) ou outros métodos para detecção de polimorfismos de nucleotídeo simples (SNP), detecção de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), detecção de seqüência amplificada variada, detecção de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), detecção de polimorfismo de

comprimento	de	fragmento de	restrição (RFLP),	detecção	de
replicação	de	seqüência	auto-sustentável,	detecção	de
repetição	de	seqüência	simples	(SSR),	detecção	de
polimorfismos de	conformação	de fita	simples (SSCP) , detecção
de marcadores	de isoenzimas, ou	similares.	Enquanto	os

marcadores exemplares providos nas figuras e tabelas descritas aqui são ou marcadores SSR ou SNP (ASH), qualquer um dos tipos de marcadores previamente mencionados podem ser empregados no contexto da invenção com o intuito de identificar segmentos cromossômicos englobando elemento genético que contribui para desempenho agrícola superior ex., resistência recém-conferida ou resistência aumentada).

INTERVALOS CROMOSSOMICOS DE QTL Em alguns aspectos, segrega com

a	invenção	provê intervalos
um	QTL	(ou	múltiplos	QTL) que
ao	MRCV	são	contidos	naqueles
métodos	bem	conhecidos	na arte

estão disponíveis para identificação de intervalos cromossômicos (também como descrito em detalhes nos Exemplos 1

89/213 e 2). As bordas de tais intervalos cromossômicos são delineados de modo a englobar marcadores que irão estar ligados a um ou mais QTL. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é delineado de modo que qualquer marcador que se localiza dentro do intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem as bordas do intervalo) pode ser usado como marcadores para resistência. Cada intervalo contém pelo menos um QTL, e além disso, pode de fato conter mais de um QTL. Forte proximidade de múltiplo QTL no mesmo intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador particular com um QTL particular, do mesmo modo que um marcador pode demonstrar ligação a mais de um QTL. De modo inverso, ex. , se dois marcadores em forte proximidade apresentam co-segregação com o traço fenotípico desejado, não é às vezes claro se cada um desses marcadores identificam o mesmo QTL ou dois QTL diferentes. De maneira indiferente, o conhecimento de quantos QTL estão em um intervalo particular não é necessário para fazer ou praticar a invenção.

A presente invenção provê intervalos cromossômicos de milho, onde os marcadores dentro daquele intervalo demonstra co-segregação com a resistência ao MRCV. Logo, cada um desses intervalos contêm pelo menos um QTL de resistência ao MRCV como mostrado na Tabela 9.

90/213

Tabela 9

Marcadores Flanqueadores	Método(s) de Identificação
MZA8381 e MZA1810	Analise de associação, identidade por descendência
MZA4305 e MZA2803	Analise de associação, identidade por descendência
MZA15490 e MZA2038	Analise de associação, identidade por de s c endênc i a
bnlgl458b e umcl2 61a	Linkage to a preferred marker
bnlgl458b e umcl2 62a	Ligação a um marcador preferencial
bnlgl327 e umcl261a	Ligação a um marcador preferencial
bnlgl327 e umc!262a	Ligação a um marcador preferencial

Cada um dos intervalos descritos acima apresentam uma clusterização de marcadores que co-segregam com a resistência ao MRCV. Essa clusterização de marcadores ocorre em domínios relativamente pequenos nos grupos de ligação, indicando a presença de um ou mais QTL naquelas regiões cromossômicas.

91/213

Intervalos de QTL são delineados a englobar os marcadores que co-segregam com a resistência. Os intervalos são definidos através dos marcadores nas suas terminações, onde o intervalo engloba todos os marcadores que são mapeados dentro do intervalo assim como os marcadores que definem a terminação.

Em alguns casos, um intervalo pode ser delineado onde o intervalo é definido através de ligação com um marcador preferencial. Por exemplo, um intervalo no cromossomo 2 é definido onde qualquer marcador que está ligado ao marcador MZA16656 é um membro daquele intervalo. Por exemplo, como usado aqui, ligação é definido como qualquer marcador que está a menos de 25 cM a partir do MZA16656. Esse intervalo no cromossomo 2 é adicionalmente ilustrado na Tabela 8. Os marcadores que estão ligados ao MZA16656 (ex., a menos de 5 cM do MZA16656) como determinado através de qualquer mapa de ligação genético apropriado (por exemplo, o mapa IBM2 2005 Neighbors Frame 2 encontrado no sítio da internet MaizeGDB). Esses marcadores são mostrados em ordem genética. Cada um dos marcadores listados, incluindo os marcadores terminais pco061820a e sog5758o, são membros do intervalo. Os marcadores pco061820a e sog5758o são conhecidos na arte.

Como descrito acima, um intervalo (ex., um intervalo cromossômico ou um intervalo de QTL) não precisa depender de uma medida absoluta de tamanho de intervalo tal como um valor em centimorgans. Um intervalo pode ser descrito através de marcadores terminais que definem as extremidades do intervalo, e tipicamente o intervalo irá incluir os marcadores terminais que definem a extensão do intervalo. Um intervalo pode incluir qualquer marcador localizado dentro daquele domínio cromossômico, sendo aqueles marcadores atualmente conhecidos ou desconhecidos. A invenção provê uma variedade de meios de definição de um intervalo cromossômico, por exemplo, nas

92/213 listas de marcadores ligados da Tabela 8, e nas referências citadas aqui.

MAPAS GENÉTICOS

Como alguém versado na arte irá reconhecer, frequências de recombinação (e como um resultado, posições de mapa genético) em qualquer população particular não são estáticas. As distâncias genéticas separando dois marcadores (ou um marcador e um QTL) podem variar dependendo de como as posições de mapa são determinadas. Por exemplo, variáveis tais como as populações de mapeamento utilizadas, o programa de computador usado no mapeamento do marcador ou mapeamento do QTL, e os parâmetros selecionados pelo usuário do programa de computador de mapeamento podem contribuir para as relações do mapa genético do QTL/marcador. Porém, não é intuito da invenção ser limitada a quaisquer populações de mapeamento em particular, uso de qualquer programa de computador em particular, ou qualquer conjunto particular de parâmetros de programa de computador para determinar ligação de um marcador ou intervalo cromossômico particular com o fenótipo de resistência ao MRCV. Está bem dentro da habilidade de alguém basicamente versado na arte extrapolar os novos aspectos descritos aqui a qualquer conjunto gênico ou população de milho de interesse, e usando qualquer programa de computador e parâmetros de programa de computadores particulares. De fato, observações a respeito de marcadores de resistência e intervalos cromossômicos nas populações em adição a aquelas descritas aqui são prontamente feitas usando o ensinamento da presente revelação.

Programa de Computador para Mapeamento

Uma variedade de programas de computador comerciais está disponível para mapeamento genético e estudos de associação de marcadores (ex. , mapeamento de QTL). Esse programa de

93/213 computador inclui porém não está limitado àqueles listados na Tabela 10.

Tabela 10

Programa de Computador	Descrição/Referências
Windows QTL Cartographer Version 2.5	Wang S., C. J. Basten, e Z.-B. Zeng (2007). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC.
JoinMap®	VanOoijen, e Voorrips (2001) JoinMap 3.0 software for the calculation of genetic linkage maps, Plant Research International, Wageningen, the Netherlands; and, Stam Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new Computer package: JoinMap, The Plant Journal 3(5):739-744 (1993)
MapQTL®	J.W. vanOoijen, Software for the mapping of quantitative trait loci in experimental populations, Kyazma B.V., Wageningen, Netherlands
MapManager QT	Manly e Olson, OverView of QTL mapping software and introduction to Map Manager QT, Mamm. Genome 10:327-334 (1999)
MapManager QTX	Manly, Cudmore e Meer, MapManager QTX, cross-platform software for genetic mapping, Mamm. Genome 12:930-932 (2001)
GeneFlow® e QTLocate™	GENEFLOW, Inc. (Alexandria, VA)
TASSEL	(Trait Analysis by aSSociation, Evolution, and Linkage) por Edward Buckler, e informação sobre o programa pode ser achado

94/213

na página de internet do Buckler Lab web page no Institute for Genomic Diversity at Cornell University.

Mapas Genéticos Unificados

Mapas genéticos unificado, consenso ou integrado que incorporam dados de mapeamento de duas ou mais fontes foram criados, incluindo fontes que usaram diferentes populações de mapeamento e diferentes modos de análise estatística. A fusão de informações de mapa genético aumenta a densidade de marcador no mapa, assim como o melhoramento da resolução do mapa. Esses mapas melhorados podem ser usados de maneira vantajosa na seleção assistida por marcador, clonagem baseada em mapeamento, provê uma estrutura melhorada para o posicionamento de marcadores moleculares recém-identifiçados e auxiliam na identificação dos intervalos e aglomerados cromossômicos de QTL de marcadores ligados de maneira vantaj osa.

Em alguns aspectos, um mapa consenso é derivado através de simples sobreposição de um mapa em cima do outro. Em outros aspectos, vários algoritmos, ex., análise de JoinMap®, permite a combinação dos dados de mapeamento genético a partir de múltiplas fontes, e reconcilia discrepâncias entre dados de mapeamento a partir de fontes originais. Veja, Van Ooijen e Voorrips (2001) JoinMap 3.0 software for the calculation of genetic linkage maps, Plant Research International, Wageningen, Holanda; Stam (1993) Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new Computer package: JoinMap, The Plant Journal 3(5):739-744.

MARCADORES LIGADOS

A partir da presente revelação e amplamente reconhecida na arte, é claro que qualquer marcador genético que apresenta

95/213 uma probabilidade significativa de co-segregação com um traço de interesse fenotípico (ex., no caso presente, uma resistência recém-conferida ou traço de resistência aumentada) pode ser usado como um marcador para aquele traço. Uma lista de marcadores de QTL úteis providos pela presente invenção é provida nas Tabelas 1 e 2.

Em adição aos marcadores de QTL notados nas Tabelas 1 e 2, marcadores adicionais ligados a (apresentando desequilíbrio de ligação com) marcadores de QTL podem também ser usados para predizer o traço de recém-conferida resistência ou resistência aumentada em uma planta de milho. Em outras palavras, qualquer outro marcador apresentando freqüência de recombinação menor que 50% (separados por uma distância genética de menos que 50 cM) com um marcador de QTL da invenção (ex. , os marcadores providos nas Tabelas 1 e 2) é também parte integrante da invenção. Qualquer marcador que está ligado a um marcador de QTL pode também ser usado de maneira vantajosa na seleção assistida de marcador para o traço em particular.

Marcadores genéticos que estão ligados aos marcadores de QTL (ex., marcadores de QTL providos nas Tabelas 1 e 2) são particularmente úteis quando eles estão suficientemente proximais (ex., fortemente ligado) a um dado marcador de QTL de modo que o marcador genético e o marcador de QTL apresentam uma baixa freqüência de recombinação. Na presente invenção, tais marcadores fortemente ligados são parte integrante da invenção. Como definido aqui, marcadores fortemente ligados apresentam freqüências de recombinação de por volta de 10% ou menos (o dado marcador está a menos de 10 cM do QTL) . Colocando de outra maneira, esses loci fortemente ligados cosegregam pelo menos 90% das vezes. De fato, o quanto mais perto um marcador está de um marcador de QTL, mais efetivo e vantajoso aquele marcador se torna um indicador para o traço desejado.

96/213

Logo, em outras concretizações, loci fortemente ligados tais como um lócus marcador de QTL e um segundo lócus apresentam uma freqüência de cross-over inter-lócus de por volta de 10% ou menos, preferencialmente por volta de 9% ou menos, mais preferencialmente por volta de 8% ou menos, ainda mais preferencialmente por volta de 7% ou menos, ainda mais

preferencialmente	por	volta	de	6%	ou	menos	, ainda	mais
preferencialmente	por	volta	de	5%	ou	menos	, ainda	mais
preferencialmente	por	volta	de	4%	ou	menos	, ainda	mais
preferencialmente	por	volta	de	3%	ou menos,	e ainda	mais
preferencialmente	por	volta de 2%	ou	menos	. Em	concretizações

altamente preferenciais, o loci relevante (ex., um lócus marcador e um lócus alvo tal como um QTL) apresentam uma freqüência de recombinação de por volta de 1% ou menos, ex., por volta de 0,7 5% ou menos, mais preferencialmente por volta de 0,5% ou menos, ou ainda mais preferencialmente por volta de 0,25% ou menos. Logo, o loci estão separados em por volta de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos. Colocado de outra maneira, dois loci que estão localizados no mesmo cromossomo, e a tal distância que a recombinação entre os dois loci ocorre a uma freqüência de menos que 10% (ex., por volta de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos) são ditos serem proximais um ao outro.

Em alguns aspectos, marcadores ligados (incluindo marcadores fortemente ligados) da invenção são determinados através da revisão de um mapa genético, por exemplo, os mapas genéticos integrados encontrados no sítio da internet MaizeGDB. Por exemplo, é mostrado aqui que os marcadores do grupo de ligação 2 MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490,

MZA2038, MZA11826, e MZA9105 se correlacionam com pelo menos um QTL de resistência ao MRCV. Marcadores que estão ligados a MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e

97/213

ΜΖΑ9105 podem ser determinados a partir da lista provida na

Tabela 8 (veja também Tabela 11, que apresenta o Lócus de

Arroz e Identidade de Gene de Milho de Trabalho dos marcadores genéticos entre MZA625 e MZA9105).

98/213

Resumo de Anotação	Fator Transcricional	Proteína de ligação a putrescina; Proteína hipotética	peroxidase L-ascorbato putativa	Proteína de desenvolvimento de piastideo; DAG	Proteína hipotética; Subunidade da ATP sintase vacuolar?	Proteína hipotética	Proteína hipotética	Proteína hipotética	Fator de regulação de
Identidade de Gene de Milho de Trabalho	ACl91302_5part	AC1913O2_3	VO LD 00 O O vo o υ a	r- o CO LÍO o o a	Γ LD o CO σο LÍO o o a	vo 1 ΓΊ O CD v—1 cr» τ—1 O <	Inferido por arroz e sorgo	CD τ—1 [> τ—1 vo o o a	i—1 CO τ—1 σο LÍO o o a
Lócus de Arroz ί	o C4 co .—1 LD tn 'sjt o cn O 1 U O J	o '—1 co ϊ—1 LT) tn o tn O 1 O o A	LOC_Os04g51300	o CO Γ4 τ—1 LÍO tn o tn O 1 u o A	o Í-- C4 T—1 LÍO tn o tn O 1 O O A	o LD C4 rH LÍO tn o tn O 1 O o A	O LIO C4 s—1 LÍO tn o tn O 1 O O D	o C4 τ—1 LÍO tn 'Lí O tn O 1 O O Al	o σο T—1 ΐ—1 LÍO tn 'Ljl o tn O 1 u o Al
Ordem de Lócus	OO CO O 1 ü o J	Loc_028	Loc_027	Loc_025	C4 O 1 O O A	Loc_023	Loc_022	Loc_021	LD 1—1 O 1 o o A
UC7 PCO X Conjunto Amplicons _1	MZA625
ω a Q O (0 w ft £ ft	64,05
Crom PHD	C4

99/213

crescimento	Receptor 89C acoplado à proteína G (Homo sapiens)	Proteína intrínseca principal; NIP; BREVIS RADIX like 1	Proteína hipotética	Oxidase alternativa A0X3	Proteína hipotética	Myb-like; 2-componente de regulador de resposta	Interator de clatrina; Epsina; Proteína hipotética	Proteína CDC20 de repetição WD	Proteína de síntese de Cobalamina
	Genomi c_PCO 6 2260 0_PCO 666161	LD CN n 00 07 LD o o a	pco514627	L0 CO cn co co LD O υ	Inferido por arroz e sorgo	CN Ν’ Ν’ Ν' Ν’ LD O O a	147 L47 N x—1 Ν’ LD O O a	c—1 Ν' L47 O N* LD O O a	T—1 o τ—1 LD L0 O υ a
	o co x—l X—1 147 tn Ν' o ω O 1 U O	LOC_Os04g51172	LD LD x—1 x—1 147 0) Ν’ O ω O 1 u o	o o LD 147 X—1 X—1 x—1 x—1 147 147 0) Pl Ν’ Ν’ Ο Ο ω ω ο ο 1 1 ο ο ο ο η j	o Ν’ x-l χ—1 147 Ο) Ν’ Ο Ui Ο 1 U Ο	LOC_Os04g51130	o CN x—1 x—1 L47 bl Ν’ o Ui o 1 o o βΙ	LOC_Os04g51110	o o X—1 X—1 147 b) Ν’ O ω o 1 O O
	Loc_015	Loc_014	Loc_013	Loc_012	010 ι	600	co o o 1 o o	Loc_007 1 1	Loc_006
		MZA166656		ΜΖΑ15451			MZA2038
		65,99		65,30			65,99
		CN		CN			CN

100/213

Proteína hipotética	Scramblase	Proteína hipotética	Proteína hipotética	Proteína quinase receptora
	σ> o LO CM LD O O a	m LD r- co LO LO O o a	cn ΟΊ o 'tf 'tf co O O a	Ctfi r~ T—1 co 00 in O O a
o cn o Ϊ—1 LO tn 'tf o ω O 1 O o	o 00 o ϊ—1 LD tn 'tf o ω O 1 O o a	o r- o T—1 LD tn 'tf o ω O 1 u O a	o co o ,—1 LD tn >tf o ω O 1 U O	o tn o ϊ—1 LD tn Stf o ω O 1 U O ►q
Loc_005	'tf o o 1 o o	co o o 1 ü O	CM o o 1 O o a	rH O O 1 o o
				in o T—t ΟΛ CM £
				stf LD co
				CM

101/213

Por exemplo, marcadores no grupo de ligação 2 que estão ligados a MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105 incluem aqueles listados na Tabela 12.

Tabela 12

Marcador	Posição de Mapa
pco061820a	148,07
pcoll6928a	148,07
sog093 0a	148,07
pcol02443	148,07
pcol33385a	148,07
sog5467ac	148,07
cl7211_ll	148,08
K4-14p	148,08
pcol35612a	148,08
si687005h09 c	148,08
si707023g07 c	148,08
cll5901_la	148,08
pcol34907	148,08
si660032fl2 i	148,08
cl7048_lb	148,08
cl2578_l	148,09
cl5312_la	148,09
pco094715	148,09
sog5829a	148,09
cl30_le	148,09
pcol25905	148,09
sog0690	148,09
cl36282_lb	148,09

102/213

pcoll8508	148,09
gpm63 6	148,09
pco066747a	148,09
pco083425q	148,09
sog5844av	148,09
bnlgl458b	148,09
si606065el2 a	148,09
cl22018_l	148,09
pco091058	148,09
si946053gl0	148,10
sogl265	148,10
sog0743c	148,10
cl9862_l	148,10
pcoll4887	148,10
bnlgl327	148,10
sog5587a	148,10
cll488_-4a	148,11
pco085208a	148,11
sogl295c	148,11
sog5609b	148,11
sog0912a	148,11
tel7sclah	148,11
si660060d.ll b	148,11
cll0933_ld	148,11
cl37019_la	148,11
sogl856ae	148,11
pcoll70071	148,11
cl40761_la	148,11
siaf099388e	148,11
pcol37067a	148,11

103/213

sog2274m	148,11
cl31185_3a	148,11
pco098939a	148,11
pcol50139r	148,11
clll825_la	148,11
pcol22145b	148,11
cl24291_la	148,11
si618065g03 a	148,11
si707029g03 a	148,11
sogl495a	148,75
umcl2 62a	153,10
umcl2 61a	154,60
sog5758o	154,71

De maneira similar, marcadores ligados (incluindo marcadores fortemente ligados) da invenção podem ser determinados através da revisão de qualquer mapa genético de milho apropriado. Por exemplo, mapas genéticos integrados podem ser encontrados nos recursos do sítio de internet MaizeGDB.

Não é o intuito que a determinação de marcadores ligados ou fortemente ligados seja limitada ao uso de qualquer mapa genético de milho particular. De fato, um grande número de mapas genéticos de milho está disponível e são bem conhecidos por alguém versado na arte. De maneira alternativa, a determinação de marcadores ligados e fortemente ligados pode ser feita através da geração de um conjunto de dados experimentais e análise de ligação.

Também não é intuito que a identificação dos marcadores que estão ligados (ex. , a menos de por volta de 50 cM ou a menos de por volta de 10 cM) aos marcadores de QTL de

104/213 resistência ao MRCV identificados aqui seja limitada a qualquer mapa ou metodologia em particular. Os mapas genéticos integrados providos no sítio de internet MaizeGDB serve somente como exemplo para identificação de marcadores ligados.

De fato, marcadores ligados como definidos aqui podem ser determinados a partir de qualquer mapa genético conhecido na arte (um mapa experimental ou um mapa integrado) , ou alternativamente, podem ser determinados a partir de qualquer novo conjunto de dados de mapeamento.

É notado que listas de marcadores ligados e fortemente

I ligados podem variar entre mapas e metodologias devido a vários fatores. Primeiramente, os marcadores que são localizados em quaisquer dois mapas pode não ser idêntico, e além disso, alguns mapas podem apresentar uma maior densidade de marcadores que outro mapa. Também, as populações de mapeamento, metodologias e algoritmos usados para construir mapas genéticos podem diferir. Alguém versado na arte reconhece que um mapa genético não é necessariamente mais ou menos acurado que outro, e além disso, reconhece que qualquer mapa genético possa ser usado com o intuito de determinar marcadores que estão ligados e fortemente ligados aos marcadores de QTL da presente invenção.

TÉCNICAS PARA DETECÇÃO DE MARCADORES

A invenção fornece marcadores moleculares que possuem uma probabilidade significativa de co-segregação com QTL que confere um fenótipo de resistência ao MRCV. Esses marcadores de QTL podem ser utilizados na seleção assistida por marcadores por traços desejados (nova resistência ou resistência aumentada), e também possuem outros usos. Não é a intenção que a invenção seja limitada a qualquer método de detecção em particular desses marcadores.

105/213

Marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por numerosos métodos bem estabelecidos na arte (ex., amplificação específica de sequência baseada em PCR, polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP), marcadores de isoenzimas, hibridização específica de alelos (ASH), seqüências variadas amplificadas do genoma de plantas, replicação auto-sustentada de seqüências, repetição de sequência simples (SSR), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) ou I polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados (AFLP)). Em uma concretização adicional, a presença ou ausência de um marcador molecular é determinada simplesmente pelo seqüenciamento de nucleotídeos de uma região marcadora polimórfica. Este método é prontamente adaptado para análise em larga escala assim como os outros métodos mencionados acima, ex. , utilizando métodos de seqüenciamento em larga escala disponíveis assim como seqüenciamento por hibridização.

Geralmente, a maioria dos marcadores genéticos dependem de uma ou mais propriedades dos ácidos nucléicos para sua detecção. Por exemplo, algumas técnicas para detectar marcadores genéticos utilizam hibridização de uma sonda de ácido nucléico para ácidos nucléicos correspondentes ao marcador genético (ex., ácidos nucléicos amplificados produzidos utilizando DNA genômico de milho como molde). Formatos de hibridização, incluindo mas não limitados a fase solúvel, fase sólida, fase mista, ou ensaio de hibridização in situ, são úteis. Para detecção de alelos. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em

Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier, Nova Iorque, assim como em Sambrook e Ausubel (neste); e Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning

106/213

Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger).

Por exemplo, marcadores que contém polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) são detectados, ex., pela hibridização de uma sonda que é tipicamente uma subfragmento (ou um oligonucleotídeo sintético correspondendo a um sub-fragmento) do ácido nucléico a ser detectado ao DNA genômico digerido por restrição. A enzima de restrição é selecionada para originar fragmentos de restrição de ao menos dois alternativos (ou polimórficos) tamanhos em indivíduos ou populações diferentes. A determinação de um ou mais enzima de restrição que produz fragmentos informativos para cada cruzamento é um procedimento simples, bem conhecido na arte. Após a separação pelo tamanho em uma matriz apropriada (ex., agarose ou poliacrilamida) e transferência para uma membrana (ex., nitrocelulose, nylon, etc.), a sonda marcada é hibridizada sob condições que resultam em ligação em equilíbrio da sonda ao alvo seguida da remoção da sonda em excesso por lavagem.

Sondas de ácido nucléico para loci marcadores podem ser clonados e/ou sintetizados. Qualquer, marcação adequada pode ser utilizada com a sonda da invenção. Marcações detectáveis adequadas para o uso com ácido nucléico incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por meios espectrométrico, radioisotópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico ou químico. Marcações úteis incluem biotina para corar com conjugado de estreptavidina marcada, contas magnéticas, corantes fluorescentes, radio-marcação, enzimas, e marcações colorimétricas. Outras marcações incluem ligantes que se ligam a anticorpos marcados com fluoróforos, agentes quimioluminescentes, e enzimas. Uma sonda pode também constituir oligos de PCR radio-marcados que sã utilizados para gerar um amplicon radio-marcado. Estratégias de marcação para

107/213 marcar ácidos nucléicos e estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, ex., em Haugland (1996)

Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sexta

Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR) ; ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals

Eighth Edition por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR) (Disponível em CD ROM).

Métodos de Detecção baseados em Amplificação 10 PCR, RT-PCR e LCR são de uma particular ampla utilização como métodos de amplificação e amplificação-detecção para amplificar ácidos nucléicos de interesse (ex., aqueles contendo loci marcador), facilitando a detecção de marcadores. Detalhes em torno do uso desses e outros métodos de amplificação podem ser encontrados em uma variedade de textos padrões, incluindo, ex., Sambrook, Ausubel, Berger e Croy, aqui. Muitos livros de biologia disponíveis também possuem extensivas discussões sobre PCR e métodos de amplificação relacionados. Alguém versado irá reconhecer que essencialmente qualquer RNA pode ser convertido em DNA dupla-hélice apropriado para digestão de restrição, expansão por PCR e seqüenciamento utilizando transcriptase reversa e uma polimerase (PCR de Transcrição Reversa, ou RT-PCR). Veja também, Ausubel, Sambrook e Berger, acima.

Métodos de Amplificação/Detecção em Tempo Real

Em um aspecto, PCR em tempo real ou LCR é desempenhado em misturas de amplificação descritas aqui, ex., utilizando sinalizadores moleculares ou sondas TaqMan™. Um sinalizador molecular (MB) é um oligonucleotídeo ou PNA que, sob condições de hibridização apropriadas, auto-hibridiza para formar estruturas em forma de grampo. O MB possui uma marcação e um esmorecedor no término do oligonucleotídeo ou PNA; portanto,

108/213 sob condições que permitam hibridizações intra-moleculares, a marcação é normalmente esmorecida (ou ao menos alterada em sua fluorescência) pelo esmorecedor. Sob condições onde o MB não apresenta hibridização intra-molecular (ex., quando ligado a um ácido nucléico alvo, ex., a uma região de um amplicon durante a amplificação), a marcação do MB está esmorecida. Detalhes sobre métodos padrão de produção e utilização de MBs estão bem estabelecidos na literatura, e MBs estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes de reagentes comerciais. Veja também, ex., Leone et al. (1995) Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous realtime detection of RNA, Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Tyagi e Kramer (1996) Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14:303-308; Blok e Kramer (1997) Amplifiable hybridization probes containing a molecular switch Mol Cell Probes 11:187-194; Hsuih et al. (1997) Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum J Clin Microbiol 34:501-507; Kostrikis et al. (1998) Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles Science 279:1228-1229; Sokol et al. (1998) Real time detection of DNA:RNA hybridization in living cells Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95:11538-11543; Tyagi et al. (1998) Multicolor molecular beacons for allele discrimination Nature Biotechnology 16:49-53; Bonnet et al. (1999) Thermodynamic basis of the Chemical specificity of struetured DNA probes Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96:6171-6176; Fang et al. (1999) Designing a novel molecular beacon for surfaceimmobilized DNA hybridization studies J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922; Marras et al. (1999) Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons Genet. Anal. Biomol. Eng. 14:151-156; e Vet et al. (1999) Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 96:6394-6399. Detalhes

109/213 adicionais a respeito da concretização e do uso de MB são encontrados na literatura de patentes, ex. , U.S. Patent Nos.

5.925.517, 6.150.097, e 6.037.130.

Detecção e quantificação por PCR utilizando sondas fluorogênicas de oligonucleotídeo duplamente marcadas, usualmente referidas como sondas TaqMan™, podem ser desempenhadas de acordo com a presente invenção. Estas sondas são compostas por pequenos (ex., 20-25 bases) oligodeoxinucleotídeos que são marcados com dois corantes fluorescentes diferentes. No término 5' de cada sonda está um

I corante repórter, e no término 3 ' de cada sonda é encontrado um corante esmorecedor. A seqüência da sonda de oligonucleotídeo é complementar a uma seqüência alvo interna presente em uma amplicon de PCR. Quando a sonda está intacta, transferência de energia ocorre entre os dois fluoróforos e a emissão de um repórter é esmorecida por um esmorecedor por FRET. Durante a fase de extensão do PCR, a sonda é clivada pela atividade de nuclease 5' da polimerase utilizada na reação, portanto liberando o repórter do oligonucleotídeo esmorecedor e produzindo um aumento da intensidade de emissão do repórter. Durante a fase de extensão do PCR, a sonda é clivada pela atividade de nuclease 5' da polimerase utilizada na reação, portanto liberando o repórter do esmorecedor oligonucleotídico e produzindo um aumento na intensidade de emissão do repórter. De acordo, sondas TaqMan™ são oligonucleotídeos que possuem uma marcação e um esmorecedor, onde a marcação é liberada durante a amplificação pela ação de exonuclease da polimerase utilizada na amplificação. Isto fornece uma medida em tempo real da amplificação durante a síntese. Uma variedade de reagentes TaqMan™ estão disponíveis comercialmente, ex., da Applied Biosystems (Division Headquarters in Foster City, CA) assim como de uma variedade

110/213 de vendedores de especialidades como Biosearch Technologies (ex., sondas esmorecedoras black hole).

Detalhes Adicionais Sobre Seqüências Variáveis Amplificadas,

SSR, AFLP, ASH, SNPs e Marcadores de Isoenzima

Seqüências variáveis amplificadas refere-se a seqüências amplificadas do genoma da planta que exibem alta variabilidade de resíduos de espécie. Todos ácidos nucléicos entre membros da mesma organismos possuem seqüências genômicas variáveis e cada organismo (com exceção de um clone) tem um conjunto diferente de seqüências variáveis. Uma vez identificada, a presença da seqüência variável específica pode ser utilizada para predizer características fenotípicas. Preferencialmente, DNA da planta serve como um molde para amplificação com oligos que flanqueiam a seqüência variável de DNA. A seqüência variável é amplificada e então seqüenciada.

Alternativamente replicação de seqüência auto-sustentada pode ser utilizada para identificar marcadores genéticos. Replicação de seqüência auto-sustentada se refere a um método de amplificação de ácido nucléico utilizando seqüências alvo de ácidos nucléicos que são replicadas exponencialmente in vitro sob condições substancialmente isotérmicas pela utilização de três atividades enzimáticas envolvidas na replicação retroviral: (1) transcriptase reversa, (2) Rnase H, (3) uma RNA polimerase dependente de DNA (Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sei USA 87:1874) . Através da mimetização da estratégia retroviral de replicação de RNA por meios de intermediários de cDNA, esta reação acumula cópias de cDNA e RNA do alvo original.

Polimorfismos de tamanho de fragmentos amplificados (AFLP) também podem ser utilizados como marcadores genéticos (Vos et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:4407). A expressão polimorfismo de tamanho de fragmento amplificado se refere a

111/213 fragmentos de restrição selecionados que são amplificados antes ou após divagem por uma endonuclease de restrição. A etapa de amplificação permite uma detecção mais fácil de fragmentos de restrição específicos. AFLP permite a detecção de um alto número de marcadores polimórficos e tem sido utilizada para o mapeamento genético de plantas (Becker et al. (1995) Mol Gen Genet 249:65; e Meksem et al. (1995) Mol Gen

Genet 249:74).

Hibridização alelo específica (ASH) pode ser utilizada para identificar os marcadores genéticos da invenção. A tecnologia ASH é baseada no anelamento estável de uma sonda oligonucleotídica pequena e simples fita a um ácido nucléico alvo compietamente complementar. Detecção ocorre via marcação isotópica ou não isotópica associada à sonda.

Para cada polimorf ismo, duas ou mais sondas ASH diferentes são projetadas para possuir seqüências de DNA idênticas exceto nos nucleotídeos polimórficos. Cada sonda possuirá homologia exata com uma seqüência alélica de modo que a amplitude de sondas possa distinguir todas as seqüências alélicas alternativas conhecidas. Cada sonda é hibridizada ao DNA alvo. Com planejamento da sonda e condições de hibridização apropriados, um único erro de pareamento de uma base entre a sonda e o DNA alvo prevenirá a hibridização. Desta forma, somente uma das sondas alternativas irá hibridizar à amostra alvo que é homozigota ou homogênea para um alelo. Amostras que são heterozigotas ou heterogêneas para dois alelos irão hibridizar a ambas as sondas alternativas.

Marcadores ASH são utilizados como marcadores dominantes onde a presença ou ausência de apenas um alelo é determinada a partir da hibridização ou falta de hibridização por apenas uma sonda. O alelo alternativo pode ser inferido a partir da falta de hibridização. Sonda ASH e moléculas alvo são opcionalmente RNA ou DNA; as moléculas alvo são de qualquer

112/213 uma por digerida com por tamanho tamanho de nucleotídeos além da sequência que é complementar à sonda; a sonda é projetada para hibridizar com ambas fitas de um alvo de DNA; a sonda abrange tamanhos a fim de obedecer a condições de hibridização estringentes variadas, etc.

PCR permite que seqüências alvo para ASH sejam amplificadas a partir de baixas concentrações de ácido nucléico em volumes relativamente pequenos. De outra maneira, a seqüência alvo do DNA genômico é endonuclease de restrição e separada eletroforese em gel. Hibridizações ocorrem normalmente com seqüências alvo ligadas à superfície de uma membrana ou, como descrito em U.S. Patent No. 5.468.613, a seqüência da sonda ASH pode estar ligada à uma membrana.

Em uma concretização, dados de ASH são normalmente obtidos pela amplificação de fragmentos de ácido nucléico (amplicons) a partir de DNA genômico utilizando PCR, transferindo o DNA do amplicon alvo do para uma membrana em formato dot blot, hibridizando uma sonda de oligonucleotídeo marcada com o amplicon alvo, e observando os pontos de hibridização por auto-radiografia.

Polimorfismos de seqüência únicos (SNP) são marcadores que consistem seqüências compartilhadas diferenciadas em base de um único nucleotídeo. Normalmente, a distinção é detectada pelo padrão diferenciado de migração de um amplicon contendo o SNP em, ex., um gel de acrilamida. Entretanto, modos alternativos de detecção, como hibridização, ex., ASH, ou análise por RFLP também são apropriados.

Marcadores de isoenzima podem ser empregados como marcadores genéticos, ex., para rastrear marcadores outros que os marcadores de resistência contidos aqui, ou para rastrear marcadores de isoenzima ligados a marcadores contidos aqui. Isoenzimas são formas múltiplas de enzimas que diferem umas das outras em suas seqüências de aminoácidos, e portanto em

113/213 suas seqüências de ácidos nucléicos. enzimas multiméricas contendo diferentes. Outras isoenzimas são monoméricas mas foram clivadas da

Algumas isoenzimas são subunidades levemente tanto multiméricas ou pró-enzima em sítios <

diferentes na seqüência de aminoácido. Isoenzimas podem ser caracterizadas e analisadas ao nível de proteína, ou alternativamente, isoenzimas que diferem ao nível de ácido nucléico podem ser determinadas. Em tais casos qualquer um dos métodos baseados em ácido nucléico descritos aqui podem ser utilizados para analisar marcadores de isoenzima.

Detalhas Adicionais Relativos A Amplificação de Acido Nucléico

Como mencionado, técnicas de amplificação de ácido nucléico como PCR e LCR são bem conhecidos na arte e podem ser aplicadas à invenção presente para amplificar e/ou detectar ácidos nucléicos de interesse, como ácidos nucléicos contendo loci marcadores. Exemplos de técnicas suficientes para instruir aqueles versados na arte em métodos in vitro, incluindo a reação em cadeia da polimerase(PCR) , a reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação por θββ-replicase e outras técnicas mediadas por RNA polimerase (ex., NASBA), são encontradas nas referências mencionadas acima, ex., Innis, Sambrook, Ausubel, Berger e Croy. Detalhes adicionais são encontrados em Mullis et al. (1987) U.S. Patent No. 4.683.202;

Arnheim & Levinson (1 de outubro de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwoh et al. (1989)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173; Guatelli et al. (1990)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:10771080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu e Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; e

Sooknanan e Malek (1995) Biotechnology 13:563-564. Métodos melhorados de amplificação de ácidos nucléicos grandes por

114/213

PCR, que é útil no contexto de clonagem por posicionai, estão ulteriormente resumidas em Cheng et al. (1994) Nature 3 69:684, e nas referências ali, nas quais amplicons de PCR de até 40 kb são produzidos.

Detecção de Marcadores Para Clonagem Posicionai

Em algumas concretizações, uma sonda de ácido nucléico é utilizada para detectar um ácido nucléico que contém uma sequência marcadora. Tais sondas podem ser utilizadas, por exemplo, na clonagem posicionai para isolar sequência nucleotidicas ligadas à sequência nucleotídica do marcador. Não é intencionado que as sondas de ácido nucléico da invenção sejam limitadas a qualquer tamanho particular. Em algumas concretizações, uma sonda de ácido nucléico possui ao menos 20 nucleotídeos em extensão, ou alternativamente, ao menos 50 nucleotídeos em extensão, ou alternativamente, ao menos 100 nucleotídeos em extensão, ou alternativamente, ao menos 200 nucleotídeos em extensão.

Uma sonda hibridizada é detectada utilizando autoradiografia, fluorografia ou outras técnicas de detecção similares dependendo da marcação a ser detectada. Exemplos de protocolos específicos de hibridização são amplamente disponíveis na arte, veja, ex., Berger, Sambrook, e Ausubel, todos incluídos aqui.

Métodos de Síntese de Sonda/Oligo

Normalmente, métodos sintéticos oligonucleotídeos, incluindo moleculares, PNAs, LNAs (ácido nucléicos trancados), etc., bem conhecidos. Por exemplo, oligonucleotídeos podem sintetizados quimicamente de acordo com o método fosforamidita triéster em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers (1981), Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, ex., para produzir sondas, oligos, sinalizadores são ser de

115/213 utilizando sintetizador automatizado disponível comercialmente, ex. , com descrito em Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. Oligonucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos modificados podem também ser encomendados de uma variedade de fontes comerciais conhecidas de pessoas versadas. Existem vários provedores comerciais de serviços de síntese de oligo, e portanto esta é uma tecnologia amplamente acessível. Qualquer ácido nucléico pode ser feitos sob encomenda de qualquer uma de uma variedade de fontes comerciais, como The Midland Certified Reagent Company, The Great American Gene Company, ExpressGen Inc., Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras. Semelhantemente, PNAs podem ser feitos sob encomenda de qualquer uma de uma variedade de fontes, como PeptidoGenic, HTI Bio-Products, Inc., BMA Biomedicals Ltd (Reino Unido),

Bio·Synthesis, Inc., e muitas outras.

Detecção In Silico de Marcadores

Em concretizações alternativas, métodos in silico podem ser utilizados para detectar os loci marcadores de interesse. Por exemplo, a seqüência de um ácido nucléico contendo o lócus marcador de interesse pode ser armazenada em um computador. A seqüência do lócus marcador desejado ou seu homólogo pode ser identificado utilizando um algoritmo apropriado de busca de ácidos nucléicos como provido por, por exemplo, em tais programas prontamente disponíveis como BLAST, ou mesmo simples processadores de palavras.

OLIGOS DE AMPLIFICAÇÃO PARA DETECÇÃO DE MARCADORES

Em algumas concretizações preferenciais, os marcadores moleculares da invenção são detectados utilizando um método de detecção por PCR apropriado, onde o tamanho ou a seqüência do amplicon do PCR é indicativo da ausência ou presença do

116/213 marcador (ex., um alelo marcador particular). Nestes tipos de métodos, oligos de PCR são hibridizados com regiões conservadas flanqueando a região do marcador polimórfico. Como utilizado na arte, oligos de PCR utilizados para amplificar um marcador molecular são algumas vezes chamada marcadores de PCR ou simplesmente marcadores.

Será apreciado que, embora muitos exemplos específicos de oligos sejam providos aqui (veja, Tabela 3), oligos apropriados a serem utilizados com a invenção podem ser desenhado utilizando qualquer método apropriado. Não é o intuito que a invenção seja limitada a qualquer oligo ou par de oligo particular. Por exemplo, oligos podem ser desenhados utilizando qualquer programa de computador apropriado, como LASERGENE®.

Em algumas concretizações, os oligos da invenção são radio-marcados, ou marcados por qualquer maneira apropriada (ex. , utilizando uma cauda fluorescente não radioativa), para permitir a rápida visualização dos amplicons de tamanhos diferentes após uma reação de amplificação sem qualquer etapa adicional de marcação ou etapa de visualização. Em algumas concretizações, os oligos não são marcados, e os amplicons são visualizados após resolução de tamanho, ex., após eletroforese em gel de agarose. Em algumas concretizações, a coloração dos amplicons de PCR por brometo de etídeo após resolução de tamanho permite a visualização de amplicons de tamanhos diferentes.

Não é o intuito que os oligos da invenção sejam limitados a produzir um amplicon de qualquer tamanho particular. Por exemplo, os oligos utilizados para amplificar os loci marcadores e alelos incluídos aqui não são limitados a amplificar toda a região do lócus relevante. Os oligos podem produzir um amplicon de qualquer tamanho apropriado. Em algumas concretizações a amplificação dos marcadores produz um

117/213

amplicon de ao alternativamente,	menos 2 0	nucleotídeos em 50 nucleotídeos em	extensão, extensão,	ou ou
ao	menos
alternativamente,	ao	menos	100 nucleotídeos em	extensão,	ou

Φ alternativamente, ao menos 200 nucleotídeos em extensão.

SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR E CRUZAMENTOS DE PLANTAS

A motivação principal para o desenvolvimento de marcadores moleculares em espécies de plantas cultivadas é o potencial para maior eficiência no cruzamento de plantas através da seleção assistida por marcador (MAS). Marcadores genéticos são usados para identificar plantas que contem um genótipo desejado em um ou mais loci, e que seja esperado que transfira o genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado, para a sua progênie. Marcadores genéticos podem ser utilizados para identificar plantas que contem o genótipo desejado em um lócus, ou em vários loci ligados ou não ligados (ex., um haplótipo), e que se supõe que transfiram um genótipo desejado, junto com o fenótipo desejado para a sua progênie. A presente invenção fornece os meios para identificar plantas, particularmente plantas de milho, que possuem resistência recém conferida ou maior resistência para, ou são suscetíveis para, MRCV pela identificação de plantas que possuem um alelo especificado em um desses loci, ex., MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, ou MZA9105. Em uma concretização, plantas resistentes identificadas possuem o haplótipo: C em MRQV_08351-173, A em MRQV_08351-262, G em MRQV_08351-280, G em MRQV_08351-323, C em MRQV_08351-369, C em MRQV_08351-372.

Semelhantemente, pela identificação de plantas sem o lócus marcador desejado, plantas suscetíveis ou menos resistentes podem ser identificadas, ex., eliminadas de cruzamentos subseqüentes. Semelhantemente, estes lócus marcadores podem ser introgredidos em qualquer background

118/213 genômico, germoplasma, planta, linhagem, variedade, etc., desejados, como parte de um programa abrangente de cruzamento MAS desenhado para melhorar a produtividade do milho. Em uma concretização, plantas suscetíveis identificadas possuem o haplótipo: T em MRQV_08351-173, T em MRQV_08351-262, A em MRQV_08351-280, C em MRQV_08351-323 , T em MRQV_08351-369, T em MRQV_08351-372.

A invenção também fornece intervalos de QTL cromossômicos que podem ser igualmente utilizados em MAS para selecionar plantas que apresentam resistência recém conferida ou maior resistência ao MRCV. Semelhantemente, os intervalos de QTL também podem ser utilizados ou possuem para contra-selecionar plantas que são suscetíveis ou possuem resistência reduzida ao MRCV. Qualquer marcador que esteja mapeado dentro do intervalo de QTL (incluindo os términos dos intervalos) podem ser utilizados na invenção. Estes intervalos são definidos pelos seguintes pares de marcadores:

(i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a.

Normalmente, MAS utiliza marcadores polimórficos que têm sido identificados como possuindo uma probabilidade significativa de co-segregação com o traço de resistência. Tais marcadores são supostamente mapeados próximos a um gene o a genes que concedem à planta o seu fenótipo de resistência, e são considerados indicadores para o traço desejado, e são chamados de marcadores QTL. Plantas são testadas para a presença de um alelo desejado no marcador QTL. A maioria dos

119/213 marcadores escolhidos (ou alelos marcadores) são aqueles que possuem a associação mais forte com o traço de resistência.

Análise de ligação é utilizada para determinar qual alelo marcador polimórfico demonstra uma probabilidade estatística de co-segregação com o fenótipo de resistência (portanto, um alelo marcador de resistência). Procedendo a identificação de um alelo marcador para a co-segregação com o fenótipo de resistência, é possível utilizar o marcador para uma varredura rápida e acurada de linhagens de plantas para o alelo de resistência sem a necessidade de cultivar as plantas através do seu ciclo de vida e aguardar avaliações fenotípicas, e além disso, permite a seleção genética para um alelo de resistência particular mesmo quando a identidade molecular do verdadeiro QTL de resistência é desconhecido. Amostras de tecido podem ser obtidas, por exemplo, da primeira folha da planta e triadas com o marcador molecular apropriado, e é rapidamente determinado qual progênie progredirá. Marcadores ligados também removem os impactos ambientais que freqüentemente influenciam a expressão fenotípica.

Um lócus marcador QTL polimórfico pode ser utilizado para selecionar plantas que contém o alelo marcador (ou alelos) que correlacionam com o fenótipo de resistência desejado, normalmente chamado de seleção assistida por marcador (MAS). Brevemente, um ácido nucléico correspondendo a um alelo de ácido nucléico marcador é detectado em uma amostra biológica de uma planta a ser selecionada. Esta detecção pode ser feita na forma de hibridização de uma sonda de ácido nucléico a um alelo marcador ou amplicon deste, ex., utilizando hibridização alelo-específica, análise de Southern, análise de Northern, hibridização in situ, hibridização de oligos seguida de amplificação por PCR de uma região do marcador, ou semelhantes. Uma variedade de procedimentos para detecção de marcadores é descrita aqui, ex., na secção intitulada

120/213

TÉCNICAS PARA DETECÇÃO DE MARCADORES. Após da presença (OU ausência) de um alelo marcador particular na amostra biológica ser verificada, a planta é selecionada (ex., utilizado para produzir plantas descendentes por cruzamento seletivo).

Aqueles envolvidos no melhoramento de plantas de milho desejam combinações de loci de resistência com genes para alta produtividade e outros traços desejáveis para desenvolver variedades melhoradas de milho. A varredura de um grande número de amostras por métodos não moleculares (ex., avaliação de traços em plantas de milho) pode ser custosa, demorada e não confiável. Uso dos marcadores polimorficos descritos aqui, quando ligados geneticamente ao loci de resistência fornece um método efetivo para selecionar variedades resistentes em programas de melhoramento. Por exemplo, uma vantagem da seleção assistida por marcador sobre avaliações de campo é que a MAS pode ser feita em qualquer época do ano, independente da época de cultivo. Alem disso, efeitos ambientais são basicamente irrelevantes para a seleção assistida por marcador.

Quando uma população está segregando para múltiplos loci afetando um ou múltiplos traços, ex. , múltiplos loci envolvidos em resistência, ou múltiplos loci cada um envolvido em resistência a doenças diferentes, a eficiência da MAS comparado com a varredura fenotípica se torna ainda maior, porque todos os loci podem ser avaliados juntos no laboratório, a partir de uma única amostra de DNA. Na presente instância, os marcadores MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105, assim como qualquer dos intervalos cromossômicos (i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlg!458b e umcl261a;

121/213 (v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a;

podem ser testados simultaneamente ou seqüencialmente a partir de uma única amostra ou uma população de amostras.

Outro uso da MAS em melhoramento vegetal é auxiliar na recuperação do genótipo parental por cruzamento parental. Cruzamento parental é o processo de cruzamento de um progênie com um dos seus parentais ou linhagens parentais. Cruzamento parental é normalmente realizado com o objetivo de introgredir um ou um pequeno número de loci de um doador parental (ex., um parental contendo um loci marcador de resistência desejável) em um distinto background genético desejável de um parental recorrente (ex., uma linhagem de milho diferente de alta produtividade). Quanto mais ciclos de cruzamento parental forem feitos, maior a contribuição genética do parental recorrente para a variedade introgredida. Isto é frequentemente necessário, porque plantas resistentes podem ser por outro lado não desejáveis, ex., devido à baixa produtividade, baixa fecundidade, ou similar. Em contraste, linhagens que são o resultado de programas intensivos de cruzamento podem possuir excelente produtividade, fecundidade ou similares, sendo deficientes meramente em um traço desejável como resistência ao MRCV.

A presença e/ou ausência de um marcador genético ou alelo particular, ex., marcadores MZA625, MZA16656, MZA15451,

MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105, assim como qualquer dos intervalos cromossômicos (i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

122/213 (vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a;

no genoma de uma planta é produzida por qualquer método mencionado aqui. Se os ácidos nucléicos da planta forem positivos para o alelo marcador genético desejado, a planta pode ser auto-fertilizada para criar uma linhagem melhorada verdadeira com o mesmo genótipo, ou ela pode ser cruzada com uma planta com o mesmo marcador ou com outras características desejadas para criar uma geração híbrida cruzada sexualmente.

Introgressão de Alelos Favoráveis—Cruzamento Parental de

Marcadores de Resistência em Linhagens Elite

Uma aplicação de MAS, no contexto da presente invenção é utilizar a marcadores de resistência aumentada para introgressão ou tentativa resistência recém conferida ou aumentar a eficiência de uma de cruzamento parental com o objetivo de introduzir um QTL de resistência em um background desejado (normalmente de alta produtividade). Em cruzamentos parentais assistidos por marcador de marcadores específicos (e QTL associados) de uma fonte doadora, ex., para um background genético elite ou exótico, alguém seleciona os traços do doador dentre a progênie do cruzamento parental e então utiliza repetidos cruzamentos parentais com o background da linhagem elite ou exótica para reconstituir o máximo possível do genoma do background elite/exótico.

Portanto, os marcadores e métodos da presente invenção podem ser utilizados para auxiliar a seleção assistida por marcador ou melhoramento de variedades de complemento (conjunto) desejado de formas milho com o alélicas de segmentos cromossômicos associados a um desempenho agronômico superior marcadores (resistência, juntamente com para produtividade, etc.).

quaisquer outros Qualquer um dos marcadores expostos pode ser introduzido em uma linhagem de

123/213 milho via introgressão, por cruzamento tradicional (ou introduzido via transformação, ou ambos), para produzir uma planta de milho com um desempenho agronômico superior.

número de alelos associados com a resistência que podem ser introduzidos ou estar presentes em uma planta de milho da presente invenção varia entre 1 e o número de alelos expostos aqui, cada número inteiro do qual está incorporado aqui como se explicitamente relatado.

A presente invenção também se estende a um método de produção de uma planta de milho descendente e estas plantas de milho descendentes, per se. Métodos incluem cruzar uma planta de milho anterior com uma segunda planta de milho e o cultivar a planta de milho feminina sob condições de cultivo vegetal para produzir a progênie de plantas de milho. Métodos de cruzamento de cultivo de plantas de milho estão de acordo com o conhecimento comum daqueles versados em técnicas básicas da arte. Tal progênie de plantas de milho podem ser testadas para alelos associados com resistência e, por meio disso, a progênie desejada selecionada. Estas plantas ou sementes descendentes podem ser vendidas comercialmente para a produção de milho, utilizadas para alimento, processadas para obter um constituinte desejado do milho, ou utilizadas adiante em séries de cruzamento subseqüentes. Ao menos uma das primeira ou segunda plantas de milho é uma planta de milho da invenção, uma vez que ela contém pelo menos uma das formas alélicas dos marcadores da presente invenção, de modo que a prole seja capaz de herdar o alelo.

Um método da presente invenção pode ser aplicado a ao menos uma planta de milho relacionada como das linhagens progenitor ou descendente na estirpe da planta de milho em questão de maneira que a hereditariedade do alelo de resistência desejado pode ser traçada. O número de gerações separando as plantas de milho sujeitas aos métodos da presente

124/213 invenção serão geralmente de 1 a 20, comumente 1 a 5, e tipicamente 1, 2, ou 3 gerações de separação, e muitas vezes um descendente direto ou parental da planta de milho sujeita ao método (ex., uma geração de separação).

Introgressão de Alelos Favoráveis—Incorporação de Germoplasmas

Exóticos durante a Manutenção da Progressão do Cruzamento

Diversidade genética é importante para o ganho genético de longo termo em qualquer programa de melhoramento. Com uma diversidade limitada, o ganho genético eventualmente irá estagnar quando todos os alelos favoráveis estiverem fixados na população elite. Um objetivo é incorporar diversidade em um conjunto elite sem perder o ganho gênico que já foi obtido e com o mínimo possível de investimento. MAS fornece uma indicação de quais regiões genômicas e quais alelos favoráveis dos ancestrais originais têm sido selecionadas e conservadas ao longo do tempo, facilitando variação favorável de fontes (parentais que não são relacionadas ao conjunto gênico elite) com expectativa de encontrar alelos favoráveis que atualmente não existem no conjunto gênico elite.

Por exemplo, os marcadores da presente invenção podem ser utilizados para MAS em cruzamentos envolvendo linhagens de milho elite x exóticas sujeitando a progênie segregante à MAS para manter os principais alelos de produtividade, junto com os alelos marcadores de resistência incluídos aqui.

esforços para incorporar de germoplasma exógenas

CLONAGEM POSICIONAL loci molecular marcador e alelos da presente invenção, ex., marcadores MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e MZA9105, assim como qualquer um dos intervalos cromossômicos (i) MZA8381 e MZA18180;

125/213 (ii) ΜΖΑ4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a;

podem ser utilizados, como indicado previamente, para identificar um QTL de resistência, que pode ser clonado por procedimentos bem estabelecidos, ex., como descrito em detalhes em Ausubel, Berger e Sambrook, incluídos aqui.

Esses clones de resistência foram primeiramente identificados pela sua ligação genética com marcadores da presente invenção. Isolamento de um ácido nucléico de interesse é realizado por qualquer número de métodos com discutido em detalhes em referências como Ausubel, Berger e Sambrook, incluídas aqui, e Clark, Ed. (1997) Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual Springer-Verlag, Berlin.

Por exemplo, clonagem gênica posicionai utiliza a proximidade de um marcador de resistência a um fragmento cromossômico fisicamente definido e isolado contendo um gene QTL de resistência. O fragmento cromossômico isolado pode ser produzido por métodos bem conhecidos como digestão do DNA cromossômico com uma ou mais enzimas de restrição, ou pela amplificação de uma região cromossômica em uma reação em cadeia da polimerase (PCR) , ou qualquer reação de amplificação alternativa disponível. O fragmento digerido ou amplificado é tipicamente ligado em um vetor apropriado para replicação e, ex., expressão, do fragmento inserido. Marcadores adjacentes a uma fase aberta de leitura (ORF) associados a um traço fenotípico podem hibridizar com um clone de DNA (ex. , um clone de uma biblioteca de DNA genômico) , e por meio disso identificar um clone em que uma ORF (ou fragmento de uma ORF) está localizado. Se o marcador está mais distante, um

126/213 fragmento contendo a ORF é identificado por sucessivos ciclos de varredura e isolamento de clones que juntos constituem uma seqüência contigua de DNA, um processo chamado chromosome walking, resultando em um contig ou mapa de contig. Protocolos adequados para conduzir alguém versado através do isolamento de clones associados a marcadores ligados são encontrados em, ex. , Berger, Sambrook e Ausubel, todos incluídos aqui.

PRODUÇÃO DE CÉLULAS E PLANTAS TRANSGENICAS

A presente invenção também se refere a células hospedeiras e organismos que são transformados com ácidos nucléicos correspondentes a QTL de resistência identificados de acordo com a invenção. Por exemplo, tais ácidos nucléicos incluem intervalos do cromossomo (ex., fragmentos genômicos), ORFs e/ou cDNAs que codificam um traço de resistência recém conferida ou resistência aumentada. Adicionalmente, a invenção auxilia na produção de polipeptídeos que fornecem resistência recém conferida ou resistência aumentada por técnicas recombinantes.

Textos gerais que descrevem técnicas biológicas moleculares para a clonagem e manipulação de ácidos nucléicos e produção de polipeptídeos codificados incluem Berger, Sambrook, e Ausubel supra. Estes textos descrevem mutagênese, o uso de vetores, promotores e outros muitos tópicos relevantes relacionados a, ex. , a produção de clones que contém ácidos nucléicos de interesse, ex. , loci marcadores, sondas marcadoras, QTL que segregam com os loci marcadores, etc.

Células hospedeiras são engenheiradas geneticamente (ex., transduzidas, transfectadas, transformadas, etc.) com os vetores desta invenção (ex., vetores, como vetores de expressão que incluem uma ORF derivada de ou relacionada a um

127/213

QTL de resistência) que podem ser, por exemplo, um vetor de clonagem, um vetor de transferência ou um vetor de expressão. Tais vetores estão, por exemplo, na forma de um plasmídeo, um fagomídeo, uma agrobactéria, um vírus, um polinucleotídeo exposto (linear ou circular), ou um polinucleotídeo conjugado. Vetores poder ser introduzidos em bactéria, especialmente com o objetivo de propagação e expansão. Os vetores também são introduzidos em tecidos vegetais, células vegetais cultivadas ou protoplastos vegetais por uma variedade de métodos padrão conhecidos na arte, incluindo mas não se limitando à eletroporação (From et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

82:5824), infecção por vetores virais como vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Hohn et al. (1982) Molecular Biology of

Plant Tumors (Academic Press, Nova Iorque), pp. 549-560; U.S. Patent No. 4.407.956), penetração balística de alta velocidade por pequenas partículas com ácido nucléico tanto no interior da matriz de pequenas contas ou partículas, ou na superfície (Klein et al. (1987) Nature 327:70), utilização de pólen como vetor (WO85/01856) , ou utilização de Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogen.es carregando um plasmídeo de T-DNA no qual fragmentos de DNA são clonados. O plasmídeo de T-DNA é transmitido para células vegetais pela infecção por Agrobacterium tumefaciens, e uma porção é integrada de forma estável no genoma da planta (Horsch et al. (1984) Science 233:496; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

80:4803). Detalhes adicionais sobre métodos de introdução de ácido são encontrados em Sambrook, Berger e Ausubel, supra. O método de introdução de um ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira não é crítico para a presente invenção, e não é o intuito que a invenção seja limitada a qualquer método particular para introdução de material genético exógeno em uma célula hospedeira. Portando, qualquer método apropriado, ex. , incluindo mas não se limitando a um

128/213 dos métodos fornecidos aqui, que auxilia na introdução efetiva de um ácido nucléico em uma célula ou protoplasma pode ser empregado, encontrando uso na invenção.

As células hospedeiras podem ser cultivadas em meios nutricionais convencionais modificados como o apropriado para atividades como, por exemplo, ativação de promotores ou seleção de transformantes. Estas células podem ser opcionalmente cultivadas em plantas transgênicas. Em adição a Sambrook, Berger e Ausubel, supra, a regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al. (1983) Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176 (MacMillan Publishing Co.), New York; Davey (1983) Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts, Protoplasts, pp. 12-29, (Birkhauser, Basel); Dale (1983) Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereais and Other Recalcitrant Crops, Protoplasts pp. 31-41, (Birkhauser, Basel); Binding (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, (CRC Press, Boca Raton, FL) . Detalhes adicionais sobre cultivo e regeneração de células vegetais incluem Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) e Plant Molecular Biology (1993) R.R.D.Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6. Meios de cultura de células geralmente estão também publicados em Atlas e Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Informação adicional para cultivo de células é encontrada na literatura comercial disponível como o Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) da SigmaAldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, ex. , the

129/213

Plant Culture Catalogue e suplemento (ex., 1997 ou posterior) também da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-PCCS).

A presente invenção também se refere à produção de organismos transgênicos, que podem ser bactérias, leveduras, fungos, animais ou plantas, transduzidos com os ácidos nucléicos da invenção (ex., ácidos nucléicos incluindo o loci marcador e/ou QTL mencionado aqui). Uma discussão completa das técnicas relevantes ao cultivo de bactérias, eucariotos unicelulares e células é encontrada em referencias enumeradas aqui e são brevemente resumidas como se segue. Vários métodos bem conhecidos de introdução de ácidos nucléicos em células bacterianas estão disponíveis, e qualquer um destes pode ser utilizado na presente invenção. Estes incluem: fusão das células recipientes com protoplastos bacterianos contendo o DNA, tratamento das células com lipossomos contendo o DNA, eletroporação, bombardeamento de projéctil (biolística), transferência por fibra de carbono, e infecção com vetores virais (discutido mais adiante, abaixo), etc. Células bacterianas podem ser utilizadas para amplificar o número de plasmídeos contendo construções de DNA desta invenção. A bactéria é crescida até a fase log, e os plasmídeos contidos na bactéria podem ser isolados por uma variedade de métodos conhecidos na arte (veja, por exemplo, Sambrook). Adicionalmente, uma pletora de kits para a purificação de plasmídeos de bactérias estão disponíveis comercialmente. Para o seu uso adequado, segundo as instruções do fabricante (veja, por exemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos da Pharmacia Biotech; StrataClean™, da Stratagene; e, QIAprep™ da Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados são então ulteriormente manipulados para produzir outros plasmídeos usados para transfectar células vegetais ou incorporados em vetores relacionados à Agrobacterium tumefaciens para infectar plantas. Vetores típicos contém terminadores de transcrição e

130/213 tradução, seqüências de iniciação de transcrição e tradução, e promotores úteis para a regulação da expressão de um determinado ácido nucléico alvo. Os vetores incluem opcionalmente cassetes de expressão genéricos contendo ao menos uma seqüência terminadora independente, seqüências que permitem a replicação do cassete em eucariotos, ou procariotos, ou ambos (ex., vetores de transferência) e marcadores de seleção para ambos sistemas procariótico e eucariótico. Vetores são apropriados para replicação e integração em procariotos, eucariotos, ou preferencialmente ambos. Veja, Giliman & Smith (1979) Gene 8:81; Roberts et al. (1987) Nature 328:731; Schneider et al. (1995) Protein Expr. Purif. 6:10; Ausubel, Sambrook, Berger (todos supra). Um catálogo de Bactérias e Bacteriófagos úteis para clonagem é fornecido, ex., pela American Type Culture Collection (ATCC), ex. , The ATCC Catalogue of Bactéria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicada pela ATCC. Procedimentos básicos adicionais para seqüenciamento, clonagem e outros aspectos da biologia molecular e considerações teóricas fundamentais também podem ser encontrados em Watson et al. (1992)

Recombinant DNA, Segunda Edição, Scientific American Books, NY. Adicionalmente, essencialmente qualquer ácido nucléico (e virtualmente qualquer ácido nucléico marcado, sendo padrão ou não padrão) pode ser encomendado ou feito sob encomenda de uma de uma variedade de fontes comerciais, como The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX) , The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL) , Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) e muitas outras.

Introdução de Ácidos Nucléicos em Plantas

Concretizações da presente invenção pertencem à produção de plantas transgênicas contendo os ácidos nucléicos clonados, ex., ORFs isoladas e cDNAs codificando genes de resistência.

131/213

Técnicas para transformar células vegetais com ácidos nucléicos estão amplamente disponíveis e podem ser prontamente adaptadas para a invenção. Em adição à Berger, Ausubel e Sambrook, todos supra, referências gerais úteis para clonagem, cultivo e regeneração de células vegetais incluem Jones (ed) (1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols-- Methods in Molecular Biology, Volume 49 Humana Press Towata NJ (Jones); Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (Payne); e Gamborg e Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) (Gamborg). Uma variedade de meios de cultura de célula são descritos em Atlas Microbiological Media e Parks (eds) The Handbook of (1993) CRC Press, Boca Raton, FL (Atlas). Informação adicional para a cultura de célula vegetal é encontrada em literatura comercial disponível como o Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) da SigmaAldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) e, ex. , o Plant Culture Catalogue e suplemento (1997) também da Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) (Sigma-PCCS) . Detalhes adicionais sobre cultura de célula vegetal são encontrados em Croy.

As construções de ácido nucléico da invenção, ex. plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais, polinucleotídeos de DNA e RNA, são introduzidos em células vegetais tanto em cultura ou nos órgãos da planta por uma variedade de técnicas convencionais. Onde a seqüência é expressa, a seqüência é opcionalmente combinada com seqüências regulatórias de iniciação transcricional e traducional que direcionam a transcrição e tradução da seqüência de DNA exógena nos tecidos pretendidos da planta transformada.

Ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser introduzidos em plantas de acordo com qualquer uma de uma

132/213 variedade de técnicas conhecidas na arte. Técnicas para transformar uma ampla variedade de espécies de vegetais superiores são também conhecidas e descritas nas literaturas técnica, científica e de patentes amplamente disponíveis. Veja, por exemplo, Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477.

As construções de DNA da invenção, por exemplo plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, fagos, polinucleotídeos de DNA expostos ou variavelmente conjugados (ex., DNA conjugado a polilisina, DNA conjugado a peptídeo, DNA conjugado a lipossomo), ou cromossomos artificiais, podem ser introduzidos diretamente no DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas como eletroporação e microinjeção do protoplasto da célula vegetal, ou as construções de DNA podem ser introduzidas diretamente em células vegetais utilizando métodos balísticos, como bombardeamento de partículas com DNA.

Técnicas de microinjeção para injetar, ex., células, embriões, calos e protoplastos vegetais, são conhecidos na arte e bem descritos na literatura científica e de patentes. Por exemplo, um número de métodos são descritos em Jones, assim como em outra referências mencionadas aqu.i e disponíveis na literatura.

Por exemplo, a introdução de construções de DNA utilizando precipitação por polietilenoglicol é descrita em Paszkowski et al. , EMBO J. 3:2717 (1984) . Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824 (1985). Técnicas de transformação por balística são descritas em Klein et al. , Nature 327:70-73 encontrados em

Jones (1987). Detalhes adicionais são Gamborg, supra, e em U.S. Patent No. 5.990.387.

Alternativamente, e em alguns casos preferencialmente, transformação mediada por Agrobacterium é empregada para produzir plantas transgênicas. Técnicas de transformação

133/213 mediada por Agrobacterium, incluindo desarmamento e uso de vetores binários, são também bem descritos na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsch, et al. (1984) Science

233:496; Fraley et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA

80:4803: e revisado em Hansen e Chilton (1998) Curr. Top.

Microbiol. Immunol. 240:21 e Das (1998) Subcellular

Biochemistry 29: Plant Microbe Interactions, pp. 343-363.

Construções de DNA são opcionalmente combinadas com regiões apropriadas flanqueando o T-DNA e introduzidas em um vetor hospedeiro convencional de Agrobacterium tumefaciens. As I funções de virulência da Agrobacterium tumefaciens hospedeira irá direcionar a inserção da construção e de marcador adjacente no DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Veja, U.S. Patent No. 5.591.616. Embora

Agrobacterium seja útil principalmente para dicotiledôneas, certas monocotiledôneas podem ser transformadas por Agrobacterium. Por exemplo, transformação de milho por Agrobacterium é descrita em U.S. Patent No. 5.550.318.

Outros métodos de transfecção ou transformação incluem (1) transformação mediada por Agrobacterium rhizogenes (veja, ex., Lichtenstein e Fuller (1987) In: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed. , Londres, Academic Press; e

Lichtenstein e Draper (1985) In: DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press; WO 88/02405, publicado em 7 de abril, 1988, descreve o uso da cepa A4 de A. rhizogenes e seu plasmídeo Ri junto com os vetores pARC8 ou pARC16 de A. tumefaciens, (2) aquisição de DNA mediada por lipossomo (veja, ex., Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 25:1353), e (3) o método de vórtice (veja, ex., Kindle (1990) Proc. Natl.

Acad. Sei. (USA) 87:1228).

DNA também pode ser introduzido em plantas pela transferência direta de DNA em pólen como descrito por Zhou et al. (1983) Meth. Enzymol. 101:433; D. Hess (1987) Intern Rev.

134/213

Cytol. 107:367; Luo et al. (1988) Plant Mol. Biol. Rep. 6:165. Expressão de genes codificando polipeptídeos pode ser obtida pela injeção de DNA em órgãos reprodutivos de uma planta como descrito por Pena et al. (1987) Nature 325:274. DNA também pode ser injetado diretamente em células de embriões imaturos e embriões dissecados e reidratados como descrito por Neuhaus et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30; e Benbrook et al. (1986) em Proceedings Bio Expo Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54. Uma variedade de vírus de vegetais que podem ser empregados como vetores são conhecidos na arte e incluem vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), geminivírus, vírus do mosaico do bromo, e vírus do mosaico do tabaco.

Produção/Regeneração de Plantas Transgênicas

Células vegetais transformadas que são originadas por qualquer uma das técnicas de transformação mencionadas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado e portanto o fenótipo transformado. Tais técnicas de regeneração dependem da manipulação de certos fitormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente envolvendo um biocida e/ou marcador de herbicida que foi introduzido junto com as seqüências nucleotídicas desejadas. Regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Payne; Fundamental Methods Springer Lab (Berlin Heidelberg Nova Iorque);

Protoplasts Isolation and Culture,

Culture pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York; e Binding (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton. Regeneração também pode ser obtida a partir de calos, explantes, embriões somáticos (Dandekar et al. (1989) J. Tissue Cult. Meth. 12:145;

McGranahan et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:512), órgãos, ou

Manual, Springer-Verlag Evans et al. (1983)

Handbook of Plant Cell

135/213 partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al. (1987) Ann. Rev. Plant Phys. 38:467486. Detalhes adicionais são encontrados em Payne e Jones, ambos supra, e Weissbach e Weissbach, eds. (1988) Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, Inc., San Diego, CA. Este processo de regeneração e crescimento inclui os passos de seleção das células e brotos transformantes, enraizamento dos brotos transformantes, e crescimento das plântulas na terra. Estes métodos são adaptados para a invenção para produzir plantas transgênicas carregando QTL e outros genes isolados de acordo com os métodos da invenção.

a regeneração de plantas contendo os presente invenção introduzidos por

Adieionalmente, polinucleotídeos da

Agrobacterium em células de explantes de folha pode ser 15 alcançada como descrito por Horsch et al. (1985) Science

227:1229-1231.

Neste procedimento, transformantes sao cultivados na presença de um agente seletivo em um meio que induz a regeneração de brotos nas espécies de plantas transformadas como descrito por Fraley et al. (1983) Proc.

Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 80:4803. Este procedimentos tipicamente produz brotos dentro de duas a quatro semanas, e estes brotos transformantes são então transferidos para um meio de indução de raiz contendo o agente seletivo e um antibiótico para evitar crescimento bacteriano. Plantas transgênicas da presente invenção podem ser férteis ou estéreis.

Não é o intuito que transformação de planta e expressão de polipeptídeos que proporcionam resistência a doença, como provida pela presente invenção, seja limitados a espécies de milho. De fato, é contemplado que os polipeptídeos que proporcionam a resistência em milho podem também proporcionar tal resistência quando transformados e expressos em outras espécies agronomicamente e horticulturalmente importantes. Por

136/213 exemplo, tais espécies incluem: soja, canola, alfafa, trigo, girassol, e sorgo.

Na construção de cassetes de expressão recombinantes da invenção, que inclui, por exemplo, plasmídeos auxiliares contendo funções de virulência, e plasmídeos ou vírus contendo seqüências de DNA exógeno como genes estruturais, é opcionalmente empregado um fragmento de promotor de planta que controla a expressão de um ácido nucléico em qualquer ou todos os tecidos da planta regenerada. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição 3 5S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o promotor 1' ou 2' derivado do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes de planta conhecidos por aqueles versados. Alternativamente, o promotor da planta pode dirigir a expressão do polinucleotídeo da invenção em um tecido específico (promotores tecidoespecíficos) ou podem estar de outra maneira sob controle ambiental mais preciso (promotores induzíveis). Exemplos de promotores tecido-específicos controlados pelo desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição somente em certos tecidos, como fruto, sementes ou flores.

Qualquer um de um número de promotores que direcionam a expressão em células vegetais podem ser apropriados. O promotor pode ser tanto constitutivo como induzível. Em adição aos promotores mencionados acima, promotores de origem bacteriana que operam em plantas incluem o promotor da octopina sintase, o promotor da nopalina sintase e outros promotores derivados dos plasmídeos Ti nativos. Veja, HerraraEstrella et al. (1983) Nature 303:209. Promotores virais incluem os promotores de RNA 35S e 19S do vírus do mosaico da couve-flor. Veja, Odell et al. (1985) Nature 313:810. Outros promotores de planta incluem o promoter do inibidor de tripsina Kunitz (KTI), SCPl, SUP, UCD3,o promotor da pequena

137/213 subunidade da ribulose-1,3-bifosfato carboxilase e o promotor da faseolina. As seqüências do promotor do gene E8 e outros genes também podem ser utilizadas. O isolamento e a seqüência do promotor E8 são descritos em detalhe em Deikman e Fischer (1988) EMBO J. 7:3315. Muitos outros promotores estão atualmente em uso e podem ser utilizados junto a uma seqüência de DNA exógeno para direcionar a expressão do ácido nucléico.

Se a expressão de um polipeptídeo de um cDNA é desejada, uma região de poliadenilação no término 3 ' da região codificante é tipicamente incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada de um gene natural, de um variedade de outros genes de planta, ou de , ex., T-DNA.

vetor contendo as seqüências (ex., promotores ou regiões codificantes) de genes codificando produtos de expressão e transgenes da invenção irão tipicamente incluir uma subseqüência de ácido nucléico, um gene marcador que confere um fenótipo selecionável, ou alternativamente, passível de ser triado, em células vegetais. Por exemplo, o marcador pode codificar tolerância a biocida, particularmente tolerância a antibiótico, como tolerância à canamicina, G418, bleomicina, higromicina, ou tolerância a herbicida, como tolerância ao clorosulforon, ou fosfinotricina (o ingrediente ativo nos herbicidas bialophos ou Basta) . Veja, ex. , Padgette et al. (1996) Em: Herbicide-Resistant Crops (Duke, ed.), pp 53-84, CRC Lewis Publishers, Boca Raton. Por exemplo, seletividade de plantas de cultivo para herbicidas específicos pode ser conferida através da engenharia de genes em plantas de cultivo que codificam enzimas metabolizadoras de herbicida apropriadas de outros organismos, como micróbios. Veja, Vasil (1996) Em: Herbicide-Resistant Crops (Duke, ed.), pp 85-91, CRC Lewis Publishers, Boca Raton).

Alguém versado na arte reconhece que após o cassete de expressão recombinante ser estavelmente incorporado em plantas

138/213 transgênicas e confirmado ser funcional, este pode ser introduzido em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de um número de técnicas padrão de cultivo pode ser utilizada, dependendo da espécie a ser cruzada. Em plantas de cultivo propagadas vegetativamente, plantas transgênicas maduras podem ser propagadas através do uso de mudas ou através de técnicas de cultura de tecido para produzir múltiplas plantas idênticas. Seleção de transgênicos desejáveis é feita e novas variedades são obtidas e propagadas vegetativamente para uso comercial. Em plantas de cultivo propagadas por sementes, plantas transgênicas maduras podem ser auto-cruzadas para produzir uma planta endocruzada homozigota. A planta endocruzada produz sementes contendo o ácido nucléico recém introduzido. Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que produziríam o fenótipo selecionado. Partes obtidas das plantas regeneradas, como flores sementes, folhas, galhos, frutos, e similares, estão incluídos na invenção, estabelecido que estas partes incluem células contendo o ácido nucléico isolado da presente invenção. Progênie e variantes, e regeneradas, estão também incluídas invenção, estabelecido que estas partes contém as seqüências de ácido nucléico introduzidas.

Plantas transgênicas ou introgredidas expressando um polinucleotídeo da presente invenção podem ser tríadas para transmissão do ácido nucléico da presente invenção através de, por exemplo, métodos padrão de detecção de ácido nucléico ou por protocolos de imunoblot. Expressão em nível de RNA pode ser determinado para identificar e quantificar plantas positivas para expressão. Técnicas padrão para análise de RNA podem ser empregadas e incluem ensaios de amplificação por RTPCR utilizando oligos de oligonucleotídeos desenhados para amplificar somente moldes de RNA heterólogo ou introgredidos e mutantes das plantas dentro do escopo da

139/213 ensaios de hibridização em solução utilizando sondas específicas marcadoras ou ligadas a QTL. Plantas também poder ser analisadas em relação à expressão de proteína, ex. , por análise imunoblot de Western utilizando anticorpos que reconhecem os polipeptídeos codificados. Adicionalmente, hibridização in situ e imunocitoquímica podem ser feitas de acordo com protocolos padrão utilizando sondas heterólogas de polinucleotídeo específicas para ácido nucléico e anticorpos, respectivamente, para localizar locais de expressão no tecido transgênico. Geralmente, um número de linhagens transgênicas í são usualmente triadas para o ácido nucléico incorporado para identificar e selecionar plantas com os perfis de expressão mais apropriados.

Uma concretização da invenção é um planta transgênica que é homozigota para o ácido nucléico heterólogo adicionado; ex., uma planta transgênica que contém duas cópias da seqüência do ácido nucléico adicionado, ex. , um gene no mesmo lócus em cada cromossomo de um par de cromossomos homólogos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida através de cruzamento sexuado (auto-fertilização) de uma planta transgênica heterozigota que contém um único ácido nucléico heterólogo adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para expressão alterada de um polinucleotídeo da presente invenção relativa à planta controle (ex., uma planta nativa, não transgênica). Cruzamento parental com uma planta parental pode ser utilizado para introgredir o ácido nucléico heterólogo no background selecionado (ex., uma linhagem elite ou exótica de milho).

MÉTODOS PARA PLANTAS DE MILHO RESISTENTES A MRCV

Criadores de planta experientes podem identificar plantas de milho resistentes no campo e podem selecionar os indivíduos ou populações resistentes com propósito de cruzamento ou para

140/213 propagação. Neste contexto, o criador de planta identifica plantas de milho resistentes e não resistente, ou suscetíveis.

Tais praticantes de melhoramento vegetal irão perceber que resistência da planta é um espectro fenotípico consistindo de extremos de resistência, susceptibilidade e um contínuo de fenótipos de resistência intermediários. Resistência também varia devido a efeitos ambientais e à severidade da infecção pelo patógeno. Avaliação de fenótipos utilizando testes reproduzíveis e métodos de pontuação de resistência são importantes para cientistas que procuram identificar loci genéticos que conferem resistência, conduzem seleção assistida por marcador em populações resistentes, e em técnicas de introgressão para cruzar um traço de resistência em uma linhagem elite de milho, por exemplo.

Em contraste a observações de campo casuais que classificam plantas como tanto resistentes ou suscetíveis, são conhecidos vários sistemas para pontuar o grau de resistência ou susceptibilidade da planta. Estas técnicas podem ser aplicadas a locais diferentes em tempos diferentes, e fornecem pontuações de resistência aproximadas que podem ser utilizadas para caracterizar uma dada linhagem não obstante as condições de cultivo ou localização.

SISTEMAS DE DETECÇÃO/CORRELAÇÃO AUTOMATIZADOS DA INVENÇÃO

Em algumas concretizações, a presente invenção inclui um sistema automatizado para detectar marcadores da invenção e/ou correlacionar os marcadores com um fenótipo desejado (ex., resistência). Portanto, um sistema típico pode incluir um conjunto de sondas marcadoras ou oligos configurados para detectar ao menos um alelo favorável de um ou mais loci marcadores associados a uma resistência recém conferida ou resistência aumentada ao MRCV. Estas sondas ou oligos são

141/213 configurados para detectar os alelos marcadores mencionados nas tabelas e exemplos incluídos aqui, ex. , utilizando qualquer formato de detecção de alelo disponível, ex. , detecção baseada em arranjo em fase líquida ou sólida, detecção de amostra baseada em microfluídos, etc.

Por exemplo, em uma concretização, o lócus marcador é

MZA625, MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826, e

MZA9105, ou qualquer combinação destes, assim como qualquer um dos intervalos cromossômicos (i) MZA8381 e MZA18180;

(ii) MZA4305 e MZA2803;

(iii) MZA15490 e MZA2038;

(iv) bnlgl458b e umcl261a;

(v) bnlgl458b e umcl262a;

(vi) bnlgl327 e umcl261a; e (viii) bnlgl327 e umcl262a; ou qualquer combinação destes, e o conjunto de sondas é configurado para detectar o lócus.

O sistema típico inclui um detector que está configurado para detectar uma ou mais produções de sinal de um conjunto de sondas marcadoras ou oligos, ou amplicon destes, e por meio disto identificar a presença ou ausência do alelo. Uma ampla variedade de aparatos de detecção de sinal estão disponíveis, incluindo tubos fotomultiplicadores, espectrofotômetros, arranjos de CCD, arranjos e varredores de arranjos, detectores de varredura, fototubos e fotodiodos, postos de microscopia, galvodigitalizador, aparelhos de detecção de amplificação microfluida de ácidos nucléicos, e similares. A configuração precisa do detector irá depender, em parte, do tipo de marcação utilizada para detectar o alelo marcador, assim como da instrumentação que pode ser mais convenientemente obtida pelo usuário. Detectores que detectam fluorescência, fosforescência, radioatividade, pH, carga, absorbância, luminescência, temperatura, magnetismo, e similares podem ser

142/213 exemplo, utilizados. Concretizações de detectores típicos incluem detectores de luz (ex., fluorescência) ou detectores de radioatividade. Por exemplo, detecção de emissão de luz (ex., emissão de fluorescência) ou outra marcação de sonda é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. Detecção de fluorescência é especialmente preferida e é geralmente usada para detecção de ácido nucléicos amplificados (entretanto, operações a montante e/ou a jusante também poder ser executadas em amplicons, que podem envolver outros métodos de detecção). Geralmente, o detector detecta a emissão (ex., luz) de uma ou mais marcações de uma sonda marcada, que é um indicativo da presença ou ausência do alelo marcador.

0(s) detector(es) opcionalmente monitora um de uma pluralidade de sinais de uma reação de amplificação. Por o detector pode monitorar sinais óticos que correspondem a resultados de ensaios de amplificação em tempo real.

Instruções de sistema que correlacionam a presença ou ausência de um alelo favorável com a resistência esperada também são aspectos da invenção. Por exemplo, as instruções podem incluir ao menos uma tabela de consulta que inclui a correlação entre a presença ou ausência de alelos favoráveis e a resistência recém conferida ou resistência aumentada esperada. A forma precisa das instruções pode variar dependendo dos componentes do sistema, ex., podem estar presentes como um programa de computador em uma ou mais unidades integradas do sistema (ex., um microprocessador, computador ou mídias capazes de serem lidas por computador), ou podem estar presentes em uma ou mais unidades (ex., computadores ou mídias capazes de serem lidas por computador) operacionalmente acopladas a um detector. Como mencionado, em uma típica concretização, as instruções de sistema incluem ao menos uma tabela de consulta que inclui uma correlação entre a

143/213 presença ou ausência de alelos favoráveis e resistência recém conferida ou resistência aumentada esperada. As instruções também incluem tipicamente instruções fornecendo uma interface de usuário com o sistema, ex. , para permitir ao usuário a observação dos resultado de uma análise de amostra e para introduzir parâmetros no sistema.

sistema tipicamente inclui componentes para armazenar ou transmitir dados capazes de serem lidos por computador representando ou designando os alelos detectados através dos métodos da presente invenção, ex., em um sistema automatizado. A mídia capaz de ser lida por computador pode incluir cachê, memória principal, e de armazenamento e/ou outros componentes de armazenamento de dados eletrônicos (disco rígidos, disquetes, disco de armazenamento, etc.) para armazenamento de códigos fonte. Dados representando alelos detectados através dos métodos da presente invenção poder ser transmitidos eletronicamente, opticamente, ou magneticamente em um sinal de dados de computador concretizado um meio de transmissão em uma rede como intranet ou internet ou combinações destes. O sistema pode ser também ou alternativamente transmitido via rede sem fio, IR, ou outras alternativas de transmissão disponíveis.

Durante a operação, o sistema tipicamente inclui uma amostra a ser analisada, como um tecido da planta, ou material isolado do tecido como DNA genômico, DNA genômico amplificado, cDNA, cDNA amplificado, RNA, RNA amplificado, ou similar.

A expressão sistema de detecção/correlação de alelo no contexto desta invenção se refere a um sistema no qual dados introduzidos no computador correspondem a objetos físicos ou processos externos ao computador, ex., um alelo marcador, e um processo que, dentro de um computador, causa uma transformação física dos sinais de entrada em diferentes sinais de saída. Em outras palavras, os dados de entrada, ex., amplificação de um

144/213 alelo marcador particular são transformados em dados de saída, ex., a identificação da forma alélica de um segmento do cromossomo. O processo no computador é um conjunto de instruções, ou programa, pelo qual amplificação positiva ou sinais de hibridização são reconhecidos pelo sistema integrado e atribuído a amostras individuais como genótipo. Programas adicionais correlacionam a identidade de amostras individuais com valores fenotípicos ou alelos marcadores, ex. , métodos estatísticos. Adícionalmente, existem vários programas C/C++ para computação, programas Delphi e/ou Java para interfaces GUI, e ferramentas de produtividade (ex., Microsoft Excel e/ou SigmaPlot) para desenhar e criar tabelas de consulta de correlações relevantes de alelo-traço. Outras ferramentas de programa de computador úteis no contexto dos sistemas integrados da invenção incluem pacotes estatísticos como SAS, Genstat, Matlab, Mathematica, e S-Plus e pacotes de modelagem genético como QU-GENE. Ademais, linguagens de programação adicionais como visual básico também são apropriadamente empregadas nos sistemas integrados da invenção.

Por exemplo, valores de alelos marcadores de resistência designados para uma população de uma progênie descendente de um cruzamento entre linhagens elite são registrados em um meio capaz de ser lido por computador, e por meio disso estabelecendo um banco de dados correspondendo alelos de resistência com identificadores únicos para membros de uma população de descendentes. Qualquer arquivo ou pasta, tanto feita sob encomenda ou comercialmente disponível (ex., da Oracle ou Sybase), apropriada para gravar dados em uma mídia capaz de ser lida por computador é aceita como um banco de dados no contexto da presente invenção. Dados referentes aos genótipos para um ou mais marcadores moleculares, ex. , ASH, SSR, RFLP, RAPD, AFLP, SNP, marcadores de isoenzima, e outros marcadores como descrito aqui, são similarmente gravados em um

145/213 banco de dados acessível por computador. Opcionalmente, dados de marcadores são obtidos utilizando sistemas que automatizam um ou mais aspectos do ensaio (ou ensaios) utilizado para determinar o genótipo do(s) mascador(es). Em tal sistema, dados de entrada correspondentes aos genótipos para marcadores moleculares são retransmitidos de um detector, ex., um arranjo, um digitalizador, um CCD, ou outro dispositivo de detecção diretamente para arquivos em uma mídia capaz de ser lida por computador acessível pela unidade central de processamento. Um conjunto de instruções de sistema (tipicamente concretizadas em um ou mais programas) codificando as correlações entre resistência e os alelos da invenção é executado pelo dispositivo computacional para identificar correlações entre alelos marcadores e fenótipos esperados de traços.

Tipicamente, o sistema também inclui um dispositivo de entrada do usuário, como um teclado, um mouse, uma tela sensível ao toque, ou similares (para, ex., selecionar arquivos, obter dados, revisar tabelas de informação de marcadores), e um dispositivo de saída (ex., um monitor, uma impressora) para visualizar ou obter o produto da análise estatística.

Portanto, em um aspecto, a invenção fornece um sistema integrado incluindo um computador ou mídia capaz de ser lida por computador incluindo um conjunto de arquivos e/ou um banco de dados com ao menos um conjunto de dados que corresponde aos alelos marcadores incluídos aqui. O sistema também inclui uma interface permitindo o usuário visualizar seletivamente um ou mais destes banco de dados. Adieionalmente, programas padrão de computador para manipulação de texto como programas de computador de processamento de palavras (ex., Microsoft Word™ ou Corel WordPerfect™) e banco de dados ou planilhas eletrônicas (ex., planilhas eletrônicas como Microsoft Excel™,

146/213

Corel Quattro Pro™, ou programa de banco de dados como Microsoft Access™ ou Paradox™) podem ser utilizados junto com uma interface de usuário (ex., uma GUI em um sistema operacional padrão como um sistema Windows, Macintosh, Unix ou Linux) para manipular cadeias de caracteres correspondendo a alelos ou outros aspectos do banco de dados.

Os sistemas opcionalmente incluem componentes para manipulação de amostras, ex., dispositivos robóticos incorporados. Por exemplo, uma armação robótica de controle de líquidos para transferência de soluções (ex., extrato de células vegetais) de uma fonte para um destino, ex., de uma placa de microtitulação para um arranjo de substrato, é opcionalmente conectado operacionalmente ao computador digital (ou a um computador adicional no sistema integrado). Um dispositivo de entrada para inserir dados no computador digital para controlar a transferência de alta escala de líquidos pela armação robótica de controle de líquidos e, opcionalmente, para controlar a transferência pela armadura ao suporte sólido é normalmente uma característica do sistema integrado. Muitos destes sistemas robóticos automatizados de manipulação de fluídos estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, uma variedade de sistemas automatizados são disponíveis pela Caliper Technologies (Hopkinton, MA) , que utiliza vários sistemas Zymate, que tipicamente incluem, ex., robótica e módulos de manipulação de fluídos. Similarmente, o robô comum ORCA®, que é utilizado em uma variedade de sistemas de laboratórios, ex. , para manipulação de placas de microtitulação, é também disponível comercialmente, ex. , pela Beckman Coulter, Inc. (Fullerton, CA) . Como uma alternativa a robótica convencional, sistemas de microfluídos para realizar manipulação e detecção de fluídos são agora amplamente disponíveis, ex., pelas Caliper Technologies Corp. (Hopkinton, MA) e Agilent Technologies (Paio Alto, CA).

147/213

Sistemas para análise de marcadores moleculares da presente invenção podem então incluir um computador digital com um ou mais programas de computador para controle de alta escala de líquidos, programas de computador de análise de imagem para analisar dados da marcação de marcadores, programas de computador de interpretação de dados, uma armação robótica de controle de líquidos para transferir soluções de uma fonte para um destino operacionalmente conectada a um computador digital, um dispositivo de entrada (ex., um teclado de computador) para inserir dados no computador digital para controlar a transferência em larga escala de líquido pela armação robótica de controle de líquido e, opcionalmente, um digitalizador de imagem para digitalizar sinais de marcação de sondas marcadas hibridizadas, ex., a marcadores em um suporte sólido operacionalmente conectados a um computador digital. O digitalizador de imagem se comunica com o programa de análise de imagem para fornecer uma medida de, ex., intensidade de marcação da sonda de ácido nucléico sob hibridização a uma população de amostras de ácido nucléico em arranjo (ex. , incluindo um ou mais marcadores), onde a medida da intensidade da marcação da sonda é interpretada pelo programa de interpretação de dados para mostrar se, e a que nível, a sonda marcada hibridiza a um ácido nucléico marcador (ex., um alelo marcador amplificado). O dado derivado desta forma é então correlacionado com a identidade da amostra, para determinar a identidade de uma planta com genótipo(s) particular(es) para marcadores ou alelos particulares, ex., para facilitar a seleção assistida por marcador de plantas de milho com formas alélicas de segmentos de cromossomos favoráveis envolvidas em desempenho agronômico (ex., resistência recém conferida ou resistência aumentada).

Imagens óticas, ex., padrões de hibridização observados (e, opcionalmente, gravados) por uma câmera ou outro

148/213 dispositivo de gravação (ex., um fotodiodo e um dispositivo de armazenamento de dados) são opcionalmente processadas ulteriormente em qualquer uma das concretizações incluídas aqui, ex. , pela digitalização da imagem e/ou armazenamento e análise da imagem em um computador. Uma variedade de equipamentos periféricos e programas de computador comercialmente disponíveis são utilizáveis para digitalizar, armazenar e analisar vídeos ou imagens óticas digitalizadas, ex. , utilizando computadores PC (ex., Intel x86 ou Pentium

DOS™ compatível com chip, 0S2™, WINDOWS™, WINDOWS NT™, WINDOWS ₍ 95™, WINDOWS 97™, WINDOWS 2000™, WINDOWS XP™, ou máquinas baseadas em WINDOWS VISTA™), MACINTOSH™, LINUX, ou baseados em

UNIX (ex., estação de trabalho SUN™) .

EXEMPLO 1

Análise de Mapeamento de Associação

Uma estratégia de mapeamento de associação foi conduzida para identificar marcadores genéticos de milho associados com a resistência à infecção por MRCV, que é o agente causativo do

Mal de Rio Cuarto.

MAPEAMENTO DE ASSOCIAÇÃO

A compreensão da extensão e padrões do desequilíbrio de ligação (LD) no genoma é um pré-requisito para o desenvolvimento de abordagens de associação eficientes com o intuito de identificar e mapear loci de traço quantitativo (QTL) . Desequilíbrio de ligação (LD) se refere à associação aleatória de alelos em uma coleção de indivíduos. Quando LD é observado entre alelos em loci ligados, é medido como se LD decaísse ao longo de uma região específica de um cromossomo. A extensão do LD é o reflexo do histórico de recombinação daquela região. A taxa média de decaimento de LD em um genoma pode ajudar a predizer o número e densidade de marcadores que

149/213 são requerido para desempenhar um estudo de associação por todo o genoma e provê uma estimativa da resolução que pode ser esperada.

Mapeamento de associação ou mapeamento de LD tem como objetivo identificar associações genótipo-fenótipo significativas. Esse tipo de mapeamento foi explorado com uma ferramenta poderosa para mapeamento fino em espécies exocruzadas tal como humanos (Corder et al. (1994) Protective effect of apolipoprotein-E type-2 allele for late-onset

Alzheimer-disease, Nat Genet 7:180-184; Hastbacka et al. (1992) Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations: diastrophic dysplasia in Finland, Nat Genet

2:204-211; Kerem et al. (1989) Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis, Science 245:1073-1080) e milho (Remington et al., (2001) Structure of linkage disequilibrium and phenotype associations in the maize genome, Proc Natl Acad Sei USA 98:11479-11484; Thornsberry et al. (2001) Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time, Nat Genet 28:286-289; revisado por Flint20 Garcia et al. (2003) Structure of linkage disequilibrium in plants, Annu Rev Plant Biol. 54:357-374), onde a recombinação entre heterozigotos é freqüente e resulta em um decaimento rápido do LD. Em espécies endocruzadas onde a recombinação de entre genótipos homozigóticos não é geneticamente detectável, a extensão do LD é maior (ex. , bloco maiores de marcadores ligados são herdados juntos) e isso aumenta dramaticamente o poder de detecção do mapeamento de associação (Wall e Pritchard (2003) Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human genome, Nat Rev Genet 4:587-597).

O histórico de recombinação e mutação de uma população é uma função do hábito de cruzamento assim como do tamanho efetivo e idade de uma população. Tamanhos populacionais grandes para detectar recombinação oferecem possibilidades

150/213 aumentadas na detecção de recombinação, enquanto populações mais velhas estão geralmente associadas com índices mais elevados de polimorfismo, ambos os quais contribuem para taxas acelerada a níveis observáveis de decaimento do LD. Por outro lado, tamanhos populacionais efetivamente menores, ex. , aqueles que passaram recentemente por um gargalo genético, tendem a apresentar uma taxa mais lenta de decaimento do LD, resultando em uma conservação do haplótipo mais extensiva (Flint-Garcia et al. (2003) Structure of linkage disequilibrium in plants, Annu Rev Plant Biol. 54:357-374).

₍ Linhagens de melhoramento elite provêm um ponto inicial valioso para análise de associação. Análises de associação utilizam pontuações fenotípicas quantitativas (ex., tolerância a doença pontuadas de um a nove para cada linhagem de milho) na análise (em oposição a simples observação de distribuição de freqüência de alelos tolerantes versus resistentes em tipos de análise de distribuição alélica intergrupo). A disponibilidade de dados detalhados de desempenho fenotípico coletados através de programas de melhoramento ao longo de múltiplos anos e ambientes para um grande número de linhagens elite provê um valioso conjunto de dados para análises de mapeamento de associação de marcadores genéticos. Isso abre o caminho para uma integração completa entre pesquisa e aplicação e tira vantagem de conjunto de dados acumulados historicamente. Porém, a compreensão da relação entre polimorfismo e recombinação é útil no desenvolvimento de estratégias apropriadas para extração eficiente do máximo de informação proveniente dessas fontes.

Esse tipo de análise de associação não gera ou requer qualquer dado de mapa, mas, ao invés, é independente da posição de mapa. Essa análise compara a pontuação fenotípica da planta como os genótipos em vários loci. Subsequentemente, qualquer mapa de milho apropriado (por exemplo, um mapa

151/213 composto) pode opcionalmente ser utilizado para auxiliar na distribuição dos marcadores de QTL identificados e/ou a clusterização de marcadores de QTL utilizando localizações de mapa dos marcadores previamente determinadas.

LINHAGENS DE MILHO E PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Linhagens de milho foram fenotipicamente pontuadas baseado nos seus graus de resistência à infecção por MRCV (em contraste à simples categorização de tolerante ou suscetível). As variedades de plantas utilizadas na análise I foram provenientes de diversas fontes, incluindo germoplasma elite, cultivares liberadas comercialmente e outras variedades públicas. As coleções contêm 475 linhagens de milho. As linhagens utilizadas no estudo apresentam um grande espectro de maturidade variando de CRM (maturidade relativa comparativa) 90 a CRM 140, representando as principais linhagens endocruzadas do germoplasma Pioneer.

O grau de resistência vegetal à infecção por MRCV variou enormemente, de acordo com a medição usando uma escala de um (altamente suscetível) a nove (altamente resistente).

Geralmente, uma pontuação de dois (2) indicou as cepas mais suscetíveis, uma pontuação de quatro (4) foi designada no limiar entre uma planta ser considerada suscetível ou resistente (menos que 4, suscetível; 4 ou maior é resistente) e uma pontuação de sete (5-7) foi designada às linhagens mais resistentes. Pontuações de resistência de oito (8) e nove (9) foram reservados para níveis de resistência que são muito raros e geralmente não observados em germoplasma existente. Se a doença não estivesse presente no campo, a designação de pontuação de resistência não era conduzida. Porém, se uma doença ocorresse em uma localização específica do campo, todas as linhagens naquela localização eram pontuadas. Pontuações para testagem de cepas se acumularam ao longo de múltiplas

152/213 localizações e múltiplos anos, e uma pontuação média (ex., consenso) foi por final designada a cada linhagem.

Pontuações de resistência para a coleção de 475 linhagens endocruzadas foram coletadas ao longo de várias temporadas de cultivo (394 linhagens endocruzadas foram avaliadas ao mesmo tempo na temporada de cultivo) . A coleção de dados foi tipicamente desempenhada em uma pontuação após o tempo de florescimento.

Para estimar a ligação dos marcadores para tolerância, uma abordagem quantitativa, onde a pontuação de resistência para cada linhagem de milho foi estimada e incorporada na análise estatística de mapeamento de associação.

GENOTIPAGEM DE MILHO

Uma coleção de 475 linhagens de milho foi analisada através de seqüenciamento de DNA em 4000-10000 genes (loci genéticos) . A variação de SNP foi utilizada para gerar haplótipos específicos ao longo de linhagens endocruzadas em cada loci. Esse dado foi utilizado para identificar associações entre alelos e resistência MRCV a nível genômico.

MÉTODOS ESTATÍSTICOS

Uma análise de associação baseada em estrutura é conduzida utilizando-se métodos de mapeamento de associação padrão onde a estrutura da população é controlada através da utilização de dados de marcadores. Um programa de computador de análise clusterizadas baseada em modelo, Structure, desenvolvido por Pritchard et al. foi utilizado com os dados de haplótipo para 880 linhagens endocruzadas elite de milho em duzentos marcadores para estimar coeficientes mesclados e designar os endocruzados de sete sub-populações (J.K. Pritchard, M. Stephens e P. J. Donnelly (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data, Genetics 155:945153/213

959). Isso reduz a ocorrência de falso positivos que podem surgir devido ao efeito de estrutura de população na estatística de mapeamento de associação. A estatística de Kuiper para testagem de quando duas distribuições são iguais é utilizada para testar um dado marcador para associação entre haplótipo e fenótipo em uma dada sub-população (W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, Β. P. Flannery, 2002; Numerical Recipes in C, segunda edição, Cambridge University Press, NY) .

O mapeamento de associação baseado em estirpe é conduzido usando o Procedimento de GPA (Análise de Associação Geral Baseada em Estirpe), desenvolvido por Shu et al. (Guoping Shu, Beiyan Zeng, e Oscar Smith, 2003; Detection Power of Random, Case-Control, and Case-Parent Control Designs for Association Tests and Genetic Mapping of Complex Traits th Annual KSU Conference on Applied

Agriculture. 15: 191-204). O Procedimento de GPA é um programa de computador de mapeamento de associação baseado em probabilidade condicional implementado em SAS Computer Language Version 9.0 (2001, SAS Institute, Cary, Carolina do

Norte).

Proceedings of Statistics in

RESULTADOS

As Tabelas 1 e 2 provêm uma listagem de marcadores de milho que demonstraram desequilíbrio de ligação com o fenótipo MRCV usando o métodos de Mapeamento de Associação, e eles foram validados em populações de segregação. Também indicado nas Tabelas 1 e 2 estão os cromossomo nos quais os marcadores estão localizados e suas posições de mapa aproximadas relativo a outros marcadores, dado em cM, com a posição zero sendo o primeiro (mais distai do centrômero) marcador conhecido no início do cromossomo. Essas posições de mapa não são absolutas, e representam uma estimativa da posição de mapa. As

154/213

Tabelas 6 e 7 provêm as seqüências de oligo e sondas utilizadas na tipagem de marcadores SNP.

As probabilidades estatísticas de que o alelo marcador e fenótipo de tolerância à doença estão segregando independentemente são refletidas nos valores de probabilidade ajustados no mapeamento de associação nas Tabelas 1 e 2, que é a probabilidade (P) derivada da análise de associação entre genótipo e fenótipo. Quanto menor o valor de probabilidade, mais significativo é a associação entre o genótipo marcador naquele lócus e o fenótipo de tolerância à infecção por MRCV.

A análise de associação não estruturada para o grupo nomeado de SS revelou a presença de dois picos de probabilidade no cromossomo 2, na posição 65,99 representada pelos marcadores MZA2038 (p= 0,00000266) e MZA11826 (p=

0,00000179) e na posição 127,18-131,13 representado pelos marcadores MZA11806 (p= 0,000002) e MZA14212 (p= 0,00000327).

A análise não-estruturada também revelou várias outras associações ao longo do genoma. A única associação consistente que foi validade através de abordagens independentes corresponde à posição 65,99 no cromossomo 2. A análise não estruturada aumenta o poder de avaliação da variabilidade alélica total para uma região alvo, porém, ao mesmo tempo, aumenta o número de associações falso positivas devido ao fato de que a estrutura de população não é corrigida através dessa análise.

FIG. IA apresenta uma análise de associação estruturada de um grupo de linhagens endocruzadas argentinas (ou linhagens endocruzadas de um programa de argentino melhoramento) onde vários marcadores foram significativos à nível de p= 0,0005 na região da posição entre 65,99 a 85,84, incluindo MZA16656 (P=

0,000194), MZA18224 (p= 0,000066) eMZA5057 (p= 0,000045).

FIG. 1B apresenta uma análise de associação estruturada para um grupo SS onde no braço curto do cromossomo 3, os

155/213 marcadores mais associados foram MZA1525 na posição 54,62 (p=

0,00043) e MZA11826 na posição 65,99 (p= 0,00168). Duas associações adicionais foram observadas na posição 91,19 representada através do marcador MZA13812 (p= 0,000299) e posição 154,06 representada através do marcador MZA10682 (p=

0,000024).

FIG. IC apresenta uma análise de associação estruturada para o grupo SS com um diferente conjunto de dados fenotípicos. 0 marcador associado mais alto no braço curto do cromossomo 2 foi MZA12899 na posição 53,83 (p= 0,000298).

Existiam outros marcadores associados no braço longo do cromossomo 2, onde os marcadores associados mais altos foram MZA1067 (Posição de mapa: 141,9; p= 0,000094) e MZA10832 (Posição de mapa: 159,8; p= 0,000086).

EXEMPLO 2

Mapeamento de Intervalo de QTL e Análise de Regressão de Marcador Único

Um mapeamento de intervalo de QTL e uma análise de regressão de marcador único foram conduzidos com o intuito de identificar intervalos cromossômicos de milho e marcadores genéticos (respectivamente) que estão associados como resistência e permitem que a planta de milho resista à infecção por MRCV. Mapeamento de QTL e regressão de marcador são métodos amplamente utilizados com o intuito de identificar loci genéticos que co-segregam com um fenótipo desejado. Através da identificação de tais loci genéticos, a seleção assistida de marcador (MAS) pode ser utilizada para aumentar a eficiência de melhoramento para linhagens endocruzadas e híbridos de milho melhorados.

156/213

LINHAGENS DE MILHO

Duas populações de mapeamento principais para a resistência ao MRCV foram criadas a partir de cruzamentos das linhagens endocruzadas PH7WT (fenótipo resistente) e PH3DT (genótipo altamente suscetível), e PH9TJ (genótipo resistente) e PH890 (genótipo suscetível). A população PH7WTxPH3DT consistiu de 120 famílias F5/F7 e a PH9TJxPH890 consistiu de 212 famílias BC2F4/BC2F5.

PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

A pontuação fenotípica de cada uma das linhagens foi baseada nos conjuntos de dados fenotípicos coletados no campo em duas (cruzamento PH890xPH9TJ) ou três (PH7WTxPH3DT) temporadas de cultivo diferentes.

GENOTIPAGEM DE MILHO

A prole F5 de milho de PH7WTxPH3DT foi genotipada utilizando-se um total de 246 marcadores polimórficos e de boa qualidade e a prole BC2F4 de PH890xPH9TJ foi genotipada utilizando-se 167 marcadores polimórficos e de boa qualidade. A primeira rodada de genotipagem incluía marcadores SSR. Uma segunda rodada de genotipagem com um conjunto de 101 marcadores polimórficos e de boa qualidade foi desempenhada na prole F7 de PH7WTxPH3DT. Uma segunda rodada de genotipagem foi desempenhada na população PH890xPH9TJ através da utilização de um conjunto de marcadores em regiões genômicas específicas.

Windows QTL Cartographer (a versão mais atualizada desse programa de computador foi utilizada de acordo com a data do mapeamento de QTL) foi utilizado para tanto a análise de regressão de marcador quanto o mapeamento de intervalo de QTL. Pontuações LOD (logaritmos de taxa de probabilidade) foram estimadas ao longo do genoma de acordo com procedimentos

157/213 padrão de mapeamento de QTL. O termo piausibilidade de probabilidade é utilizado para descrever a probabilidade relativa de duas ou mais explicações das fontes de variação em um traço. A probabilidade dessas duas diferentes explicações (modelos) podem ser computadas, e o modelo mais plausível pode ser escolhido. Se o modelo A é 1000 vezes mais provável que o modelo B, então a razão das probabilidade é 1000:1 e o logaritmo da razão das probabilidades é 3.

Tanto os dados brutos para replicações individuais quanto para anos, e pontuações médias, foram utilizadas no mapeamento de intervalo de QTL. O limiar de LOD foi 2,5. Um intervalo de confiança foi estimado para cada QTL. As posições obtidas são então plotadas como um histograma sobrepondo a figura de mapeamento de intervalo.

RESULTADOS

Mapeamento de Intervalo de QTL

O presente estudo identificou vários intervalos cromossômicos que se correlacionam com QTLs que se associam 20 com resistência/suscetibilidade à infecção por MRCV. Os QTLs foram identificados utilizando-se dados de campo. Um QTL significativo principal foi localizado no grupo de ligação 2 em ambos os cruzamentos de mapeamento (veja FIGS. 12-14; veja também Tabela 13, que apresenta uma análise de regressão de marcador de QTL para o cruzamento PH890xPH9TJ).

158/213 η

<D

XI (ti

E-i

	(ti
	3 (ti
	4-> -H		-X	•X	X	X	*	X	-X	-X
	fi Ti		•X	-X	•X	X	*	*	«X	•X
	Ο '<D	*	•X	X	•X	•X	*	-X	*	•X
	£	-X	-X	X	•X	X	*	•X	•X	X
	___	r-
	Cl.	o
	'—'	o
	54	-
	a	o	o	o	o	o	O	o	o	o
							n	cn	00	ϊ—1
	1		ΐ—1	t—1	co	o	cn	σ>	cn	co
	£	CN	kO	CN	CN	cn	m	cn	o	cn
	»»	LO	kO	kD	CO	LO	*
	rH	Ν’	-	-	-		r-	l>	Ν’	cn
	—'	·»	cn	rH	LO	o	r4	T—1	τ—1	T—1
	IX CN		CN	CN	CO	ΟΊ	rH	L—1	L—1	ϊ—1
		CN	cn	O	o	CN	m	LO	cn	00
		Ν’	co	CO	Ν’	CN	00	CO		cn
		CN	cn	cn	kO	kO	LO	kO	kO	k£>
	ΐ—t	-	«.	«.	»
	XI	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o
				X	•X	X	*	-X	-X	*
	a		X	•X	X	•X	*	•X	•X	X
	ω		•X	•X	•X	X	*	•X	•X	-X
	tá CN		•X	-X	X	•X	*	*	•X	*
		cn
	l-M	Γ—1
		cn
	54	-
	a	o	o	o	o	o	o	o	o	o
	1		t-	f	o	cn	LO	to	o	o
	tí	kO	cn	00		o	O	o	cn	cn
	-	CN	kO	LO	l—1	00	O	o	00	LO
	l—1	O		«.		1«.	w		«.
	----	-	cn	Γ-	00	00	LO	kO	LO	N<
	a <n	r—1	τ—1	5—1	IO	LO	LO	kO	kO	kO
		o	cn	Ν’	kO	kO	P-	[·	o	o
		5—I	co	Ν’	v-f	00	CN	CN	CN	cn
		r-1	cn	Ν’	Γ—	kO	r~	l>	O	o-
	τ—|	*»	-	«.		·»		<s	«.	K
	X!	1 o	1 o	1 ο	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o
					•X	*	*	-X	*	*
	a		-X	X	•X	*	*	•X	*	•X
	ω		-X	*	•X	«X	*	-X	X	-X
	cd x-i	-X	-X	-X	X	•X	*	•X	•X	-X
		CN	ϊ—1
	P-l	cn	o
	-—'	o	o
	54
	a	o	o	ο	o	o	o	o	o	o
	1		\—1	Ν’	o	Ν'	o	o	o-	00
	α	rH	00	CN	k£>	O	cn	cn	cn	cn
	«-	cn	00	kO	T—1	LO	r-	Γ-	o	LO
	T—1	kO				«.
	-—	-	τ—1	cn	LO	O	LO	kO	Ν’	cn
	a cn	Ν’	Ϊ—i	τ—I	Ν’	LO	LO	kO	kO	kO
		LT)	Ν’	cn	O	CO	cn	cn	CN	cn
		Ν’	LO	00	Ν’	cn	rH	r-Η	O	cn
		CN	cn	cn	kO	kO	t	r-	r**	I>
	t—1	*			·»		*
	X!	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o
	O
	«ti
	O	cn	o	LO	r-~	LO	cn	Ν’	Ν'	o
	•H	LT)	kO	00	Ν’	o	cn	Ν'	Ν'	00
	CO			«.				>».
	o	Ν’	LO	co	cn	Ν’	in	LO	LO	co
	(X	cn	Ν'	Ν’	kO	kO	LO	kO	kO	kO
	£
	o
	i-i
	U	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN
	5-1		1	1 CN	1		LO	1	1	1 Ν'
	O	1	CN	LO	Γ—1	1	LO	LO	O	CN
	Ti	C—	CN	CN	co	LO	LO	O	τ—1	CN
	(0	T—1	T—1	O	cn	CN	LO	cH	LO	00 <
	U	T—1	Ν’	τ—1	00 <	LO <	H	cn	cn	r-l 1
	54	< l	< <	< 1	< 1	< l	c <	< <	< <	T—1
	(ti	IN CN	tN 1	IN O	N cn	N O	N 1	N 1	CN 1	N O
	g	S	g CO	S 1	g CN	g CO	g CO	g LO	g oo	g oo

159/213

*	X	-X	-X			X	-X
•X	*	•X	•X			X	*	-X	-X
*	•X	*	•X			*	X	«X	•X
•X	X	•X	X	-X	-X	•X	•X	*	*	-X
				00	co					co
					CN					v—1
				o	O					O
				X	X					X
ο	ο	o	o	o	o	o	o	o	o	o
vo
CN	co	VO	Γ			l>	co	CN	t—1
ο	Ln	ΟΊ	00	r-~	CN	l>	vH	LD	o	o
X	ο	CO	τ—1		Lf)	o	o	LT)	CN	[>
ο	X	X	X	VO	CN	X	X	X	X	CN
ο	LO	Ν'	00	X	X	o	co	Ν'	Ν’	X
γΗ	VO	VO	Ν'	Lf)	LT)	rH	CN	t—1	t—1	vo
ϊ-1	CO	cn	t	CO	Ν'	vo	Lf)	co	τ—1
LT)	Ν’	CN	Γ	CN	CO	co	r*	ΟΊ	cn
VO	LT)	Lf)	Ν'	CN	CN	co	co	CN	CN
X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
1 ο	1 ο	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1
*	-X	X	*			-X	-X
*	-X	•X	•X			•X	•X
*	•X	X	•X			*	•X
-X	-X	X	X		•X	*	*	*	*	X
				Ν'	CN			CN	CN	o
				vo	vd			CN	CN	Ν'
				v—1	O			O	O	O
				X	X			X	X	X
ο	ο	o	o	o	o	o	o	o	o	o
Γ~	CN	VO	l>			vo	r—
ο	co	CN	o	Lf)	CN	Lf)	Lf)	o	Lf)	Ν’
νο	VO	VO	rH	Lf)	00	τ—1	CO	00	O	vo
X	χ	«X	X	CD	Ν’	X	X	co	CO	CN
Ν'	CN	Lf)	VO	X	X	vo	r—1	X	X	X
Ν'	co	CO	CN	x—1	vo	t—1	CN	Lf)	in	Ν’
Lf)	τ—1	00	in	CD	CN	ϊ—1	cd	LD	Ν'
<Ν	CO	co		vo	CO	CN	Lf)	co	CO
VO	LT)	Lf)	Ν'	τ—1	co	Ν’	Ν'	CN	CN
X	X	x	X	X	X	X	X	X	X
1 ο	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1
X	-X	-X	X
•X	•X	*	*
•X	•X	•X	*			X	X
X	X	*	X	X		*	•X	*	-X
				LT)	co	co	ϊ—1	cd	CN
				CN	Ν’	o	o	τ—1	CN	LD
				O	CN	o	o	O	O	CN
				X	X	X	X	X	X	X
ο	o	o	o	o	o	o	o	o	o	O
ι>	LT)	cn	vo				cn
[	VO	00	00	i—1	Γ—t	vo	CN	cn	cn	CN
Γ**	τ—1	vo	VO	co	Γ	o	Ν’	Ν’	co	O)
X	X	X	X	o	co	CN	X	VO	co	CN
ο	T-1	Γ-	o	X	X	X	o	X	X	X
νο	Ν’	co	co	LT)	rH	r~	T—1	LD	LD	ϊ—1
Ν’	vo	CN	T—I	£	co	Ν'	vo	l>	τ—1
σ>	ί>	Ν'	o	vo	ID	00	CN	co	co
νο	m	LT)	LíO	CN	v—1	CN	CO	CN	CN
X	*.	X	X	X	X	X	X	X	X
1 ο	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1 o	1
					co	r~	Lf)	N1		co
ο	in	o	o	co	Γ	00	o	Ν'	o	CN
00	r~	00	cn	Ν’	X	X	X	X	X	X
*	X	x	X	X	Ν’	CN	Ν’	r-	co	LT)
00	τ—|	VO	o	vo	Ν’	LD	LD	VO	vo	O
VO	[>	c-~	00	cn	τ—1	τ—1	<—1	ϊ—1	ϊ—1	τ—1
CN	CN	CN	CN	CN	m	in	Lf)	in	m	in
1	1 vo	1	1	1	1 co	1	l	1	1	1
σ>	co	CD	cn	vo	o	co	vo	cn	co	cn
Ν’	o	CO	o	vo	Lf)	o	CN	cn	Ν'	cn
CO	00	τ—I	o	CN	Lf)	CD	l>	LD	O	00
<Ν <	t-4 XíJ	co <	T—1	Γ-	τ—1	Γ <	00	Ν’ <	co	CO
< 1	< 1	< ι			< I	< 1		< 1	< <
Ν rd	cs3 n	N LO	N 1	C0 1	N CN	Cd O	co 1	Ν Ν’	Ν 1	tN
£ c-	£	£ «Η	£ co	£ co	£ Ή	£ cn	£ cd	£ CM	£ oo	£

160/213

0,211
0,225
0,123
10-Α

161/213

Um segundo QTL foi identificado no grupo de ligação 5 na posição 150-160 (pop PH890xPH9TJ) e outro na posição 200-220 no grupo de ligação 5 (pop PH7WTxPH3DT) . Um terceiro QTL foi mapeado na PH7WTxPH3DT na posição 165-185 no cromossomo 2.

Regressão de Marcador Único

Utilizando-se regressão de marcador único, existem um número de marcadores apresentando associação com o fenótipo de resistência a um nível de confiança de P = 0,05 ou mais, como mostrados nas Tabelas 1 e 2. Alguns dos marcadores identificados na análise de regressão de marcador apresentam uma concordância de observações com o mapeamento de associação, onde as diferentes abordagens identificam o mesmo marcador. Por exemplo, existem marcadores na região entre 55 a 70 cM no cromossomo 2 identificados através de tanto a regressão de marcador quanto a associação de mapeamento.

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Esse presente estudo identificou intervalos cromossômicos e marcadores individuais que se correlacionam com a resistência ao MRCV. Marcadores que se localizam dentro desses intervalos são úteis na utilização de MAS, assim como para outros propósitos.

EXEMPLO 3

Validação de QTL através de seleção assistida por marcador

Um mapeamento de intervalo de QTL e uma análise de regressão de marcador único foram conduzidos com o intuito de identificar intervalos cromossômicos de milho e marcadores genéticos (respeetivamente) que estão associados como resistência e permitem que a planta de milho resista à infecção por MRCV. Mapeamento de QTL e regressão de marcador são métodos amplamente utilizados com o intuito de identificar

162/213 loci genéticos que co-segregam com um fenótipo desejado. Através da identificação de tais loci genéticos, a seleção assistida de marcador (MAS) pode ser utilizada para aumentar a eficiência de melhoramento para linhagens endocruzadas e híbridos de milho melhorados.

LINHAGENS DE MILHO

Uma população principal para validação e mapeamento da resistência ao MRCV foi criada a partir do cruzamento das linhagens endocruzadas PH7WT e PH3DT. Outras populações foram geradas com o intuito de validar o efeito desse QTL ao longo de backgrounds. A população PH7WTxPH3DT consistia de 82 famílias BC3F3 geradas através da introgressão de marcadores de QTL que foram mapeados no cromossomo 2 em PH3DT. Existiam 4 populações adicionais BC1F3 geradas através da seleção assistida por marcador que consistia de 24 BC1F3 provenientes do cruzamento PH6KWxPH7WT, 12 BC1F3 provenientes do cruzamento PH6B8xPH7WT, 3 BC1F3 provenientes do cruzamento PHP3PlxPH7WT e 6 BC1F3 provenientes do cruzamento PH6GFxPH7WT. Essas populações foram geradas através do auto-cruzamento de plantas BC3 e BC1 específicas e derivação de famílias BC3F3 ou BC1F3 com variação alélica na região do QTL.

PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Pontuação fenotípica de cada um dos BC1F3, BC3F3 e parentais foi baseado nos conjuntos de dados fenotípicos coletados no campo em uma temporada de cultivo.

GENOTIPAGEM DE MILHO

A prole BC1F2 de milho provenientes de diferentes cruzamentos e BC3F3 provenientes de cruzamento PH7WTxPH3DT foram genotipados através da utilização de SNPs polimórficos na região de QTL. BC3F3 foram submetidas a limpeza de

163/213 background no estágio BC3, especialmente no QTL de cromossomo 5. Marcadores incluíam marcadores SNP.

Windows QTL Cartographer (a versão mais atualizada desse programa de computador foi utilizada de acordo com a data do mapeamento de QTL) foi utilizado para tanto a análise de regressão de marcador quanto o mapeamento de intervalo de QTL. Pontuações LOD (logaritmos de taxa de probabilidade) foram estimadas ao longo do genoma de acordo com procedimentos padrão de mapeamento de QTL.

Tanto os dados brutos para replicações individuais quanto para pontuações médias foram usados no mapeamento de intervalo de QTL. O limiar de LOD foi 2,5. Um intervalo de confiança foi estimado para cada QTL. As posições obtidas foram então representadas em forma de histograma sobrepondo a figura de mapeamento de intervalo.

Como essas populações foram geradas através de seleção assistida por marcador (eventos não aleatórios de recombinação), análise de regressão de marcador foi considerada tão poderosa quanto análise de mapeamento de intervalo.

RESULTADOS

Mapeamento de Intervalo de QTL

O presente estudo identificou um único intervalo cromossômico que se correlaciona com QTLs que se associam com resistência/suscetibilidade à infecção por MRCV. Os QTLs foram identificados utilizando-se dados de campo. Um QTL significativo principal foi localizado no grupo de ligação 2 na população BC3F3 de validação principal. Os marcadores principais nesse QTL na população de validação principal quando checada nas outras proles BC1F3 confirmaram o efeito desse QTL na resistência/suscetibilidade à infecção ao MRCV.

164/213

Regressão de Marcador Único

Utilizando-se regressão de marcador único, existem um número de marcadores apresentando associação com o fenótipo de resistência a um nível de confiança de P = 0,05 ou mais, como mostrados nas Tabelas 1 e 2. Alguns dos marcadores identificados na análise de regressão de marcador apresentam uma concordância de observações com o mapeamento de associação, onde as diferentes abordagens identificam o mesmo marcador. Por exemplo, existem marcadores na região entre 55 a 70 cM no cromossomo 2 identificados através de tanto a regressão de marcador quanto a associação de mapeamento. Veja FIG. 2 para intervalo de mapeamento e Tabela 14 para análise de regressão de marcador para o cruzamento PH3DTxPH7WT. Note que a replicação #3 foi afetada por estresse por herbicida. MRCVSC = pontuação fenotípica de MRCV. Inc. Sev. Symp. = freqüência de plantas com sintomas severos em cada unidade experimental.

165/213

νρ ω

Λ ίθ

Η

Pontuação I

Média

*

*

* *

* * * *

* * •X X

•X •X X •X

-X -X X -X

X •X -X *

-X -X X •X

a

|Ϊ4

ϊ—1

ird

ρ

'—

o

O

ω

Η a

o

O

o

o

o

o

o

o

o

>

ω

1

ω

tí

00

CN

LD

LD

r-

CN

CD

*

<Tt

LD

LD

00

LD

LD

CD

LD

LD

ο

τ—1

CN

CD

X

X

X

x

χ

χ

α

-

«χ

o

Γ—1

c—1

LD

o

CD

Np

Η

CN

LD

LD

x—1

CD

CD

CD

nP

nP

nP

a

X

CD

*

X

X

-X

*

•X

Cd

cd

*

4<

X

•X

•X

•X

4c

£

CO

^J1

CN

ς.

CN

CN

o

r>1 W

X

X

a

o

O

o

o

o

o

o

o

O

>

ω

1

ω

d

t—1

LD

LD

LD

V—1

*

cn

CO

o

CN

o

CN

00

LD

cn

υ

rH

r—I

CD

LD

x

LD

X

χ

X,

β

'—

-

«x

*

O

X

o

o

ΐ—1

Η

CN

í—1

í—1

LD

c—I

cn

ϊ—1

T—1

T—1

χ—1

a

-X

X

4c

<D

*

X

-X

•X

*

4c

CN

X

X

*

•X

*

4c

&

LD

NP

CO

τ—1

ς.

—'

o

o

O

r-*1 ω

X.

X.

x

a

o

o

O

o

o

o

o

o

O

>

ω

1

ω

α

r-

cn

LD

nP

*

CN

o

LD

σ>

c—1

o

CO

CN

CTi

υ

T—1

CN

τ—1

T—1

nP

CN

X

X.

α

—

-—-

-X

<x

X

X

x

o

CN

Np

CD

Η

CN

NP

CD

CN

cn

CTi

T—1

T—1

x—1

1

a

•X

-X

-X

-X

*

4c

X

-X

-X

*

•X

4c

(D

*

•X

•X

•X

•X

*

4c

cd

ϊ—1

*

*

*

X

X

4c

•X

4c

a

l>

CN

Ρ

o

O

ω

«X

a

o

o

O

o

o

o

O

O

O

►>

ω

1

ω

d

CTi

o

CD

LD

ϊ—1

[X

υ

*·

CTi

Γ

00

r-Η

τ—1

LD

LD

CD

CN

c—1

NP

LD

σ>

x

x

x

β

—'

*

X

-

LD

CO

O

CN

Np

Np

Η

CN

CD

LD

cr

CN

CN

CD

CD

CD

CD

o

i(Ü

o

τ~4

00

O

I>

CD

CN

r-

LD

-H

cr

LD

CD

LD

O

LD

LD

NP

O

ω

CN

X

X

x

X

x

X.

X,

o

*

ld

CD

LD

CN

CD

NP

CD

NP

CC

cr»

CN

CD

NP

LD

LD

LD

LD

LD

g

o

d

O

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

d

1

1

I

1

1

1

O

CN

1

NP

CN

o

CN

LD

t—1

1

Ό

CTi

LD

CD

CN

LD

CN

CN

00

LD

ctí

LD

CN

CD

r—1

O

00

LD

CD

CN

O

CN

CN

<3

CD

nP

00

LD

< 1

r-1

<3

00

1

LO

d

<3

1

<3

1

<3

<3

<3

1

<3

<3

1

<

c-1

(tí

N

CD

N

o

N

1

N

1

N

C

N

LD

N

00

N

o

N

£

£

o

£

CD

£

NP

£

CD

£

CN

£

τ-1

£

cn

£

CO

£

166/213

	* * * k	k * k k	-k k * k	k * k k	* k -k k	-k -k k k	k k k k	k k k k	k k k k	k k k k
	ο	o	O	o	O	O	o	O	o	o
	χ—1	L0	L0	<0	<0	<0	<0	tf	o	L0
	CN	cn	X—1	x-d	X—1	x~d	x—1	x—1	00	l>
	*	*·	«X	*»	X»	x.	X»	X.	X,	X,
	'tf	o	'tf	'tf	tf	'tf	'tf	tf	LD	CN
	'tf	'tf	'tf	'tf	tf	tf	'tf	tf	cn	CN
	*
	k	k	k	-k	-k	k	k	k	k
	-k	k	*	k	k	k	k	k	k	k
										CN
										O
										X,
	o	O	o	O	o	O	o	o	O	o
	CO	00	L0	<0	L0	<0	<0	cr»
	D-	o	'tf	'tf	'tf	'tf	tf	cn	x-d	CN
	*	*·	*	-X	•X	•X	•X	•X.	-tf	O
	x—1	x—1	x—1	X—1	X—1	x~d	x—1	X—1		X,
	x—1	x-d	x-d	X—1	r-|	x—1	x—1	X—1	CT	L0
	k	*	-k	-k	k	k	k	k
	k	*	k	k	k	k	k	k	k
	k	k	k	k	k	k	k	k	k	k
										CN
										O
										X
	o	O	o	O	O	O	O	O	O	o
	x—1	l>	L0	<0	<0	<0	l>	V0	LD
	CN	x—1	<0	<0	<0	<0	L0	Γ-	<0	r-
	*	*	*.	«x	x.	x.		X.	x,	cr»
	'tf	cn	'tf	'tf	tf	'tf	'tf	'tf	x—1
	x—1	x-1	X—1	x-d	X—1	x-d	r—1	X—1	x-1	LD
	k	k	k	*	k	k	k	k	k	k
	k	k	k	k	k	k	k	k	k	k
	k	k	-k	k	-k	k	k	k	k	k
	k	k	-k	k	k	k	k	k	k	k
	O	O	O	o	O	o	o	O	o	o
	CO	cn	x-d	x—1	X—1	x-1	o	cr»	o
	CO	o	cn	cn	cn	cn	cn	x—1	tf	00
	**	-			·>»	x.	X.	X.	X.	X
	'tf	CN	'tf	'tf	'tf	'tf	'tf	'tf	cr»	cn
	co	cn	cn	cn	co	cn	cn	cn	CN	CN
	03	cr»	cr»	03	cr»	cr»	'tf	o	LD	CN
	03	cr»	cr»	03	cr»	cr»	'tf	00	c-	Γ-
	*»	*>	».	XX	x.	X.		X,	X.	X
	LD	LD	LD	LD	LD	LD	LD	co	X—1	r-
	VD	C0	L0	L0	<0	<0	<0	L0	r~	i>
	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN
		1 VO	1 o	1	1 <0	1 <0	1	1	1 LO	1 cn
	1	LD	03	00	CN	CN	LD	CN	cn	LD
	LD		'tf	cn	co	00	O	CN	o	00
	CN	<0	LD <	o	x—1 f^J	χ-d r^3	x—1	00 <	00	LD
	VO <	X“d <(3	t—L 1	CN <	x-d 1	x-d 1	03	X-d 1
1	< 1	< l	^3 x—l	< I	< co	kíj x-d	< <	^3 x-d	< 1	<3 1
cr»	tsl o	N 03	N O	Cd x-d	to o	CN O	CN 1	CN O	CN CO	CN O
CN	a co	s Ή	a cd	a i>	a cd	a cd	à CD	a co	a CN	S ϊ-l

167/213

-X	-X
*	•X	X
-X	*	X	*	-X	-X		•X
*	•X	*	•X	•X	-X	X	*
			τ—1	χ—1	t—1	χ—1	X—1	ΓΩ	Ν’	Γ
			ο	ο	Ο	Ο	ο	<0	00	00
			kk	k.	k.		k.	k.	kk	kk
ο	ο	ο	ο	ο	ο	Ο	ο	Ο	ο	ο
LÍ7	04	LÍ7
ο	ΓΩ	Γ*Η	ο	V0	ο	X—1	CTi	Ν’	Ν’	ΓΩ
kk	«k	kk	σ>	ΓΩ	Γ-	LO	Ν’	CN	Ο	Ο
Ν’	07	CN		X	kk	k.	kk	kk	kk
CN	Τ—1	ϊ—1	ι>	Γ-	ι>	<0	θ'	ο	ο	Ο
-X	-X				X	X	-X
•X	•X	X	-X	X	*	X	-X
χ—1	τ—1	χ—1	CN	χ—1	5—1	X—1		Ν’	147	Ν’
ο	ο	ο	Ο	ο	ο	ο		χ—1	Ν’	[>
«k	«k	k.	kk	ο.	kk	kk		kk	kk	kk
ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο	ο
χ—Η	L0	Ο-	ΓΩ	ΓΩ	0Λ	Ν’	σ>	<0	Γ	X—1
ΟΊ	γΗ	ΓΩ	CN	<Τι	ΟΊ	ΓΩ	LÍ7	CN	L47	χ—1
*.	k	-	·»	>»	·»	<k	•k	«k	•k	kk
ι>	00	<0	<0	<0	1>	Ο-	00	CN	ο	ο
X
04	<0	γ--	LC7	<0	ΓΩ	LÍ7	CN	σ>	X—1	χ—1
Ο	ο	χ—1	χ—1	τ—1	CN	ΓΩ	Ν’	00	ΟΊ
«»	«k	«k	«k,	·>.	».	k.	«k	•k	«k	kk
ο	ο	ο	ο	Ο	ο	Ο	ο	ο	Ο	ο
CN	C	Ν’	00	χ—1	θ'	Ο	<0	CN	χ—1	χ—1
00	<0	σ>	ο	ο	Ν’	σ>	<0	Ο	ο	Ο
«k		•k	«k	•k	•k	«k	>k	kk	kk	>k
LÍ7	ΓΩ	ϊ—I	04	04	χ—1	ο	Ο	ο	ο	ο
-X	•X
*	*	-X
X	X	-X
X	•X	•X	-X	X	X	-X	-X
			CN	CN	ΓΩ	Ν’	04	<0	00	<0
			Ο	Ο	Ο	Ο	Ο	L0	Ο	<0
			κ	ο.	».	k»	k.	kk	kk	kk
ο	ο	ο	ο	ο	Ο	ο	ο	ο	ο	ο
Ν’	00	CN
CN	Ν'	Ν'	Ν’	CN	ϊ—1	Γ	L47	ο	ο	07
-	-k	*	CN	ΓΩ	σ>	04	00	CN	ο	χ—1
ΓΩ	ΟΊ	04	«k	».	·»		k.	kk	kk	<k
CN	τ—1	τ—1	V0	LD	Ν’	Ν’	147	ο	ο	Ο
					ΟΊ	|>	Ο	00	ΓΩ	ο
Ο	Γ	00	ο	χ-1	ΟΊ	LÍ7	χ—1	07	LD	<0
σι	C0	<0	Ν'	Ο	-k	k.		k.	k
«·.	«k	•k	-k	*»	LÍ7	00	CN	00	ο	Γ-
ο	CN	LD	Ν'	<0	Ο	CN	Ν’	LÍ7	Γ	Γ
C0	00	00	07	07	χ—1	rH	χ—1	χ—1	Χ~Ι	X—1
CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	CN	04	CN
1 Ν'	1	1	1	1	1	1	1	1 ΓΩ	I LT7	1 C0
(Τι	Ν'	ι_η	Ν’	CN	X—1	07	Ν’	co	χΗ	C0
Ο	00	CN	L0	<0	00	ΓΩ	LD	00	07	Ν’
Ο	LC7	Ν'	07	0Ί	LÍ7	Ν’	147	ο	CN	Ο
χΗ	Χ“1 <2	Ν' <	[> <	τ—1	147 <	ΓΩ	Ν’ <	χ—1	χΗ XíJ	χ—1
	< ι	< 1	< 1	< ι	< ι		< 1	< 1	< ι	<
Ν 1	Ν 07	CN LÍ7	ΕΝ 07	Ν 07	CN 07	C0 1	CN 07	CN θ'	CN 07	CN
£	S Ή	£ CN	£ 07	£ 07	S ή	£ 00	£ Ν’	S γΗ	s Ή	£

168/213

Pontuação 1

Média

-X

X •X

X •X •X •X

•X •X •X *

* •X •X •X

___

o

<D

a

ío

CN

o

o

CN

O

*

fi

i—1

o

a

o

o

o

o

o

o

O

1

cn

α

o

1—1

co

o

LO

>

o

CO

LO

OT

SP

LO

o

LO

O

1—1

CO

»

-

a

1—1

O

CN

sP

o

co

g

Í-L|

CN

i—1

LD

1—1

CN

CO

CO

a

ω

X

X

04

co

X

•X

•X

_

cn

CN

Pm

O

CPi

CN

co

CO

CN

στ

CN

r-l

o

*.

Sd

O

o

a

o

o

o

o

O

o

u

1

ω

fi

sp

co

>

s.

CN

LD

CO

o

LO

co

r-

io

o

1—1

O

i—1

sp

στ

00

o

*·

*

a

.--

o

1—1

g

a

CN

o

1—1

CN

sp

00

στ

a

0)

-X

-X

04

CN

X

-X

•X

•X

sp

sp

a

k£>

r-

LT)

CN

r*

i-1

CO

O

O

O

*

«.

fi

o

o

a

o

o

o

o

o

o

O

1

w

fi

1—1

CN

>

<o

1—1

co

CO

<N

co

i—|

CN

o

i—1

CO

CO

o

o

LD

στ

*.

*.

04

O

CN

g

a

CN

o

CO

sp

co

στ

στ

-X

*

•X

•X

a

-X

*

•X

*

<1)

-X

*

•X

X

•X

a

r~1

•X

•X

•X

•X

-X

o

CO

a

στ

r-

CN

'—'

o

*

fi

o

o

a

o

o

o

o

o

o

O

1

ω

tí

00

CO

CN

co

lo

o

>

r-

ΟΊ

LO

LO

r-

o-

i—1

CN

o

i—1

CO

CO

«K

-

*·

04

s

t-l

LO

00

co

O

1—1

g

a

CN

CN

00

CN

CO

sP

LO

o

l>

LO

!<r)

CN

CO

o

i—1

00

o

[>

CO

«*

*

•H

CTi

LO

co

CO

LO

τ—1

i—1

ω

CN

«.

«»

«.

σ>

O

o

LD

co

LO

CN

co

1~1

CN

a

σ>

CN

co

SP

LO

LO

£

o

fi

CN

CN

o

CN

CN

CN

CN

CN

CN

1

fi

1

1

1

1

C9

1

o

CN

1

sP

CN

[>

CN

LO

LO

P

ΟΊ

ID

CO

<N

LO

CN

T—1

o

(tí

LO

CN

m

1—1

O

CO

CO

<

lo

I

o

CN

CN

co

sP

00

<

LO

1

<

1

<

o

fi

1

<

1

<

1

<

ι—1

Cd

lo

Cd

LO

(0

Cd

CO

Cd

O

Cd

1

N

1

N

l>

Cd

CN

g

ι—1

g

CN

g

g

r-

g

LD

g

sp

g

CO

g

CN

g

169/213

	* •X * -X	-X •X * *	-X -X •X •X	* * •X *	•X •X X X	•X •X X X	-X -X •X •X	-X •X •X X	X * •X -X	-X •X •X •X
	ο	ο	ο	ο	o	o	o	o	o	o
	νο	Γ~	CM	ΓΩ		CM	CM	CM	CM	rd
	00	LO	σ	ΓΩ	00	VO	VO	vo	VO	vo
	·»		·.		«.		«.		«.
	LD		ο	Ο	00	r—1	t—1	t—1	rd	τ—1
	γω	ΓΩ		<=ρ	ΓΩ	=P	tP
	-X	-X	-X	X	*	-X	X	-X	X	-X
	-X	•X	X	•X	X	X	X	X	•X	X
	ο	ο	ο	ο	o	o	o	o	o	o
			CM		ΓΩ	T—1	τ—1	ϊ—1	r-1	o
	νο	Ο]	00	ϊ—1	T—1	lo	m	LD	lo	LD
	CD	LO		00
	*	*	ο		o	o	o	o	o	o
	00	cn	Γ—1	cd	ΐ—1	T—1	r—1	ϊ—1	r~1	τ—1
		•X	*	*		-X	-X	-X	•X	*
	-X	X	*	X	X	•X	•X	X	X	*
	•X	X	X	-X	X	-X	-X	•X	*	-X
	ο	ο	ο	ο	o	o	o	o	o	O
	CN	cd	ΟΊ	^ρ	ΓΩ	cd	cd	CD	CD	CD
	τ—1	ο	CN	^Ρ	CN	o	o	o	o	O
	*·	*			*	«.
	Ο	CNJ	ΓΩ	(Μ	T—1	ΓΩ	ΓΩ	ΓΩ	ΓΩ	ΓΩ
	ϊ—1	—1	τ-1	v~d	rd	?-d	rd	rd	rd	rd
	*	-X	X	-X	-X	*	•X	-X	-X	•X
	*	•X	•X	X	-X	X	-X	-X	-X	•X
	*	*	•X	•X	•X	•X	•X	•X	•X	•X
	*	-X	-X	•X	•X	•X	•X	X	•X	-X
	ο	ο	Ο	ο	O	o	o	o	o	O
	LO	Μ*	00	CM	cd	LD	lo	LD	LO	ΓΩ
	—1	VO	00	Ο		O	O	o	o	O
	-«	«»	*.	««
	00	00	ΓΩ	ο	σ	CM	CM	CM	CM	CM
	ΙΟ	ΙΟ	VO	VO	lo	vo	vo	VO	vo	vo
	CM	ι>	ιο	cd	cd	cd	CD	cd	CD
	VO		ο	cd	cd	cd	cd	cd	CD	^p
	*.	«»	*	«.	«.
	Μ1	ΓΩ	31	LO	LO	LO	LD	LO	lo	lo
	m	VO	νο	νο	VO	vo	vo	vo	vo	vo
	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM
	1	1			1 VO	1 o	1	1 vo	1 vo
	lo	τ—1	1	1	lo	σ	00	CM	CM	LO
	CM	00	LO	lo	VO	xP	ΓΩ	00	CO	O
	ιο	οο <	CM	CM	vo	io <	o	vi ^3	rd f^3	rd
	r-j <	00 I	kO <	co <	rd <3	v-l 1	CM <	i-l 1	1-1 I	σ
1	< ι	v~d	< 1	< I	< 1	Xí3 τ—1	< i	< co	Xl3 rd	< <
lo	Ν 00	Ν Ο	Μ <η	co o	n σ	N O	IS] T—1	N O	N O	N 1
Γ“1	S ΟΊ	2 οο	S CM	S co	S ή	2 oo	S I>	2 CO	2 oo	2 oo

170/213

* * * -X

-X X -X X

* •X -X *

-X -X -X *

-X •X -X X

-X •X •X

* * •X

X •X *

X * *

X X

•X

x—1

X—1

O

o

ο

ο

ο

ο

ο

ο

o

o

o

o

o

ο

Γ~·

ο

ο

00

CN

στ

LO

στ

ιη

X—

00

CN

m

LO

00

CN

LO

ΓΩ

00

·«.

..

«.

x-t

r-~

χ—1

Ο

χ—

x—1

ΙΟ

m

ΓΩ

ΓΩ

tf

-

ςρ

ΓΩ

ΓΩ

CN

χ~4

χ—

χ—1

T—1

r-~

LO

-X

X

-X

-X

X

*

X

-X

X

•X

•X

•X

*

*

•X

χ—1

χ—1

χ—

CN

χ—

x—

X—

o

CD

ο

ο

Ο

Ο

ο

O

O

X—

O

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

O

o

O

o

ΓΩ

'tf

00

'Ρ

X—

00

00

lo

ΓΩ

co

CN

00

*

ιη

-tf

ΓΩ

ΓΩ

CN

ο

LO

tf

00

CD

ο

«κ

-

K

o.

χ—1

γ-

lo

στ

00

ιη

Γ

r-

LO

CN

CN

-X

X

-X

-X

-χ

X

X

-X

X

-X

•X

χ—1

ΓΩ

ΓΩ

CN

ΓΩ

Γ

ΓΩ

ΓΩ

ο

Ο

CN

χ—1

X—1

X—1

CN

CN

ο

ο

ο

ο

Ο

Ο

ο

o

o

O

O

ο

ΓΩ

χ—1

00

LD

CN

Ο

'tf

'tf

ΓΩ

l>

l>

*.

·»

[-

LO

στ

tf

<tf

ΓΩ

στ

'tf

'tf

ΓΩ

χ—1

K

<s

χ—1

χ-1

00

Γ-

'tf

X—1

CN

CN

x—1

X—1

X—1

*

*

-X

•X

-X

•X

*

•X

-χ

*

-X

*

•X

*

*

•χ

•X

•X

X

X

•X

-X

X

*

•X

•X

•X

•X

«X

•X

«X

x—1

στ

CD

O

O

O

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

ο

o

o

o

o

ι>

m

CN

|>

στ

CN

'tf

CN

ο

cn

ΓΩ

00

00

στ

στ

O

CN

ΓΩ

o

*

*

x~1

CD

o

χ-1

r-

ΓΩ

Γ-

ΓΩ

CD

CN

χ—1

LO

tf

ΓΩ

ΓΩ

χ—1

χ—1

x—1

00

CN

CN

ΟΊ

O

O

ο

ιη

CN

Ο

Ο

00

ο

xH

στ

in

x—1

CO

Γ-

«στ

00

lo

'tf

O

·.

*.

ο.

«W

LT>

00

CN

C0

X—1

Γ-

ο

CN

ιη

'tf

LO

o

CN

'tf

lo

Γ

Γ

00

00

00

CTT

στ

χ-1

χ-1

x—1

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

CN

1 co

1 ΓΩ

1 ’χΡ

1 'tf

1

1

1

1

1

1

CN

ΓΩ

ιη

στ

<tf

m

'tf

CN

x—1

CD

>tf

CN

<

ο

00

Ο

00

CN

LO

LO

00

ΓΩ

CO

CO

00

m

1

ο

ιη

'tf

στ

cd

m

'tf

in

χ-1

1

χ—1

<

χ-Η

χ—1

χ—4

1

'tf

< 1

r-

χ—f

m

1

ΓΩ

'tf

χΉ

<

<

<

1

1

ο

Ν

ΓΩ

Ν

ο

Ν

1

Ν

στ

Csl

in

N

ΓΩ

N

ΓΩ

N

ΓΩ

N

1

£

00

£

CN

£

χ-Η

£

LO

£

χ—1

£

CN

£

ΓΩ

£

ΓΩ

£

x—1

£

00

£

171/213

	co	LO	r-1	co	l>
	xH		cn	LO	cn
		·»			«.
	O	o	o	o	o
	cn	r-	x—1	x—1	o
	co	lo	o	cn	co
		*.		*.	«.
	x—1	o	o	o	o
	o	cn	LD	o	o
	vo	vo	00	o	co
	·»	K	o.		«.
	o	o	o	x—1	o
	co	vo		o	o
	CN	x-H	o	o	o
		-	*»	«.	K
	o	O	o	o	o
	vo	x—1	LD	[·	cn
	cn	LD	cn	LO	vo
		«.	«.
	o	o	o	o	o
	vo	cn	x—1	CN	cn
	co		O	cn	CN
	*»	·».	·.		·»,
	o	o	o	o	o
	vo	CV]	LO	cn	CN
	cn		vo
			·*	«o
	o	o	o	o	o
	o	l>	Γ—1	CV]	vo
	o	vo	CN	vo	vo
	*.	·»	«.		«t
	o	o	o	o	o
	00	cn	o	l>	LO
	cn	LD	vo	CN	cn
	«.	«.	«.
	00	o	t	x—1	x—1
	LD	[>		cn	O
	Γ—)	x—1	χ—1	x—1	CN
	CN	CN	CN	CN	CN
	1 cn	1 LO	1 00	1
	00	x-1	co	CN	1
	co	cn	Sjt	IO	IO
	o	CN	o	X—I	O <
<	X—f	X-1	Γ-1	CO I=tl	LO 1
1	< 1	rtj 1	< l	< 1	< O
cn	N Γ	N cn	LSI r—1	N CO	N LO
	2 <-í	2 ή	£ CN	£ Ή	£ CN

172/213 efeito da variação alélica de MRCVl em vários backgrounds foi avaliada através de dados fenotípicos da prole BClF3s com variação alélica na região MRCVl. 0 alelo de resistência MRCVl apresentou um efeito positivo ao longo de outros 4 backgrounds genéticos (linhagens endocruzadas PH6GF, PHP3P1, PH6B8 e PH6KW). A Tabela 15 abaixo apresenta a pontuação de média fenotípica para a prole BC1F3 com variação alélica na região MRCVl.

Tabela 15

Posição de marcador 65,99	Linhagens endocruzadas
	PH6GF	PHP3P1	PH6B8	PH6KW
Pontuação do endocruzado	3,8	2,5	3	3
BC1F3 alelo suscetível (AA)	5,00	4,10	4,50	4,19
BC1F3 alelo heterozigoto (AB)	-	3,53	5,17	4,26
BC1F3 alelo resistente (BB)	6,11	6,17	5,47	5,00
Efeito de QTL	1,11	2,07	0,97	0,81

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Esse presente estudo identificou intervalos cromossômicos 15 e marcadores individuais que se correlacionam com a resistência ao MRCV. Marcadores que se localizam dentro desses intervalos são úteis na utilização de MAS, assim como para outros propósitos.

173/213

EXEMPLO 4

Validação de QTL em populações de cruzamento DH

Uma análise de regressão de marcador de QTL foi realizada para identificar os intervalos de cromossomos de milho e marcadores genéticos (respectivamente) que são associados com resistência e concede resistência à infecção por MRCV. Mapeamento de QTL e regressão de marcador são métodos amplamente utilizados para identificar loci genéticos que cosegregam com um fenótipo desejado. Pela identificação de tais loci genéticos, seleção assistida por marcador (MAS) pode ser utilizada para melhorar a eficiência de melhoramento de milho endocruzado e híbridos.

LINHAGENS DE MILHO

Seleção de estirpes melhoradas por marcador (MEPS) se refere ao esquema de cruzamento de populações para resistência ao MRCV que foram criadas a partir de cruzamentos de endocruzados. Os cruzamentos incluíram: a) Cruzamentos com MRCVl fixado: PHKEFxPHBNA, PHKEFxPHS2G, PHKFDxPHS3J,

PHKFAxPHBNA, PHKFAxPHKEF, PHS2YxPHKEF, e b) Cruzamentos com MRCVl segregando: PH3DTxPHKEF, PHKEFxPH9PR, PHKEFxPH9PR,

PHKEFxPHKDK, PHKDNxPHKFD, PHKDNxPHS3J, PHKFDxPHCOG,

PHKDKxPHKFA, PHKDNXPH9 PH.

Tabela 16

População	# Ind	MRCVl
PHKEF/PHBNA	9	Fixado
PHKEF/PHS2G	13	Fixado
PHKFD/PHS3J	12	Fixado
PHKFA/PHBNA	12	Fixado
PHKFA/PHKEF	34	Fixado
PHS2Y/PHKEF	12	Fixado

174/213

PH3DT/PHKEF	11	Segregando
PHKEF/PH9PR	12	Segregando
PHKEF/PHKDK	18	Segregando
PHKDN/PHKFD	30	Segregando
PHKDN/PHS3J	11	Segregando
PHKFD/PHCOG	9	Segregando
PHKDK/PHKFA	15	Segregando
PHKDN/PH9PH	8	Segregando

Estas populações foram produzidas através de processo de duplicação de haplóides. O número de indivíduos caracterizados para resistência ao MRCV foram incluídos na Tabela 16. Dados de impressão genética para a região principal de QTL e identidade através da informação de descendência foram utilizados para definir populações fixadas para QTL segregantes para QTL.

PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Pontuação fenotípica de cada uma das populações DH MEPS foi baseada em conjuntos de dados fenotípicos coletados do campo em uma estação de cultivo.

GENOTIPAGEM DO MILHO

Progênie de milho DH de cruzamentos diferentes foram genotipadas utilizando um conjunto de 756 SNPs distribuídos no genoma de milho. As posições obtidas são então demarcadas como um histograma sobrepondo a figura de mapeamento de intervalo.

RESULTADOS

Análise de marcadores de QTL

O presente estudo identificou um único intervalo cromossômico principal que correlaciona com QTL associado a

175/213 resistência/susceptibilidade à infecção por MRCV (quando populações de cruzamentos SS Resistente X Suscetível e segregantes para QTL principal para MRCV no cromossomo 2 foi selecionado a priori. O QTL foi identificado utilizando os dados de campo. Um QTL principal significante foi localizado no grupo de ligação 2. Cruzamentos genéticos entre endocruzantes contendo o alelo positivo do QTL principal no cromossomo 2 (QTL fixado pelos parentais) exibiram a maioria da prole com uma pontuação de campo para MRCV de 4 ou mais alta.

Regressão de Marcador Único

Utilizando regressão de marcador único, existe um número de marcadores apresentando associação com o fenótipo resistente a um nível de confiança de P = 0,05 ou melhor, como demonstrado nas Tabelas 1 e 2. Alguns desses marcadores identificados na análise de regressão de marcadores apresentam uma concordância de observações com o mapeamento da associação, onde abordagens diferentes identificam os mesmos marcadores. Por exemplo, existem mercadores na região de 55 a 70 cM no cromossomo 2 identificados por ambas regressão de marcadores e mapeamento de associação. Um grupo de endocruzantes SS, forte associação foi localizada no marcador MZA10538 (posição 54,5). Em um grupo de endocruzantes NSS, uma associação principal foi localizada na posição de 72 cM.

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Este presente estudo identificou intervalos cromossômicos e marcadores individuais que correlacionam com resistência a MRCV. Marcadores que se encontram dentro destes intervalos são úteis para utilização em MAS, assim como para outros propósitos

176/213

EXEMPLO 5

Caracterização de endocruzantes principais

Um conjunto de materiais genéticos chave argentinos foram caracterizados fenotipicamente e geneticamente para confirmar loci marcadores genéticos de milho associados com resistência a MRCV. Através da identificação de tais marcadores genéticos, seleção assistida por marcador (MAS) pode ser utilizada para aumentar a eficiência de cruzamentos para resistência aumentada do milho ao MRCV.

LINHAGENS DE MILHO E PONTUAÇÃO DE RESISTÊNCIA

As variedades vegetais utilizadas na análise eram de fontes diversas, incluindo germoplasma elite, cultivares liberadas comercialmente e outras linhagens públicas representando um amplo espectro de germoplasmas relacionados com o programa de melhoramento argentino e incluindo fontes importantes de resistência ao MRCV.

Os grupos de linhagens de milho foi reunido para a análise baseado nas suas respostas fenotípicas contra a infecção por MRCV, onde as plantas foram classificadas em altamente suscetíveis quanto altamente classificações de resistência variedades tanto resistentes. As e

susceptibilidade foram baseadas somente em observações de incidências casuais da doença, de ocorridas naturalmente em testes de campo no decurso de vários anos. O grau de resistência da planta à infecção por MRCV variou bastante, como medido utilizando uma escala de um (altamente suscetível) a nove (altamente tolerante). Normalmente, uma pontuação de dois (2) indicou as cepas mais suscetíveis, uma pontuação de quatro (4) foi designada como limiar para considerar uma planta suscetível ou resistente (menos que 4, suscetível; 4 ou maior é resistente) e uma pontuação de sete (5-7) foi atribuída às linhagens mais resistentes. Pontuações de

177/213 resistência de oito (8) e nove (9) foram reservadas para níveis de resistência que são muito raros e geralmente não observados em germoplasmas existentes. Se nenhuma doença estava presente em um campo, nenhuma pontuação de resistência foi feita. Entretanto, se uma doença ocorresse em um local do campo específico, todas as linhagens naquele local foram pontuadas. Pontuações para cepas teste acumuladas ao longo de múltiplos locais e múltiplos anos, e uma pontuação mediana (ex., consenso) foi enfim atribuída para cada linhagem.

Coleta de dados era feita tipicamente em um tempo de pontuação. Tempo de pontuação foi estabelecido após o tempo de floração.

Para avaliar a associação de marcadores à resistência, uma comparação através de abordagem de regressão simples foi utilizada. Origem do alelos foi checada através da identidade por aproximação de descendentes. Utilizando esta abordagem, aquelas linhagens de milho que foram consideradas como representativas de classes tanto resistentes como suscetíveis foram utilizadas para estimar associação. Uma lista de linhagens resistentes foi elaborada, onde endocruzantes possuindo uma pontuação de resistência de 4 ou mais foram consideradas Resistentes. Similarmente, linhagens de milho com pontuações de 3 ou menos foram coletivamente consideradas suscetíveis. Somente linhagens que pudessem ser seguramente colocadas nos dois grupos foram utilizadas. Uma vez que a linhagem fosse incluída no grupo Resistente ou suscetível, esta era tratada como igual naquele grupo. Os índices quantitativos reais foram também utilizados para o teste de associação. Em adição a este teste, a identidade pela informação de descendentes foi utilizada para confirmar a origem do alelo de resistência nos marcadores mais associados.

No estudo, 85 linhagens de milho que foram consideradas resistentes no espectro fenotípico foram identificadas; estas

178/213 plantas constituíram o grupo RESISTENTE. Também, 35 linhagens de milho que foram julgadas como sendo suscetíveis ao MRCV foram identificadas; estas cepas constituíram o grupo SUSCETÍVEL.

GENOTIPAGEM DE MILHO

Cada uma das linhagens tolerantes e suscetíveis foi genotipada com um conjunto de 63 marcadores SNP que estendem sobre a região do QTL no Cromossomo 2 utilizando técnicas bem conhecidas na arte. O protocolo de genotipagem consistiu em coletar tecido de folha jovem e isolar DNA genômico de tecidos agregados de cada endocruzante. O DNA genômico de milho foi extraído pelo método CTAB como descrito em Maroof et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81:8014-8018.

O DNA genômico isolado foi então utilizado em reações de PCR utilizando oligos de amplificação específicos para um grande número de marcadores que cobrem a região do QTL. Marcadores do tipo SNP foram genotipados utilizando um protocolo ASH.

A lógica implícita é que marcadores com distribuições alélicas significativamente diferentes entre os grupos resistentes e suscetíveis (ex., distribuições não aleatórias) poderiam estar associados com o traço e podem ser utilizados para separá-los para fins de seleção assistida por marcador de linhagens de milho com resistência ou susceptibilidade ao MRCV previamente caracterizadas ou não. A presente análise examinou um lócus marcador por vez e determinou se a distribuição do alelo dentre do grupo resistente é significantemente diferente da distribuição do alelo dentro do grupo suscetível. Esta análise compara a pontuação fenotípica das plantas com os genótipos nos loci alvo.

179/213

RESULTADOS

Tabelas 1 e 2 listam marcadores de milho que demonstraram fenótipos de estimada marcador desequilíbrio de ligação com os resistência/suscetibilidade ao MRCV. Também indicada nestas tabelas está a localização dos marcadores e suas posições de mapa aproximadas relativas a outros marcadores conhecidos, dadas em cM, com a posição zero sendo o primeiro (mais distai) marcador conhecido no início do cromossomo. Estas posições de mapa não são absolutas, e representam uma posição de mapa As probabilidades estatísticas de que o alelo e o fenótipo de tolerância estejam segregando independentemente estão refletidas nos valores ajustados de probabi1idade.

Tabelas 6 e 7 fornecem as seqüências de oligos de PCR que foram utilizadas para genotipar estes loci marcadores.

A distribuição não aleatória de alelos entre grupos de plantas resistentes e suscetíveis nos vários loci marcadores nas Tabelas 1 e 2 é uma boa evidência de que um QTL influenciando a resistência ao MRCV esteja ligado a esses loci marcadores. Considerando que a maioria dos endocruzantes deste conjunto correspondem a um programa específico de melhoramento (programa de melhoramento argentino), é suposto que Requerentes encontraram desequilíbrio de ligação com outros marcadores em regiões que flanqueiam o gene. Os marcadores mais associados corresponderam a marcadores escolhidos previamente considerados.

Como bem conhecido na arte, o nível de associação de marcadores alvo a traços de interesse será determinado pelo nível de desequilíbrio de ligação na região alvo naquele conjunto específico de materiais genéticos. Tabela 17 abaixo mostra o nível de associação ao longo da região alvo entre os dados genotípicos dos marcadores de SNPs e a resposta ao MRCV.

180/213

Tabela 17

Cr	Pos	Marcador	bO	bl	F(l,n- 2)	pr(F )	Traço MRCV
2	64,0 5	MZA625-29-A	1,61 2	0,322	95,712	0	* ★ * ★
2	64,0 5	MZA625-30-A	1,60 2	0,326	92,373	0	* * * *
2	65,9 9	MZA16656-8-A	1,61 3	0,255	44,107	0	★ ★ ★ *
2	65,9 9	MZA16656-19- A	1,57 1	0,344	105,78 1	0	k -fe ★ k
2	65,9 9	MZA15490- 137-A	1,72 4	0,189	23,834	0	****
2	65,9 9	MZA15490- 138-A	1,73 1	0,179	20,667	0	* * * *
2	65,9 9	MZA15490- 801-A	1,72 7	0,172	19,222	0	* * * *
2	65,9 9	MZA2038-71-A	1,70 2	0,045	1,095	0,29 8
2	65,9 9	MZA2038-76-A	1,69 1	0,063	1,987	0,16 1
2	65,9 9	MZA11826- 801-A	1,67 3	0,098	4,614	0.03 4	*
2	65,9 9	MZA11826-27- A	1,68 1	0,092	4,315	0,04	★
2	65,9 9	MZA11826- 803-A	1,67 3	0,113	6,286	0,01 4	*
2	65,4 4	MZA9105-8-A	1,57 6	0,226	22,461	0	★ ★ ★ ★
2	65,4 4	MZA9105-6-A	1,68 1	0,081	3,452	0,06 6

181/213

Para avaliar o efeito da variação alélica neste QTL ao nível de híbridos, um conjunto de 371 híbridos (fundos genéticos heterogêneos) foi caracterizado de acordo com a presença de um (heterozigoto para o QTL) ou dois alelos de resistência (homozigoto para o QTL) das plantas parentais. Um efeito positivo e aditivo do alelo de resistência no QTL principal nas combinações de híbridos foi observado; nenhum efeito maternal foi observado. Tabela 18 abaixo mostra o desempenho de campo dos híbridos com genótipos diferentes no

QTL principal.

Tabela 18

Genótipo híbrido no QTL principal	Números de híbridos	MRCVSC	Categoria
AA, homozigoto alelo suscetível	65	3,8	Suscetível
BA, heterozigoto, alelo resistente feminino	121	4,41	Resistente
AB, heterozigoto, alelo resistente masculino	96	4,46	Resistente
BB, homozigoto alelo resistente	89	4,76	Resistente

DISCUSSÃO

Existe um número de maneiras de utilizar a informação fornecida nesta análise para o desenvolvimentos de variedades melhoradas de milho. Uma aplicação é utilizar os marcadores associados (ou mais baseado em um valor de corte de maior probabilidade) como candidato para mapear QTL em populações específicas que estejam segregando para plantas possuindo tolerância à infecção por MRCV. Nesta aplicação, alguém prossegue com mapeamento convencional de QTL em uma população segregante, mas focando em marcadores que estejam associados com a tolerância à infecção por MRCV, ao invés de utilizar

182/213 marcadores que abrangem o genoma inteiro. Isto torna esforços de mapeamento mais custo-efetivo através da redução dramática de recursos do laboratório comprometidos com o projeto. Por exemplo, ao invés de varrer populações segregantes com um grande conjunto de marcadores que abrangem todo o genoma, alguém poderia varrer com apenas aqueles poucos marcadores que satisfaçam alguns cortes estatísticos no estudo de associação de alelo. Isto não irá apenas reduzir o custo do mapeamento mas também irá eliminar falsos indícios que certamente irão ocorrer com um grande conjunto de marcadores. Em qualquer dado cruzamento, é provável que apenas um pequeno subgrupo dos marcadores associados irão estar realmente correlacionados com tolerância à infecção por MRCV. Uma vez os poucos marcadores relevantes sejam identificados em um parental tolerante, esforços de seleção assistida por marcadores (MAS) poderão focar em apenas aqueles marcadores que são importantes para aquela fonte de tolerância. Através da pré-seleção de linhagens que possuem o alelo associado com tolerância via

MAS, alguém pode eliminar as linhagens suscetíveis indesejáveis e concentrar os custosos recursos de teste em campo em linhagens que possuem uma alta probabilidade de serem resistentes à infecção por MRCV.

EXEMPLO 6

Avaliação de QTL em populações cruzadas F3

Associações a marcadores são métodos amplamente utilizados para identificar loci genéticos que co-segregam com um fenótipo desejado. Através da identificação de tais loci genéticos, seleção assistida de marcador (MAS) pode ser utilizada para melhorar a eficiência de cruzamento para melhorar endocruzantes e híbridos de milho.

183/213

LINHAGENS DE MILHO

Antigos esquemas de melhoramento eram baseados no método tradicional baseado em estirpe para produzir cruzamentos Fl e originar várias auto gerações (F2, F3, F4, etc.) . Com o objetivo de verificar a importância dos alelos positivos e negativos em QTL principais para resistência a MRCV em um conjunto específico de materiais de melhoramento argentinos, estas etapas foram seguidas: a) Seleção de parentais resistentes cuja resistência é supostamente baseada no MRCVl principal; b)Seleção de um total de 2372 famílias F3 originárias de múltiplos cruzamentos de melhoramento; c) Criação de dois grupos de famílias F3, um primeiro grupo, baseado em cruzamentos entre parentais sem os alelos positivos do QTL principal e um segundo grupo com ambos parentais carregando o alelo positivo no QTL principal. Dados de impressão genética para a região principal de QTL e identidade através de informação de descendência foram utilizados para definir populações fixadas para QTL segregantes para QTL (positivo/negativo). MZA16656 e/ou marcadores flanqueadores foram marcadores chave para definir a presença do alelo positivo MRCVl.

número total de indivíduos localizados nestes grupos foi de 2372. Dados de impressão genética da região do QTL principal e identidade através da informação de descendência foram utilizados para definir populações fixadas para QTL segregantes para QTL.

PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Pontuação fenotípica de cada uma das populações F3 foi baseada em conjuntos de dados fenotípicos coletados do campo em uma estação de cultivo.

184/213

GENOTIPAGEM DE MILHO

Famílias F3 individuais não foram genotipadas. Genótipo do QTL principal de cada indivíduo F3 foi estimado de acordo com os alelos específicos de ambos os parentais. Se ambos parentais em uma população F3 específica carregam o alelo positivo em MRCVl, toda a prole daquele cruzamento foi considerada como contendo o alelo positivo. Se ambos parentais em uma população F3 específica carregam o alelo negativo de MRCVl, toda a prole daquele cruzamento foi considerada como contendo o alelo negativo. Programa de computador padrão foi utilizado para análise ANOVA dos marcadores.

RESULTADOS

Análise de marcador QTL

O presente estudo corrobora com a conclusão que um intervalo cromossômico principal correlaciona com QTL associado com resistência/suscetibilidade à infecção por MRCV quando populações de cruzamentos fixadas para o QTL principal para MRCV no cromossomo 2 foram selecionadas a priori.

ANOVA de Marcador Único

Utilizando ANOVA de marcadores, existe um número de marcadores mostrando associação com o fenótipo de tolerância com um nível de confiança de P = 0,05 ou melhor, como mostrado nas Tabelas 1 e 2. Alguns dos marcadores identificados na análise ANOVA de marcadores mostram uma concordância de observações com o mapeamento por associação, onde abordagens diferentes identificam os mesmos marcadores. Por exemplo, existem marcadores na região de 55 a 7 0 cM no cromossomo 2 identificados por tanto regressão de marcador como mapeamento por associação.

185/213

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Este presente estudo identificou intervalos cromossômicos e marcadores individuais que correlacionam com resistência a MRCV. Marcadores que se encontram dentro destes intervalos são úteis para utilização em MAS, assim como para outros propósitos. Neste exemplo, Requerentes avaliaram o efeito da variação alélica em MRCVl na resistência ao MRCV, e existia uma clara associação entre esta variação alélica e o fenótipo esperado em um alto número de descendentes F3.

Tabela 19 abaixo mostra o teste F do modelo onde a Fonte é

I QTL e dois níveis da fonte foram considerados: Nível AA: populações F3 com alelos suscetíveis fixados na região alvo (posição 65,99 ou inferido por marcadores flanqueadores) e Nível BB: populações F3 com alelos resistentes fixados na região alvo (posição 65,99 ou inferido por marcadores flanqueadores).

Tabela 19

ANOVA mono caudal: pontuação MRCVSC contra QTL
Fonte	DF	SS	MS	F	P
QTL	1	1656,41	1656,41	1383,90	0,000
Erro	2370	2836,69	1,20
Total	2371	4493,10

S = 1,094; R-Sq = 36,87%; R-Sq(adj) = 36,84%

References:

DF. Grau de liberdade. SS. Soma de Quadrados. MS. Média quadrática. F. valor F. P. valor de Probabilidade.

Tabela 20 abaixo mostra um teste de média onde nível AA e 25 nível BB representam a variação alélica no QTL alvo e de acordo com o modelo incluído na Tabela 19. Média fenotípica para o nível AA foi de 3,42 (categoria suscetível ao MRCV) e

186/213 média fenotípica para o nível BB foi de 5,13 8 (categoria resistente ao MRCV).

Tabela 20

Nível

AA

BB

1462

910

Média

3,420

5,138

DevPad

1,048

1,164

Intervalo de Confiança Individual de 95% Para Médias Baseadas em DevPad Agrupada

---+---------+---------+------ +-----(*-) (-*)

---+---------+---------+------ +-----3.50 4.00 4.50

5.00

DevPad agrupada = 1,094 Referências:

N: Número de famílias. Média: Média fenotípica de cada nível. StDev: Desvio padrão.

^10 EXAMPLE 7

Mapeamento gênico em alta escala e linhagens quase-isogênicas

Mapeamento gênico em alta escala através de teste da progênie para plantas recombinantes homozigotas para posicionamento em alta resolução de genes de resistência para

MRCV foi realizado. Mapeamento do intervalos do QTL e análise de regressão de marcador único foram desempenhadas para identificar intervalos cromossômicos de milho e marcadores genéticos (respectivamente) que são associados com resistência e resistência aumentada à infecção por MRCV. Mapeamento de QTL e regressão de marcador são métodos amplamente utilizados para identificar loci genéticos que co-segregam com um fenótipo

187/213 desejado. Através da identificação de tais loci genéticos, seleção assistida por marcador (MAS) pode ser utilizada para aumentar a eficiência de cruzamentos para melhoramento de endrocruzantes e híbridos de milho.

LINHAGENS DE MILHO

Uma população principal para mapeamento gênico em alta escala para resistência ao MRCV foi criada a partir do cruzamento entre endocruzantes PH7WT e PH3DT.

população foi criada para o mapeamento fino a cruzamento dos endocruzantes PH9TJ e PH890. A

Uma outra partir do população

PH7WTxPH3DT consiste de 256 famílias BC5F3 produzidas pelo auto-cruzamento fixação de plantas recombinantes BC5 selecionadas de um total de 3000 plantas BC5 carregando um fragmento heterozigoto na região de 50 a 80 cM no cromossomo 2. Esta estratégia permitiu a cobertura com recombinantes de toda a região do QTL (Tabelas 7 e 8, e Fig. 4A e Fig. 4B) . A população PH9TJxPH890 consiste de 245 famílias BC3F3 produzidas através de: a) Cruzamento de plantas homozigotas para o QTL principal nos cromossomos 2 e

PH890 (parental suscetível); b) Produção de duas gerações auto-cruzantes para proceder para famílias BC3F3 fixadas.

Tabela 21 mostra o número de recombinantes BC5F3 produzidos a partir do cruzamento PH3DTxPH7WT. Um tamanho esperado em KB para cada intervalo de marcador também está incluído. Tabela 22 mostra o número de recombinantes BC5F3

BC2F4 com produzidos a partir do cruzamento PH3DTxPH7WT. Uma comparação com a primeira estimativa do conteúdo gênico está incluída.

m tl lo

U cq cn

LD

CM 'tf •=tf

188/213

O

P (ti ε

•H

4J

W o

P β

(ΰ ε

ns

Η

Φ

4-) β

(ti β

-H o

u

Φ

Pd (ti

4->

o

Eh

MD

O co in β

d)

Φ β

o

H

O-i (ti p

o u

-H

4-) 'Φ β

Φ

Cn β

a β

£ ω

φ

-β β

β β

-Η

Ο υ

φ

Pd

Ο «—I (ϋ > β Φ 4-> β (ti

Ρ (ti υ

φ

Ρ φ

Ρ ω

ο

Ρ (ti

Ρ (0

-Η υ

β <φ

		X
φ	ο	*
Ρ	(β
	ω	β
05	ω	υ
β	φ	Η
Ρ	β	4-)
β	a	'Φ
β	ε	β
m	Η	Φ
		Ο

(ti a

<ΰ £

(ti

Ρ

Ο υ

-Η

4J 'Φ β

Φ

Ο β

Φ

Φ β

Ο •Η a

LD

Ο 'tf

MD

CM β

1-1 φ

Ρ β

Εβ ο

Ρ (ti υ

β β

£

LD

CM

MD

CM £

0) &

β o

•H (ti £

P o

CM

P w

o

CM β

O •H fÜ a

Λ o

LO

Φ &

β o

•H (Ü £

P

LO

MD

CM

Lf)

ΓΩ

Γ*Ί co σ\ cn in

MD

MD LD MD MD ,—I < CM £

LD

MD

LC5

LO t—(

CM £

OD

OD m

MD

Lf)

MD σ>

LD

VO

LD

MD

CD

CO

MD o

(β a

(ti β

•H o

υ •H 'β y-ι

O

4-) β

Φ ε

(ti •H υ

s

Φ

O OD 'tf LO ΐ—I

CM £

CO

O

CM

CM £

vo CN 00 τ—I τ—I < ES3 a

I

I o LO ,—I cn < CM £

I

1—I o co I 'tf CM CM 00 T—1

CM £

ε ο

u ο

Ρ β

ο υ

β φ

Ρ ο

Ρ

-Η

Ρ φ

a β

ο ρ

β υ

β (ti £

* (ti

-Η

U β

<Φ β

Φ

Μ-4

Φ β

Ο ε

ο υ

φ

4->

β φ

ε ο

ο

Ρ β

γΗ

U β

-Η 'β

4-) φ

ω φ

β ο

Ρ (ti

Ü β

(0 ε

φ ρ

ω

Φ β

(ti a

ω ο

φ β

4-4 β

Φ (ti υ

Η

4-) 'Φ β

Φ a

ο ίβ ω

ω φ

β •Η φ

Ρ ω

(ΰ

Ρ β

(ti

Ρ φ

Ρ

Ο β

Φ

CM

CM

Φ

Ρ β

Εη

φ
Ρ	ο
	!β
ο	a
•Η	β
β	4-)
'β	ο β
Ü5

φ ρ

φ β

φ ο

ο ρ

β β

ο

-Η υ

β β

a ο

Η

0) β

υ

Ό

Ρ

	05
	β
	ο
ο	υ	φ
Ο	Ή	Ρ
a	ι—1	β
	a
ο	Α	β
ο	ι5]	-Η
ο	05	£
	>
HD	OS	Mapa
a	a

Q

Κ (β

189/213

59
Fator de Transcrição	Proteína ligante a putrescina; Proteína hipotética	L-ascorbato peroxidase putativa	Proteína de desenvolvimento plastidial; DAG	Proteína hipotética; Subunidade da ATP sintase vacuolar?	Proteína hipotética	Proteína hipotética
4-> β β a LD 1 CM O ΟΊ x—1 CD x—1	AC191302_3	LD ID CO o o kO o o a	pco530474	CD O CO CPi in o o a	AC1913O2_6	Inferido por arroz e sorgo
Loc_029	Loc_028	Loc_027	Loc_025	Loc_024	1 Loc_023	CM CM o 1 o o
MZA625 1
64.05
CM

190/213

	CM	ϊ—1
Proteína hipotética	Fator regulador de crescimento	Receptor acoplado à proteína GG 89C (Homo sapiens)	Proteína intrínseca principal; NIP; Similar a BREVIS RADIX 1	Proteína hipotética	Oxidase alternativa A0X3	Oxidase alternativa A0X2	Proteína hipotética	Myh-1i ke;
CD 5—1 í> T—1 vo 0 υ a	pco591841	Genomi c_PCO 6 22 60 0_PCO 6 66161	pco638426	Γ CM LD sf τ—1 LD o o a	LD n σ> 00 00 LD O O a	pco642154	Inferido por arroz e sorgo	CM st st st st LC c c c
Loc_021	Loc_016	Loc_015	st ϊ—1 o 1 o o A	Loc_013	Loc_012		Loc_010	cr α c c c
			vo LD VO vo VO N S		MZA15451	MZA15490
			65.99		65.30	65.99
			CM		CM

191/213

	O
Regulador de resposta de 2 componentes	Interator de clatrina; Epsina; Proteína hipotética	CDC20 Proteína com repetições WD	Proteína da síntese da Cobalamina		Proteína hipotética	Scramblase	Proteína hipotética	Proteína hipotética	Proteína quinase
	IO in r—1 Ό o ü a	1—1 LO O Ό O O a	ϊ—1 cn o τ—1 LO Ό O o a		pco571541	60^S35ood	pco553755	pco644099	cn Γí—1 co 00 in O O a
	Loc_008	Loc_007	1 900-3°T 1		LO O o 1 o o	o o 1 o o	Loc_003	Loc_002	TOO soq
	MZA2038			MZA11826					MZA9105
	65.99 1								65.44
	CN								CN

192/213

	13	CN	23
receptora
	AC208537(CAP)	AC197085(CAP)	MZA18224

193/213

Linhagens quase-isogênicas (NIL) BC5F3 carregando variação alélica na região dos marcadores escolhidos (MZA16656, MZA15451, MZA15490, MZA2038, MZA11826 e MZA9105) foram produzidas através de seleção assistida por marcador a partir do cruzamento PH7WTxPH3DT. As NILs foram produzidas através da introgressão da região do QTL de PH7WT em PH3DT, limpando o fundo genético, e selecionando recombinantes específicos para a região dos marcadores escolhidos. Através do auto-cruzamento de plantas BC5F2 individuais carregando um fragmento heterozigoto para a região dos marcadores escolhidos, foram originadas linhagens quase-isogênicas negativas e positivas, e o QTL foi tratado como um único fator Mendeliano.

PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Pontuação fenotípica para cada uma das famílias BC5F3 do cruzamento PH7WTxPH3DT e as 245 famílias BC3F3 do cruzamento PH9TJxPH890 e parentais foi baseada em conjuntos de dados fenotípicos coletados do campo (experimentos de campo sob infecção natural, Província de Córdoba, Argentina) em uma estação de cultivo.

Em adição à pontuação fenotípica, as isolinhagens específicas para a região dos marcadores específicos foram caracterizados por teste de ELISA para vírus na Província de Buenos Aires, Argentina.

GENOTIPAGEM DE MILHO

Progênie de milho BC5F3 do cruzamento PH7WTxPH3DT e BC3F3 do cruzamento PH9TJxPH890 foram genotipadas através da utilização de SNPs polimórficos para a região de QTL no cromossomo 2 (veja Exemplo 2). Adicionalmente, dois marcadores CAPS foram desenhados e utilizados para genotipar as progênies

194/213

BC5F3; estes dois marcadores CAPS foram posicionados no intervalo MZA9105 a MZA18224. No caso do cruzamento PH9TJxPH890, marcadores adicionais foram posicionados no QTL do cromossomo 5. As BC5F3s do cruzamento PH7WTxPH3DT foram sujeitas a limpeza do fundo genético no estágio BC3, especialmente para o QTL do cromossomo 5. As BC3F3s do cruzamento PH9TJxPH890 foram sujeitas a limpeza do fundo genético no estágio BC2.

Cartógrafo de QTL do Windows (versão atualizado de acordo 10 com a data do mapeamento de QTL) foi utilizada para ambas análise regressão de marcador e mapeamento de intervalos de QTL. Pontuações de LOD (logaritmo da razão de chances) foram estimadas ao longo das regiões alvo de acordo com os procedimentos padrão de mapeamento e QTL.

Pontuações médias foram utilizadas no mapeamento de intervalos de QTL. O ponto de corte de LOD foi de 2,5. Um intervalo de confiança foi estimado para cada QTL. As posições obtidas são então representadas como histogramas cobrindo a figura de mapeamento de intervalo.

Como estas populações foram produzidas através de seleção assistida por marcador (e não eventos aleatórios de recombinação) , análise de regressão de marcador foi considerada tão poderosa quanto análise de mapeamento de intervalo.

RESULTADOS

Mapeamento de Intervalos de QTL presente estudo identificou um único intervalo cromossômico que correlaciona com QTLs associados com resistência/suscetibilidade à infecção por MRCV. Os QTL foram identificados utilizando dados de campo. Um QTL principal significante foi localizado no grupo de ligação 2 na posição de marcadores preferidos nas populações de mapeamento de

195/213 alta resolução dos cruzamentos PH7WTxPH3DT e PH9TJxPH890. O QTL adicional no cromossomo 5 do cruzamento PH9TJxPH890 não era significante neste análise.

Regressão de Marcador Único

Utilizando regressão de marcador único, existe um número de marcadores apresentando associação com o fenótipo resistente a um nível de confiança de P = 0,05 ou melhor, como mostrado nas Tabelas 23 e 24. Os marcadores identificados na análise de regressão de marcador mostra uma posição gênica de alta resolução para o QTL alvo, coincidente com a posição dos marcadores preferidos. Veja Tabela 23 para análise de regressão de marcador (MRCVSC = pontuação fenotípica de MRCV) e FIG. 5 para mapeamento de intervalo para o cruzamento PH7WTxPH3DT. Veja Tabela 24 para uma análise de regressão de marcador de QTL para o cruzamento PH9TJxPH890 em QTL específico nos cromossomos 2 e 5 (MRCVSC = pontuação fenotípica de MRCV) e FIG. 6 para mapeamento de intervalo para o cruzamento PH7WTxPH3DT.

Tabela 23

Marcador	Posição	bO	bl	F(l,n- 2)	pr (F)	MRCVSC
MZA1525-98-A	54,62	3,423	0,330	9,144	0,003	★ *
MZA8381-801-A	63,47	3,337	0,429	15,852	0	★ ★ ★
MZA625-29-A	64,05	3,362	0,422	16,218	0	★ ★ ★
MZA16656-19-A	65,99	3,300	0,589	38,934	0	★ ★ ★ ★
MZA15490-137- A	65,99	3,331	0,597	42,193	0	★ ★ ★ ★

196/213

MZA2038-71-A	65,99	3,377	0,628	51,838	0	★ ★ Ά· ★
MZA11826-801- A	65,99	3,377	0,628	51,838	0	★ ★ ★
MZA9105-8-A	65,44	3,377	0,628	51,838	0	★ ★ -k ★
AC208537_003		3,448	0,257	5,276	0,025	*
AC197O85_OO3		3,472	0,135	1,331	0,253
MZA18224-801- A	68,80	3,403	0,095	0,595	0,443

Tabela 24

Marcador	Cr	Pos	bO	bl	21n(L0/L 1)	F(l,n- 2)	pr (F )	MRCVSC
MZA9997-42-A	2	54,56	3,891	0,460	37,209	39,855	0	* * * *
MZA2201-44-A	2	56,95	3,828	0,334	24,549	25,610	0	* * * *
^[ZA8381-29-A	2	63,47	3,939	0,465	33,536	35,647	0	★ ★ -k ★
MZA625-30-A	2	64,05	3,907	0,485	38,029	40,803	0	* * * *
MZA9105-6-A	2	66,00	3,887	0,547	51,358	56,671	0	* * * *
MZA2349-71-A	2	68,80	3,907	0,534	49,417	54,307	0	★ ★ ★ *
MZA18224-801-A	2	68,80	3,902	0,531	48,959	53,751	0	★ ★ ★ ★
MZA18036-23-A	2	71,75	3,906	0,505	43,106	46,746	0	•k ★ ★ *

197/213

MZA10543-14-A	2	81,45	3,934	0,054	0,332	0,320	0,57 2
MZA18843-61-A	5	141,0 8	3,897	0,004	0,003	0,003	0,95 8
MZA5521-17-A	5	141,6 2	3,895	0,009	0,014	0,014	0,90 6
MZA12753-14-A	5	143,9 5	3,886	0,044	0,333	0,331	0,56 6
MZA7908-20-A	5	152,8 7	3,903	0,046	0,311	0,309	0,57 9
^ÍZA8726-9-A	5	154,0 5	3,901	0,050	0,385	0,382	0,53 7
MZA11109-19-A	5	169,7 7	3,895	0,036	0,156	0,155	0,69 4

Linhagens quase-isogênicas

As linhagens quase-isogênicas carregando variação alélica para a região de marcadores preferidos apresentaram uma diferença significante em sua resposta à doença na Província de Córdoba. (FIG. 7 A e Fig. B) . Tabela 2 5 mostra o genótipo de SNPs nas regiões dos marcadores preferidos para as linhagens quase-isogênicas (isolinhagens negativas=haplótipo suscetível; isolinhagem positiva=haplótipo resistente); o fragmento introgredido é representado pela polimorfia de SNP nos marcadores de MZAl6656-19-A a MZA9105-8-A enquanto marcadores monomórficos flanqueadores MZA625-30-A e MZA18224801-A representam o haplótipo suscetível em ambas linhagens quase-isogênicas. O teste ELISA para vírus (amostras da Província de Buenos Aires) apresentaram 0% das plantas positivas para vírus nas linhagens carregando o alelo resistente, enquanto 38% das plantas eram positivas para o vírus nas isolinhagens carregando o alelo de suscetibilidade.

198/213

LD

CX fO 1—I (D b (tí F

MZA1822 4-801-A	68.8
MZA910 5-8-A	65.44	O
MZA118 26- 803-A	65.99	Fi	o
MZA1182 6-801-A	65.99	O
MZA2038- 76-A	65.99	U	F
MZA2038 -71-A	65.99	F
MZA1549 0-137-A	65.99		o
MZA154 90- 801-A	65.99	O	o
MZA1665 6-19-A	65.99		o
MZA62 5-30- A	64.05	u	u
Isolinhag em		Negativa	Positiva

199/213

Nota: teste de ELISA não foi realizado em materiais plantados na Província de Córdoba (a pressão da doença era maior que na

Província de Buenos	Aires).	Entretanto,	a	presença	de
protuberâncias (um	sintoma	específico	de	Fi j ivírus)	em
5 ambos materiais resistentes e	suscetíveis	na	Província	de

Córdoba indica a presença do vírus nas plantas.

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Este presente estudo identificou intervalos cromossômicos e marcadores individuais que correlacionam com resistência a | MRCV. Marcadores que se encontram entre estes intervalos são úteis para utilização em MAS, assim como outros propósitos. 0 posicionamento gênico de alta resolução facilita a clonagem do

QTL alvo.

EXEMPLO 8

Posicionamento gênico, seqüenciamento e genes candidatos

Seqüenciamento, informação genética e física para a região dos marcadores preferenciais foi integrado para caracterizar a região alvo. Informação proveniente de abordagens diferentes (dados de recombinação, análise de associação e fragmentos conservativos) foi utilizada para identificar um intervalo específico para a geração de dados de seqüenciamento adicionais.

LINHAGENS DE MILHO E PONTUAÇÃO FENOTÍPICA

Linhagens de milho foram fenotipicamente pontuadas baseado nos seus graus de resistência à infecção pelo MRCV (em contraste à simples categorização de tolerante ou suscetível). As variedades de plantas utilizadas na análise foram provenientes de fontes diversas, incluindo germoplasma elite, cultivares comercialmente liberadas e outras variedades públicas. As coleções contém 883 linhagens de milho. As

200/213 linhagens utilizadas no estudo apresentam um grande espectro de maturidade variando de CRM (maturidade relativa comparativa) 90 a CRM 140, representando as principais linhagens endocruzadas do germoplasma Pioneer.

O grau de resistência vegetal à infecção por MRCV variou enormemente, de acordo com a medição usando uma escala de um (altamente suscetível) a nove (altamente resistente).

Geralmente, uma pontuação de dois (2) indicou as cepas mais suscetíveis, uma pontuação de quatro (4) foi designada no limiar entre uma planta ser considerada suscetível ou resistente (menos que 4, suscetível; 4 ou maior é resistente) e uma pontuação de sete (5-7) foi designada às linhagens mais resistentes. Pontuações de resistência de oito (8) e nove (9) foram reservados para níveis de resistência que são muito raros e geralmente não observados em germoplasma existente. Se a doença não estivesse presente no campo, a designação de pontuação de resistência não era conduzida. Porém, se uma doença ocorresse em uma localização específica do campo, todas as linhagens naquela localização eram pontuadas. Pontuações para testagem de cepas se acumularam ao longo de múltiplas localizações e múltiplos anos, e uma pontuação média (ex., consenso) foi por final designada a cada linhagem.

Pontuações de resistência para a coleção de 883 linhagens endocruzadas foram coletadas ao longo de várias temporadas de cultivo (394 linhagens endocruzadas foram avaliadas ao mesmo tempo na temporada de cultivo) . A coleção de dados foi tipicamente desempenhada em uma pontuação após o tempo de florescimento.

GENOTIPAGEM DE MILHO

Uma coleção de 883 linhagens de milho foi analisada através de seqüenciamento de DNA em 4000-10000 genes (loci genéticos) . A variação de SNP foi utilizada para gerar

201/213 haplótipos específicos ao longo de linhagens endocruzadas em cada loci. Esse dado foi utilizado para identificar associações entre alelos e resistência MRCV a nível genômico.

ESTIRPE DE MILHO- FONTES DE RESISTÊNCIA

Um banco de dados da estirpe Pioneer foi utilizado para entender a relação entre linhagens endocruzadas e haplótipos.

relação de desde 1919. informação estirpe entre No caso de pública sobre

Esse banco de dados contém a linhagens endocruzadas Pioneer linhagens endocruzadas públicas, estirpe e origens foram incorporadas com o intuito de entender a relação de linhagens endocruzadas e haplótipo. Uma lista de fundadores imprescindíveis representando fontes de resistência e suscetibilidade ao MRCV no germoplasma Pioneer (incluindo linhagens públicas) foi criada através da utilização de dados de estirpe, fenótipo e genótipo. A maioria das linhagens endocruzadas suscetíveis descendem de um conjunto específico de haplótipos provenientes de germoplasma americano (Linhagens públicas tais como B37, B73, B14, OH07, C103 e linhagens endocruzadas Pioneer 165 e 938); uma exceção é PH26N proveniente de germoplasma tropical.

POSICIONAMENTO GENICO

O intervalo entre os marcadores MZA15490 e MZA2038 (FIG. 8) foi considerado como uma região candidata para o estudo da diversidade alélica na região gênica de resistência. Essa região foi selecionada através da utilização de informação provenientes de:

a) Recombinantes. O posicionamento através de recombinantes foi mostrado no Exemplo 7. Os dados fenotípicos para dois recombinantes no intervalo de MZA16656 a MZA15490 e um recombinante no intervalo de MZA15490 a MZA2038 foi usado para delimitar o lado esquerdo da posição gênica. A partir da

202/213 população de recombinação, não existem recombinantes disponíveis na região MZA2038-MZA11826-MZA9105.

b) Informação genotípica e fenotípica ao longo de linhagens endocruzadas do germoplasma Pioneer foi utilizada com o intuito de detectar um fragmento conservativo ao longo de linhagens endocruzadas resistentes/suscetíveis. A detecção de um fragmento conservativo foi desempenhada dentro de estirpes específicas e ao longo de múltiplos fundadores independentes quando um número suficiente de SNPs conservativos estava disponível ao longo de fundadores independentes.

DIVERSIDADE ALELICA NATURAL E RELAÇAO DE FUNDADOR

O intervalo de MZA15490 a MZA2038 foi selecionado para análise de diversidade alélica devido à alta probabilidade de carregar um gene candidato ou um alto desequilíbrio de ligação com um gene candidato. Com a disponibilização da seqüência completa no intervalo de MZA15490 a MZA2038 para a linhagem B73 (B73 = 274) , um grupo de 13 pequenos fragmentos de seqüência foi selecionados para seqüenciamento em um conjunto de linhagens de testagem. As linhagens de testagem (Tabela 26) incluem: a) algumas das linhagens endocruzadas e haplótipos imprescindíveis resistentes e suscetíveis; b) os parentais provenientes de populações de PH9TJxPH890; c) provenientes do conjunto população de recombinação resistentes e suscetíveis mapeamento PH7WTxPH3DT e imprescindíveis endocruzadas e recombinantes de linhagens (PHG63 e um recombinante no intervalo de MZA15490 a MZA2038).

A Tabela 26 apresenta uma lista de linhagens de testagem incluindo fontes resistência e suscetibilidade ao MRCV no Germoplasma Pioneer e recombinante no intervalo MZA15490MZA2038.

203/213

Tabela 26

Linhagem Endocruzada	Fenótipo	Haplótipo esperado	n
PH9TJ	Resistente	PH9TJ	1
PHJ40	Resistente	PHJ40	5
PHGD3	-	PHGD3	2
383	Resistente	-	1
PHG63	Resistente	630	14
630	Resistente	630	14
PH7WT	Resistente	630	14
PHR33	Resistente	PHR33	1
501	-	501	-
PH467	Resistente	PH467	1
PHDG9	Resistente	PHDG9	1
PHK09	Resistente	PHK09	1
274	Suscetível	274	47
1047	Suscetível	1047	23
PH2 6N	Suscetível	PH2 6N	1
PH3DT	Suscetível	274	47
PH890	Suscetível	1047	23
165	Suscetível	165	33
661	Suscetível	PHANO	93
PHR03	Suscetível	PHANO	93
PHK56	Suscetível	PHANO	93
PHN47	Suscetível	PHN47	1
PHNV8	Suscetível	PHNV8	1
apl9506156	Suscetível	Recombinante	1
apl9506157	Suscetível	Recombinante	1
apl9506160	Suscetível	Recombinante	1
157	Suscetível	625	7
625	Suscetível	625	7
PHKP5	-	PHKP5	1

204/213

Fig. 9 apresenta a posição dos fragmentos selecionados no intervalo de MZA15490 a MZA2038 e a posição de genes candidatos. Resultados de seqüenciamento foram obtidos para seqüências chamadas: MRQV_00005-l; MRQV_1318-1; MRQV_02352-l; MRQV_03828-l; MRQV_06374-l; MRQV_08351-l; MRQV_09551-l-l;

MRQV_10673-l e	MRQV_11074-l.	. As
de linhagens	endocruzadas	de
MRQV_08351-l e	MRQV_10673-l	são

seqüências ao longo do grupo testagem para os segmentos providas aqui, incluindo SNPs

polimórficos para caracterizar haplótipos (veja Fig. 16). A posição de seqüência no intervalo de MZA15490 a MZA2038 foi incluída na Fig. 9.

Dados de seqüência foram utilizados com o intuito de identificar um suposto homólogo através de segmentos descendentes entre fontes independentes de resistência ou suscetibilidade. A região de MRQV_00005-l a MRQV_08351-l foi comum à maioria das fontes independente de suscetibilidade. Os dados para um recombinante imprescindível (a partir da população de mapeamento de alta resolução; suscetível à doença) mostraram que o ponto recombinante para esse material genético está localizado dentro de um suposto fator transcricional Myb (PCO644442) e que a variação de seqüência gerando a resistência poderia estar localizado a partir da posição desse gene em direção a MZA2038. Houve também uma relação de IBD (identidade por descendência) esperada entre fontes independentes de resistência na região do ou perto do PCO644442 uma vez que:

a) PHR33 e PH467.

b) PHR33, PH9TJ, PHJ40 e PHDG9.

c) PHK09 apresentou um haplótipo específico.

d) 630 apresentou um haplótipo específico.

Houve um grupo dos SNPs alvo em MRQV_083 51-l muito específico para a maioria das fontes resistentes. Porém, dados

205/213 recombinantes indicam que a seqüência alvo deve estar localizada a partir de MRQV_08351-l (localizado em PCO644442) em direção ao MZA2038.

Considerando-se a especificidade dos SNPs alvo em MRQV_08351-l, esse fragmento específico foi seqüenciado em um total de 625 linhagens endocruzadas provenientes de germoplasma Pioneer. Uma descrição genética foi desenvolvida em relação à resistência ao MRCV de parte do germoplasma Pioneer através da utilização da informação combinada proveniente de: a) marcadores flanqueadores desse intervalo (MZA15490 e MZA2038), b) o dado de seqüência para as 625 linhagens endocruzadas e as linhagens de testagem, c) a relação de estirpe entre linhagens endocruzadas, e d) os dados fenotípicos dessas linhagens endocruzadas.

' de	haplótipos	em MRQV_08351-l	ou
’ de	haplótipo	para MRQV_10673-l	e
para	aumentar	a caracterização	e
informação de	descendência para	as

MZA2038 foi utilizado identificar através de principais fontes de resistência no germoplasma Pioneer e para considerar supostas variantes da região alvo. A Tabela 27 apresenta uma descrição de haplótipos específicos e a resposta observada e esperada à doença ao longo dos materiais por haplótipo. As fontes representativas são incluídas como referência.

206/213

Dados de segregação		Não	ε •H cn			Não	ε -H CO	ε •H CO
Fonte	PHFV5, 274, PHANO, 165, OH7, outros	PHJ40	PH7WT, 173, 630, PHB04, PH14J, PHAA4, PHG64	C103, 157, outros	216, outros	PHR33, PH467, 501 LACAUNEOP	PHP51, PHDG9, 546, LACAUNEOP	PHK09, PH884, PHBD6, PHFCF
β	247	LD	22	19	13	CO	10	CM
MRCVSC	3,02	4,60	4,59	3,21	3,31	5,00	5,90	5,00
Fenótipo esperado	Suscetível	Resistente	Resistente	Suscetível	Suscetível	Resistente	Resistente	Resistente
Ligação MZA2038	4,5,9,11	LO	12	1,14		4,11	10,15	CO
MRQV_10673	1,2,8,9	CO		co			CO	r-
MRQV_8381	Γ—1	rH	CM	ro		LD	r~-	σ

207/213

Utilizando a informação para MRQV_08351-l ou combinado com seqüências flanqueadoras (MRQV_10673-l e MZA2038), os Requerentes inferiram o seguinte:

a) Fonte de resistência 1. As fontes PHR33 e PH467 podem ter um mesmo ancestral comum em MRQV_08351-l. Regiões comuns com materiais europeus derivados de variedade polinizada aberta LACAUNE suporta uma origem em comum provável proveniente de uma única região de haplótipo.

b) Fonte de resistência 2. As fontes PHR33, PH9TJ, PHJ40 e PHDG9 podem apresentar um ancestral em comum na região flanqueadora de MRQV_08351-l. Em adição, PHP51 pode ser inferido como parte desse grupo. Regiões em comum com materiais europeus derivados de variedade polinizada aberta LACAUNE suporta uma origem em comum provável proveniente de uma única região de haplótipo.

c) Fonte de resistência 3. PHK09 apresentou um haplótipo em comum com PHBD6 em MRQV_08351-1, e eles possuem uma origem em comum derivados de germoplasma Tuxpen.

d) Fonte de resistência 4. 630 apresentou um haplótipo específico, e não há uma relação IBD confirmada com outras fontes.

A partir de resultados da população de mapeamento, os Requerentes demonstraram um QTL na região dos marcadores preferenciais nessas fontes independentes:

630.

-	PH9TJ.	Alélico	a	630 .
-	PHP51.	Alélico	a	630.
-	PHBD6.	Alélico	a	630.

A integração de análise de recombinação, seqüência, e estirpe e a inferência de uma relação de IBD esperada entre fontes independentes permitiram aos Requerentes considerar que quatro principais haplótipos na região de dois dos marcadores preferenciais (MZA15490 e MZA2038) podem ser usados com o

208/213 intuito de caracterizar a maioria das fontes de resistência no germoplasma Pioneer. Esses quatro haplótipos principais podem ser agrupados de acordo com essas fontes de germoplasma:

(a) Fonte de resistência 1 e 2. Germoplasma Flint SWAN apresentando região homóloga em comum com materiais da população polinizada aberta LACAUNE européia pederneira.

(b) Fonte de resistência 3. Materiais de origem TUXPEN.

(c) Fonte de resistência 4. Fonte específica, 630 é a linhagem endocruzada representativa. O desenvolvimento dessa linhagem inclui uma base genética ampla incluindo germoplasma TUXPEN e MEXICAN JUNE.

PCO644442 (Fig. 8, um suposto fator transcricional Myb) parece ser o gene candidato mais provável para a resistência à doença ao MRCV. Seqüências fortemente ligadas ao PCO644442 devem também ser consideradas como alvos para a clonagem gênica, incluindo o suposto EPSIN1 e seqüências flanqueadoras do intervalo de MZA11826 a MZA9105.

Um único recombinante de MZA15490 a MZA2038 proveniente do cruzamento PH3DT e PH7WT foi caracterizado e o ponto de recombinação foi localizado dentro do PCO644442. A região desde o íntron 3 do PCO644442 à seqüência promotora do PCO644442 é considerada alvo imprescindíveis para a validação de efeitos nas variações nas respostas de resistência/suscetibilidade ao longo dos genótipos. Fig. 10 apresenta a caracterização do recombinante desde MZA15490 até MZA2038; um PCO644442 quimérico foi originado a partir de genótipos PH3DT e PH7WT. As seqüências na região promotora de PCO644442 do PH3DT (SEQ ID NO:212) e PH7WT (SEQ ID NO:211) estão incluídas aqui, apresentando sítios polimórficos (veja Fig. 15 para alinhamento de seqüência).

209/213

EXEMPLO 9

MRDV - Caracterização de híbridos principais - Europa

Um conjunto de materiais genéticos europeu imprescindíveis foi caracterizado fenotipicamente e geneticamente com o intuito de confirmar loci de marcadores genéticos de milho associados com a resistência ao MRDV. Através da identificação de tais marcadores genéticos, seleção assistida por marcador (MAS) pode ser utilizada para melhorar a eficiência de melhoramento para resistência aumentada de milho ao MRDV.

HÍBRIDOS DE MILHO E PONTUAÇÃO DE RESISTÊNCIA

As variedades de planta utilizadas na análise foram de diversas fontes, incluindo germoplasma elite, cultivares liberadas comercialmente e híbridos pré-comerciais representando uma ampla variedade de germoplasmas relacionados com um programa de melhoramento europeu.

Os grupos	de híbridos	de	milho
experimento de	campo na	Espanha.
resistência e	suscetibilidade	foram
observações de	incidência	de	doença
casual, natural	nos testes	de	campo. ι

As classificações de de plantas à infecção ao MRDV variaram enormemente, como medido utilizando-se uma escala de incidência dos sintomas de

MRDV.

Coleta de dados foi tipicamente desempenhada em uma vez de pontuação. O tempo para a realização da pontuação era após o tempo de florescimento.

Para estimar a associação dos marcadores à resistência, uma comparação através da utilização de informação IBD de linhagens parentais foi utilizada. Origem alélica foi checada através de abordagem de identidade por descendência. Utilizando-se essa abordagem, aquelas linhagens de milho que

210/213 foram consideradas a ser representativas de qualquer uma das classes genotípicas foram utilizadas para estimar a associação e predizer o desempenho à nível híbrido.

GENOTIPAGEM DE MILHO

Cada linhagem parental desses híbridos foi genotipada e cálculos de IBD foram estimados para cada linhagem.

A lógica implícita é que marcadores com distribuições alélicas significativamente diferentes entre os grupos resistentes e suscetíveis (ex., distribuições não aleatórias) poderíam estar associados com o traço e podem ser utilizados para separá-los para fins de seleção assistida por marcador de linhagens de milho com resistência ou susceptibilidade ao MRCV previamente caracterizadas ou não. A presente análise examinou a informação de IBD na posição genética da região de marcadores preferenciais e determinou se a distribuição alélica dentro do grupo de resistência é significativamente diferente da distribuição alélica dentro do grupo suscetível. Essa análise compara as pontuações fenotípicas das plantas com os genótipos nos loci alvo; os genótipos foram preditos através de IBD.

211/213

RESULTADOS

Com o intuito de avaliar o efeito da variação alélica nesses QTL à nível híbrido, um conjunto de 212 híbridos (Backgrounds genéticos heterólogos) foi caracterizado de acordo com a presença de um (heterozigoto para o QTL) ou dois (homozigoto para o QTL) alelos resistentes provenientes das linhagens parentais. Um efeito positivo e aditivo do alelo resistente no QTL principal foi observado nas combinações de híbridos. A Tabela 28 apresenta o desempenho no campo de híbridos com diferentes genótipos no QTL principal. O desempenho no campo foi caracterizado de acordo com MRDV_score, protocolo similar à pontuação MRCV.

Tabela 28

Genótipo híbrido no QTL principal	N2 híbridos	Média de MRDV_score	Dev Pad
AA, alelo homozigoto suscetível	163	4,25	0,92
BA, heterozigoto, alelo resistente feminino	37	5,45	1,01
BB, alelo homozigoto resistente	3	6,00	0,88

Fig. 11 apresenta o desempenho de híbridos de milho sob infecção por MRDV. O desempenho no campo está expresso como MRDV_score.

DISCUSSÃO/CONCLUSÕES

Esse exemplo identificou intervalos cromossômicos que se correlacionam com a resistência ao MRDV. Marcadores que se localizam dentro desses intervalos são úteis para MAS, assim como para outros propósitos. A predição de resistência aumentada ao MRDV através da utilização de marcadores

212/213 preferenciais para resistência ao MRDV indica que esses marcadores podem ser utilizados no desempenho de MAS para diferentes Fijivírus. Um efeito positivo dos marcadores preferenciais para resistência a outros Fijivírus, tal como o rice black-streaked dwarf fijivírus, é então esperado.

EXEMPLO 10

Ensaio Fenotípico de Resistência ao MRCV

O que: Uma pontuação de 1-9 do Vírus Mal de Rio Cuarto com 1 significando sem resistência (desenvolvimento afetado, encurtamento dos entrenós, sem espiga), e 9 significando que o material genético é resistente à doença (sem sintomas).

Quando: Desde o florescimento até a colheita

Checar pontuações de linhagens suscetivas conhecidas para ver se suas notas atuais estão de acordo com as pontuações históricas.

Como:

1. Compare notas que você daria hoje a poucas linhagens suscetivas conhecidas com suas pontuações históricas para ver se elas são compatíveis.

2. Se as notas forem muito altas, então não existe pressão de doença suficiente para pontuar essa locação. Porém, anote qualquer mostragem que apresente mais doença que os controles suscetíveis.

3. Pontue baseado em canteiros. Plantas dentro de um canteiro pode variar em sintomas devido ao tempo de infecção ou algumas plantas podem escapar da doença (infecção natural depende da população de vetores).

213/213

4. Considere severidade de sintomas e freqüência de plantas com sintomas. Pontuações de 1-3 estão na categoria suscetível; 4-6 estão na categoria resistente; 7-9 estão na categoria altamente resistente.

Descrição das pontuações de campo:

a) Pontuações 1-3. Categoria suscetível. Sintomas incluem nanismo severo, severo encurtamento dos entrenós, sem espigas ou desenvolvimento muito pobre de espigas, morte prematura da planta.

b) Pontuações 4-6. Categoria resistente. Plantas com sintomas como profusões e leve encurtamento dos entrenós. Baixa freqüência de plantas com sintomas severos.

c) Pontuações 7-9. Categoria altamente resistente. Planta saudável. Presença de profusões ou sem sintomas.

1/3

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de identificação de uma planta de milho ou germoplasma que apresenta resistência recém-conferida ou resistência aumentada a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método

   5 compreende:

   a) isolar os ácidos nucléicos de uma planta de milho ou germoplasma;

   b) analisar os ácidos nucleicos isolados quanto à presença de um alelo QTL associado à resistência recém-conferida ou

   10 resistência aumentada a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, onde a presença do referido alelo QTL é determinada pela detecção na planta de milho ou germoplasma de um haplótipo dentro de um intervalo cromossômico flanqueado por e incluindo MZA8381 e MZA18180, em que o

   15 referido haplótipo compreende G em MZA16656-19-A, G em

   MZA15490-801-A, C em MZA15490-137-A, A em MZA2038-71-A,

   T em MZA2038-76-A, um A em MZA11826-801-A, C em

   MZA11826-803-A, e A em MZA9105-8-A; e

   c) selecionar a referida planta de milho ou germoplasma se

   20 o referido alelo QTL for detectado.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do haplótipo estar dentro de um intervalo cromossômico flanqueado por e incluindo MZA4305 e MZA2803.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método adicionalmente compreende a introgressão do haplótipo presente na referida planta de

   Petição 870170065684, de 04/09/2017, pág. 14/20

   2/3 milho ou germoplasma em uma segunda planta de milho ou germoplasma para produzir uma planta de milho introgredida ou germoplasma introgredido.

   5 4. Método de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de a planta de milho introgredida ou o germoplasma introgredido compreender a SEQ ID NO:49. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO

   10 pelo fato do membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus ser o Mal de Río Cuarto Virus (MRCV).

   6. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus ser o Maize

   15 Rough Dwarf Virus (MRDV).

   7. Método de produção de uma planta de milho apresentando resistência recém-conferida ou resistência aumentada a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, CARACTERIZADO pelo fato

   20 do método compreender a introdução de um ácido nucléico exógeno em uma planta de milho alvo ou prole desta, onde o ácido nucléico exógeno é derivado de uma seqüência nucleotídica que é ligada a pelo menos um haplótipo que é associado com a resistência recém-conferida ou resistência

   25 aumentada a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, em que o haplótipo se localiza dentro de um intervalo cromossômico flanqueado por e incluindo MZA8381 e MZA18180; com isso a planta transgênica resultante apresenta resistência recémconferida ou resistência aumentada a um membro do Sorogrupo

   30 2 de Fijivírus.

   Petição 870170065684, de 04/09/2017, pág. 15/20

   3/3

   8. Método de seleção de pelo menos uma planta de milho através de seleção assistida por marcador de um lócus de traço quantitativo associado com a resistência recém5 conferida ou resistência aumentada a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, CARACTERIZADO por o dito lócus de traço quantitativo estar localizado em um intervalo cromossômico definido por e incluindo marcadores MZA8381 e MZA18180 no grupo de ligação 2, o dito método compreendendo:

   10 (a) testar pelo menos um marcador no dito intervalo cromossômico para o dito lócus de traço quantitativo; e (b) selecionar a dita planta de milho contendo o dito lócus de traço quantitativo.

   15 9. Método de identificação de uma planta de milho ou germoplasma que apresenta suscetibilidade a um membro do Sorogrupo 2 de Fijivírus, CARACTERIZADO por o método detectar na planta de milho ou germoplasma pelo menos um haplótipo que é associado com a suscetibilidade, onde o haplótipo se

   20 localiza dentro de um intervalo cromossômico flanqueado por e incluindo MZA8381 e MZA18180.

   10. Método de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por a planta de milho ou germoplasma ter o haplótipo:

   25 T em MRQV 08351-173 T em MRQV 08351-262 A em MRQV 08351-280 C em MRQV 08351-323 T em MRQV_ 08351-369 30 T em MRQV_ 08351-372.

   Petição 870170065684, de 04/09/2017, pág. 16/20

   Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.

   Código de Controle

   Campo 1
4. 5A633840A2EEA258

   Campo 2

   624B2ECEBF910A97

   Outras Informações:

   - Nome do Arquivo: P1763 Listagem de Sequências - Manifestação 7.1.TXT

   - Data de Geração do Código: 04/09/2017

   - Hora de Geração do Código: 21:33:27

   - Código de Controle:

   - Campo 1: 5A633840A2EEA258

   - Campo 2: 624B2ECEBF910A97

   Petição 870170065684, de 04/09/2017, pág. 20/20