CN107290440A - 一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物品种鉴定方法，特别涉及一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法。该方法包括如下步骤：步骤1：样品的制备水稻抽穗初期的叶片用液氮磨碎，称样量为20 mg‑50 mg，入顶空样品瓶备用；步骤2：样品进行自动固相微萃取阶段，萃取分为三阶段1)第一阶段：80℃保持预加热2‑5分钟；2)第二阶段：采用萃取头以80℃,转速250 rpm/min,摇20 S,停5 S的间隔步骤，萃取头插入进样瓶的深度为22毫米，此萃取阶段持续10‑15分钟。3）第三阶段：萃取物直接入气质联用仪的进样口,进样时间为1分钟,进样温度为260℃；步骤3：样品进入气质联用仪进行分析。

Description

一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法
技术领域
本发明涉及一种植物品种鉴定方法，特别涉及一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法。
背景技术
香稻，以其清香可口而深受国内外消费者喜爱，市场上优质香米售价一般是普通稻米的2～3倍。香稻资源丰富、栽培历史悠久，几乎遍及世界各稻米生产国，印度、泰国、巴基斯坦、越南、日本和美国等都有自己的优质香稻品种；如印度的巴斯马蒂香稻（Basmati），泰国的Khao Dawk Mail 105，澳大利亚的Goolarah,美国的Della，伊朗Sadri，日本的祝贺，中国的万年香米等均是著名的香稻品种类。现中国众多的育种家都很重视对香稻品种的选育。大多数研究表明水稻的香味遗传是受单隐性基因控制。在香稻常规育种工作中，最常用的方法有杂交育种，而此选育过程中对F2代及多代的香味植株的筛选非常重要。现一般常规容易做的还是参照Sood等1988年创立的氢氧化钾溶液浸泡法进行香味鉴定方法；即叶片剪碎，浸入1.7 %浓度的氢氧化钾后闻嗅而评判香味有否。此方法容易带有个人感官经验性而使评判有主观性和不稳定性，甚至会有误判。同理，咀嚼法 、热水法、显色法等传统感官鉴评均存在人员感官差异，结果准确性和可靠性难以保证。仪器法具有灵敏度高、结果准确等优点，能有效弥补上述方法的缺陷。仪器分析方法但目前应用于稻米香气收集的技术，如超临界流体萃取 、顶空气体捕集 、同时蒸馏萃取和柱吸附等技术，存在样品及试剂消耗量大、操作步骤复杂和收集浓缩耗时等缺点，难以满足育种工作中大批量试验材料的鉴定工作。目前对香稻研究已三十多年，迄今已报道的香稻中的香味挥发物有200余种，只确定少数几种与米饭的香味或风味有关（Champage, 2008; Cho等2014）。美国威斯顿地区研究中心(WRRC)Buttery等1982年首次分离和鉴定出水稻香味的主要成分：2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-AP)，并提出此物质是几个亚洲水稻品种呈香味的主要缘由；同时我们实验室已得到数据结果是若是香稻，则整个生长期的植株叶子均是香的；反之，则均没有香味。正是基于此两因素，我们提出早期鉴定植株叶片的2-AP而来评判是否是香稻。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，通过优化自动固相微萃取程序, 快速鉴定香稻中香味主要特征香味物质2-乙酰-1-吡咯啉。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：样品的制备 水稻抽穗初期的叶片用液氮磨碎，称样量为20 mg- 50 mg，入顶空样品瓶备用；
步骤2：样品进行自动固相微萃取阶段，萃取分为三阶段
1)第一阶段：80℃保持预加热2-5分钟；
2)第二阶段：采用萃取头型号为fiber(聚二甲基硅烷/二乙烯苯/; 65µm )或fiber(CAR/DVB/PDMS; 50/30 µm ,1 cm长) 以80℃ ,转速250 rpm/min,摇20 S, 停5 S的间隔步骤，萃取头插入进样瓶的深度为22毫米，此萃取阶段持续10-15分钟；
3）第三阶段：萃取物直接入气质联用仪的进样口,进样时间为1分钟,进样温度为260℃；
步骤3：样品进入气质联用仪进行分析。
本发明通过优化自动固相微萃取对香稻香味主要特征物2-乙酰-1-吡咯啉萃取前处理条件及气相-质谱仪器参数设置，使之可以快速准确鉴定2-乙酰-1-吡咯啉，从而达到鉴别香与非香植株。
作为优选，第三阶段中，萃取头入自动固相微萃取进样烘烤位置以高温260℃净化萃取头5分钟。
作为优选，所述步骤3的具体参数是：
1）气质接口温度为250℃, 离子源温度为200℃，分离柱子采用Rxi-5Sil 毛细柱(30 m×0.25 mm × 0.25 µm) ；
2）气相程序升温为50℃保持1分钟,然后以5℃/ min升至120℃,后以20℃/ min升至260℃,保持5分钟；
3）质谱采用全扫描(scan)结合选择离子监测(SIM, selected ion monitoring)模式,扫描速度为10000, m/z 范围为40 to 450，间隔为0.05，离子检测选择检测通道为m/z 83，111，和68，间隔为0.3。
作为优选，步骤3的3）中，载气为纯度为99.999%的氦 ,流速为36.3 cm/sec，电子轰击(EI)离子源,离子化能量为70 eV。
本发明通过优化自动固相微萃取程序, 快速鉴定香稻中香味主要特征香味物质2-乙酰-1-吡咯啉, 克服以往用超临界流体萃取、顶空气体捕集、同时蒸馏萃取和柱吸附或手工固相微萃取等技术的步骤繁琐和易损失的问题,本发明提供了叶片前处理，自动固相微萃取的提取条件和气质联用仪器参数,可以对2--乙酰-1-吡咯啉进行快速准确分析,在香稻品质选育和香味遗传研究等均有很好的应用前景。
本发明方法包括采样时期，采样处理，自动固相微萃取处理的优化和气质联用仪器测试方法参数的建立。本发明所提出的方法具有简便，快速，准确和高效，在香稻育种早世代筛选和香味基因遗传研究等均具有良好的应用前景。
附图说明
图1是香稻样品的总离子流色谱图；
图2是2-AP的质谱图；
图3是香稻样品的总离子流色谱图；
图4是2-AP的质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，步骤如下：
步骤1：水稻样品一：取抽穗初期采1-2片叶子，用液氮磨碎，称样量50 mg,入20毫升螺纹口顶空样品瓶，用含PTFE/蓝色硅胶隔垫的磁性金属盖拧紧。
步骤2：进行自动固相微萃取阶段，萃取分为三阶段
第一阶段：80℃保持预加热5分钟；
第二阶段：采用萃取头型号为fiber (carboxen/ divinybenzene/polydimethylsiloxane,碳分子筛/二乙烯苯/聚二甲基硅烷; 50/30 µm ,1 cm长) 以80℃,转速250 rpm/min,摇20 S, 停5 S的间隔步骤。萃取头入进样瓶的深度为离瓶口22毫米。此萃取阶段持续10分钟。
第三阶段：萃取物直接入气质联用仪的进样口,进样时间为1分钟,进样温度为260℃。萃取头入自动固相微萃取进样烘烤位置以高温260℃净化萃取头5分钟。
步骤3: 进入气质联用仪进行分析,仪器设置参数如下:
气质接口温度为250℃,离子源温度为200℃。分离柱子采用Rxi-5Sil毛细柱(30 m×0.25 mm × 0.25 µm)。气相程序升温为50℃保持1分钟,然后以5℃/ min升至120℃,后以20℃/ min升至260℃,保持5分钟。质谱采用全扫描(scan)结合选择离子监测(SIM,selected ion monitoring)模式,扫描速度为10000, m/z 范围为40 to 450，间隔为0.05。离子检测选择检测通道为m/z 83，111，和68，间隔为0.3。气为高氦(99.999%) ,流速为36.3cm/sec。电子轰击(EI)离子源,离子化能量为70 eV。2-乙酰-1-吡咯啉物质的判定经NIST库检索，与2-AP标准质谱图匹配。
图1 为香稻样品的总离子流色谱图, 由图可见2-AP出峰保留时间在6.12min（箭头处）。图2为2-AP的质谱图，分子离子峰为m/z 111，特征离子碎片为m/z 68和83
经NIST库检索，与2-AP标准质谱图匹配。
实施例2：
一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，步骤如下：
步骤1：水稻样品二：取水稻抽穗初期采1-2片叶子，用液氮磨碎，称样量20 mg-50 mg,入20毫升螺纹口顶空样品瓶，用含PTFE/蓝色硅胶隔垫的磁性金属盖拧紧。
步骤2：进行自动固相微萃取阶段，萃取分为三阶段
第一阶段：85 ℃保持预加热2分钟；
第二阶段：采用萃取头型号为fiber (polydimethylsiloxane/divinybenzene/, 聚二甲基硅烷/二乙烯苯/; 65 µm )以80℃ ,转速250 rpm/min,摇20 S, 停5的间隔步骤。萃取头入进样瓶口深度的距离为22毫米。此萃取阶段持续15分钟。
第三阶段：萃取物直接入气质联用仪的进样口,进样时间为1分钟,进样温度为260℃。萃取头入自动固相微萃取进样烘烤位置以高温260 ℃净化萃取头5分钟。
步骤3: 进入气质联用仪进行分析,仪器设置参数如下:
气质接口温度为250℃,离子源温度为200 ℃。分离柱子采用Rxi-5Sil毛细柱(30 m×0.25 mm × 0.25 µm)。气相程序升温为50 ℃保持1分钟,然后以5 ℃/ min升至120℃,后以20 ℃/min升至260 ℃,保持 5 分钟。质谱采用全扫描(scan)结合选择离子监测(SIM,selected ion monitoring)模式,全扫描速度为10000, m/z 范围为40 to 450，间隔为0.05。离子检测选择检测通道为m/z 83，111，和68，间隔为0.3。载气为高氦(99.999%) ,流速为36.3 cm/sec。电子轰击(EI)离子源,离子化能量为70 eV。2-乙酰-1-吡咯啉物质的判定经NIST库检索，要与2-AP标准质谱图匹配。
图3 为香稻样品的总离子流色谱图, 由图可见2-AP出峰保留时间在6.32min（箭头处），图4是2-AP的质谱图，分子离子峰为m/z 111，特征离子碎片为m/z 68和83,经NIST库检索，与2-AP标准质谱图匹配。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (4)

1.一种快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1：样品的制备 水稻抽穗初期的叶片用液氮磨碎，称样量为20 mg- 50 mg，入顶空样品瓶备用；
步骤2：样品进行自动固相微萃取阶段，萃取分为三阶段
1)第一阶段：80℃保持预加热2-5分钟；
2)第二阶段：采用萃取头型号为fiber(聚二甲基硅烷/二乙烯苯/; 65µm )或fiber(CAR/DVB/PDMS; 50/30 µm ,1 cm长) 以80℃ ,转速250 rpm/min,摇20 S, 停5 S的间隔步骤，萃取头插入进样瓶的深度为22毫米，此萃取阶段持续10-15分钟；
3）第三阶段：萃取物直接入气质联用仪的进样口,进样时间为1分钟,进样温度为260℃；
步骤3：样品进入气质联用仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，其特征在于：第三阶段中，萃取头入自动固相微萃取进样烘烤位置以高温260℃净化萃取头5分钟。
3.根据权利要求1所述的快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，其特征在于：所述步骤3的具体参数是：
1）气质接口温度为250℃, 离子源温度为200℃，分离柱子采用Rxi-5Sil 毛细柱(30 m×0.25 mm × 0.25 µm) ；
2）气相程序升温为50℃保持1分钟,然后以5℃/ min升至120℃,后以20℃/ min升至260℃，保持5分钟；
3）质谱采用全扫描结合选择离子监测模式，扫描速度为10000，m/z 范围为40 to 450，间隔为0.05，离子检测选择检测通道为m/z 83，111，和68，间隔为0.3。
4.根据权利要求3所述的快速准确鉴定水稻生长早期的香与非香植株的方法，其特征在于：步骤3的3）中，载气为纯度为99.999%的氦，流速为36.3 cm/sec，电子轰击离子源，离子化能量为70 eV。
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