CN102660518B - 基因组长片段删除系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因组长片段删除系统，由特异剪切目的基因2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成，作用于基因组后能够对目的基因实现长片段删除；还公开了该删除系统的应用，使用方便，能够获得遗传变异大的品种，为育种提供丰富的遗传资源，具有广泛的应用前景。

Description

基因组长片段删除系统及其应用

技术领域                         

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基因组长片段删除系统，还涉及基因组长片段删除系统的应用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业在历史上一直与农并茂，为中华民族经济的发展和文化的弘扬都做出了巨大贡献。蚕丝拥有雍容典雅的光泽、轻盈舒适的触感、良好的衣料悬垂性和曲线性、适中的吸水性以及对人体肌肤的亲和性等固有的优良特性，长久以来都深受广大消费者的喜爱，蚕丝也因此而被誉为“纤维皇后”。目前我国丝绸工业年总产值达1350亿元，占纺织工业总产值的10%以上；茧丝产量和出口量分别占世界总额的70%和80%以上，年创汇超过50亿美元，是在国际市场上处于绝对优势的特色产业。全国共有种桑养蚕农户2000多万户，遍布20余个省区。蚕业是目前我国农村经济中的重要组成部分，其年出口创汇额在农产品中位居前列，是农民收入的重要来源。蚕丝产业在解决“三农”问题，特别是增加农民收入、调整农村产业结构上发挥着越来越重要的作用。

然而，作为一个古老的传统产业，蚕桑丝绸生产技术与水平最近60年来都处于一个平台期。蚕品种的强健性、绢丝品质、产量等主要经济性状差等品种资源问题一直没有取得重大的突破，蚕丝服装易发黄、变皱等固有缺陷没有得到根本的解决。品种资源更新远远跟不上生产需要，蚕丝业整体生产效益低下。这主要是因为：1）经过上百年的挖掘，基于传统育种手段的增产潜力已经发挥到极致，加之自然条件的特殊性和局限性，目前已很难突破品种资源本身的局限。现存的家蚕品种虽然种类和数量颇多，但是其遗传背景单一，相互之间的经济性状和生物学性状并没有显著的差异。家蚕品种经过百年更迭，在经济性状和生物学性状上都没有显著的改进。2）作为纺织纤维，蚕丝因其价格昂贵使得众多消费者望而止步，加之蚕丝具有易发黄、起皱的缺点，使其在各种纺织纤维中并不占有很大的市场份额。在蚕丝产业几乎停滞不前的近几十年中，棉、毛等纺织纤维的研究和利用进展良好，各种人造纤维异军突起，对蚕丝产业造成了比较大的冲击。3）长久以来，人类驯化和饲养家蚕的主要目的是缫丝织绸，所以现存的家蚕品种几乎都是千篇一律的多丝量品种，其茧丝的成分和特性基本上没有什么区别。在蚕业科技日新月异的今天，蚕丝越来越多的作为一种多功能的生物材料而被重新认识。

家蚕是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物和重要的生物反应器。家蚕遗传学和生理学的早期研究成果为昆虫信息素、激素、解剖学、生理学和遗传学等方面的基础发现做出尤为重要的贡献；在家蚕基因组框架图、家蚕基因组精细图、家蚕基因芯片和遗传变异图相继解析之后，家蚕基因组学和功能基因组学研究在现代昆虫生物学研究中也起着举足轻重的作用。作为合成和分泌丝蛋白的唯一器官，家蚕丝腺是昆虫中蛋白质合成能力最强的生物器官，一头家蚕可生产纯蛋白质0.5g以上。无论是在基础研究，还是在药物、化妆品开发领域，提取或表达纯化的蛋白都扮演着极其重要的角色。饲养一头蚕的成本不足1角钱，却能吐0.5g的丝蛋白，而如果能用基因工程手段让家蚕吐出0.5g纯蛋白，这对于蚕丝产业、甚至生物产业都将产生革命性的推动作用。也正是这一奇特的生物学现象和应用前景吸引着众多生物学家自分子生物学发端以来就长期致力于家蚕丝蛋白的表达调控和家蚕生物反应器的开发。

要突破传统育种的局限，获得品种选育的革命性突破；彻底克服蚕丝的固有缺陷，恢复蚕丝的纺织纤维市场中生机；开发新型多功能蚕丝材料，促进单一的蚕丝产业向更为广阔的非绢丝产业扩展，这些都是现代蚕业中亟须解决的关键问题。在分子农业时代，这些问题的解决离不开对家蚕重要经济性状相关基因的功能解析和遗传改造。要最大程度的发挥家蚕在鳞翅目昆虫研究中的模式作用，推动家蚕生物反应器的进一步开发和应用，也离不开转基因、基因组编辑和遗传改造等重要的分子工具。尽管转基因和RNAi等目前广泛应用的分子改良工具在家蚕中已经得到了较好的应用，但是能直接对家蚕内源基因进行编辑和改造的技术还未见报道，更没有长片段基因组序列删除的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供基因组长片段删除系统，该删除系统能够为对目的基因进行编辑，删除目的基因的长片段，提供遗传资源丰富的物种，技术方案为：

基因组长片段删除系统，所述基因组长片段删除系统由特异剪切目的基因内2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成；所述2个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’的第二靶序列；所述2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B2和TALEN-B3组成，所述TALEN-B2特异剪切所述第一靶序列，所述TALEN-B3特异剪切第二靶序列。

进一步，所述靶序列为T(Nn)A结构的核苷酸序列，N为A，G，T和C中的任一碱基，n为24至65之间的任一数字。

进一步，所述目的基因为家蚕油蚕基因BmBlos2 。

进一步，所述第一靶序列如SEQ ID NO.6所示核苷酸，所述第二靶序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸。

进一步，所述TALEN-B2由SEQ ID NO.7所示和SEQ ID NO.8所示核苷酸分别编码的蛋白质组成；所述TALEN-B3由SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示核苷酸分别编码的蛋白质组成。

本发明目的之二在于提供基因组长片段删除系统的应用，技术方案为：

所述基因组长片段删除系统在靶细胞中删除目的基因核酸序列的应用。

进一步，所述靶细胞为家蚕细胞。

进一步，所述目的基因为家蚕油蚕基因BmBlos2。

本发明的有益效果在于：本发明利用TALEN技术，通过在靶细胞内部同时使用2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN通过核定位信号NLS定位于细胞核中，然后识别蛋白特异识别靶序列，核酸酶FokI发生剪切，在基因内部同时存在2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，能够删除识别靶序列之间的序列，与使用单个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN相比，基因序列发生变化更大，获得遗传变异大的品种。利用本发明提供的长片段删除体统遗传改造效率高，能够快速、准确在基因组中对目的基因实现遗传改造，为育种提供丰富的遗传资源。

附图说明

图1为本发明家蚕BmBlos2基因的结构示意图和转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的剪切位点，其中数字表示外显子或内含子的长度，ATG和TAA分别表示起始和终止密码子，下划线表示转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的识别位点。

图2为本发明BmBlos2基因敲除以后家蚕的表型，其中WT表示野生型的家蚕个体，mutant表示突变体。

图3为本发明注射了TALEN-B3后产生的突变序列，其中a图表示BmBlos2基因的部分结构示意图，上方的箭头表示PCR和测序引物的位置，b图表示来自与不同蛾圈的突变个体的序列，以“>”开头的标识表示不同的蛾圈编号，是“△”、“M”和“I”分别表示缺失、碱基替换和插入，其后的数字表示缺失、替换或插入的碱基数，“X”及后面的数字表示相应序列的条数，下划线的序列为TALEN的识别位点。

图4本发明家蚕BmBlos2基因的结构示意图和长片段删除的结果。其中a图显示了家蚕BmBlos2基因的结构示意图；b图显示了共注射后B2和B3后的PCR结果；图c表示共注射后B2和B3后测序峰图；图d表示共注射后B2和B3后家蚕突变体序列比对图。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕品种为“N4”，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

实施例1、家蚕油蚕基因BmBlos2的序列分析

从silkDB数据库下载家蚕油蚕基因BmBlos2的序列（编号为BGIBMGA002101）。序列分析显示该基因包括四个长分别为180bp，131bp，112bp和608bp的外显子以及三个长分别为2465bp， 663bp和2703bp的内含子，第一外显子包括125bp的非翻译区和55bp的编码区，其结构如图1所示。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和第三外显子为理想的靶标位点，本实施例以第二外显子和第三外显子为靶标位点。

实施例2、第三外显子核酸酶TALEN-B3的设计

根据家蚕油蚕基因BmBlos2的序列特征，我们选择第三外显子上的序列作为转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B3剪切的靶序列，家蚕油蚕基因BmBlos2第三外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据TALEN原理将结构为T(Nn)A的核苷酸序列为转录激活子样效应因子核酸酶TALEN识别靶序列，其中N为A，G，T和C中的任一碱基，n为24至65之间的任一数字。按照上述原理设计TALEN识别的靶位点为5’- tcaccaagtacgcagatcta aggagcctagccgcgaacctgaacaagaccctta-3’(SEQ ID NO.2)，划线部分为转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B3识别模块，黑体部分表示间隔序列，其中5’端划线核苷酸序列为5’端识别模块，对应SEQ ID NO.2所示的1-20位核苷酸，3’端核苷酸序列为3’端识别模块，对应SEQ ID NO.2所示的36-54为核苷酸序列。分别将5’端识别模块和3’端识别模块按照A=NI，T=NG，G=NN，C=HD规律设计识别靶序列的蛋白质的可变氨基酸，并在识别蛋白上游设置核定位信号NLS，下游设置内切核酸酶FokI，得到由核定位信号NLS、识别所述5’端识别模块的蛋白质和内切核酸酶FokI依次串联组成的TALEN-L-B3和由核定位信号NLS、识别所述3’端识别模块的蛋白质和内切核酸酶FokI依次串联组成TALEN-R-B3。根据TALEN-L和TALEN-R的氨基酸序列设计编码TALEN-L-B3和TALEN-R-B3的核苷酸序列，编码TALEN-L-B3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中82-102位核苷酸编码核定位信号NLS，120-2826位核苷酸编码识别所述5’端识别模块的蛋白质，2833-3420位核苷酸编码内切核酸酶FokI，编码TALEN-R-B3核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中76-96位核苷酸编码核定位信号NLS，114-2820位核苷酸编码识别所述3’端识别模块的蛋白质，2826-3414位核苷酸编码内切核酸酶FokI。

分别人工合成编码TALEN-L-B3和TALEN-R-B3的核苷酸序列（SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），再用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切后连接经同样酶切的原核表达载体pET28a，然后转化大肠杆菌，并筛选阳性克隆，获得重组载体，分别命名为pET28a-B3L和pET28a-B3L。将所得重组载体分别用XhoⅠ酶切消化后用MessageMax T7 mRNA体外转录试剂盒（购自Epicentre）进行体外转录，体外转录条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，加1μL DNA酶，再继续孵育15分钟。然后将反应液用Epicentre A-plus加尾试剂盒（购自Epicentre）进行加A反应，反应条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，然后用MEGAClear试剂盒（购自Ambion）进行纯化，得编码TALEN-L-B3和TALEN-R-B3的 mRNA，将所得编码TALEN-L-B3和TALEN-R-B3的mRNA混合物命名B3，于-80℃保存备用。

实施例3、第二外显子核酸酶TALEN-B2的设计

根据家蚕油蚕基因BmBlos2的序列特征，选择第二外显子上的序列作为TALEN-B2作用的靶序列，家蚕油蚕基因BmBlos2第二外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，根据TALEN原理将结构为T(Nn)A的核苷酸序列为TALEN作用靶序列，其中N为A，G，T和C中的任一碱基，n为24至65之间的任一数字。按照上述原理设计TALEN作用的靶序列为5’-tggatccacatgatcctgt gatcagtcggttagcc acacagctctttaaaaaaa-3’(SEQ ID NO.6)，划线部分为TALE识别模块，黑体部分表示间隔序列，其中5’端划线核苷酸序列为5’端识别模块，对应SEQ ID NO.2所示的1-19位核苷酸，3’端核苷酸序列为3’端识别模块，对应SEQ ID NO.2所示的36-54为核苷酸序列。分别在5’端识别模块和3’端识别模块按照A=NI，T=NG，G=NN，C=HD规律设计识别靶序列的蛋白质的可变氨基酸，并在识别蛋白上游设置核定位信号NLS，下游设置内切核酸酶FokI，得到由核定位信号NLS、识别所述5’端识别模块的蛋白质和内切核酸酶FokI依次串联组成的TALEN-L-B2和由核定位信号NLS、识别所述3’端识别模块的蛋白质和内切核酸酶FokI依次串联组成TALEN-R-B2。根据TALEN-L-B2和TALEN--R B2氨基酸序列设计编码TALEN-L-B2和TALEN-R-B2核苷酸序列，其中编码TALEN-L-B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO.3第82-102位核苷酸编码核定位信号NLS，第120-2826位核苷酸编码识别所述5’端识别模块的蛋白质，第2833-3420位核苷酸编码内切核酸酶FokI，编码TALEN-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.4第76-96位核苷酸编码核定位信号NLS，第114-2820位核苷酸编码识别所述3’端识别模块的蛋白质，第2826-3414位核苷酸编码内切核酸酶FokI。

分别人工合成如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示核酸酸序列，再用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切后连接经同样酶切的原核表达载体pET28a，然后转化大肠杆菌，并筛选阳性克隆，获得重组载体，分别命名为p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL。将所得重组载体p-TALE(L)-CKK和p-TALE(R)-NEL分别用XhoⅠ酶切消化后用MessageMax T7 mRNA体外转录试剂盒（购自Epicentre）进行体外转录，体外转录条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，加1μL DNA酶，再继续孵育15分钟。然后将反应液用Epicentre A-plus加尾试剂盒（购自Epicentre）进行加A反应，反应条件为：在温度为37℃条件下孵育30分钟，然后用MEGAClear试剂盒（购自Ambion）进行纯化，得编码TALEN-L-B2和TALEN-R-B2的 mRNA，将所得编码TALEN-L-B2的mRNA和编码TALEN-R-B2的mRNA混合物命名B2，于-80℃保存备用。

实施例4、第三外显子核酸酶TALEN-B3功能验证

选择多化性家蚕品种“N4”，在25℃恒温、相对湿度75%的环境中，用桑叶饲养。羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、光强为50~155 μmol/m2/s条件下交配4小时后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上产卵，所得蚕卵直接用于显微注射。用浓度为700ng/μL的B3用显微注射仪（FemtoJet 5247 显微注射仪，购自Eppendorf）注射所得蚕卵中的521粒蚕卵，每粒蚕卵注射量约10nL。注射后的蚕卵用无毒胶水封住注射口，并用体积百分比为35%的甲醛蒸气中消毒5分钟，置于25℃、相对湿度为85%的环境中催青孵化，将孵化的G0代蚁蚕人工饲料收集饲养至化蛾。

在521粒注射蚕卵中，经人工饲养获得126头五龄幼虫，其中28头表现出嵌合体的表型，如图2所示。将获得的126个G0代蚕蛾，通过自交或回交获得41蛾圈G1代蚕卵，将41个蛾圈催青并单独饲养至G1代三龄幼虫观察，在其中的6个蛾圈中发现277头具有表型为油蚕的家蚕突变体。

选取表型为油蚕的家蚕突变体51个，提取基因组，选取选取突变位点附近序列设计PCR引物进行PCR扩增。PCR引物：上游引物为B3-F364：5’-tccaatttgagggcaatgctac-3’（SEQ ID NO.9），下游引物为B3-R315：5’-atttcaccacctcattcaactaagat-3’ （SEQ ID NO.10）；PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10 min。同时选取选取突变位点附近序列设计测序引物，测序引物为如SEQ ID NO.9所示。PCR产物经电泳检测、纯化，然后进行测序。测序结果表明所选取的51个突变个体在TALEN(B2)靶位点均发生了突变，突变包括变异、缺失或小片段的插入，测序结果如SEQ ID NO:11-20，部分结果如附图3所示。

实施例5、目的基因长片段删除

用多化性品种“N4”作为材料，收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、光强为50~155 μmol/m2/s的条件下交配4小时后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上产卵。并于产卵后立即将终浓度700ng/μL的B3和终浓度700ng/μL的B2等体积混合后用显微注射仪（FemtoJet 5247 显微注射仪，购自Eppendorf）注射到326粒蚕卵中，每粒蚕卵注射量约为10nL。注射后的蚕卵用无毒胶水封住注射口，并用体积百分比为35%的甲醛蒸气中消毒5分钟，然后置于25℃、相对湿度为85%的环境中催青孵化，将孵化的G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾。

在326粒注射蚕卵中，孵化获得51个G0代蚁蚕，经人工饲养至化蛾，获得40头五龄幼虫，其中8头表现出嵌合体的表型，如图3所示。获得的40个G0代蚕蛾，通过自交或回交获得14蛾圈G1代蚕卵，将14个蛾圈催青并单独饲养至G1代三龄幼虫观察，在其中的2个蛾圈中发现132头油蚕表型的家蚕突变体。

从132头油蚕中选取14个，提取基因组，并在突变位点附近序列设计PCR引物，上游引物为B2-F241：5’-ttggtccagtaggtttgaagtaggt-3’ （SEQ ID NO.21），下游引物为B3-R315，如SEQ ID NO.10所示核苷酸，PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10 min。同时选取选取突变位点附近序列设计测序引物，测序引物如SEQ ID NO.21所示。PCR产物经电泳检测、纯化，然后进行测序。测序结果表明所选取的14个突变体种有7个发生了长片段的缺失，具体序列如SEQ ID NO.22所示，结果如附图4所示。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  西南大学

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<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

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<223>  家蚕油蚕基因BmBlos2第三外显子核苷酸序列

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<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

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<223>  第三外显子TALEN-B3结合位点

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  编码TALEN-L-B3核苷酸序列

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actcctgagc aggtcgtagc tatagcatcc aacggaggtg gaaggccagc actcgagtcg 2640   

atcgtggctc aattaagtag acccgaccct gcccttgcag cgctgactaa tgatcacttg 2700   

gtcgcactcg cgtgcttagg cggtagaccc gcccttgatg cagtgaaaaa gggtctgcca 2760   

catgctccag cactcatcaa aagaaccaat cgtcgtattc ccgagaggac atcacacagg 2820   

gtggcgggat cccagctggt gaagagcgag ctggaggaga agaagtccga gctgcggcac 2880   

aagctgaagt acgtgcccca cgagtacatc gagctgatcg agatcgccag gaacagcacc 2940   

caggaccgca tcctggagat gaaggtgatg gagttcttca tgaaggtgta cggctacagg 3000   

ggaaagcacc tgggcggaag cagaaagcct gacggcgcca tctatacagt gggcagcccc 3060   

atcgattacg gcgtgatcgt ggacacaaag gcctacagcg gcggctacaa tctgcctatc 3120   

ggccaggccg acgagatgca gagatacgtg aaggagaacc agacccggaa taagcacatc 3180   

aaccccaacg agtggtggaa ggtgtaccct agcagcgtga ccgagttcaa gttcctgttc 3240   

gtgagcggcc acttcaaggg caactacaag gcccagctga ccaggctgaa ccacaaaacc 3300   

aactgcaatg gcgccgtgct gagcgtggag gagctgctga tcggcggcga gatgatcaaa 3360   

gccggcaccc tgacactgga ggaggtgcgg cgcaagttca acaacggcga gatcaacttc 3420   

tgataa                                                            3426

 

<210>  4

<211>  3414

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  编码TALEN-R-B3核苷酸序列

<400>  4

atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac   60   

gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca tccacggggt acccatgatg  120   

tctcgcactc gtctccctag ccctccagca ccgtcaccag cattctcggc aggttccttc  180   

tcggacttat tacgccagtt tgacccgagc ttattcaata ctagcctttt tgattccctg  240   

cctccattcg gtgctcacca tacagaagct gccactggcg aatgggacga ggttcaatcc  300   

ggtctgaggg cagcagatgc accaccacct accatgagag tggctgttac ggctgccagg  360   

ccaccgagag ctaaaccagc accaagaagg cgtgcagcac agccatcaga cgcttctccg  420   

gctgcccaag tggatctcag gaccttaggt tactcacaac agcaacagga aaaaatcaaa  480   

ccaaaagtta gatctacagt cgcccagcac catgaggcat tggtgggcca cggttttact  540   

cacgcgcata tcgttgctct gtcgcagcat ccggcagcgt tgggaaccgt cgctgtaaag  600   

tatcaagaca tgattgctgc cctccccgaa gccacacacg aggcaatagt gggagttggc  660   

aaacaatggt caggagctag ggccttggaa gcgctgttga cagtggctgg agagctcaga  720   

ggaccccctt tacaacttga taccggccag ctcttaaaga ttgctaaacg cggtggagtc  780   

acggcagtag aagcggtgca cgcttggcgt aacgcgttaa caggagctcc cctgaatttg  840   

actcctgaac aggtggttgc aatagcgtcg cacgacggcg gtaaacaagc ccttgagacc  900   

gtacagcgcc ttctgccagt gttgtgccaa gcacatggtc tcacgccgca acaggtcgta  960   

gctatcgcca gtaacattgg aggcaaacaa gcgttagaaa cagttcagcg tttgctcccc 1020   

gtcttatgtc aagctcacgg acttactcct caacaggtgg ttgcaatcgc gtcaaacaat 1080   

ggtggaaagc aagccttgga gaccgtacag aggttacttc cagtgctgtg ccaagcacat 1140   

ggcttgacgc cggaacaggt cgtagctatt gcctctaata agggcggtaa acaagcgctc 1200   

gagacagttc agagactgtt gcccgtcctc tgtcaagcac acggtttaac accagagcaa 1260   

gtggttgcaa tagcgagcaa caatggaggc aaacaagccc tggagaccgt acaggcactc 1320   

ttaccagtgc tttgccaagc ccatggactt actcctgagc aagttgtagc tatcgcctcc 1380   

aacggtggag gcaagcaagc gttggagaca gttcaggctc ttctgcccgt cttgtgtcaa 1440   

gctcacggcc tcacaccaga acaggtggtt gcaattgcgt cgcatgatgg tggaaaacaa 1500   

gccctcgaga ccgtacaggc attgctccca gtgttatgcc aagctcacgg tcttactcct 1560   

gaacaggtcg tagctatagc cagtaacggc ggtggaaagc aagctctgga gacagttcag 1620   

cgcttacttc ccgtcctgtg tcaagcccat ggactgacac ccgagcaagt tgttgcaatc 1680   

gcgtcaaatg gcggtggaaa acaagcattg gagaccgtac agcgtctgtt gccagtgctc 1740   

tgccaggctc acggcttaac tcctcagcaa gttgttgcta ttgcctctaa caatggcggt 1800   

aaacaagccc tcgaaacagt tcagaggctc ttacccgtcc tttgtcaagc tcatggtctc 1860   

acacccgagc aggttgtcgc aatagcgagc aacggaggcg gtaaacaagc gctggagacc 1920   

gtacaggctc ttctgccagt cttgtgccaa gctcacggac tcactccaga gcaagtcgta 1980   

gctatcgcct ccaatggagg cggtaaacaa gccttggaga cagtgcagag attgctcccc 2040   

gttttatgtc aagctcacgg ccttacaccc gagcaggttg tggctattgc gtcgcatgac 2100   

ggtggcaaac aggccctgga gaccgtccag cgcttgttgc cagtgctgtg ccaagctcat 2160   

ggtctgactc cagagcaggt tgttgctata gccagtaaca tcggaggaaa gcaggccttg 2220   

gagacagttc agcgtttgct gcctgttctc tgtcaagctc acggattaac acccgagcag 2280   

gttgttgcaa tagcgtcaaa taacggtggt aaacaggctt tggagaccgt gcagagactc 2340   

ttaccagttc tttgccaagc tcatggcctg actcctcagc aagtggttgc tatcgcctct 2400   

aacaaaggag gccgccccgc cctggaaaca gtccaacgtc ttctgcctgt gttgtgtcag 2460   

gctcacggtc tcactccaga acaagtggtt gcaattgcga gcaatggagg tggcaaacaa 2520   

gctttggaga ccgttcagcg cttgctcccg gtcttatgcc aggctcacgg acttacgccc 2580   

cagcaagtgg tcgctatcgc atccaacggt ggaggaaggc ctgcactcga atcgattgtg 2640   

gcacaattaa gtcgtcccga ccctgccctt gcagcgctga ctaatgatca cttggtcgca 2700   

ctcgcgtgct taggtggaag acctgccctt gatgcagtga aaaagggtct gccacatgct 2760   

cccgcactca tcaagagaac taatagacgc atacccgaga gaaccagcca ccgtgttgct 2820   

ggatcccagc tggtgaagag cgagctggag gagaagaagt ccgagctgcg gcacaagctg 2880   

aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg ccaggaacag cacccaggac 2940   

cgcatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggaaag 3000   

cacctgggcg gaagcagaaa gcctgacggc gccatctata cagtgggcag ccccatcgat 3060   

tacggcgtga tcgtggacac aaaggcctac agcggcggct acaatctgcc tatcggccag 3120   

gccgacgaga tggagagata cgtggaggag aaccagaccc ggaataagca cctcaacccc 3180   

aacgagtggt ggaaggtgta ccctagcagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgagc 3240   

ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 3300   

aatggcgccg tgctgagcgt ggaggagctg ctgatcggcg gcgagatgat caaagccggc 3360   

accctgacac tggaggaggt gcggcgcaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttc       3414

 

<210>  5

<211>  131

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕油蚕基因BmBlos2第二外显子核苷酸序列

<400>  5

agcttgaaat gtcaccgagc tgttcgagtt tcgaagtcct ggatccacat gatcctgtga   60

tcagtcggtt agccacacag ctctttaaaa aaacaactga ctaccttcag gctgaaatgg  120

ttgctggaca g                                                       131

 

<210>  6

<211>  54        

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  第二外显子TALEN-B2结合位点

<400>  6

tggatccaca tgatcctgtg atcagtcggt tagccacaca gctctttaaa aaaa     54

 

<210>  7

<211>  3426

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  编码TALEN-L-B2核苷酸序列

<400>  7

atgagatctg actacaaaga ccatgacggt gattataaag atcatgacat cgattacaag   60   

gatgacgatg acaagatggc ccccaagaag aagaggaagg tgggcattca tggggtaccc  120   

atgatgtctc gtactcgctt gccttcgcct cctgctcctt ctcccgcctt ctccgctggt  180   

tcattttctg acttacttcg ccaattcgac ccgagcttat tcaacactag cctttttgat  240   

tccctgcctc cattcggtgc tcaccataca gaagctgcca ctggtgaatg ggacgaggtt  300   

caatccggac tgagggcagc agatgcacca ccacctacca tgagagtggc tgttacggct  360   

gccaggccac cgagagctaa accagcacca agaaggcgtg cagcacagcc atcagacgct  420   

tctccggctg cccaagtgga tctcaggacc ttaggttact cacaacagca acaggaaaaa  480   

atcaagccaa aagttagatc tacagtcgcc cagcaccatg aggcattggt gggtcacgga  540   

tttactcacg cgcatattgt tgctctgtcg cagcatccgg cagcgttggg aaccgtcgct  600   

gtaaagtatc aagacatgat agctgccctc cccgaagcca cacacgaggc aatcgtgggc  660   

gttggtaaac aatggtcagg cgctagggcc ttggaagcgc tgttgacagt ggctggagag  720   

ctcagaggcc cccctttaca acttgatacc ggtcagctct taaagatagc taaacgcggt  780   

ggagtcacgg cagtagaagc ggtgcacgct tggcgtaacg cgttaacagg agctcccctg  840   

aatttgactc ctgaacaggt ggttgcaatc gcgtcgaaca atggcggtaa acaagccctt  900   

gagaccgtac agcgccttct gccagtgttg tgccaagcac acggactcac gccgcaacag  960   

gtcgtagcta ttgccagtaa caatggaggc aaacaagcgt tagaaacagt tcagcgtttg 1020   

ctccccgtct tatgtcaagc tcatggcctt actcctcagc aagtggttgc aatcgcgtca 1080   

aacattggtg gaaagcaagc cttggagacc gtacagaggt tacttccagt gctgtgccaa 1140   

gcacacggtt tgacgccgga acaggtcgta gctatagcct ctaatggcgg tggaaaacaa 1200   

gcgctcgaga cagttcagag actgttgccc gtcctctgtc aagcacacgg attaacacca 1260   

gagcaagttg tcgcaatcgc gagccatgac ggcggtaaac aagccctgga gaccgtacag 1320   

gcactcttac cagtgctttg ccaagcacac ggactgacgc cagagcaagt cgtagctatt 1380   

gcctcccatg acggtggcaa acaagcgttg gagacagttc aggctcttct gcccgtcttg 1440   

tgtcaagctc acggtctcac accagaacag gtggttgcaa tagcgtcgaa catcggtgga 1500   

aagcaagccc tcgagaccgt acaggcattg ctcccagtgt tatgccaagc tcacggactt 1560   

actcctgagc aggttgtagc tattgccagt cacgatggcg gtaaacaagc tctggagaca 1620   

gttcagcgct tacttcccgt cctgtgtcaa gcccatggcc tgacacccga gcaggtggtt 1680   

gcaattgcgt caaacatagg aggcaagcaa gcattggaga ccgtacagcg tctgttgcca 1740   

gtgctctgcc aggctcacgg tttaactcct cagcaagttg ttgctatagc ctctaacggt 1800   

ggaggcaaac aagccctcga aacagttcag aggctcttac ccgtcctttg tcaagctcat 1860   

ggacttacac ccgaacaagt tgtggcaatc gcgagcaaca atggtggaaa gcaagcgctg 1920   

gagaccgtac aggctcttct gccagtcttg tgccaagctc acggcctcac tcctgaacag 1980   

gtcgtagcta tcgcctccaa cattggcggt aaacaagcct tggagacagt gcagagattg 2040   

ctccccgttt tatgtcaagc tcatggtctt acacccgaac aagtcgttgc aattgcgtcg 2100   

aatggaggtg gtaaacaggc cctggagacc gtccagcgct tgttgccagt gctgtgccaa 2160   

gctcacggac tgactccaga gcaggttgtt gctatagcca gtcatgacgg aggcaaacag 2220   

gctttggaga cagttcagcg tttgctgcct gttctctgtc aagctcacgg cttaacaccc 2280   

gaacaagttg ttgcaatcgc gtcacatgat ggtggaaagc aagccctgga gaccgtgcag 2340   

agactcttac cagttctttg ccaagctcac ggtctgactc ctcagcaagt tgtcgctatt 2400   

gcatctaatg gaggtggaag gccagcactg gaaacagtcc aacgtcttct gcctgtgttg 2460   

tgtcaggctc atggactcac tccagaacaa gtggttgcaa tagcgagcaa taacggtggt 2520   

aaacaggctt tggagaccgt tcagcgcttg ctcccggtct tatgccaggc tcacggcctt 2580   

acgccccagc aagttgttgc tattgcatcc aacggaggtg gtaggcctgc actcgaatcg 2640   

atagtggcac aattaagtcg tcccgaccct gcccttgcag cgctgactaa tgatcacttg 2700   

gtcgcactcg cgtgcttagg aggcagacct gcccttgatg cagtgaaaaa gggtctgcca 2760   

catgctcccg ctctcatcaa aagaaccaat cgccgtattc ccgaacgcac ctcgcaccgt 2820   

gtggctggat cccagctggt gaagagcgag ctggaggaga agaagtccga gctgcggcac 2880   

aagctgaagt acgtgcccca cgagtacatc gagctgatcg agatcgccag gaacagcacc 2940   

caggaccgca tcctggagat gaaggtgatg gagttcttca tgaaggtgta cggctacagg 3000   

ggaaagcacc tgggcggaag cagaaagcct gacggcgcca tctatacagt gggcagcccc 3060   

atcgattacg gcgtgatcgt ggacacaaag gcctacagcg gcggctacaa tctgcctatc 3120   

ggccaggccg acgagatgca gagatacgtg aaggagaacc agacccggaa taagcacatc 3180   

aaccccaacg agtggtggaa ggtgtaccct agcagcgtga ccgagttcaa gttcctgttc 3240   

gtgagcggcc acttcaaggg caactacaag gcccagctga ccaggctgaa ccacaaaacc 3300   

aactgcaatg gcgccgtgct gagcgtggag gagctgctga tcggcggcga gatgatcaaa 3360   

gccggcaccc tgacactgga ggaggtgcgg cgcaagttca acaacggcga gatcaacttc 3420   

tgataa                                                            3426

 

<210>  8

<211>  3414

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  编码TALEN-R-B2核苷酸序列

<400>  8

atggactaca aagaccatga cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac   61   

gatgacaaga tggcccccaa gaagaagagg aaggtgggca tccacggggt acccatgatg  121   

tcgcgcacaa gattgccaag cccaccagca ccttcaccag cattctcagc gggttccttt  181   

tccgatttac tccgtcagtt cgacccgtcg ttattcaaca cttcgctttt tgatagtctg  241   

cctccattcg gtgctcacca tacagaagct gccactggag aatgggacga ggttcaaagt  301   

ggactgaggg cagcagatgc accaccacct accatgagag tggctgttac ggctgcaagg  361   

ccaccaagag ctaagccagc accaagaagg cgtgcagcac agccaagcga cgcttcccca  421   

gctgcacaag tggatctcag gaccttaggt tacagccaac agcaacagga aaaaatcaag  481   

ccaaaagtta gatccacagt cgcccagcac catgaggcat tggtgggaca cggctttact  541   

cacgcgcata ttgttgctct gtcacagcat ccggcagcgt tgggaaccgt cgctgtaaag  601   

tatcaagaca tgatagctgc cctccccgaa gccacacacg aggcaatcgt gggtgttgga  661   

aaacaatggt caggtgctag ggccttggaa gcgctgttga cagtggctgg cgagctcaga  721   

ggtccccctt tacaacttga taccggacag ctcttaaaga tagctaaacg cggtggagtc  781   

acggcagtag aagcggtgca cgcttggcgt aacgcgttaa caggagctcc cctgaatttg  841   

actcctgaac aggtggttgc aatcgcgtca aacggcggtg gaaagcaagc ccttgagacc  901   

gtacagcgcc ttctgccagt gttgtgccaa gcacacggcc tcacgccgca acaggtcgta  961   

gctattgcct ctaatggcgg tggaaaacaa gcgttagaaa cagttcagcg tttgctcccc 1021   

gtcttatgtc aagctcatgg tcttactcct cagcaagtgg ttgcaatcgc gagcattggt 1081   

ggaggaaagc aagccttgga gaccgtacag aggttacttc cagtgctgtg ccaagcacac 1141   

ggattgacgc cggaacaggt cgtagctata gcctccaacg gtggaggaaa acaagcgctc 1201   

gagacagttc agagactgtt gcccgtcctc tgtcaagcac atggcttaac accagagcaa 1261   

gttgtcgcaa tcgcgtcgaa tggtggcgga aagcaagccc tggagaccgt acaggcactc 1321   

ttaccagtgc tttgccaagc ccacggtctt actcctgagc aagttgtagc tattgccagt 1381   

aacggtggcg gaaaacaagc gttggagaca gttcaggctc ttctgcccgt cttgtgtcaa 1441   

gctcatggac tcacaccaga acaggtggtt gcaatagcgt caaatatcgg cggtaaacaa 1501   

gccctcgaga ccgtacaggc attgctccca gtgttatgcc aagctcacgg ccttactcct 1561   

gagcaagtgg ttgctattgc ctctaacata ggaggcaaac aagctctgga gacagttcag 1621   

cgcttacttc ccgtcctgtg tcaagcccat ggactgacac cagagcaagt tgtggcaatc 1681   

gcgagcaata ttggtggaaa gcaagcattg gagaccgtac agcgtctgtt gccagtgctc 1741   

tgccaggctc acggattaac tcctcagcaa gttgttgcta tagcctccaa caatggtggt 1801   

aaacaggccc tcgaaacagt tcagaggctc ttacccgtcc tttgtcaagc tcatggcctt 1861   

acacccgagc aggttgtcgc aatcgcgtca aactctggag gcaagcaagc gctggagacc 1921   

gtacaggctc ttctgccagt cttgtgccaa gctcacggtc tcactcctga gcaagtcgta 1981   

gctattgcct cgaataaggg tggaaaacaa gccttggaga cagtgcagag attgctcccc 2041   

gttttatgtc aagctcacgg acttacaccc gagcaggtcg ttgcaatagc gagtcatgat 2101   

ggtggtaaac aagccctgga gaccgtccag cgcttgttgc cagtgctgtg ccaagctcat 2161   

ggcctgactc ctgagcaggt cgtagctatc gcctcaaacg gaggcggtaa acaggctttg 2221   

gagacagttc agcgtttgct gcctgttctc tgtcaagctc acggtttaac acccgaacag 2281   

gtggttgcaa ttgcgtctaa caatggaggc aaacaggctc tggagaccgt gcagagactc 2341   

ttaccagttc tttgccaagc tcatggactg actcctcagc aagtcgtagc tatagcaagc 2401   

aatggtggag gaaggccagc actggaaaca gtccaacgtc ttctgcctgt gttgtgtcag 2461   

gctcacggcc tcactccaga acaagtggtt gcaattgcgt ccaacaatgg tggaaaacag 2521   

gcactggaga ccgttcagcg cttgctcccg gtcttatgcc aggctcacgg acttacgccc 2581   

cagcaagtgg tcgctattgc atcgaacgga ggtggaaggc ctgcactcga atcaatagtg 2641   

gcacaattat ctcgtcccga ccctgccctt gcagcgctga ctaatgatca cttggtcgca 2701   

ctcgcgtgct taggcggtag acctgccctt gatgcagtga aaaagggtct gccacatgct 2761   

cccgcactga taaaacgcac caaccgtcgt attcctgaac gcacctcaca tcgtgtcgca 2821   

ggatcccagc tggtgaagag cgagctggag gagaagaagt ccgagctgcg gcacaagctg 2881   

aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg ccaggaacag cacccaggac 2941   

cgcatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggaaag 3001   

cacctgggcg gaagcagaaa gcctgacggc gccatctata cagtgggcag ccccatcgat 3061   

tacggcgtga tcgtggacac aaaggcctac agcggcggct acaatctgcc tatcggccag 3121   

gccgacgaga tggagagata cgtggaggag aaccagaccc ggaataagca cctcaacccc 3181   

aacgagtggt ggaaggtgta ccctagcagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgagc 3241   

ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc 3301   

aatggcgccg tgctgagcgt ggaggagctg ctgatcggcg gcgagatgat caaagccggc 3361   

accctgacac tggaggaggt gcggcgcaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttc       3414

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  第三外显子上游检测引物B3-F364

<400>  9

tccaatttga gggcaatgct ac

 

<210>  10

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  第三外显子下游检测引物B3-R315

<400>  10

atttcaccac ctcattcaac taagat  26

 

<210>  11

<211>  674

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-1-01测序结果

<400>  11

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

aaccgcgaac ctgaacaaga cccttaatga atacaacgag atgtgtgagt ttttaactgg  420  

aaccatcaat tttttaatga atgtattgcc agcaaatgtg tcataataca aagcaacttg  480      

tgtttcagtt atcaaataat ttgataaaca ctgtggctag cttatgtgtc atttgttttt  540   

gtgaaggcat agaattgaaa taatccctca tatcaactat tgctataatc tctaaattgc  600      

attctgtcaa cgcctggcct attagaattt aggcctaact aacacaagat cttagttgaa  660     

tgaggtggtg aaat                                                    674

 

<210>  12

<211>  673

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-1-05测序结果

<400>  12

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agcgcgaacc tgaacaagac ccttaatgaa tacaacgaga tgtgtgagtt tttaactgga  420  

accatcaatt ttttaatgaa tgtattgcca gcaaatgtgt cataatacaa agcaacttgt  480      

gtttcagtta tcaaataatt tgataaacac tgtggctagc ttatgtgtca tttgtttttg  540  

tgaaggcata gaattgaaat aatccctcat atcaactatt gctataatct ctaaattgca  600      

ttctgtcaac gcctggccta ttagaattta ggcctaacta acacaagatc ttagttgaat  660     

gaggtggtga aat                                                     673

 

 

<210>  13

<211>  680

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bb-1-07测序结果

<400>  13

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agcagaagcc gcgaacctga acaagaccct taatgaatac aacgagatgt gtgagttttt  420 

aactggaacc atcaattttt taatgaatgt attgccagca aatgtgtcat aatacaaagc  480     

aacttgtgtt tcagttatca aataatttga taaacactgt ggctagctta tgtgtcattt  540 

gtttttgtga aggcatagaa ttgaaataat ccctcatatc aactattgct ataatctcta  600

aattgcattc tgtcaacgcc tggcctatta gaatttaggc ctaactaaca caagatctta  660     

gttgaatgag gtggtgaaat                                              680

 

 

<210>  14

<211>  678

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-02测序结果

<400>  14

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatgaaagg  360      

agctagccgc gaacctgaac aagaccctta atgaatacaa cgagatgtgt gagtttttaa  420  

ctggaaccat caatttttta atgaatgtat tgccagcaaa tgtgtcataa tacaaagcaa  480     

cttgtgtttc agttatcaaa taatttgata aacactgtgg ctagcttatg tgtcatttgt  540 

ttttgtgaag gcatagaatt gaaataatcc ctcatatcaa ctattgctat aatctctaaa  600

ttgcattctg tcaacgcctg gcctattaga atttaggcct aactaacaca agatcttagt  660     

tgaatgaggt ggtgaaat                                                678

 

<210>  15

<211>  673

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-04测序结果

<400>  15

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agccgcgaac ctgttaagac ccttattgaa tacaacgaga tgtgtgagtt tttaactgga  420   

accatcaatt ttttaatgaa tgtattgcca gcaaatgtgt cataatacaa agcaacttgt  480      

gtttcagtta tcaaataatt tgataaacac tgtggctagc ttatgtgtca tttgtttttg  540  

tgaaggcata gaattgaaat aatccctcat atcaactatt gctataatct ctaaattgca  600      

ttctgtcaac gcctggccta ttagaattta ggcctaacta acacaagatc ttagttgaat  660     

gaggtggtga aat                                                     673

 

 

<210>  16

<211>  669

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-06测序结果

<400>  16

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agcgcctgaa caagaccctt aatgaataca acgagatgtg tgagttttta actggaacca  420  

tcaatttttt aatgaatgta ttgccagcaa atgtgtcata atacaaagca acttgtgttt  480

cagttatcaa ataatttgat aaacactgtg gctagcttat gtgtcatttg tttttgtgaa  540 

ggcatagaat tgaaataatc cctcatatca actattgcta taatctctaa attgcattct  600

gtcaacgcct ggcctattag aatttaggcc taactaacac aagatcttag ttgaatgagg  660   

tggtgaaat                                                          669

 

 

<210>  17

<211>  669

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-09测序结果

<400>  17

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agcacctgaa caagaccctt aatgaataca acgagatgtg tgagttttta actggaacca  420  

tcaatttttt aatgaatgta ttgccagcaa atgtgtcata atacaaagca acttgtgttt  480

cagttatcaa ataatttgat aaacactgtg gctagcttat gtgtcatttg tttttgtgaa  540 

ggcatagaat tgaaataatc cctcatatca actattgcta taatctctaa attgcattct  600

gtcaacgcct ggcctattag aatttaggcc taactaacac aagatcttag ttgaatgagg  660   

tggtgaaat                                                          669

 

 

<210>  18

<211>  678

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-12测序结果

<400>  18

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360

agctagccgc gaacctgaac aagaccctta atgaatacaa cgagatgtgt gagtttttaa  420  

ctggaaccat caatttttta atgaatgtat tgccagcaaa tgtgtcataa tacaaagcaa  480     

cttgtgtttc agttatcaaa taatttgata aacactgtgg ctagcttatg tgtcatttgt  540 

ttttgtgaag gcatagaatt gaaataatcc ctcatatcaa ctattgctat aatctctaaa  600

ttgcattctg tcaacgcctg gcctattaga atttaggcct aactaacaca agatcttagt  660     

tgaatgaggt ggtgaaat                                                678

 

 

<210>  19

<211>  667

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-4-17测序结果

<400>  19

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   60    

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  120

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  180

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  240  

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  300 

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  360     

aacctgaaca agacccttaa tgaatacaac gagatgtgtg agtttttaac tggaaccatc  420 

aattttttaa tgaatgtatt gccagcaaat gtgtcataat acaaagcaac ttgtgtttca  480      

gttatcaaat aatttgataa acactgtggc tagcttatgt gtcatttgtt tttgtgaagg  540 

catagaattg aaataatccc tcatatcaac tattgctata atctctaaat tgcattctgt  600      

caacgcctgg cctattagaa tttaggccta actaacacaa gatcttagtt gaatgaggtg  660 

gtgaaat                                                            667

 

 

<210>  20

<211>  667

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Bc-21-11测序结果

<400>  20

tccaatttga gggcaatgct acaatattag aactgcacta ttaaaaataa tcgatttaat   61      

gaatgaaaga ttaataaatc tacagtttat ttcgaaataa atagtatcag atctttgttt  121 

tgtataaatt tttttatgaa tatctataac cagtttagag aaaatctgta agaataataa  181 

atccttaagc aaattgttgc aagggactga ttgttgtatc acaccaaggt acttaagacc  241    

cagagaatta ccagaaacaa gacccatatg gttatttcaa gtaaatattt gatacaggaa  301   

cactacatgc tgcttgagga gatcaacaga ctcgcgatca ccaagtacgc agatctaagg  361

agccgcgaac ctgaacaaga cccttaatga atacaacgag atgtgtgagt ttttaactgg  421  

aaccatcaat tttttaatga atgtattgcc agcaaatgtg tcataataca aagcaacttg  481      

tgtttcagtt atcaaataat ttgataaaca ctgtggctag cttatgtgtc atttgttttt  541   

gtgaaggcat agaattgaaa taatccctca tatcaactat tgctataatc tctaaattgc  601      

attctgtcaa cgcctggcct attagaattt aggcctaact aacacaagat cttagttgaa  661     

tgaggtggtg aaat                                                    674

 

 

<210>  21

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  第二外显子上游引物B2-F241

<400>  21

ttggtccagt aggtttgaag taggt

 

<210>  22

<211>  551

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx moriL.）

<220> 

<223>  家蚕突变体Be-21测序结果

<400>  22

ttggtccagt aggtttgaag taggtagtgt ttgaagggac aaagtatcag tataaacaga   60  

cagattcaaa acaaattgaa aggtttgata tagagtaaaa taatcataat attatttgaa  120      

accattcaca tacatcagta ttattatcta tagtatgaca gttttttttt tgcaaagctt  180   

caaatgtcac ccagctgttc gagtttcgaa gtcctggatc cacatgatcc tgtgatcagc  240   

cgcgaacctg aacaagaccc ttaatgaata caacgagatg tgtgagtttt taactggaac  300  

catcaatttt ttaatgaatg tattgccagt aaatgtgtca taatacaaag caacttgtgt  360

ttcagttatc aaataatttg ataaacactg tggctagctt atgcgtcatt tgtttttgtg  420 

agggcataaa attgaaataa tccctcatat caactattgc tataatctct aaattgcatt  480

ctgtcaacgc ctggcctatt aaaatttagg cctaactaac acaagatctt agttgaatga  540    

ggtggtgaaa t                                                       551

 

Claims (2)

1.基因组长片段删除系统，其特征在于：所述基因组长片段删除系统由特异剪切目的基因内2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成；所述2个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’端的第二靶序列；所述2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B2和TALEN-B3组成，所述TALEN-B2特异剪切所述第一靶序列，所述TALEN-B3特异剪切第二靶序列；

所述目的基因为家蚕油蚕基因BmBlos2；

所述第一靶序列如SEQ ID NO.6所示核苷酸，所述第二靶序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸；

所述TALEN-B2由SEQ ID NO.7所示和SEQ ID NO.8所示核苷酸分别编码的蛋白质组成；所述TALEN-B3由SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示核苷酸分别编码的蛋白质组成。

2.权利要求1所述基因组长片段删除系统在家蚕细胞中删除家蚕油蚕基因BmBlos2核酸序列的应用。

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