CN101358196A - 利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 - Google Patents
利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101358196A CN101358196A CNA2008101204778A CN200810120477A CN101358196A CN 101358196 A CN101358196 A CN 101358196A CN A2008101204778 A CNA2008101204778 A CN A2008101204778A CN 200810120477 A CN200810120477 A CN 200810120477A CN 101358196 A CN101358196 A CN 101358196A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polya
- puc19
- silkworm
- silkgland
- recombinant plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101710124870 Fibroin light chain Proteins 0.000 claims description 41
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 17
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 abstract 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710152529 Fibrohexamerin Proteins 0.000 description 1
- 101710197767 Fibroin heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 108050002220 Green fluorescent protein, GFP Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000080 chela (arthropods) Anatomy 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003161 proteinsynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19－FL－GFP－PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19－FL－GFP－PolyA重组质粒或pUC19－FL－PolyA质粒或插有外源基因的pUC19－FL－PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。本发明的有益之处在于：本发明是在25℃～29℃条件下表达蛋白，低温(常规是在37℃)条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成，利于蛋白的分离纯化。同时，本发明所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内合成蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用了家蚕后部丝腺体外表达系统。
背景技术
目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等表达系统(下文中往往称为“细胞系统”)作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于其功能保留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白质的表达阻止了细胞生长而存在许多不能被容易表达的蛋白质。而体外表达系统相对而言没有上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不伤害生物体的情况下合成蛋白质。另外由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统相比，可在短时间内合成蛋白质。此外，由于体外表达系统还用来大规模生产由不被生物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方法。
家蚕(Bombyx mori)是一种具有强大泌丝能力的昆虫。蚕丝蛋白由丝素(fibroin，Fib)和丝胶(sericin，Ser)组成。丝素由重链(heavy chain，fib-H)、轻链(light chain，fib-L)和FhxPP25(fibrohexamerin)以摩尔比6∶6∶1组成。形成茧层的丝蛋白主要在家蚕幼虫5龄中、后期合成。在短短的4～5天内，后部丝腺每个细胞合成丝素约300μg，亦即2条后部丝腺(大约1000多个细胞)每小时合成丝素2mg左右，平均每秒钟合成6×108丝素分子，比肝细胞合成血清白蛋白快60倍以上。如此高的蛋白合成强度，在其他动物细胞内是罕见的。因此，丝蛋白基因启动子是具有较强时空特异性和强大启动能力的天然启动子。家蚕丝素蛋白轻链基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。可以利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法。
本发明的一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。
所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括：
(1)取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75％乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置于0.9％的生理盐水或PBS中，取后部丝腺，-80～-60℃保存；
(2)取以上保存的后部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上匀浆；取匀浆液于1.5ml EP管中，2℃～6℃，10000～14000rpm离心10～15min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕后部丝腺组织提取液。
所述pUC19-FL-PolyA质粒的制备方法包括：
(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL；
L-1：5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′；
L-2：5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′；
(2)以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L polyA(1)，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-PolyA；
L-3：5′-gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3′；
L-4：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′。
所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括：
(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL；
L-1：5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′；
L-2：5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′；
(2)以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-LpolyA(2)；
L-5：5′-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3′；
L-6：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′；
(3)，以质粒pEGFP-N1为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列；
L-7：5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′；
L-8：5′-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3′；
(4)以fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列的片段，即GFP-PolyA，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA，
L-6：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′；
L-7：5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′。
本发明的有益之处在于：本发明是在25℃～29℃条件下表达蛋白，低温(常规是在37℃)条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成，利于蛋白的分离纯化。同时，本发明所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内合成蛋白质。
附图说明
图1、本发明的实施例的重组质粒pUC19-FL-PolyA；
图2、本发明的实施例的重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA；
图3、本发明的实施例的检测蛋白表达的电泳图；
图中：M，标准分子量蛋白；1，0小时取样；2，3小时取样；3，6小时取样；4，12小时取样；5，18小时取样。
具体实施方式
本发明选取四龄或五龄时期的家蚕，解剖获得家蚕后部丝腺后，置于匀浆器中，加入适量生理盐水或PBS，冰上匀浆，离心获得上清液，即为家蚕后部丝腺提取液。将家蚕后部丝腺提取液在25℃～29℃水浴中孵育，分0，3h，6h，12h，18h，24h取样，用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定此系统是否具有合成蛋白的能力。
重组质粒的构建：
1、重组质粒pUC19-FL-PolyA
以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列(约605bp)，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19(promega公司)中，获得重组质粒pUC19-FL。同样以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L的polyA加尾信号(约286bp)，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-PolyA(图1)。
2、重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA
以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-L的polyA加尾信号序列(约286bp)，即fib-L polyA(2)；以质粒pEGFP-N1(Genbank U55762)为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列(约720bp)。随后以fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列(GenbankM76430和Genbank U55762)为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列的融合序列GFP-PolyA，GFP-PolyA经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA(图2)。
利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白。反应体系：在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-PolyA重组质粒或pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒或pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒，加入蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，分0，3h，6h，12h，18h，24h取样。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达。
实施例
一、家蚕丝腺的准备
取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75％乙醇中麻醉30秒后取出，用大头针固定家蚕头部和尾部于腊盘上，腹面朝上，用解剖剪刀将其腹部剪开，把皮肤左右展开，用大头针固定。用解剖摄铗住直肠，一面向头部方向提起，一面剪断攀着的气管和肌肉。除掉消化管后，这样左右两部的丝腺就露出来了，用镊子将丝腺取出，置于0.9％的生理盐水或PBS中。随后用剪刀将前中部丝腺和后部丝腺分开。-70℃保存备用。
二、家蚕后部丝腺提取液的制备
取10条蚕的后部丝腺，置于匀浆器中，加入1ml生理盐水或PBS，冰上匀浆；吸取匀浆液于1.5ml EP管中，4℃，12000rpm离心10min，取上清，重复三次；吸取上清至新的1.5ml EP管中，用500ul管子分装，每管50ul，即为家蚕后部丝腺提取液，即用或存放于液氮中。
三、家蚕后部丝腺基因组DNA的提取
从8条5龄幼蚕中取出后部丝腺，加液氮捣碎，加2mL上述所得的家蚕后部丝腺提取液(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH8.0)，1％SDS，500mmol/L NaCl)，混匀后加蛋白酶K(promega)(使终浓度达250ug/mL)，50℃静置12～24h，加入等体积的酚，缓慢地来回颠倒10min，离心，取上清液，加RNA酶(sigma)，于37℃静置30min；先后加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶异戊醇各抽提1次，取上清液加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，用细玻璃棒小心缠绕出DNA，70％乙醇洗1次，37℃干燥后，溶于TE缓冲液中。
四、重组质粒的构建
参照GenBank中已公开的家蚕fib-L全序列(Genbank：M76430)，合成克隆启动子序列用的一对引物：
L-1(5′- CCGGAATTCCGACTCGCCAAGTTACGTC-3′，下划线表示EcoR I位点)
L-2(5′-GGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGTGGTCTGTTATGTGACC-3′，含BamHI位点)；合成克隆fib-L polyA加尾信号序列用的两对PCR引物：
L-3(5′-GCGGTCGACCTGCAGGCATGCCAAATTGTGTTTGCGTTAGG-3′，含SalI位点)
L-4(5′-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3′，含HindIII位点)
L-5(5′-GAGCTGTACAAGTAACAAATTGTGTTTGCG-3′)
L-6(5′-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3′，含HindIII位点)。
参照质粒pEGFP-N1(Genbank U55762)序列，合成克隆绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)报告基因用的一对PCR引物：
L-7(5′-CCGGTCGACCTGCAGGCATGCATGGTGAGCAAGGGC-3′，含SalI位点)
L-8(5′-CGCAAACACAATTTGTTACTTGTACAGCTC-3′)。
1、fib-L启动子序列的扩增
以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
L-1 1μl
L-2 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl
加无菌双蒸水至100μl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
2、fib-L的polyA加尾信号序列(1)的扩增
以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
L-3 1μl
L-4 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl
加无菌双蒸水至100μl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段，获得fib-L polyA(1)。
3、fib-L的polyA加尾信号序列(2)的扩增
以家蚕基因组DNA(Genbank M76430)为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
L-5 1μl
L-6 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl
加无菌双蒸水至100μl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。该目的片段可作为模板fib-L polyA(2)用于后续实验。
4、GFP报告基因序列的扩增
以质粒pEGFP-N1(Genbank U55762)为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
L-7 1μl
L-8 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本) 1μl
加无菌双蒸水至100μl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。该目的片段可作为模板GFP用于后续实验。
5、fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列的融合，构建GFP-PolyA
PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
L-7 1μl
L-6 1μl
模板fib-L polyA(2) 1μl
模板GFP(获自前面步骤4) 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本) 1μl
加无菌双蒸水至100μl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段。
因为GFP报告基因的下游引物L-8设计时加入了fib-L的polyA(2)加尾信号序列5’端的部分序列，所以PCR扩增出的GFP报告基因的3’端序列与fib-L的polyA加尾信号序列5’端序列存在重叠，fib-L的polyA加尾信号序列的下游引物L-5设计时加入了GFP报告基因5’端的部分序列，所以PCR扩增出的fib-L的polyA加尾信号序列的3’端序列与GFP报告基因的5’端序列存在重叠，利用PCR方法就可以扩增出fib-L的polyA加尾信号序列和GFP报告基因的融合序列，构建得GFP-PolyA。
6、重组质粒pUC19-FL的构建
将步骤1中PCR扩增出的fib-L启动子序列片段连接到质粒pUC19(TAKARA，宝生物)上。先分别对fib-L启动子序列片段和质粒pUC19进行EcoRI、BamHI双酶切，37℃反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。
在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分：
fib-L启动子序列片段 2μl
质粒pUC19 0.5μl
2×Rapid Ligation buffer 5μl
T4 DNA ligase(购自promage公司) 1μl
加无菌双蒸水至10μl，混匀。25℃反应1h后，反应混合物转化至感受态细胞E.coli DH5α中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。
7、重组质粒pUC19-FL-PolyA的构建
分别对fib-L polyA(1)和质粒pUC19-FL进行SalI、HindIII双酶切，37℃反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。
将PCR扩增出的polyA加尾信号序列连接到质粒pUC19-FL上。
在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分：
fib-L polyA(1) 2μl
质粒pUC19-FL 0.5μl
2×Rapid Ligation buffer 5μl
T4 DNA ligase(购自promage公司) 1μl
加无菌双蒸水至10μl，混匀。25℃反应1h后，反应混合物转化至感受态细胞E.coli DH5α中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。
8、重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA的构建
将PCR扩增出的融合片段GFP-PolyA连接到质粒pUC19-FL上。分别对质粒pUC19-FL和融合片段GFP-PolyA进行SalI、HindIII双酶切，37℃反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。
在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分：
融合片段GFP-PolyA 2μl
质粒pUC19-FL 0.5μl
2×Rapid Ligation buffer 5μl
T4DNA ligase(购自promage公司) 1μl
加无菌双蒸水至10μl，混匀。25℃反应1h后，反应混合物转化至感受态细胞E.coli DH5α中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。
9、外源基因插入载体pUC19-FL-PolyA或pUC19-FL-GFP-PolyA
将目的基因扩增出来，同时在目的基因的两端加入酶切位点(BamHI、XbaI、SalI三者任选两个)，再同时对目的基因和载体(pUC19-FL-PolyA或pUC19-FL-GFP-PolyA)进行双酶切，回收酶切产物，在T4连接酶的作用下即可将目的基因连接到载体中。
五、利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法
在装有50ul家蚕后部丝腺组织提取液的离心管中加入约1ng pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒(或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插入外源基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒)及蛋白酶抑制剂，25℃-29℃水浴，分0，3h，6h，12h，18h，24h取样检测蛋白的表达。见图3，3小时就有蛋白表达，6小时最佳，18小时后蛋白表达明显降低，有可能是表达的蛋白降解。
六、表达产物的检测
电泳法(见《分子克隆》)检测蛋白的表达。电泳结束后，在荧光显微镜下观察，在488nm激发波长下观察绿色荧光蛋白GFP的表达。如果所用的载体为带有外源目的基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒，则采用考染法观测目的蛋白的表达。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
28 ccggaattcc gactcgccaa gttacgtc
SEQ ID NO 2：
42 ggcggatccc cgggtaccga gctcgtggtc tgttatgtga cc
SEQ ID NO 3：
41 gcggtcgacc tgcaggcatg ccaaattgtg tttgcgttag g
SEQ ID NO 4：
28 gccaagcttc actgtccaat ccaccgtc
SEQ ID NO 5：
30 gagctgtaca agtaacaaat tgtgtttgcg
SEQ ID NO 6：
28 gccaagcttc actgtccaat ccaccgtc
SEQ ID NO 7：
36 ccggtcgacc tgcaggcatg catggtgagc aagggc
SEQ ID NO 8：
30 cgcaaacaca atttgttact tgtacagctc
Claims (4)
1、一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于：在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。
2、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括：
(1)取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75％乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置于0.9％的生理盐水或PBS中，取后部丝腺，-80～-60℃保存；
(2)取以上保存的后部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上匀浆；取匀浆液于1.5ml EP管中，2℃～6℃，10000～14000rpm离心10～15min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕后部丝腺组织提取液。
3、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-FL-PolyA质粒的制备方法包括：
(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL；
L-1：5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′；
L-2：5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′；
(2)以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L polyA(1)，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-PolyA；
L-3：5′-gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3′；
L-4：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′。
4、根据权利要求1所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括：
(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoR I和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL；
L-1：5′-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3′；
L-2：5′-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3′；
(2)以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-L polyA(2)；
L-5：5′-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3′；
L-6：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′；
(3)，以质粒pEGFP-N1为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列；
L-7：5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′；
L-8：5′-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3′；
(4)以fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-L polyA(2)和GFP报告基因序列的片段，即GFP-PolyA，经SalI和HindIII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA，
L-6：5′-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3′；
L-7：5′-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3′。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008101204778A CN101358196A (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2008101204778A CN101358196A (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101358196A true CN101358196A (zh) | 2009-02-04 |
Family
ID=40330794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2008101204778A Pending CN101358196A (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101358196A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| CN104846011A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-08-19 | 浙江大学 | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 |
| US9416164B2 (en) | 2012-03-19 | 2016-08-16 | Richter Gedeon Nyrt. | Method for the production of polypeptides |
| CN117092084A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-11-21 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | Wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法 |
-
2008
- 2008-08-29 CN CNA2008101204778A patent/CN101358196A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| CN102187845B (zh) * | 2010-03-05 | 2013-06-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| US9416164B2 (en) | 2012-03-19 | 2016-08-16 | Richter Gedeon Nyrt. | Method for the production of polypeptides |
| CN104846011A (zh) * | 2015-03-18 | 2015-08-19 | 浙江大学 | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 |
| CN117092084A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-11-21 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | Wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法 |
| CN117092084B (zh) * | 2023-10-20 | 2024-01-12 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | Wnv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016155482A1 (zh) | 一种利用非遗传物质对植物基因组进行定点改造的方法 | |
| JP5888983B2 (ja) | 小麦グリアジンの配列を含むポリヌクレオチドおよびＲＮＡｉによるサイレンシングのためのその使用 | |
| FR2631238A1 (fr) | Baculovirus recombinant, procede de production de la proteine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise a l'aide dudit virus, et cette proteine | |
| TW201202422A (en) | Strategies for the transgenic manipulation of filamentous fungi | |
| WO2019024379A1 (zh) | 新型融合蛋白的制备及其在提高蛋白质合成的应用 | |
| CN111088255A (zh) | 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的ras对立物(rop)及相关核酸分子 | |
| CN111575319B (zh) | 一种高效的crispr rnp和供体dna共位介导的基因插入或替换方法及其应用 | |
| CN101358196A (zh) | 利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 | |
| CN101798575A (zh) | 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 | |
| CN101423842A (zh) | 利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 | |
| CN113151300B (zh) | Camta3基因及其在植物中的应用 | |
| CN105939599B (zh) | 使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达 | |
| CN114989268A (zh) | 一种植物病毒移动蛋白及其应用 | |
| JPH10502521A (ja) | 植物アラビノガラクタン蛋白質（ａｇｐ）遺伝子 | |
| CN112813092B (zh) | GbBCCP5蛋白质及其编码基因在调控生物油脂含量中的应用 | |
| CN111793645B (zh) | 一种家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用 | |
| WO2021121321A1 (zh) | 一种提高基因编辑效率的融合蛋白及其应用 | |
| CN101423845B (zh) | 利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法 | |
| CN107226856B (zh) | 从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途 | |
| CN112980842B (zh) | 一种非编码的核苷酸序列及其在提高外源基因表达水平的应用 | |
| CN110564634A (zh) | 一株胞外分泌表达桦褐孔菌二肽酶的工程菌 | |
| WO2016190386A1 (ja) | 転写制御因子の強化により取り出しやすい形でセルロースを効率よく産生する植物を生産する方法 | |
| JP2005013164A (ja) | 植物ウイルスベクター | |
| CN101358205B (zh) | 利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法 | |
| CN105177037B (zh) | 利用双油体蛋白融合技术表达胶原蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090204 |