CN101798575A - 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 - Google Patents
一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101798575A CN101798575A CN200910216633A CN200910216633A CN101798575A CN 101798575 A CN101798575 A CN 101798575A CN 200910216633 A CN200910216633 A CN 200910216633A CN 200910216633 A CN200910216633 A CN 200910216633A CN 101798575 A CN101798575 A CN 101798575A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gln
- gly
- wheat
- centrifugal
- pro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白。小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因序列如SEQ ID NO：1所示，小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因所表达的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在遗传背景相似的条件下，具有本发明5’亚基(1Dx5’基因编码)的小麦在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉加工品质主要指标上都明显优于具有5亚基的小麦。因此，我们认为小麦高分子量麦谷蛋白新亚基5’对小麦面粉的加工品质的贡献优于亚基5，其编码基因1Dx5’在小麦品种的加工品质改良方面具有重要的利用价值和开发潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白。
背景技术
小麦是世界第一大粮食作物，而小麦高分子量谷蛋白亚基是直接影响小麦品质的重要因子。小麦高分子量谷蛋白亚基(High-Molecular-Weight-Glutenin Subunit，HMW-GS)的类型和数量直接关系到面筋的弹性和强度，对面粉的烘烤品质具有重要作用。Payne等(1984)发现仅占全部谷蛋白10％的HMW-GS就决定了面包烘烤品质的43％，而与蛋白总量一起则共同决定了面包加工品质变异的68％左右。小麦基因组中编码HMW-GS的Glu-1复合基因位点(Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1)及其不同等位基因编码的HMW-GS对烘烤品质的贡献大小不同，其中以5+10亚基组合对面包烘烤品质贡献最大，具有决定性作用，因此5亚基被认为是优质亚基。
但是，我国目前小麦面粉的烘烤品质普遍较差，这与我国品种缺少优质的HMW-GS有关，因此创造与发掘新的优质谷蛋白亚基编码基因，并开展相关生化、农学、分子生物学等方面研究、探讨优质的分子机理，对于培育优质小麦新品种具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种小麦优质高分子量麦谷蛋白业基基因及其表达的蛋白，具有该基因的小麦能够提高其面粉的烘烤品质，在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉烘烤加工品质主要指标上都具有明显的提高。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种具有SEQID NO：1所示核酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因。
本发明的从小麦品系W958中克隆一个高分子量麦谷蛋白亚基新基因1Dx5’，该基因编码亚基5’，全长为2505bp(含有1个终止密码子)，该基因长度比1Dx5(长度为2520bp)要小18bp，同时比1Dx2(长度为2517bp)要小15bp。研究表明，该基因编码的蛋白具有833个氨基酸，分子量为774.8KDa。蛋白的1-21氨基酸为信号肽区域，N-端为含有88个氨基酸残基非重复区，686个氨基酸残基的高度重复的中央区，C-端为含有1个Cys(半胱氨酸)的42个氨基酸残基非重复区。中央区含有x-型、y-型亚基所具有的重复结构，有22个六肽PGQGQQ，有3个GYYPTS/PLQQ九肽。W958是我们培育的种间远缘杂交(四倍体硬粒小麦T.durum Desf.×六倍体普通小麦T.aestivum L)优良品系，该品系在1D染色体上具有父母本没有的新型亚基，由于此亚基在SDS-PAGE电泳中具有和5亚基一样的电泳迁移率，因此我们将该亚基命名为5’亚基，将其编码基因命名为1Dx5’。
一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因所表达的蛋白。与1Dx2编码的蛋白相比，本蛋白在80位氨基酸残基处为脯氨酸，346位氨基酸为精氨酸，394位氨基酸为谷氨酸，451位氨基酸为精氨酸，而在673位则与1Dx5编码的蛋白相同，比1Dx2编码的蛋白少6个氨基酸。SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳)结果表明：1Dx5’编码的蛋白亚基5’电泳迁移率与1Dx5编码的亚基5相似，与1Dx2编码的亚基2有显著差别。同时，蛋白飞行时间质谱(MOLDI-TOLF)结果表明：该成熟蛋白的准确分子量为86815Da，明显小于1Dx5(87188Da)和1Dx2(87023Da)。这与蛋白序列的推导结果相似。
一种具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，包括下述步骤：
1.种子基因组DNA提取。
a.干种子30mg(取胚乳部分)，研成粉沫，转入2ml离心管中。
b.加入200μl提取缓冲液(200mM Tris-HCl pH7.5，2.88M NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)浸泡30min。
c.加入600μl提取缓冲液，剧烈震荡1min，4℃ 12000rpm离心10min，取上清液至新管。
d.加入等体积预冷的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(Tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1)，混匀，4℃ 12000rpm离心10min，小心将上清转入新管。
e.加入等体积预冷氯仿/异戊醇(氯仿、异戊醇的体积比为24∶1)，混匀，4℃ 12000rpm离心10min，上清至新管。
f.向上清液中加入600μl预冷的异丙醇，轻轻颠倒几次，-20℃沉淀30min，4℃ 10000rpm离心，弃上清。
g.用500μl 70％的乙醇清洗DNA沉淀，4℃ 8000rpm离心5min，重复一次。
h.沉淀放超净工作台中室温干燥。
i.加入50μl灭菌ddH2O，4℃溶解12h。
j.1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。
2.PCR扩增
(1)引物设计
HMW-GS的N-端和C-端序列高度保守，根据已知1Dx-型基因(Halford等，1987；Mackie等，1996)的序列，运用Primer Premier5.0软件自行设计了特异性引物：DX-1和DX-2，用于扩增1Dx亚基编码基因的序列，从起始密码子ATG开始，至下游15个碱基处结束。引物序列如下：
DX-1：5′-ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3′
DX-2：5′-GCTGCAGAGAGTTCTATC-3′
(2)PCR反应
a.反应体系为100μl：
TaKaRa LA Taq(5U/ul) 1μl
2×GC Buffer II 50μl
dNTP混合物(各2.5mM) 16μl
DX-1(20uM) 2μl
DX-2(20uM) 2μl
DNA模板(100ng) 8μl
ddH2O 21μl
Total 100μl
b.反应条件：
94℃预变性2分钟；94℃变性45秒，59℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
1％琼脂糖胶检测PCR产物，1kb DNA Ladder Markers为鼎国生物公司生产。
(3)PCR产物的回收纯化
琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带，用TaKaRa公司的DNA凝胶回收试剂盒Ver 2.0进行回收，步骤如下：
a.凝胶切碎放入2ml离心管，称重，以1mg＝1μl计算，加入3倍胶块体积量的胶块融化液DR-I buffer，75℃加热10min，加1/2体积的DR-II buffer，混匀。
b.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，溶液转至Spin Column中，3600rpm离心1min，弃滤液。
c.加入500μl的Rinse A至Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃滤液。
d.加入700μl的Rinse B至Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃滤液，重复1次。
e.12000rpm再离心1min。
f.将Spin Column置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央加入25μl的灭菌ddH2O，60℃加热1min，12000rpm离心1min，即得到回收产物，可立即使用或于-20℃保存。
3.PCR产物的克隆
(1)连接反应
回收的PCR产物与pGEM-T Easy vector(Promega)4℃连接，反应体系如下：
2×rapid ligation buffer 5.0μl
pGEM-T Eesy Vector 0.5μl
T4 DNA Ligase 1.0μl
PCR回收产物 3.5μl
Total 10μl
(2)感受态细胞的制备与大肠杆菌的转化
a.划板复壮宿主菌DH-5α。
b.挑取1个生长良好的单菌落(直径2-3mm)至含有30ml LB液体养基的锥形瓶中，37℃ 200rpm振荡培养过夜。
c.取500μl菌液接种50ml LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600＝0.3-0.4。
d.菌液转入无菌一次性使用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min。
e.4℃ 4100rpm离心10min，收集细胞。
f.弃上清，用10ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置10min，4℃ 4100rpm离心10min，重复此步骤一次。
g.用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮细胞，加入灭菌甘油至终浓度30％，分装后放至0℃备用或存于-70℃。
h.加5μl连接产物至200μl的感受态细胞中，轻弹管壁混匀内含物，冰上放置30min。
i.42℃热激90秒，立即插入冰中冷却2min。
j.加入800μl 37℃预热的LB液体培养基，37260℃rpm，摇培45分钟。
k.3600rpm离心30秒，吸掉800μl上清，剩下的吹散细胞，均匀的铺于涂有IPTG，X-Gal和Amp 80μg/ml LB平板，37℃倒置培养12-16小时，置4℃冰箱中显色4-6小时。
(3)质粒的小量提取
用于酶切验证或PCR检测
a.挑取单菌落于10ml LB+(Amp 80μg/ml)液体培养基，37℃培养过夜。
b.取1.5ml菌液至的2ml离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体，重复一次。
c.加100μl冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA pH8.0)，震荡，充分悬浮菌液，室温放置5分钟。
d.加新鲜配制的200μl的溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)，上下颠倒不超过5次，冰上放置5分钟。
e.加150μl冰预冷的溶液III(60ml 5M乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml ddH2O)
上下颠倒不超过5次，冰上放置，直至形成紧实的团块，12000rpm离心10分钟，上清移至新离心管。
f.加等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，上清移至新离心管。
g.加2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时，12000rpm离心10分钟。
h.用75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复一次。
i.吹干，溶于50μl灭菌ddH2O(含0.02mg/ml RNase)中，做电泳检测。
(4)重组质粒PCR和酶切鉴定
a.按3.2PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定。
b.酶切鉴定体系如下：
EcoR I 1μl
10×H Buffer 2μl
重组质粒 5μl
灭菌水 12μl
Total 20μl
37℃酶切4小时，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测，限制性内切酶EcoRI购自大连宝生物工程公司(TaKaRa)。
(5)序列测定与拼接
以上经鉴定的质粒，以SP6和T7为引物，由TaKaRa公司进行DNA序列测定和拼接。
综上，本发明的有益效果是：在遗传背景相似的条件下，具有本发明5’亚基(由1Dx5’基因编码)的小麦在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉加工品质主要指标上部明显优于具有5亚基的小麦。因此，我们认为小麦高分子量麦谷蛋白新亚基5’对小麦面粉的加工品质的贡献优于亚基5，其编码基因1Dx5’在小麦品种的加工品质改良方面具有重要的利用价值和开发潜力。
具体实施方式
实施例1：
具有基因1Dx 5’(编码亚基5’)的小麦W958与具有基因1Dx 5(编码亚基5)的小麦W168相比，W958湿面筋含量为39.3％，W168湿面筋含量为26.1％，具有基因1Dx 5’的小麦W958比具有基因1Dx5的小麦W168的湿面筋含量提高了50.6％。
实施例2：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦品种川麦107相比，W958湿面筋含量为39.6％，川麦107湿面筋含量为31.2％，具有基因1Dx 5’的小麦W958比具有基因1Dx 5的小麦川麦107的湿面筋含量提高了26.9％。
实施例3：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦W168相比，W958的Zeleny沉降值为40.5ml，W168的Zeleny沉降值为27.4ml，前者提高了47.8％。
实施例4：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦W7相比，W958的Zeleny沉降值为40.2ml，W7的Zeleny沉降值为30.1ml，前者提高了33.6％。
实施例5：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦W168相比，W958粉质仪面团形成时间为5分钟，W168面团形成时间为1.5分钟，前者形成时间比后者长3.5分钟。
实施例6：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦W168相比，W958粉质仪面团稳定时间为4分钟，W168面团稳定时间为1分钟，前者稳定时间比后者长3分钟。
实施例7：
具有基因1Dx 5’的小麦W958与具有基因1Dx 5的小麦川麦107相比，W958粉质仪面团稳定时间为4.5分钟，川麦1078面团稳定时间为2分钟，前者稳定时间比后者长2.5分钟。
序列表
<110>中国科学院成都生物研究所
<120>一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白
<130>一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2505
<212>DNA
<213>小麦
<400>1
atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg gtagtcgtcg ccctcgtggc tctcaccgtc 60
gctgaaggtg aggcctctga gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gctccaggag 120
cgcgagctca aggcatgcca gcaggtcatg gaccagcagc tccgagacat tagccccgag 180
tgccaccccg tcgtcgtcag cccggtcgcg ggacaatacg agcagcaaat cgtggtgccg 240
cccaagggcg gatctttcta ccccggcgag accacgccac cgcagcaact ccaacaacgt 300
atattttggg gaatacctgc actactaaaa aggtattacc caagtgtaac ttctccgcag 360
caggtttcat actatccagg ccaagcttct ccgcaacggc caggacaagg tcagcagcca 420
ggacaagggc aacaatcagg acaaggacaa caagggtact acccaacttc tccgcaacag 480
ccaggacaat ggcaacaacc ggaacaaggg caaccagggt actacccaac ttctccgcag 540
cagccaggac aattgcaaca accagcacaa gggcagcaac caggacaagg acaacaaggt 600
cggcagccag gacaagggca accagggtac tacccaactt cttcgcagct gcagccagga 660
caattgcaac aaccagcaca agggcaacaa gggcagcaac caggacaagg gcaacaaggt 720
caacagccag gacaagggca acaaccagga caaggacaac aaggtcaaca gccaggacaa 780
gggcaacaac caggacaagg gcaacaaggt cagcagctcg gacaaggaca acaagggtac 840
tacccaactt ctctgcaaca gtcgggacaa gggcaaccag ggtactaccc aacttctctg 900
cagcagctag gacaagggca atcagggtac tacccaactt ctccgcagca accaggacaa 960
gggcagcagc caggacaatt gcaacaacca gcacaagggc agcaaccaga acaagggcaa 1020
caaggtcagc agccacgaca agggcaacaa ggccagcagc caggacaagg gcagcaaccg 1080
ggacaagggc aaccagggta ctacccaact tctccgcagc agtcaggaca agggcaacca 1140
gggtactacc caacttcttc gcagcagcca acacaatcgc agcaaccaga acaagggcaa 1200
caaggtcagc aggtaggaca agggcaacaa gctcagcagc caggacaggg gcagcaaccg 1260
ggacaagggc agccagggta ctacccaact tctccgctgc agtcaggaca agggcaacca 1320
gggtactacc taacttctcc gcagcagtca ggacgagggc agcagccagg acaattgcaa 1380
caatcagcac aagggcaaaa aggacagcaa ccaggacaag gtcaacagcc agggcaaggg 1440
caacaaggtc agcagccagg acaagggcaa caaggtcagc aaccggggca agggcagcca 1500
gggtactacc caacttctcc gcagcaatca ggacaagggc aacagccagg acaatggcaa 1560
caaccaggac aagggcaacc aggatactac ccaacttctc cgttgcagcc aggacaaggg 1620
caaccagggt acgacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcagca accaggacaa 1680
ttgcaacaac cagcacaagg gcaacaaggg cagcaactag cacaagggca acaagggcag 1740
caaccagcac aagtgcaaca agggcagcag ccagcacaag ggcaacaagg tcagcagcta 1800
ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga caagggcagc aaccagcaca agggcaacaa 1860
ggtcagcagc caggacaagg gcaacaaggt cagcagccag gacaagggca gcaaccggga 1920
caagggcagc catggtacta cccaacttct ccgcaacagc caggacaatg gcaacaacca 1980
ggacaatggc aacaaccagg acaagggcaa ccagggtact acctaacttc tccgttgcag 2040
ctaggacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctctgc aacaaccagg acaagggcag 2100
caaccaggac aatggcaaca atcgggacaa gggcaacatg ggtactaccc aacttctccg 2160
cagctgtcag gacaagggca acggccagga caatggctgc aaccaggaca agggcaacaa 2220
gggtactacc caacttctcc gcaacagtca ggacaagggc aacaactagg acaatggctg 2280
caaccaggac aagggcaaca agggtactac ccaacttctc tgcaacagac aggacaaggg 2340
cagcaatcag gacaagggca acaaggctac tacagctcat accatgttag cgtggagcac 2400
caggcggcca gcctaaaggt ggcaaaggcg cagcagctcg cggcacagct gccggcaatg 2460
tgccggctgg agggcggcga cgcattgtcg gccagccagt gatag 2505
<210>2
<211>833
<212>PRT
<213>小麦
<400>2
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Val Val Ala Leu Val
1 5 10 15
Ala Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu
20 25 30
Arg Glu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Gln Gln
35 40 45
Val Met Asp Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Pro Glu Cys His Pro Val
50 55 60
Val Val Ser Pro Val Ala Gly Gln Tyr Glu Gln Gln Ile Val Val Pro
65 70 75 80
Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr Thr Pro Pro Gln Gln
85 90 95
Leu Gln Gln Arg Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys Arg Tyr
100 105 110
Tyr Pro Ser Val Thr Ser Pro Gln Gln Val Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln
115 120 125
Ala Ser Pro Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro
165 170 175
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln
180 185 190
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Arg Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro
195 200 205
Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Gln Leu Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln
210 215 220
Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly
225 230 235 240
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln
260 265 270
Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Ser
275 280 285
Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Leu Gly
290 295 300
Gln Gly Gln Ser Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln
305 310 315 320
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Pro
325 330 335
Glu Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Arg Gln Gly Gln Gln Gly Gln
340 345 350
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr
355 360 365
Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro
370 375 380
Thr Ser Ser Gln Gln Pro Thr Gln Ser Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln
385 390 395 400
Gln Gly Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln
405 410 415
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro
420 425 430
Leu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Gln
435 440 445
Gln Ser Gly Arg Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Ser Ala Gln
450 455 460
Gly Gln Lys Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly
465 470 475 480
Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly
485 490 495
Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln
500 505 510
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly
515 520 525
Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr
530 535 540
Asp Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln
545 550 555 560
Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Ala Gln Gly
565 570 575
Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Val Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala
580 585 590
Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln
595 600 605
Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro
610 615 620
Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly
625 630 635 640
Gln Gly Gln Pro Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln
645 650 655
Trp Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly
660 665 670
Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Leu Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr
675 680 685
Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln
690 695 700
Trp Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln His Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro
705 710 715 720
Gln Leu Ser Gly Gln Gly Gln Arg Pro Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly
725 730 735
Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln
740 745 750
Gly Gln Gln Leu Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly
755 760 765
Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly
770 775 780
Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Ser Ser Tyr His Val Ser Val Glu His
785 790 795 800
Gln Ala Ala Ser Leu Lys Val Ala Lys Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln
805 810 815
Leu Pro Ala Met Cys Arg Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser
820 825 830
Gln
Claims (4)
1.一种具有SEQ ID NO：1所示核酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因。
2.一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因所表达的蛋白。
3.一种权利要求1所述小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)种子基因组DNA提取
a.取小麦品种W958干种子30mg，研成粉沫，转入2ml离心管中；
b.加入200μl提取缓冲液浸泡30min，提取缓冲液的组成成分及含量为：200mM Tris-HCl pH7.5，2.88M NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS；
c.加入600μl提取缓冲液，剧烈震荡1min，4℃12000rpm离心10min，取上清液至新管；
d.加入等体积预冷的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇，混匀，4℃12000rpm离心10min，小心将上清转入新管，Tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1；
e.加入等体积预冷氯仿/异戊醇，混匀，4℃12000rpm离心10min，取上清液至新管，冷氯仿、异戊醇的体积比为24∶1；
f.向上清液中加入600μl预冷的异丙醇，轻轻颠倒几次，-20℃沉淀30min，4℃10000rpm离心10min，弃上清液；
g.用500μl 70％的乙醇清洗DNA沉淀，4℃8000rpm离心5min，重复一次；
h.沉淀放超净工作台中室温干燥；
i.加入50μl灭菌ddH2O，4℃溶解12h；
j.1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度；
2)PCR扩增
(1)引物设计
引物序列如下：
DX-1：5′-ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3′
DX-2：5′-GCTGCAGAGAGTTCTATC-3′
(2)PCR反应
a.反应体系为100μl：
TaKaRa LA Taq(5U/ul) 1μl
2×GC Buffer II 50μl
dNTP混合物(各2.5mM) 16μl
DX-1(20uM) 2μl
DX-2(20uM) 2μl
DNA模板(100ng) 8μl
ddH2O 21μl
Total 100μl
b.反应条件：
94℃预变性2分钟；94℃变性45秒，59℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；
1％琼脂糖胶检测PCR产物；
(3)PCR产物的回收纯化
琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，步骤如下：
a.凝胶切碎放入2ml离心管，称重，以1mg＝1μl计算，加入3倍胶块体积量的胶块融化液DR-I buffer，75℃加热10min，加1/2体积的DR-II buffer，混匀；
b.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，溶液转至Spin Column中，3600rpm离心1min，弃滤液；
c.加入500μl的Rinse A至Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃滤液；
d.加入700μl的Rinse B至Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃滤液，重复1次；
e.12000rpm再离心1min；
f.将Spin Column置于新的1.5ml离心管上，在Spin Column膜的中央加入25μl的灭菌ddH2O，60℃加热1min，12000rpm离心1min，即得到回收产物，可立即使用或于-20℃保存；
3)PCR产物的克隆
(1)连接反应
回收的PCR产物与pGEM-T Easy vector 4℃连接，反应体系如下：
2×rapid ligation buffer 5.0μl
pGEM-T Easy Vector 0.5μl
T4DNA Ligase 1.0μl
PCR回收产物 3.5μl
Total 10μl
(2)感受态细胞的制备与大肠杆菌的转化
a.划板复壮宿主菌DH-5α；
b.挑取1个生长良好的单菌落至含有30ml LB液体养基的锥形瓶中，37℃200rpm振荡培养过夜；
c.取500μl菌液接种50ml LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600＝0.3-0.4；
d.菌液转入无菌一次性使用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min；
e.4℃4100rpm离心10min，收集细胞；
f.弃上清，用10ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置10min，4℃4100rpm离心10min，重复此步骤一次；
g.用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液悬浮细胞，加入灭菌甘油至终浓度30％，分装后放至0℃备用或存于-70℃；
h.加5μl连接产物至200μl的感受态细胞中，轻弹管壁混匀内含物，冰上放置30min；
i.42℃热激90秒，立即插入冰中冷却2min；
j.加入800μl 37℃预热的LB液体培养基，37℃260rpm，摇培45分钟；
k.3600rpm离心30秒，吸掉800μl上清，剩下的吹散细胞，均匀的铺于涂有IPTG，X-Gal和Amp 80μg/ml的LB平板，37℃倒置培养12-16小时，置4℃冰箱中显色4-6小时；
(3)质粒的小量提取
用于酶切验证或PCR检测
a.挑取单菌落于10ml含Amp 80μg/ml的LB液体培养基，37℃培养过夜；
b.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体，重复一次；
c.加100μl冰预冷的溶液I，震荡，充分悬浮菌液，室温放置5分钟，溶液I的组成成分及含量为：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA pH8.0；
d.加新鲜配制的200μl的溶液II，上下颠倒不超过5次，冰上放置5分钟，溶液II组成成分及含量为：0.2M NaOH、1％SDS；
e.加150μl冰预冷的溶液III，溶液III的组成成分及含量为：60ml 5M乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml ddH2O；
上下颠倒不超过5次，冰上放置，直至形成紧实的团块，12000rpm离心10分钟，上清移至新离心管；
f.加等体积的酚/氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，上清移至新离心管，酚、氯仿的体积比为1∶1；
g.加2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时，12000rpm离心10分钟；
h.用75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复一次；
i.自然吹干，溶于50μl含0.02mg/ml RNase的灭菌ddH2O中，做电泳检测；
(4)重组质粒PCR和酶切鉴定；
a.按上述PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定；
b.酶切鉴定体系如下：
EcoR I 1μl
10×H Buffer 2μl
重组质粒 5μl
灭菌水 12μl
Total 20μl
37℃酶切4小时，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测；
(5)序列测定与拼接
以上经鉴定的质粒，以SP6和T7为引物，进行DNA序列测定和拼接。
4.根据权利要求3所述小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，其特征在于，所述小麦品种W958由四倍体硬粒小麦T.durum Desf.×六倍体普通小麦T.aestivum L种间远缘杂交获得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910216633A CN101798575A (zh) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910216633A CN101798575A (zh) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101798575A true CN101798575A (zh) | 2010-08-11 |
Family
ID=42594421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910216633A Pending CN101798575A (zh) | 2009-12-08 | 2009-12-08 | 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101798575A (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974539A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-02-16 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用 |
| CN106048048A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-10-26 | 山东农业大学 | 一种小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5的LAMP快速检测方法 |
| CN106977594A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-07-25 | 内蒙古农业大学 | 一种普通小麦低分子量麦谷蛋白及其编码基因和应用 |
| CN109576351A (zh) * | 2018-06-19 | 2019-04-05 | 嘉兴学院 | 朱栾外果皮dna在朱栾种质资源鉴定分析中的应用 |
| CN110790832A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高小麦加工品质的方法 |
| CN110862443A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-06 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用 |
| CN110894222A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-20 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 1Dx2m1/2/3蛋白及其编码基因在培育加工品质提高的小麦品种中的应用 |
| CN110938125A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-31 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高小麦加工品质的高分子量麦谷蛋白亚基突变基因1Dx2m1的创制与应用 |
| CN111303258A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-06-19 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 1Dx2m1/2蛋白及其相关生物材料在改善小麦加工品质中的应用 |
-
2009
- 2009-12-08 CN CN200910216633A patent/CN101798575A/zh active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101974539A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-02-16 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用 |
| CN101974539B (zh) * | 2010-11-05 | 2013-03-27 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用 |
| CN106048048A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-10-26 | 山东农业大学 | 一种小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5的LAMP快速检测方法 |
| CN106048048B (zh) * | 2016-07-18 | 2019-07-16 | 山东农业大学 | 一种小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5的LAMP快速检测方法 |
| CN106977594A (zh) * | 2017-04-14 | 2017-07-25 | 内蒙古农业大学 | 一种普通小麦低分子量麦谷蛋白及其编码基因和应用 |
| CN109576351A (zh) * | 2018-06-19 | 2019-04-05 | 嘉兴学院 | 朱栾外果皮dna在朱栾种质资源鉴定分析中的应用 |
| CN110790832A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-02-14 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高小麦加工品质的方法 |
| CN110894222A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-20 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 1Dx2m1/2/3蛋白及其编码基因在培育加工品质提高的小麦品种中的应用 |
| CN110938125A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-31 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高小麦加工品质的高分子量麦谷蛋白亚基突变基因1Dx2m1的创制与应用 |
| CN111303258A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-06-19 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 1Dx2m1/2蛋白及其相关生物材料在改善小麦加工品质中的应用 |
| CN110790832B (zh) * | 2019-12-12 | 2021-03-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种提高小麦加工品质的方法 |
| CN110862443A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-06 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101798575A (zh) | 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白 | |
| EA014887B1 (ru) | Способ экспрессии инсулина в семенах растения, способ получения семян растений, содержащих инсулин, и растения, способные производить семена, содержащие инсулин | |
| CN108840951A (zh) | 一种由猪白蛋白、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN102559685A (zh) | 花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15、重组表达载体和应用 | |
| CN108840947A (zh) | 牛白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种牛长效干扰素 | |
| KR101964658B1 (ko) | 콩 모자이크 바이러스에 대한 병 저항성을 조절하는 콩 유래의 GmPAP2.1 유전자 및 이의 용도 | |
| CN113845578B (zh) | 调控植物原花青素合成的myb类转录因子及其编码基因和应用 | |
| CN108588089B (zh) | 嘉宝果myb转录因子McMYB与李bHLH转录因子PsbHLH及其应用 | |
| CN108840952A (zh) | 一种由鸡白蛋白、鸡干扰素γ和鸡干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN108822195A (zh) | 砀山酥梨具有促进花粉管生长功能的蛋白、编码基因PbrTTS1及其应用 | |
| CN110526960A (zh) | 一类抗病毒多肽及其制备方法与应用 | |
| CN108192903A (zh) | 一种碱性木聚糖酶及其编码基因与应用 | |
| CN101294153A (zh) | 一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法 | |
| CN110408583A (zh) | 一种表达三肽酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 | |
| CN101323859B (zh) | 人碱性成纤维细胞生长因子植物表达载体的构建及转化表达方法 | |
| CN102367444A (zh) | 一种小麦低分子量麦谷蛋白亚基的基因及其用途 | |
| CN101955526A (zh) | 大黄鱼mstn-1前肽和前肽抗体及制备方法 | |
| US8362321B2 (en) | Methods and materials for increasing starch biosynthesis in plants | |
| CN100370027C (zh) | 硬粒小麦高分子量谷蛋白By8基因的用途 | |
| CN102367445A (zh) | 一种小麦麦谷蛋白亚基基因及其用途 | |
| CN103233014B (zh) | 一种低分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达载体和应用 | |
| CN101544982B (zh) | 一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用 | |
| CN1970765A (zh) | 一种高分子量谷蛋白亚基基因及其启动子核酸序列与应用 | |
| CN101423842A (zh) | 利用家蚕中部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法 | |
| CN101974539B (zh) | 多叶老芒麦高分子量谷蛋白亚基基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100811 |