CN101544982B

CN101544982B - 一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用

Info

Publication number: CN101544982B
Application number: CN2008101477987A
Authority: CN
Inventors: 郑有良; 祁鹏飞; 魏育明; 颜泽洪; 陈国跃
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2028-12-09
Also published as: CN101544982A

Abstract

本发明公开了一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列，如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，属于生物基因工程技术领域。该新型基因序列可以通过转基因技术或染色体工程方法导入普通小麦，培育出品质更好的小麦品种。同时可以通过构建原核或酵母表达载体，导入大肠杆菌和酵母中进行表达，纯化该基因编码的蛋白并将其添加到面粉中，具有很高的应用价值。

Description

一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及到一种新型小麦γ-醇溶蛋白基因的核酸序列，以及基于该序列通过染色体工程或转基因方法改良小麦品质的应用。

背景技术

与其它谷物相比，小麦在人类的食谱中扮演着重要的角色，人们利用小麦面粉的特性已烹制出各种各样的食物。小麦面粉的营养和加工品质主要由种子储藏蛋白决定，它们是人体摄取蛋白质的主要来源之一。种子储藏蛋白主要由谷蛋白和醇溶蛋白组成，醇溶蛋白大约占储藏蛋白的40-50％。分子生物学研究表明根据一级结构的差异可将醇溶蛋白分为α，γ和ω三种类型。研究发现二倍体、四倍体和六倍体小麦及近缘的山羊草物种中均有这三种蛋白。

γ-醇溶蛋白基因位于1号染色体的Gli-l区域，它们在小麦基因组中紧密连锁，并聚集成簇。γ-醇溶蛋白的一级结构(图1)包括一个19个残基的信号肽，N末端，长度变异很大的重复区，包含六个半胱氨酸残基的非重复区，谷氨酰胺富集区和一个包含两个半胱氨酸残基的C末端区。

多肽的一级结构决定蛋白质的性质，储藏蛋白的结构对面团的流变力和食品加工的许多方面起着重要作用。种子储藏蛋白的两大特征对面粉品质起决定作用：(1)形成分子内和分子间二硫键的半胱氨酸的数目和分布情况；(2)重复区的特征。重复区中高密度的谷氨酰胺意味着有大量可形成氢键的-OH，这很大程度上决定着蛋白质弹性。γ-醇溶蛋白包含八个保守的半胱氨酸残基，它们两两之间形成分子内二硫键。另外大约1/4的γ-醇溶蛋白包含奇数个半胱氨酸。这些醇溶蛋白在形成分子内二硫键后还有一个自由的-SH可参与形成分子间二硫键。当只有一个半胱氨酸残基以供形成分子间二硫键时，储藏蛋白聚合物的链状延伸将在该蛋白处终止，这种结构将降低面粉品质。当有至少两个半胱氨酸残基以供形成分子间二硫键时，聚合物的将顺利延伸，有利于形成高强度的面团。

醇溶蛋白与面粉品质的关系目前争议很大，不同学者通过品质测验分别得出负相关、正相关甚至没有关系的结论。之所以如此，很大程度上是因为醇溶蛋白组成非常复杂且不容易纯化，因此很有必要在分子水平上进一步深入研究醇溶蛋白。

本发明呈现的γ-醇溶蛋白基因与已报道的所有基因有明显不同，是优异基因资源。本发明通过本发明人长期反复的对小麦醇溶蛋白编码基因的详细研究，首次成功的获得了一种新型γ-醇溶蛋白基因。迄今为止，还没有相关的报道在国内外出版物上发表过。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新型γ-醇溶蛋白的编码基因序列和氨基酸序列。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明以圆锥小麦AS2255(Triticum turgidum subsp.turgidum)总DNA为模板，根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知γ-醇溶蛋白编码基因保守片段设计引物，利用PCR和分子克隆技术分离γ-醇溶蛋白基因，然后将获得的基因序列与NCBI上的γ-醇溶蛋白基因序列进行多重比对并分析它们在一级结构上的异同，结果表明我们克隆到一个新型γ-醇溶蛋白基因，命名为Gli-ngl。

一种新型γ-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-ngl)，其核酸序列如下：

1 ATGAAGACCT TACTCATCCT AACAATCCTT GCGATGGCAG

41 TAACCATCGG CACCGCCAAT ATGCAGGTCG ACCCTAGCGG

81 CCAAGTACAA TGGCCACAAC AACAACCAGT CCCGCTCCCT

121 CAGCAACCAT TCTCCCAGAA ACCACAACAA ACATTTCCCC

161 AACCCCAACA AACATTCCCA TTCCCCCATC AACCACAACA

201 ACAATTTCCC CAGCCTCAAC AACCACAACA ACAATTTCTC

241 CAGCCCCAAC AACCACAACA ACCATATCCC CAGCAACCAC

281 AACAACCATT CCCCCAGACT CAACAACCCC AACAACTATT

321 TCCCCAGTCC CAGCAACCAC AACAACCATA TCCCCAGCAA

361 CCACAACAAC CATTGTCCCA GACTCAACAA CCCCAACAAC

401 CAGCTCAATT GGAGGCGATC AGGTCATTGG TGTTGCAAAC

441 TCTTCCAACC ATGTGTAACG TGTATGTCCC ACCTGAGTGC

481 TCTATCATCA AGGCACCATT TGCCAGCATA GTCACCGGAA

521 TTGGTGGTCA ATGA

以上序列为小麦γ-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-ngl)，运用点突变的方法可对结构进行改造，得到小麦γ-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-ngl)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。

根据小麦 γ-醇溶蛋白的编码基因序列(Gli-ngl)和通用密码子信息，得到其推导的氨基酸序列，该序列如下：

1 MKTLLILTIL AMAVTIGTAN MQVDPSGQVQ WPQQQPVPLP

41 QQPFSQKPQQ TFPQPQQTFP FPHQPQQQFP QPQQPQQQFL

81 QPQQPQQPYP QQPQQPFPQT QQPQQLFPQS QQPQQPYPQQ

121 PQQPLSQTQQ PQQPAQLEAI RSLVLQTLPT MCNVYVPPEC

161 SIIKAPFASI VTGIGGQ

本发明的有益效果为：

通过构建Gli-ngl的原核或酵母表达载体，利用本领域共知的研究方法将Gli-ngl分别导入大肠杆菌和酵母中，然后纯化该基因编码的蛋白并将其添加到面粉中改变面团的品质指标。这一结果表明，该新型γ-醇溶蛋白基因的表达产物能以分子间二硫键相互连接形成高分子量的聚合物，这是优质储藏蛋白基因非常重要的一个特征。而拥有该特征的基因通过转基因技术或者染色体工程的方法导入小麦，能够培育出品质更好的小麦品种，这已是行业广泛公知的技术。

本发明的测序结果表明：Gli-ngl是不同于已经公布的所有γ-醇溶蛋白基因的新的基因类型。与其它已知γ-醇溶蛋白基因相比，它缺少非重复区和谷氨酰胺富集区及6个半胱氨酸残基(图2和图3)。体外表达分析表明Gli-ngl的两个半胱氨酸均可参与形成分子间二硫键(图4)。这该序列特征显示该基因的独特之处和导致优质的因素。

附图说明

图1：普通γ-醇溶蛋白模式结构。信号肽、N末端、重复区、非重复区、谷胺酰胺富集区和C-末端分别表示各个结构域；S指代半胱氨酸，中间的连线表示二硫键。

图2：新型γ-醇溶蛋白模式结构。信号肽、N末端、重复区和C-末端分别表示各个结构域，S指代半胱氨酸。

图3：Gli-ngl与普通γ-醇溶蛋白氨基酸序列多重比对。星号指示半胱氨酸位置。

图4：Gli-ngl体外表达结果。从做到右依次是蛋白分子量标准、Gli-ngl(溶液A，含有还原剂DTT)和Gli-ngl(溶液B，没有还原剂)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

1、提取基因组DNA

采用CTAB法提取圆锥小麦AS2255的基因组DNA，提取步骤如下：

(1)取2克新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB、1.4M NaCl、0.1M Tris-HCl PH8.0、0.1M EDTA PH8.0，临用前加2％β-巯基乙醇)15ml混匀；

(2)65℃水浴30-45分钟，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10分钟。

(3)取上清液，加等体积异丙醇，冰浴2小时沉淀DNA；

(4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl；

(5)100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。

2、根据已知相关序列的保守区域设计了以下引物：

F：5’-CTTCACACAACTAGAGCACAAG-3’

R：5’-GATGAATCAGCTAAGCAACGATG-3’

3、PCR扩增：

反应体系如下：DNA 100-150ng

dNTPs 100μM

引物P₁ 5pmol

引物P₂ 5pmol

Taq plus聚合酶 1U

10×PCR缓冲液 2.5μl

Mg²⁺ 1.5mM

ddH₂O 加至终体积25μL

PCR反应程序：(1)94℃ 4分钟

(2)94℃ 45秒

(3)57℃ 1分钟

(4)72℃ 70秒

重复(2)→(4)35次

(5)72℃ 10分钟

PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，130V恒定电压电泳30分钟。

4、PCR产物回收和纯化

使用Tiangen的胶回收试剂盒，所有操作均按照说明书进行。

5、连接和转化

使用Takara的连接试剂盒将回收产物连接到PMD-18T载体，反应体系如下：

PMD-18T载体 0.5μl(约25ng)

Solution I 4.75μl

回收PCR产物加至终反应体积10μl

16℃连接10小时

转化大肠杆菌DH5α

感受态细胞的制备：

(1)取在无抗生素平板上生长良好的DH5α单菌落，接种于2μl LB液体培养基中；

(2)取500μl活化过夜的菌液于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3；

(3)将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置10分钟；

(4)在预冷至4℃的离心机中，4000rpm离心10分钟后去掉上清液，收集菌体；

(5)加入20ml冰冷的0.1M CaCl₂于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30分钟；

(6)4℃下，4000rpm离心10分钟后去掉上清液，收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl₂溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。

转化步骤如下：

(1)将连接产物加入200μl感受态细胞中，充分混匀置于冰上30分钟；

(2)42℃热击90秒，冰浴150秒后加入预热至37℃的LB液体培养基1000μl；

(3)37℃振荡(200rpm)培养45分钟；

(4)3000rpm离心10分钟收集菌体；

(4)将菌体均匀涂于含有氨苄青霉素(33μg/ml)的LB固体培养基平板上；

(5)37℃培养箱中培养16小时。

6、阳性克隆的筛选

(1)挑取培养平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素(33μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37℃培养12小时)；

(2)挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增，反应体系如下：

DNA 少许菌体

dNTPs 100μM

引物P₁ 5pmol

引物P₂ 5pmol

Taq plus聚合酶 1U

10×PCR缓冲液 2.5μl

Mg²⁺ 1.5mM

ddH₂O 加至终体积25μl；

(3)PCR反应程序同前。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳30分钟，检测有无目的片段。

7、序列测定与比较分析

随机选取阳性克隆进行测序，序列测定由上海英俊公司完成，测序结果比较分析采用NCBI网址中的blast(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/)程序、MEGA3.1和DNAman5.2.2软件进行。

8、Gli-ngl的体外表达

(1)依据所测定的基因序列，设计可扩增整个基因编码区除信号肽区域的PCR引物，并在与基因N末端保守区结合部位的5’端添加限制性内切酶NdeI位点，另一引物的5’端添加HindIII位点，引物序列如下：

P3(NdeI-forward)：ACACATATGAATATGCAGGTCGACCCTAGCG

P4(HindIII-reverse)：TTCAAGCTTGATGAATCAGCTAAGCAACGATG；

(2)使用PCR方法从质粒中扩增出目的基因片段，回收扩增产物，方法同前；

(3)对PCR产物和pET-30a质粒载体进行NdeI和HindIII的37℃过夜酶切；

(4)对酶解后的PCR产物和pET-30a载体进行回收，16℃过夜连接反应连接体系如下：

pET-30a载体 4.35μl

PCR回收产物 4.35μl

T4连接buffer 1ml

T4连接酶 350U；

(5)连接产物转化入DH5α感受态细胞，在25μg/ml的卡那霉素平板上筛选，挑选出阳性克隆(使用引物P3和P4，步骤同前面扩菌)，提取质粒(Tiangen提取质粒试剂盒，操作步骤见说明书)，转化入大肠杆菌BL21，在含25μg/ml的卡那霉素的平板上涂板；

(6)取在平板上筛选到的单个菌落在2ml含25μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；

(7)第2天将500μl过夜的菌液加到50ml含25μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0时加入IPTG至0.1mM诱导12小时；

(8)8000r/min离心10分钟收集菌体；

(9)加600μl水混匀菌体，冻融6次，然后加1400μl无水乙醇60℃水浴2小时；

(10)8000r/min离心10分钟收集菌体；

(11)取上清，加2倍体积1.5M NaCl冰浴4小时；

(12)21000g离心10分钟，去上清，加500μl70％乙醇使沉淀溶解，再加2倍体积1.5M NaCl冰浴4小时；

(13)加1000μl水冰浴半小时；

(14)8000r/min离心10分钟，去上清，加入溶液A或B溶解表达的蛋白；

(15)SDS-PAGE电泳分析

溶液A组成：62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，10％(v/v)glycerol，2％(w/v)SDS，0.002％(w/v)bromophenol blue，1.5％(w/v)DTT；

溶液B组成：62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，10％(v/v)glycerol，2％(w/v)SDS，0.002％(w/v)bromophenol blue

9、SDS-PAGE分析

分离胶(Resolving gel)缓冲液(2.5L)：溶解378g Tris，25g SDS，95g硼酸，加水定容至2.5L，pH值应为8.9。

浓缩胶(Stacking gel)缓冲液：1.0M Tris-HCL，pH6.8，10％(W/V)SDS。

电泳缓冲液：将分离胶缓冲液稀释10倍

聚丙烯酰胺凝胶组成：

浓缩胶(3％) 分离胶(10％)

40％丙烯酰胺，ml 0.375 2.5

2％甲叉双丙烯酰胺，ml 0.2 0.52

Resolving gel缓冲液，ml 0 1

Stacking gel缓冲液，ml 0.62 0

10％SDS(W/V)，ml 0.04 0

10％(W/V)过硫酸胺，ml 0.05 0.09

TEMED，μl 5 4.2

H₂O，ml 3.7 5.9

以Takara蛋白分子量标准作对照，恒压150V电泳，待指示剂走出分离胶后，取下胶染色15分钟，用水脱震荡脱色至条带清晰后，保存于固定液中，照相保存SDS-PAGE结果。

染色液组成(1L)：650ml蒸馏水、1g考马斯亮蓝R-250、250ml异丙醇、100ml冰醋酸；

脱色液组成(1L)：650ml蒸馏水、250ml异丙醇、100ml冰醋酸；

固定液组成(1L)：100ml冰醋酸、900ml蒸馏水

序列表.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>四川农业大学

<120>一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用

<130>081129

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>535

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>1

<210>2

<211>177

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>2

Claims

1.一种新型γ-醇溶蛋白基因，其特征在于，所述基因序列为序列表中SEQID No.1所示的核酸序列。

2.一种新型γ-醇溶蛋白，其特征在于，所述γ-醇溶蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。