CN106497941A - 小麦γ‑醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦新型γ‑醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测方法。γ‑醇溶蛋白TaWG05编码基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示；γ‑醇溶蛋白TaWG05的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明在对γ‑醇溶蛋白TaWG05深入研究基础上，进一步加强了对该基因的开发利用。通过特定引物对设计，可检测、判定其它小麦品种中是否特定表达有γ‑醇溶蛋白TaWG05。基于相应检测结果，可为醇溶蛋白过敏人群的小麦食品选择提供了重要的安全保障，同时也为小麦品种改良提供了较好的理论基础和应用基础；同时也为其它过敏原蛋白的检测提供了较好的借鉴和参考。

Description

小麦γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦新型γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测方法。
背景技术
小麦是我国重要的粮食作物之一。面粉加水形成面团后可产生有弹性的网状结构，这一特殊的品质特质决定了其适于制作面包、糕点等食品。随着人们生活水平的提高，小麦的育种目标不仅只关注小麦产量的提高，而且加强了对小麦品质的改良。小麦独特的加工品质主要与种子的贮藏蛋白有关，而小麦醇溶蛋白作为贮藏蛋白主要的核心组成，其功能主要决定了面团的可塑性。
醇溶蛋白是指溶解于70%乙醇的一种单链多态混合物，根据其在A-PAGE（pH=3.1）电泳迁移率的不同，可分为α、β、γ、ω四种类型。γ类型醇溶蛋白大小介于30-75kDa之间。γ类型醇溶蛋白一般由5个部分组成：20个氨基酸残基的信号肽，N末端的非重复I区，高变重复区II区，一般包含六个半胱氨酸残基的非重复III区，多聚谷氨酞胺区IV区和包含两个半胱氨酸残基的C末端非重复V区。
醇溶蛋白是小麦面筋蛋白的主要组成成分，占小麦籽粒总蛋白含量的40%-50%，主要影响面团的延展性和粘性，是小麦优良加工品质的关键决定因素。但醇溶蛋白也是一种重要的过敏原，目前一些小麦过敏人群，比如乳糜泻和小麦依赖运动激发过敏症，都对醇溶蛋白产生一定的过敏症状。
功能标记是作物分子育种的理想标记。它的开发是以被克隆的基因序列为前提,结合标记与性状的相关性分析，确定标记的有效性，进而应用于分子辅助育种。目前，国内外已开发出60多个小麦分子标记，其中多数为功能标记，涉及的性状为简单遗传的性状如抗锈病、抗线虫、抗吸浆虫以及加工品质等，先后选育成20个新品种。但对加工品质和人类健康紧密相关的醇溶蛋白功能标记研究报道较少。因此，对一些特定类型醇溶蛋白进行鉴定、克隆、表达分析以及其功能标记的研发尤为迫切，相关研究结果可为小麦加工和食品安全提供重要的保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小麦新型γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测鉴定方法，基于该检测方法，可较为快速的检测γ-醇溶蛋白TaWG05在小麦品种或面粉制品中的存在情况，从而为过敏人群的健康提供指导，同时也为小麦品种的改良提供理论基础。
首先就小麦新型γ-醇溶蛋白TaWG05基因的发现过程简要介绍如下。发明人前期在对小麦品种郑麦366和郑麦004种子不同发育阶段的转录组进行分析，并通过荧光定量PCR验证发现若干醇溶蛋白基因表达量在品种间存在差异差别，结合测序分析，最终确定编号为TaWG05的γ-醇溶蛋白基因在郑麦004中正常表达，而在强筋品种郑麦366中表达量最低，因此重点加强了对该基因的分析和研究。
为获得TaWG05基因的全长cDNA序列，发明人采用了RACE技术进行该基因的克隆，具体过程为：
（1）依据对TaWG05基因的测序结果，分别设计第一轮PCR引物与第二轮PCR引物，采用巢式PCR扩增策略，以郑麦004的cDNA为模板，利用高保真酶Phusion 分别进行3’端和5’末端序列扩增，进行两轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并进行测序和序列的拼接分析，并进一步推测其可能的末端侧翼序列；
（2）在根据测序结果和上述RACE扩增结果，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站进行同源序列比对，根据比对到的序列的保守结构区域设计简并引物，分别以郑麦004基因组DNA和cDNA为模板进行扩增，共获得26条核苷酸序列，克隆测序后的片段再与RACE扩增的3’端和5’端序列进行拼接，最终获得的基因命名为γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因，碱基序列具体如SEQ ID No.1所示；而γ-醇溶蛋白TaWG05的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示。
进一步地，发明人对所获得的γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的结构进行了初步分析，具体过程及结论简要介绍如下：
（1）通过Signal 4.1 server软件分析，预测表明，γ-醇溶蛋白TaWG05含有21个氨基酸的信号肽序列，是一种跨膜蛋白，且含有8个保守的半胱氨酸残基S，在II重复区具有典型的γ-醇溶蛋白基本的结构F/L/PP(QQ)2-3；
（2）利用MEGA6.0构建系统发育树，结合γ-醇溶蛋白TaWG05的结构分析，确定TaWG05基因是一种多基因家族的γ类醇溶蛋白。
基于上述研究结果，本申请的主要技术方案主要如下。
γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
γ-醇溶蛋白TaWG05，其氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示。
针对γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的克隆方法，采用简并引物法设计引物，并进行克隆获得。
简并引物法，一种获得序列未完全清楚的核酸的引物设计方案，其特点为所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。以小麦郑麦004种子cDNA为模板，利用如下简并引物对进行PCR扩增，简并引物对为：
引物1：5’-ATGAAGATCT(C)TCA(T)TGGTCTTTGCC(T)-3’，
引物2：5’-TCAT(C)TGTCCACCA(G)TTG(C)TAGGCG-3’；
需要解释的是，以上述简并引物序列进行克隆表达时，以引物1或引物2进行克隆表达，而所述引物1或引物2为括号中碱基替换前一个碱基后的不同引物序列的混合物。
另外，基于上述结果，针对γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因可开发针对性的检测标记，结合Real-time PCR技术，可较为便捷的检测γ-醇溶蛋白TaWG05在不同小麦品种中的表达情况，以及为醇溶蛋白过敏人群的小麦食品选择提供健康指导。具体而言：
一对检测γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因用检测标记引物对，利用该引物对，结合Real-time PCR技术，可以有效的标识和检测该基因在小麦品种中的表达情况，所述引物对具体如下：
引物3： 5’-TCTTCTTGGTCTTTGCCCTCC-3’，
引物4： 5’- TTGGGTAAGTGGTTGCTGCT-3’。
利用所述检测标记引物对检测小麦中γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的鉴定方法，具体包括如下步骤：
（1）提取待检小麦种子RNA，
（2）以Actin基因作为内参基因，利用引物对（引物3和引物4）进行Real-time PCR扩增，
（3）采用2 -△△CT方法检测目标基因的相对表达量情况，如果目标基因TaWG05基因有表达，那么表明该品种的小麦种子中含有γ-醇溶蛋白TaWG05，如果没有表达，那么表明该品种的小麦种子中不含有γ-醇溶蛋白TaWG05。
需要说明的是，由于语言习惯及其他原因，文中的TaWG05基因、醇溶蛋白TaWG05基因等均指γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因，TaWG05蛋白、醇溶蛋白TaWG05等均指γ-醇溶蛋白TaWG05，相关表述尽管不够统一和规范，但并不影响本领域技术人员对本申请技术方案的理解。
本发明在对γ-醇溶蛋白TaWG05深入研究基础上，进一步加强了对该基因的开发利用。通过特定引物对设计，可检测、判定其他小麦品种中是否特定表达有γ-醇溶蛋白TaWG05。对部分小麦品种检测结果表明：豫麦50、云麦51、矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、郑麦004、周麦13中等小麦品种中该基因有表达，进而可以认为这些小麦品种对应面粉中含有γ-醇溶蛋白TaWG05；而在师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦366、郑麦9023中检测到该基因无表达，表明这些小麦品种对应面粉中不含γ-醇溶蛋白TaWG05。基于此检测结果，可为醇溶蛋白过敏人群的小麦食品选择提供了重要的安全保障，同时也为小麦品种改良提供了较好的理论基础和应用基础；同时也为其他过敏原蛋白的检测提供了较好的借鉴和参考。
附图说明
图1为 TaWG05基因cDNA末端快速扩增电泳图，其中A图: TaWG05基因3’端两轮PCR扩增结果；B图：TaWG05基因5’端两轮PCR扩增结果；其中1代表：第一轮PCR扩增；2代表：第二轮PCR扩增；M为DNA Marker；
图2 为TaWG05基因在郑麦004基因组DNA和cDNA中的扩增序列；1、2、3：分别是利用郑麦004基因组DNA扩增TaWG05基因；4、5、6：分别是利用郑麦004的成熟种子 cDNA扩增TaWG05基因；
图3 为TaWG05全长cDNA序列与推导的氨基酸序列分析图；
图4为γ-醇溶蛋白TaWG05结构示意图；
图5 为TaWG05多基因系统进化分析图；利用MEGA6.0软件对TaWG05多基因序列与NCBI数据公布的醇溶蛋白序列进行系统发育树的构建；共分为两大类2类分别以I、II表示，TaWG05多基因属于独立的II大类，表明其为新型的γ-醇溶蛋白；
图6为TaWG05基因在不同类型品种籽粒中表达量分析；分别提取师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦366、郑麦9023、矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、郑麦004、周麦13等不同品种成熟的种子RNA，反转录成cDNA，在不同小麦品种类型中，利用检测标记进行检测；Actin作为内标。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。
生物材料：
师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦366、郑麦9023、矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、郑麦004、周麦13等，均为商品化小麦品种；
大肠杆菌DH5α感受态购自北京全式金公司；
主要试剂：
质粒小提试剂盒、胶回试剂盒、RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；
5'-Full RACE Kit with TAP试剂盒、DNA分子量标记、PCR mix、T4连接酶等购自TaKaRa 公司；
高保真酶Phusion、PMD18-T载体、反转录试剂盒等购自Fermentas公司；
实时定量荧光PCR（qPCR）试剂盒购置于TOYOBO公司；
主要实验设备：
PCR仪，美国BIO-RAD公司产品。
实施例1
本实施例首先就TaWG05基因的获得过程简要介绍如下。
（1）设计引物
根据TaWG05基因的测序结果，利用primer 5.0，分别设计3’和5’的接头引物与2对特异性扩增引物（如下表所示，表中：31PCR表示3’端第一轮PCR引物，32PCR表示3’端第二轮PCR引物；51PCR表示5’端第一轮PCR引物，52PCR表示5’端第二轮PCR引物）；
引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。
RACE用扩增引物：
。
另一方面，利用生物信息学分析TaWG05基因序列，通过National Center forBiotechnology Information(NCBI) 中Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)进行同源序列比对，查找同源序列相似度最高的小麦属（Triticum aestivum）基因序列；进而通过ORF Finder网上在线软件分析同源序列，预测该基因的ORF区的长度与编码方式，最终根据保守区域设计PCR扩增用简并引物对如下：
引物1：5’-ATGAAGATCT(C)TCA(T)TGGTCTTTGCC(T)-3’，
引物2：5’-TCAT(C)TGTCCACCA(G)TTG(C)TAGGCG-3’；
引物序列中括号里的碱基为可替代碱基
（2）利用RACE技术，克隆TaWG05基因的侧翼序列
A、提取郑麦004种子RNA，具体步骤为：
选取郑麦004成熟小麦籽粒样品，放入研钵中，加入少量液氮，充分研磨；
按100mg样品/mL TPI比例加入TPI（试剂盒提供的裂解剂），室温放置不少于5min使其充分裂解，然后4℃、12000×g离心5min；
小心吸取600μL上清至新的2mLRNase-free离心管中；加入等体积的TPII溶液，颠倒混匀数次，加入150μL氯仿，再次颠倒混匀，室温放置5min后，4℃、12000×g离心5min；
吸取上层水相500μL，转移至新的2mL离心管中；加入等体积异丙醇混匀，室温放置5~10min；4℃、12000×g离心5min，弃上清，RNA沉于管底；
加入1mL、75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃、10000×g离心10min；弃上清，然后室温晾干或真空干燥5~10min；
最后用30μL RNA溶解液溶解沉淀，即得到小麦郑麦004的总RNA。
、TaWG05基因3’端cDNA链合成，按如下比例配置反应体系，并进行反转录cDNA链合成：
。
、TaWG05基因5’端cDNA链合成，采用5'-Full RACE Kit with TAP试剂盒，应用“去帽法”原理，高特异性地扩增 cDNA 的5’末端的全长序列；主要原理如下：
利用试剂盒中的Alkaline Phosphatase 去掉RNA样品中5’端序列的磷酸基团（mRNA中具有特殊的帽子结构，主要通过 Tobacco Acid Pyrophosphatase去掉5'帽子结构，保留一个磷酸基团）；
利用T4 RNA Ligase与5’Adaptor primer进行连接反应；反转录反应程序如下：30℃、10 min；42℃、1h；70℃再延伸15min，反应产物4℃保存备用。
、TaWG05基因的3’端cDNA末端序列扩增，具体程序为：
第一轮PCR：
20μL反应体系设计如下：
2.5mM dNTP，3.2μL；
10×buffer，2μL；
31F，1μL；
31R，1μL；
LA Taq Polymerase，0.4μL；
cDNA，1μL；
ddH2O，11.4μL；
PCR反应程序：95℃预变性3min；94℃、30s，55℃、45s，72℃、1.5min，20个循环；72℃再延伸10min；扩增产物4℃保存；
第二轮PCR：
第二轮PCR扩增是以第一轮PCR的反应产物为模板，反应体系参考第一轮PCR的反应体系设计即可，仅调整引物采用32F和32R；
PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1.5min，34个循环，72℃再延伸10min；扩增产物4℃保存。
对第二轮PCR扩增后的扩增产物进行电泳检测，结果如图1A所示，扩增到约400bp左右的DNA片段，1、2点样孔为实验的两次独立重复。
、TaWG05基因的5’端cDNA末端序列扩增，具体程序为：
第一轮PCR：
50μL反应体系设计如下：
cDNA，4μL；
1×cDNA Dilution Buffer II，7μL；
10×LA PCR Buffer，4μL；
MgCl2，3μL；
LA Taq Polymerase，0.25μL；
51R，10μM、2μL；
51F，10μM、2μL；
ddH2O，27.75μL；
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，20个循环；72℃再延伸10min；扩增产物4℃保存；
第二轮PCR：第二轮PCR扩增是以第一轮PCR的反应产物为模板，反应体系参考第一轮PCR的反应体系设计即可，仅调整引物采用52F和52R；PCR反应程序参考第一轮PCR程序即可，但反应程序中增加10个循环，以获得更多的目的条带的扩增。
对扩增产物进行电泳检测，结果如图1B所示，可以扩增到200bp左右的片段，1、2点样孔为实验的两次独立重复。
、特异性目标DNA片段的回收、纯化，具体为：
将步骤E中第二轮PCR扩增产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外灯下切出特异性片段，用DNA凝胶回收试剂盒（参考说明书进行操作）回收目标片段并进行纯化。
、将所回收DNA片段与pMD18-T Vector载体进行连接，具体为：
将步骤F中所回收目标DNA片段与pMD18-T Vector载体用Solution I（T4连接酶和T4连接酶buffer的混合液）进行连接，连接时，10μL连接体系设计如下：
pMD18-T Vector，1μL；
Solution I，5μL；
模板（所回收产物），4μL；
混合均匀后，16℃过夜连接。
、将连接产物进行转化，并进行抗性筛选，具体为：
以1:10的比例将步骤G的连接产物加入到E.coli.DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置10 min；42℃水中热击细胞90 s，迅速放置冰上90 s；
然后加入200 μL 的LB培养液（预热至37 ℃），180 r/min、37℃培养45min；
取100μL培养液加到LB/Apm+平板表面放置片刻使之吸附，37℃ 培养过夜；
挑选生长良好的阳性单克隆菌斑，用克隆载体上的通用引物（M13）进行菌落PCR检测，
通用引物（M13）为：
M13-47F：5′- GCCTGCAGGTCGACGAT-3′，
M13-48R：5′- GGGGATCCTCTAGAGAT-3′；
20μL的PCR反应检测体系设计如下：
10×buffer，2μL；
2.5mM dNTPmix，1.6μL；
M13-47F，0.8μL；
M13-48R，0.8μL；
rTaq DNA Polymerase，0.2μL；
菌液，1μL；
ddH2O，13.6μL；
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃、30s，55℃、45s，72℃、1.5min，34个循环；72℃再延伸10min；扩增产物4℃保存备用。
（3）提取郑麦004 基因组DNA，采用CTAB法提取小麦郑麦004基因组DNA，具体步骤为：
取5粒小麦种子，液氮研磨成粉末，加入650μL提前预热至65℃的CTAB缓冲液，混匀；放入65℃水中15min左右，进行颠倒混匀，放置1小时；
冷却至室温后，加入650μL氯仿-异戊醇（24:1）混合液，混匀，12000rpm离心10min重复此步骤一次；
取新的2.0mL离心管，加入500μL无水乙醇，吸取上述离心后上清500μL，颠倒混匀至出现白色絮状沉淀，室温放置10min；
12000rpm离心10min，小心倒掉上清液，此时DNA沉淀于离心管底部；
加入75%的乙醇1mL，涡旋震荡以充分洗涤DNA沉淀，然后8000rpm离心2min，倒掉上清，室温晾干DNA；
加入30μL无DNA酶污染的TE(含2μL/mL RNase)重悬，溶解沉淀，冷藏备用。
（4）TaWG05全长DNA序列及CDS序列扩增
分别以郑麦004基因组DNA（步骤（3）所制备）和cDNA（步骤（2）中提取有总RNA，参考反转录试剂盒说明书即可制备）为模板，利用步骤（1）中的简并引物对进行PCR扩增，
20μL的PCR反应体系设计如下：
10×buffer，2μL；
2.5mM dNTP，3.2μL；
引物1，1μL；
引物2，1μL；
LA Taq Polymerase，0.4μL；
DNA（或cDNA模板），1μL；
ddH2O，11.4μL；
反应程序：94℃预变性5min；94℃、30s，55℃、1min，72℃、1.5 min，34个循环；72℃再延伸10min；扩增产物4℃保存备用。
对扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示，扩增到约为1000bp的DNA片段，1、2、3泳道：分别是利用郑麦004基因组DNA扩增TaWG05基因；4、5、6泳道：分别是利用郑麦004的成熟种子 cDNA扩增TaWG05基因；
（5）转化，筛选，测序分析，并进行序列拼接，具体为：
回收步骤（4）中的PCR扩增产物，并与pMD18-T Vector载体进行连接，转化，筛选阳性克隆（相关操作参考步骤（2）中操作即可），将阳性克隆送生工生物工程有限公司测序，测序结果用DNA STAR Lasergene7进行序列拼接分析。
最终测序结果表明，γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。进一步分析表明，γ-醇溶蛋白TaWG05的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示。
依据测序结果，利用软件SignalP4.1 server对γ-醇溶蛋白TaWG05的信号肽序列进行了初步分析，结果如图4所示，分析可以看出，其信号肽长度约为21bp。
对cDNA结果分析如图3所示。结合PROSITE数据库对蛋白质家族中的同源序列进行多重序列比对，检测其保守型区域，TaWG05蛋白具有典型的γ-醇溶蛋白结构，包含N端I非重复区，II重复区F/P/LP(QQ)2-3，且在III非重复区、IV多聚谷氨酰胺区、V非重复区含有8个半胱氨酸残基S，两两连接形成4个分子内二硫键。
利用MEGA6.0软件采用Bootstrap构建系统发育树，如图5所示，与NCBI数据公布的醇溶蛋白序列进行系统发育树的构建发现，该家族共分为两大类，2类分别以I、II表示，TaWG05多基因属于独立的II大类，表明其为新型的γ-醇溶蛋白；
实施例2
在上述实施例1基础上，发明人进一步设计了一对检测γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因用检测标记引物对，利用该引物对，结合Real-time PCR技术，可以有效的标识和检测该基因在其它小麦品种中是否有所表达，从而为小麦品种改良和过敏人群过敏原选择提供保障。具体而言，发明人所设计的γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因用检测标记引物对，序列如下：
引物3： 5’-TCTTCTTGGTCTTTGCCCTCC-3’，
引物4： 5’- TTGGGTAAGTGGTTGCTGCT-3’。
发明人以部分品种小麦种子（郑麦366、郑麦004、师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦9023、藁城8901、豫麦50、云麦51、矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、周麦13）为例，利用Real-time PCR技术，对这些品种中是否表达有γ-醇溶蛋白TaWG05进行了检测，相关实验简要介绍如下。
（1）提取小麦种子RNA，具体操作参考实施例1即可。
（2）以Actin基因作为内参基因，利用上述检测标记引物对，进行Real-time PCR；扩增Actin基因时，引物设计如下：
Actin-L: 5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，
Actin-R: 5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；
反应程序为：95℃、1 min；95℃、15 s，60℃、50s，39个循环。
采用2 -△△CT方法检测目标基因的相对表达量情况，每次实验每个样本重复三次。先比较内源基因的Ct值的差别（△Ct），再比较目标基因的Ct值的差别（△Ct），把得到的两个△Ct值进行相减，得到的结果算为2的△△Ct方，即是计算的基因相对表达量值。
结果如图6所示。结果表明，在豫麦50、云麦51、矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、郑麦004、周麦13中检测到该基因有表达，而在藁城8901、师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦366、郑麦9023中检测到该基因无表达。
从上述结果可以看出，该检测标记引物对可对不同小麦品种中是否表达有γ-醇溶蛋白TaWG05做出准确判定，因而可为醇溶蛋白过敏人群的小麦食品选择提供重要的安全保障。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院小麦研究所
<120> 小麦γ-醇溶蛋白TaWG05、克隆及其检测方法
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
atgaagatct tcttggtctt tgccctcctc gttgtatcaa tgatcatcac caccgcgacc 60
gcgcagctcg atcctagcat ccatgtacaa gaaaggccac aacaatcgtt tccgcagcag 120
caaccactta cccaacaaca accattcccg ccgcaagagc cacaacaacc actattccag 180
caacaacaac cgcatccaca tcagtcactt ccccaacaac aacttcccca gcaacattta 240
tttccacagc aaccgccgca acaacaattt ccacagcaga tgccacttcc tcatcaacaa 300
caaatattcc cgcaacaaca aatattcccg caacaacaac aacccccaca acaacaacca 360
ttttaccaat atcaacaacc attaacacaa caaccatacc cgcaagagca accattgcca 420
caacaacaac cttctgtgga ggaaaaccaa caattgaact tgtgcaagga gttcctgctg 480
cagcagtgca acccggagga gaaactatca ttactgcagt cagtgatccc gttcctccga 540
ccaaagacct cgcaacagaa caactgccag ttgaagcggc aacaatgttg tcgacaactt 600
gcacatatca gcgagccgtc ccgatgcccg gccatccaca acattgtgca cgccatcatc 660
atgcaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa 720
catgtggata gaggtttcgt ccagcctcaa ccacaacagt tgggccaggg aatgcccatg 780
cagcctcaac atcaattggg ccagggctta agcctacctc aacaactagc ccagttcaag 840
ttggttaggt tacttgtgat tcagaccttg cctatgttat gcaatgtgca tgtcccatct 900
gattgctaca ccattagtgc accatttggt ggcatcactg cctacaacgg tggacaatga 960
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 2
Met Lys Ile Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Val Val Ser Met Ile Ile
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Ala Gln Leu Asp Pro Ser Ile His Val Gln Glu Arg
20 25 30
Pro Gln Gln Ser Phe Pro Gln Gln Gln Pro Leu Thr Gln Gln Gln Pro
35 40 45
Phe Pro Pro Gln Glu Pro Gln Gln Pro Leu Phe Gln Gln Gln Gln Pro
50 55 60
His Pro His Gln Ser Leu Pro Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln His Leu
65 70 75 80
Phe Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met Pro Leu
85 90 95
Pro His Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Pro Phe Tyr Gln Tyr Gln Gln Pro Leu
115 120 125
Thr Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Glu Gln Pro Leu Pro Gln Gln Gln Pro
130 135 140
Ser Val Glu Glu Asn Gln Gln Leu Asn Leu Cys Lys Glu Phe Leu Leu
145 150 155 160
Gln Gln Cys Asn Pro Glu Glu Lys Leu Ser Leu Leu Gln Ser Val Ile
165 170 175
Pro Phe Leu Arg Pro Lys Thr Ser Gln Gln Asn Asn Cys Gln Leu Lys
180 185 190
Arg Gln Gln Cys Cys Arg Gln Leu Ala His Ile Ser Glu Pro Ser Arg
195 200 205
Cys Pro Ala Ile His Asn Ile Val His Ala Ile Ile Met Gln Gln Gln
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
225 230 235 240
His Val Asp Arg Gly Phe Val Gln Pro Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln
245 250 255
Gly Met Pro Met Gln Pro Gln His Gln Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu
260 265 270
Pro Gln Gln Leu Ala Gln Phe Lys Leu Val Arg Leu Leu Val Ile Gln
275 280 285
Thr Leu Pro Met Leu Cys Asn Val His Val Pro Ser Asp Cys Tyr Thr
290 295 300
Ile Ser Ala Pro Phe Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gly Gly Gln
305 310 315

Claims (5)

1.γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.γ-醇溶蛋白TaWG05，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.克隆权利要求1所述γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的简并引物对，其特征在于，PCR扩增所述γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因时，以小麦郑麦004的DNA基因组为模板，利用如下简并引物对进行PCR扩增，简并引物对为：
引物1：5’-ATGAAGATCT(C)TCA(T)TGGTCTTTGCC(T)-3’，
引物2：5’-TCAT(C)TGTCCACCA(G)TTG(C)TAGGCG-3’。
4.检测权利要求1所述γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因用检测标记引物对，其特征在于，所述引物对具体如下：
引物3： 5’-TCTTCTTGGTCTTTGCCCTCC-3’，
引物4： 5’- TTGGGTAAGTGGTTGCTGCT-3’。
5.利用权利要求4所述检测标记引物对小麦中γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）提取待检小麦种子RNA；
（2）以Actin基因作为内参基因，利用检测标记引物对进行Real-time PCR扩增；
（3）采用2 -△△CT方法检测目标基因的相对表达量情况，如果目标基因TaWG05有表达，那么表明该品种的小麦种子中含有γ-醇溶蛋白TaWG05，如果没有表达，那么表明该品种的小麦种子中不含有γ-醇溶蛋白TaWG05。
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