KR20050040771A

KR20050040771A - Ｃｍｖ 저항성 연관 분자 표지 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20050040771A
Application number: KR1020040086321A
Authority: KR
Inventors: 김신제; 황주광; 김군보; 김수
Original assignee: 주식회사 에프앤피
Priority date: 2003-10-27
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2005-05-03
Also published as: EP1689886B1; US8026414B2; WO2005040426A1; CN1886521B; KR100520994B1; CN1886521A; DK1689886T3; EP1689886A1; ATE441728T1; JP2007509626A; DE602004022972D1; EP1689886A4; US20100199390A1; JP4739222B2

Abstract

본 발명은 CMV(cucumber mosaic virus) 저항성 연관 분자 표지 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 식물체의 CMV 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 CMV 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 분자 표지는 CMV를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 CMV 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 CMV 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있다.

Description

ＣＭＶ 저항성 연관 분자 표지 및 이의 용도{Molecular marker associated with CMV resistance and use thereof}

본 발명은 CMV(cucumber mosaic virus) 저항성 연관 분자 표지 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 식물체의 CMV 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 서열을 가지는 핵산, 상기 핵산의 일부 염기서열을 포함하는 프라이머 및 이들을 이용하여 CMV 저항성 식물체를 검출하는 방법을 제공한다.

오이 모자이크 바이러스(Cucumber Mosaic Virus; 이하 'CMV'라 함)는 식물 바이러스 중에서도 기주 범위가 가장 넓은 식물병원 바이러스로서 전세계적으로 쌍자엽 및 단자엽의 약 900여 종의 식물에 큰 경제적 피해를 주고 있다. 식물이 CMV에 감염되면 잎, 줄기 및 과실에 모자이크 증상을 나타난다. 특히 병에 걸린 잎은 작아지고 쪼글쪼글해지며, 잎맥을 따라 괴리가 생기게 된다. 과실에는 녹색농담의 모자이크가 나타나고 울퉁불퉁해져 상품가치가 떨어진다.

한편, 병 저항성 품종을 육종하기 위해서는 병 저항성 인자를 갖는 다른 품종으로부터 계속적인 역교배를 통하여 그 인자를 도입하여야 하며, 도입 단계마다 저항성 시험을 거쳐 선발하여야 하는데, 이러한 선발 단계에서 상기 병 저항성 인자와 밀접하게 연관되어 있는 분자 표지(molecular marker)를 이용한다면 매우 편리할 것이다. 따라서, 분자 표지를 이용한 CMV의 진단 방법 및 형질 전환을 통한 CMV 저항성 품종 개발에 대한 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제2000-0025699호에서는 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus) 그룹에 속하는 CMV, 땅콩 위축 바이러스 및 토마토 에스퍼미 바이러스를 한 가지 세트의 유전자 증폭용 프라이머로 진단할 수 있는 쿠쿠모바이러스 진단용 프라이머의 염기서열 및 이를 이용한 유전자 진단 및 동정 방법을 개시하고 있다. 대한민국 특허등록 제0293567호에서는 국내에서 분리한 CMV 외피 단백질 유전자를 토마토에 형질 전환시키는, CMV에 대한 저항성 계통의 개발 방법을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 제1993-0029605호에는 작물에 병을 일으키는 CMV에 대하여 저항성을 갖는 형질전환 작물을 제조하기 위해 CMV 외피 단백질 유전자의 RNA를 공격하는 망치머리형 라이보자임이 기재되어 있다.

상기한 바와 같이, CMV 저항성의 진단 및 CMV 저항성을 갖는 식물의 개발에 관한 종래의 기술들은 모두 CMV의 외피 단백질 유전자를 그 대상으로 하고 있으며, 식물체 고유의 CMV의 저항성 인자에 대한 기술 개발은 보고된 바 없다.

따라서, CMV 저항성 인자를 갖는 식물체 계통으로부터 상기 바이러스 저항성 관련 분자 표지의 개발 및 개발된 분자 표지를 이용하여 식물체에서의 CMV 감염 여부를 진단하는 방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 CMV 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 염기서열을 갖는 분자 표지 및 이의 용도를 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 CMV 저항성 식물체 검출용 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 또는 프라이머를 포함하는 CMV 저항성 식물체 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 CMV 저항성 식물체를 검출하는 방법 및 상기 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는 방법을 제공한다.

나아가 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조직배양에 의해 무성번식되고, 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 함유하는 CMV 저항성 식물체 및 이로부터 수득된 종자를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 식물체의 CMV 저항성 형질과 연관 정도가 높은 분자 표지(이하, 'CMV 저항성 연관 분자 표지'라 함)를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 CMV 저항성 연관 분자 표지는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 포함한다. 상기에서 핵산은 RNA, DNA 및 cDNA를 모두 포함하며, 바람직하게는 DNA를 말한다. 본 발명의 분자 표지는 CMV 저항성 형질과 밀접하게 연관된 염기서열로서, CMV 저항성 유전자와 상당히 근접하여 위치하므로, 상기 염기서열들이 나타내는 어떠한 다형성을 사용하더라도 식물체의 CMV 저항성 유무를 파악할 수 있다.

또한 본 발명의 분자 표지는 상기 핵산의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 CMV 저항성 식물체 검출용 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 바람직하게는 적어도 10개 이상, 보다 바람직하게는 12개 이상의 일련의 염기서열을 가질 수 있다. 본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다(Jordan et al., Theor. Appl. Genet., 106:559-567, 2003; Martins M., R. et al., Plant Cell Reports, 22:71-78, 2003; Williams, J. G. K. et al., Nucl. Acids Res., 18:6531-6535, 1990; Michelmore, R. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9828-9832, 1991; Martins et al., Plant Cell Rep., 22:71-79, 2003; Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989). DAF 분석을 위해서는 5-8개의 염기로 이루어진 프라이머를 디자인하여 사용할 수 있다. 예컨대, STS 분석을 위한 프라이머는 RFLP 표지의 말단 염기서열과 일치하게 디자인할 수 있으며, SCAR 분석을 위한 프라이머는 RAPD 표지의 말단 염기서열에 입각하여 디자인할 수 있다. 또한 CAPS 분석을 위한 프라이머는 적절한 제한효소 자리가 포함되도록 디자인할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 제공하는 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 23 내지 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 CMV 저항성 형질에 연관된 다형성 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 최소 12개의 일련의 염기서열에 임의의 염기를 부가 및/또는 치환하여 변형될 수 있다. 예컨대, 서열번호 27 또는 서열번호 28의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 분자 표지는 CMV 저항성 식물체의 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 CMV 저항성 식물체의 검출 방법을 제공한다. 상기 방법은, 이에 제한되는 것은 아니나, RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있다(Jordan et al., Theor. Appl. Genet., 106:559-567, 2003; Martins M., R. et al., Plant Cell Reports, 22:71-78, 2003; Williams, J. G. K. et al., Nucl. Acids Res. 18:6531-6535, 1990; Michelmore, R. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9828-9832, 1991; Martins et al., Plant Cell Rep., 22:71-79, 2003; Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989). 바람직하게는 RFLP, RAPD 또는 CAPS 분석일 수 있다.

구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 CAPS 분석을 통해 수행될 수 있다:

(a) CMV 저항성 및 이병성 식물체로부터 얻은 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기를 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b) PCR 산물을 제한효소로 절단하는 단계;

(c) 절단된 DNA 단편들을 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동하는 단계; 및

(d) 전기영동이 완료된 겔의 DNA 밴드 양상을 비교하는 단계.

상기 (a) 단계의 프라이머는 바람직하게는 서열번호 23 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 23/24; 서열번호 23/25; 서열번호 23/26; 및 서열번호 27/28로 이루어진 군에서 선택되는 프라이머 조합을 사용할 수 있다. 또한 상기 (b) 단계의 제한효소는 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 내에 존재하는 제한효소라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 XbaⅠ 또는 EcoRⅠ을 사용할 수 있다.

또한 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 RAPD 분석을 통해 수행될 수 있다:

(a) CMV 저항성 및 이병성 식물체로부터 얻은 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

(b) PCR 산물을 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동하는 단계; 및

(c) 전기영동이 완료된 겔의 DNA 밴드 양상을 비교하는 단계.

상기 (a) 단계의 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 핵산을 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 염기서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가질 수 있다.

아울러 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 RFLP 분석을 통하여 수행될 수 있다:

(a) CMV 저항성 및 이병성 식물체로부터 얻은 각 게놈 DNA를 적당한 제한효소로 절단하는 단계;

(b) 절단된 DNA 단편을 아가로스 겔 상에서 전기영동하는 단계;

(c) 겔 상의 DNA를 나일론 막으로 전이시키는 단계;

(d) 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 핵산을 탐침으로 하여 서던 블럿을 수행하는 단계; 및

(e) X-ray 필름 상에 노출시켜 DNA 밴드 양상을 비교하는 단계.

상기 방법에 사용될 수 있는 제한효소는 당업계에 공지된 제한효소라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 다형성을 유발하는 제한효소를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 EcoRⅠ, EcoRⅤ 및 XbaⅠ로 이루어진 군에서 선택되는 효소를 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 분자 표지는 CMV 저항성 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는 CMV 저항성 식물체의 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 통하여 수행될 수 있다. 구체적인 방법은 위에서 언급한 바와 같다.

본 발명의 방법들이 적용될 수 있는 식물체는, 이에 제한되지는 않으나, 오이, 수박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미를 포함한다.

또한 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산 또는 상기 핵산의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 CMV 저항성 식물체 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트에는 상기 핵산 또는 프라이머를 이용하여 CMV 저항성 식물체를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 식물체의 CMV 저항성 형질과 밀접하게 연관되어 있는 분자 표지인 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 함유하는 CMV 저항성 식물체를 제공한다. 상기 CMV 저항성 식물체는 CMV에 대하여 저항성의 형질을 나타내는 식물체를 말한다. 상기 식물체에는, 이에 제한되지는 않으나, 오이, 수박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미가 포함된다. 바람직하게는 고추일 수 있다. 또한 본 발명에서 제공하는 CMV 저항성 식물체는 식물의 기관, 조직, 세포, 종자 및 캘러스를 포함한다. 본 발명에 따른 CMV 저항성 식물체의 CMV 저항성의 유전 유무를 조사한 결과, 상기 CMV 저항성은 우성의 단일 유전자에 의해 결정되는 것임이 규명되었다. 본 발명의 CMV 저항성 식물체는 당업계에 공지된 일반적인 조직 배양 방법으로 무성번식될 수 있다. 예컨대, 기관 발생에 의한 미세증식법(형성된 기관이 없는 잎, 잎자루, 줄기마디, 자엽, 자엽축 등의 조직을 배양하여 새로운 눈을 상기 조직의 표면에 유도해 내는 방법) 또는 캘러스 유도를 통한 재분화 방법 등으로 무성번식 될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 CMV 저항성 식물체로부터 수득되고, 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 함유하는 종자를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명은 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리 범위를 본 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1>

CMV 저항성 고추 식물체의 순화 및 분자 표지 개발을 위한 교배 집단 작성과 CMV 저항성의 유전양식 구명

다양한 고추 식물체에 CMV를 접종하여 저항성 식물체를 스크리닝하였다. 그 결과, 얼지엔초 계통 중 한 식물체가 CMV 저항성인 것으로 확인되었다. 선발된 식물체를 'FP11'이라 명명하였다. 선발된 FP11의 CMV 저항성의 유전 유무를 테스트하기 위하여 자가수분 집단 및 교배집단을 작성하였다. 상기 교배집단은 FP11을 이병성 계통인 FP14와 교배시켜 작성하였다. 교배된 F1 종자를 파종하여 자가수분시켜 F2 집단을 만들고, 다시 각각의 F2 식물체를 자가수분시켜 F3 집단을 만들었다. F2와 F3 집단을 대상으로 CMV 저항성을 테스트한 결과, CMV 저항성은 F2 집단에서 3:1의 비율로 유전되며, F3 세대에서 호모(homo)와 헤테로(hetero)의 비율이 1:2로 분리되었다. 이로부터 CMV 저항성은 우성의 단일 유전자에 의하여 결정되는 것임을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

식물체로부터 DNA 분리

DNA 추출은 프린스 등의 방법(Prince, J. P., et al., HortScience 32:937-939, 1997)을 변형하여 수행하였다. -80℃에서 보관한 고추 잎을 액체 질소를 이용하여 마쇄한 후, 25 ㎖의 DNA 추출 버퍼(7 M 우레아, 0.35 M 염화나트륨, 0.05 M Tris-HCl pH 8.0, 0.02 M EDTA, 0.25% sarkosyl, 5% 페놀, 0.2% sodium bisulfate)와 잘 혼합하였다. 이후, 0.75 ㎖의 20% SDS를 넣고 65℃ 에서 10분마다 흔들어 주면서 30분간 배양하였다.

클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 용액을 50 ㎖ 튜브의 끝부분까지 채워 15분간 잘 섞어 주었다. 혼합액을 5,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후, 수득된 상층액을 무명천(cheesecloth)을 이용하여 새로운 50 mM 튜브에 옮겼다. 이후, 상기 튜브에 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하고 혼합한 후, 1시간 동안 DNA를 침전시켰다. U자형의 파스퇴르 피펫을 이용하여 침전된 DNA를 채취하여 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 넣고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 재침전시켰다. 실온에서 30-40분 동안 건조시켰다. 상기 건조된 DNA 펠렛에 600-700 ㎕의 TE 버퍼(10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA)를 가하여 65℃ 에서 1시간 동안 배양하였다. 원심분리 과정을 3회 반복하였다. 이후, DNA를 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 RNase(100 ㎍/㎖)를 첨가하여 RNA를 제거하였다. 정제된 DNA의 최종 농도는 형광계를 이용하여 측정하였다.

<실시예 3>

CMV 저항성 연관 RAPD 프라이머의 선발

CMV 저항성 형질과 연관된 DNA 분자 표지를 선발하기 위하여 RAPD(Williams, J. G. K. et al., Nucl. Acids Res. 18, 6531-6535, 1990)와 BSA(Bulked Segregant Analysis) 방법(Michelmore, R. W. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 88:9828-9832, 1991)을 이용하였다. 상기 실시예 1의 F2 집단으로부터의 CMV 저항성 검정 결과를 바탕으로 저항성 F2 식물체 10개체의 DNA 풀(pool)과 감수성 F2 식물체 10개체의 DNA 풀을 만들고, 풀로 만들어진 DNA 농도가 20 ng/㎕가 되도록 조절한 후, 이를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 RAPD 프라이머를 위해 Operon RAPD 10-mer 킷트(Operon, Alameda, CA, USA) 중에서 시리즈 A부터 시리즈 T까지의 약 400개 프라이머를 대상으로 PCR 반응이 양호하게 일어나는 프라이머를 147개 선발한 후, 선발된 프라이머를 사용하여 저항성 DNA 풀과 감수성 DNA 풀 간에 특이적으로 다르게 증폭되는 밴드를 탐색하였다.

PCR 반응 조성물은 1× PCR 버퍼, 60 ng 주형 DNA, dNTP 0.3 mM, 프라이머 0.6 pM, 3.5 mM MgCl₂, 0.6 Unit Taq DNA 중합효소(Takara, Japan)를 혼합하여 총 부피를 25 ㎕로 조정하였다. PCR 증폭은 94℃ 4분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 94℃ 1분, 36℃ 1분 30초 및 72℃ 1분 50초를 한 사이클로 하여 총 45회 반복한 후, 72℃에서 5분간 반응시켜 종결하였다. 그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, OPC-07 프라이머(서열번호 1)를 이용한 PCR에서 1개의 저항성 pool에만 특이적으로 나타나는 분자 표지를 선발하였다.

상기 분자 표지가 CMV 저항성 형질과 어느 정도 연관되어 있는지 알아보기 위하여, 저항성 식물체와 이병성 식물체 및 이들의 F1 세대, 그리고 저항성 F2 183개체 및 이병성 F2 64개체에 대하여 다시 RAPD 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2a 및 도 2b에서 보는 바와 같이, 상기 분자 표지가 100% 동반분리(co-segregation)되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

RAPD 분자 표지의 클로닝과 염기서열 결정

서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 OPC-07 프라이머(10 mer)를 이용하여 증폭된 DNA를 겔로부터 분리·정제하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 전기충격방법으로 대장균 DH 10B에 도입한 후, 항생제가 들어 있는 배지에서 형질전환체를 선발하였다. 선발된 형질전환체로부터 재조합 플라스미드를 분리하고, 상기 플라스미드 내에 삽입된 DNA의 염기서열을 분석하였다. 결정된 염기서열을 서열번호 2로 기재하였다.

<실시예 5>

CAPS 분자 표지로의 전환 및 인버스 PCR을 수행하기 위한 서던 블롯 실시

저항성 식물체와 이병성 식물체의 게놈 DNA를 준비하고 DNA 제한효소 EcoRV, HindⅢ, XbaI 및 EcoRI으로 절단한 후, 아가로즈 겔에 전기영동하였다. 나일론 멤브레인에 DNA를 이동시킨 후, 실시예 4에서 증폭된 CMV 저항성 특이적 DNA(서열번호 2)를 탐침으로 하여 서던 블롯을 실시하였다. 그 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, EcoRI, XbaI, EcoRV에 대해서 다형성을 나타내었고, HindⅢ에 대해서는 다형성이 나타나지 않았다. 상기 RFLP 분석 결과를 바탕으로 EcoRI, XbaI 및 EcoRV 제한효소를 인버스 PCR과 CAPS 분자 표지 전환에 사용하였다.

<실시예 6>

CMV 저항성 유전자의 근접 DNA 염기서열 결정

실시예 5의 결과(도 3)를 바탕으로 실시에 4에서 분석된 RAPD 분자 표지의 염기서열의 일부를 사용하여 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머의 염기서열을 하기 표 1에 기재하였다.

인버스 PCR에 사용된 프라이머

프라이머명	염기서열(5'→3')	서열번호
CRSCC07a	GTC CCG ACG ATA GCC CAA AAG	3
CRINVR65	TTG GCC CTA TGA GTC CGT AC	4
CRINVR125	ACT GAC TAC GAG TTG TCA CC	5
CRINVF629	TAG GGG TTC AAG GAT CAC CC	6
CRINVR796	TAT CCT CTT ATG CAA TGC GC	7
CRINVR840	AAT CCT TGT ACC TCA CAA CG	8
CRINVF975	CGA TGC CAC TTC ATA ATG CC	9
Inv l030514 R	GAC TTG GGC ACT ACA CTG GA	10
Inv l030514 F	ACA TAG GCG TGT GCT CTG GA	11
CR 1541-3	GGA GTT TCA TCA TAT GAA GCC	12
InvXbTopF1010	GGT TCA AGG ATC ACC CAA ATA A	13
InvXbTopR107	TTC ACC TTA GTC CCC AAA CCT A	14
EV Inver F2	AAC CCA AGC CTA TTT TAG CC	15
EV-INV-XbaI	GGT AAT AGG GTT CAC CTT AGT C	16
CRINVF5095	CTT TGA GCC AAA GAA TGG AA	17
CRINVR4776	TTT GGT AAT GAC CGG AGA CC	18
INVER0827R	ATA GCA GAG GAG CAC CCT AC	19
INVER0827F1	GGT ACA AGG ATT CCC CAA AGT G	20
INVER0827F2	GAT TTA GTC AGT ATG ACG ATG CCA C	21

상기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 저항성 식물체에서 당업계에 공지된 방법(Sambrook J. and D. W. Russel. 2001. Molecular Cloning. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.)에 따라 인버스 PCR을 수행하였다.

먼저, HindⅢ로 절단한 게놈 DNA를 T7 DNA 리가제(ligase)를 처리하여 원형으로 접합시킨 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 서열번호 4 및 서열번호 9의 프라이머 조합을 사용하여 네스티드(Nested) PCR로 재증폭하였다. 그 결과, 약 900bp 크기의 PCR 산물을 얻었다. 상기 PCR 산물의 염기서열을 프라이머 워킹(primer walking) 방법으로 분석하였다. 상기 염기서열을 서열번호 2의 염기서열에 연결하여 양 말단에 HindⅢ 부위를 가지는 1.8 kb의 염기서열을 얻었다. 이후, 상기 1.8 kb 크기의 염기서열을 바탕으로 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 제작하였다. 상기 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 조합을 사용하고, EcoRV로 절단하여 원형접합시킨 게놈 DNA를 주형으로 하여 다시 인버스 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 염기서열을 상기 1.8 kb 크기의 염기서열에 연결하여 양 말단에 EcoRV 부위를 갖는 3.4 kb 크기의 염기서열을 얻었다. 다시 동일한 방법으로 XbaI으로 절단하여 원형접합시킨 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 사용하여 인버스 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 염기서열을 분석하고, 이를 상기 3.4 kb 크기의 염기서열에 연결하였다. 그 결과, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 약 5.6 kb 길이의 염기서열이 결정되었다. 이의 염기서열을 서열번호 22로 기재하였다.

<실시예 7>

CAPS 분자 표지로의 전환

상기 서열번호 22의 염기서열에서 공지된 DNA 염기서열의 DNA 제한효소 부위를 알아낸 후, 저항성 식물체 및 이병성 식물체의 게놈 DNA의 제한효소 부위를 비교하여, 두 게놈 DNA 간에 다형성을 나타내는 제한효소인 XbaI(T'CTAG_A), EcoRI(G'AATT_C) 및 EcoRV(GAT'ATC)를 CAPS에 사용할 제한효소로 선택하고, 적절한 길이의 제한 패턴을 나타내는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 위치시킨 프라이머를 제작하였다. 즉, 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열로 구성된 프라이머를 4개 제작하였다(하기 표 2 참조).

CMV 저항성 확인을 위한 CAPS 분자 표지 개발을 위한 프라이머

	염기서열(5'→3')	프라이머 명	방향	서열번호
1	GTAGTAGGGTACGGACTCATA	SCC07S3	정방향	23
2	GTCCCGACGATAGCCCAAAAG	SCC07a	역방향	24
3	GGAGTTTCATCATATGAAGCC	CR1541-3	역방향	25
4	AGTGGAGCTTGGGGTAGTCC	FP5416R	역방향	26

서열번호 23과 24, 서열번호 23과 25 및 서열번호 23과 26 조합의 프라이머를 이용하고, 저항성 식물체 및 이병성 식물체, 그리고 이들의 F2 집단으로부터 추출된 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR은 94℃ 에서 1분 동안 주형 DNA를 변성시킨 후, 94℃ 에서 1분; 58℃ 에서 1분; 및 72℃ 에서 2분을 한 사이클로 하여 총 35회 반복수행한 다음 72℃ 에서 10분 동안 반응시켜 종결하였다. 이후, 증폭된 DNA를 실시예 6에서 선정된 제한효소(EcoRI, XbaI, EcoRV)로 절단하고, 아가로즈 겔에 전기 영동하여 유전자형, 즉 호모(RR)와 헤테로(Rr)형이 구분되는지 확인하였다.

서열번호 23과 24의 프라이머 조합으로, PCR을 수행한 결과를 도 4에 도시하였다. PCR 증폭된 DNA 단편의 크기는 1.0 kb이었다. 증폭된 DNA 단편을 XbaI으로 절단한 결과, 이병성과 저항성 친의 밴드 패턴이 다른 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 밴드 패턴이 실시예 1에서 F3 병저항성을 테스트하여 예측한 F2 식물체의 유전형과 동반분리되는 것을 확인할 수 있었다.

서열번호 23과 25의 프라이머 조합으로 PCR을 수행한 결과를 도 5에 도시하였다. PCR 증폭된 DNA 단편의 크기는 1,477 bp이었다. 증폭된 DNA 단편을 EcoRI(A)와 XbaI(B)으로 각각 절단한 결과, 이병성과 저항성 친의 밴드 패턴이 다른 것을 볼 수 있다. 또한 이 밴드 패턴이 실시예 1에서의 병 저항성 결과와 동반분리되는 것을 확인할 수 있었다.

서열번호 23과 26의 프라이머 조합으로 PCR을 수행한 결과를 도 6에 도시하였다. PCR 증폭된 DNA 단편의 크기는 1,846 bp이었다. 증폭된 DNA 단편을 EcoRI으로 절단한 결과, 이병성과 저항성 친의 밴드 패턴이 다른 것을 볼 수 있었으며, 이 밴드 패턴 또한 실시예 1에서의 병 저항성 결과와 동반분리되는 것을 볼 수 있었다.

상기 결과들은, 서열번호 22로 기재되는 염기서열 중 임의의 일련의 염기서열을 프라이머로 제작하여 PCR을 수행하고, 그 결과로 얻은 PCR 산물을 서열번호 22 내에 존재하는 제한효소로 절단하는 경우, CMV 저항성 유전자의 존재유무 및 그 상태(유전형), 즉 호모 또는 헤테로인지 구분할 수 있음을 보여주는 것이다. 즉, 서열번호 22로 기재되는 염기서열이 CMV 저항성 유전자와 상당히 근접되어 있으므로, 상기 염기서열들이 나타내는 어떠한 다형성을 사용하더라도 CMV 저항성 유전자의 존재여부를 파악하는 데 사용할 수 있다.

<실시예 8>

CAPS 분자 표지로의 전환 가능한 일련의 최소 염기서열의 수 결정

실시예 6에서 결정된 서열번호 22의 염기서열의 이용하여 CAPS 분자 표지로의 전환 가능한 가장 적은 일련의 염기서열의 수를 결정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 이를 위해 서열번호 23(Forward [SCC07S3]: 5'-GTAGTAGGGTACGGACTCATA-3')의 염기서열을 서열번호 27(Forward [SCC07S3-change]: 5'-gGTAGTAGGGTACGG-3')의 염기서열로, 그리고 서열번호 25(Reverse [CR1541-3] : 5'-GGAGTTTCATCATATGAAGCC-3')의 염기서열을 서열번호 28(Reverse [CR1541-3-change] : 5'-gGGAGTTTCATCAgc-3')의 염기서열로 각각 변형하였다(소문자는 임의의 부가/치환). 상기 변형된 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃ 에서 1분 동안 주형 DNA를 변성시킨 후, 94℃ 에서 1분; 50, 52, 54, 56 또는 58℃ 에서 1분; 및 72℃ 에서 2분을 한 사이클로 하여 총 40회 반복수행한 다음 72℃ 에서 10분 동안 반응시켜 종결하였다. 증폭된 DNA 단편의 크기는 1,477 bp이었다. 이후, 증폭된 DNA를 EcoRI로 절단하여 아가로즈 겔에 전기영동한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 이병성과 저항성 친의 밴드 패턴이 다른 것을 볼 수 있었으며, 이 밴드 패턴 또한 실시예 1에서의 병 저항성 결과와 동반분리되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 서열번호 22의 염기서열로부터 선택되는 최소 12개의 일련의 염기서열을 변형시킨 프라이머도 CMV 저항성을 검출하기 위한 CAPS 마커로 유용함을 확인할 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 CMV 저항성 형질과 연관 정도가 매우 높은 유전자 염기서열을 갖는 분자 표지를 제공함으로써 감별의 오류가 거의 없이 효율적으로 CMV 저항성 식물체를 감별할 수 있도록 한다. 또한 본 발명에 따른 분자 표지 및 이를 이용한 검출 방법은 CMV를 식물체에 직접 접종하지 않고서도 신속하고 정확하게 CMV 저항성 식물체를 검출할 수 있으며, 나아가 CMV 저항성 식물체의 유전형을 결정할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 오페론 프라이머(OPC-04 내지 OPC-08 및 OPC-10)를 이용하고 오이 모자이크 바이러스 저항성 DNA 풀(pool)(R)과 이병성 DNA 풀(S)을 주형으로 사용하여 RAPD 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2a 및 도 2b는 OPC-07 프라이머(서열번호 1)를 이용하여 저항성 식물체(R₀) 및 그의 F1(R₁), 이병성 식물체(S₀) 및 그의 F2(S₁), 저항성 F2 및 이병성 F2에 대하여 RAPD 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

도 3은 OPC-07 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편(서열번호 2)을 탐침으로 하여 RFLP 분석을 수행한 결과이다.

R: 저항성 식물체

S: 이병성 식물체

도 4는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 조합을 이용하여 CAPS 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 서열번호 23 및 서열번호 25의 프라이머 조합을 이용하여 CAPS 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

A: EcoRⅠ으로 절단한 경우

B: XbaⅠ으로 절단한 경우

도 6은 서열번호 23 및 서열번호 26의 프라이머 조합을 이용하여 CAPS 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

도 7은 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머 조합을 이용하여 CAPS 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

<110> FnP corp., Ltd <120> Molecular marker associated with CMV resistance and use thereof <130> NP04-0107 <150> KR 2003-75272 <151> 2003-10-27 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAPD primer (OPC-O7) <400> 1 gtcccgacga 10 <210> 2 <211> 1027 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 2 gacataatgt gtgactatga gtagtagggt acggactcat agggccaata gtatggatgg 60 cttgtgacat tgcccagaca acaagtcatg gtgacaactc gtartcagtc ttarcgagtc 120 ttcatgtaac ccgtagcgac taggcggtag atttttagct tacatttaag gcatcttact 180 aatttctctc tttcccaaca aaataccccc gacatataac acattgggga ccctattttc 240 ataactttaa caatcaatga cacctchtaa cccccttaaa ytccccactc aaaggcaaga 300 ctagggtttc aagaaattgg tcatctaggg ctctacgagt gatttcttct tcaaatttct 360 tggggattaa ggcatgtatc tctatcccta aacttttttt tcattatgta attaattggt 420 ttattattca catggttttg atgttgggtt tagcatgatg ggttgagtgt tttggatgta 480 atttgtttaa atgcttttcc cttgcttatt atggaataat tttatttgaa ttgatgatta 540 gtaaaatcat ttgggtgctt gggaatggtg aatgaaatag ggggtacaag gattccctaa 600 atttgtaaac aatggaaata ggggttcaag gatcacccaa ataattggat ttttgaataa 660 ttggattttt gtattgaaat tgataagaac ctcaacacac ttgcataatt ggttytagaa 720 tgtgattaat taattttcta ggcctacttt cttaraatta rcgcattgca taagaggata 780 acatayaaga atgatcttaa aaacgttgtg aggtacaagg attcacctaa gtgaatgatt 840 tttcttgaaa accttgtgcg gtacaaggat tctccaaagt gtatgataaa tggagtttgg 900 gtgtacaagg attcttccaa gtaatggatt aattgaattt ctagtaagat ttagtcagta 960 tgacgatgcc acttcataat gccttactta tgtttcagac tatctttcga attcttcttt 1020 tgggcta 1027 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRSCC07a primer for inverse PCR <400> 3 gtcccgacga tagcccaaaa g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVR65 primer for inverse PCR <400> 4 ttggccctat gagtccgtac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVR125 primer for inverse PCR <400> 5 actgactacg agttgtcacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVF629 primer for inverse PCR <400> 6 taggggttca aggatcaccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVR796 primer for inverse PCR <400> 7 tatcctctta tgcaatgcgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVR840 primer for inverse PCR <400> 8 aatccttgta cctcacaacg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVF975 primer for inverse PCR <400> 9 cgatgccact tcataatgcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inv l030514 R primer for inverse PCR <400> 10 gacttgggca ctacactgga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inv l030514 F primer for inverse PCR <400> 11 acataggcgt gtgctctgga 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR 1541-3 primer for inverse PCR <400> 12 ggagtttcat catatgaagc c 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InvXbTopF1010 primer for inverse PCR <400> 13 ggttcaagga tcacccaaat aa 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InvXbTopR107 primer for inverse PCR <400> 14 ttcaccttag tccccaaacc ta 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV Inver F2 primer for inverse PCR <400> 15 aacccaagcc tattttagcc 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV-INV-XbaI primer for inverse PCR <400> 16 ggtaataggg ttcaccttag tc 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVF5095 primer for inverse PCR <400> 17 ctttgagcca aagaatggaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRINVR4776 primer for inverse PCR <400> 18 tttggtaatg accggagacc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INVER0827R primer for inverse PCR <400> 19 atagcagagg agcaccctac 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INVER0827F1 primer for inverse PCR <400> 20 ggtacaagga ttccccaaag tg 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INVER0827F2 primer for inverse PCR <400> 21 gatttagtca gtatgacgat gccac 25 <210> 22 <211> 5591 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 22 tctagaacta gccagttcat gaggctcaat cctctgacct ttactagctc taaggtttag 60 gaggatcctc aaaggttcat gtatgagata gaaaaaacat ttagagtgat acatgctttc 120 gactctgaag gtgtataatt ttcaaaatat cagctgaagg atgtggtata tcaatggtat 180 gagaagtagg agcagttgag gggggatgat gctgagttag tcatatggga tatttttcta 240 gtacctttct tgattatttc tttcctcagg agataaggaa agcaaatgct gaggagttta 300 tgaataactt gataagggtt tgatccaccc tagtatttct ctgtagggtg ctcctctgct 360 atttatttgt tagaaagatg gttcccttta gatgtgtata gattatcgct agttgaataa 420 ggtgactatg aagaaaaagt accctctccc taagattgat gatttattca tccagcttca 480 gggtgcaaag tacttttcta aaattaatct ctgttaaggt tattattagt tgaaaattag 540 ggatgtggat atccctaagg ctacttttca aacccagtgt ggtcattatg agtttttggt 600 gatgtcctat ggtttgacta atgctccggt ggcaatcaag gatcttatga acatagtatt 660 ctgttagttc ctggatttat ttgttattgt gttaatagat gatattttgg tatattctaa 720 gagcgaggct gatcacgccg atcatctcca tatagtattg caaactttta aagatcaact 780 gttgtacgcc aaattttcta agtgtgaatt atggttgaat gtggtgacct tccttggtta 840 tattatttct agtgagggga ttatggtgga tccacaaaaa ttttatgcgg tgaagaagtg 900 gcctaaaacc atgattccaa ccaatattta gagtttttgg gtttagttag atattatagg 960 aggtttgtgg agagtttctc atcaattgat gctctattta ttaagttaac tcagaaaaaa 1020 ggtatggttt ctatggtcca atgcttgtca gggtagcttt gataagttga aggataagtt 1080 gactttggat atgatcttga ccctacccga aggttttaat gtttttttaa ttttgatgca 1140 tcccgtgtag gacttggttg tgttttgatg tagaaacaat agggttctgg cctatgcttc 1200 taggaaattg aaagttcatg aaatgaatta tgcgacacat aacttagaat tattagttgt 1260 ggtattttca ttgaagctta ggtatcgtta tttgtatggg ttcatgttga tatatgtttt 1320 gatcataaga ttctgtagta tgtgttcacc cagaaggagt tgaatctcag gcaaaggaca 1380 tggcttgagt ttctcaaagg ctatgacatt agtctccatt acaacccagg taaatctaac 1440 atggttgttg gtattcttag taggttgtcc atgggaagat tataaaatat ggatgaggaa 1500 aaatgagatt tggtgaagta tattcaccga tttggtaacc ttggagttcg tcttttggat 1560 tctgaggatg gaggtatggt tgttcaagag gtggtgaagt catctcttag tgttgaagta 1620 aaagcgaaac atgtcttgga tcctatctta atgcaaatca aagatgatgt gggtcaacag 1680 aaggttatgg ccttcaagat tggtagtaat ggtattttaa ggtaccaagg tagattgtgt 1740 gttaccgatg ttaatgggtt atgagaatga attttggttg aagctcatga gtcgtgattt 1800 atggctcatc ttggtttgac gaagatgtac catgattcga aggagattta ttggttgaat 1860 aatatgaaga gagatgtggc aaattttgtt gctatgttca tggtttgcca acaagtgaag 1920 gtggggaacc taaggcctgg tggattctat cgctcgtgtg gaagtgagag gtaatcagta 1980 tggattttgt ttccagtctt ccacggtctc gtagtaaatt ttatttgatt tgggtcatca 2040 ttgataggat gtctaagtct actcacttct tgccagtgag gactaataat tcatgggagg 2100 actacgcgaa gtttttcatt caggatatca tcaagttgca tggtgcttta gtttctatta 2160 tatctgatcg aggtactcag ttctcgtcta acttttagtg attatttcat gtaggtttgg 2220 ggactaaggt gaaccctatt accattttcc acccacagaa agatgtacaa gcagagagga 2280 ctattcagac tttggatagt atgctaaagg tatttgtgat taacttttgt ggtatttggg 2340 tttaccatat gcctctctta ctgtttgtgt ataataacaa ctattattct agcattcaga 2400 tgccccgttt gaggctttgg atggtaggag atgtcgttct cctattgggt ggttcaaatt 2460 tggtaagact agattggtca gcctggactt tgttcatgaa gctatagata aggtgaaggt 2520 gattagggat attcttaata ccacccaatg tcaccaaaat tcctatgtag acgtgaggca 2580 aagagagtta gagtttgatg ttggcaatta ggtgctcttg aaaatatccc ccatgaagga 2640 tgtgatatga tttgggaaga agcggaagct cagtcctcgt tatgtttgct cgtacttgaa 2700 ccttaggaga gtgggttatg ttgtttatga tttggatttg cctcgtagtt tgggttccat 2760 tcacctggag ttccacgtgt tgatgttgaa gaagtgcatg ggtgatcctt ccttgattgt 2820 ccttttgggg agtgttggta tttcatattc cttgtcttat gaggtattcc tgattgagat 2880 tttggatagg aaagtctatc atttgaggaa taaggatgtg gcttcgatga atgttctatt 2940 gaggaatcat aaggttgaag aagctacttg ggaagctaaa gaggacatga agtccaaata 3000 tccattcttg ttccctattc cggatagttg ctctcaagtt atgtgttttc cttaacatat 3060 ttgtattttg actttgttaa aggaaagtgt ggttgtgttt tgtgttaaat catacaaatg 3120 gatgctctgt ctcattattc agggacgaat aatcctacgg gggggggggg gggaatgtaa 3180 cacctcagat ttttggtcct tggaaaattt tttgactttt gaacttacag cctatgcaat 3240 gactcatctc acgagtcgta aggtgttgtc ttggcaggtc gtaggacccc aatcatagga 3300 tgaccagtaa agctttttca tgatactggc ttggtgatga cttgcacccc actagttgta 3360 aagattcatt acgagtcgta atatccagat catagggtgt ccaatgaaat ttgtcttttc 3420 tactctcttg attaaactag acataatgag tctaatacac tcttaacaag tcattgtgtg 3480 cctttcctgg caaatccagt gtagtgccca agtcattctt ccttgactat aactgaaccc 3540 gacgagacat aatgtgtgac tatgagtagt agggtacgga ctcatagggc caatagtatg 3600 gatggcttgt gacattgccc agacaacaag tcatggtgac aactcgtagt cagtcttagc 3660 gagtcttcat gtaacccgta gcgactaggc ggtagatttt tagcttacat ttaaggcatc 3720 ttactaattt ctctctttcc caacaaaata cccccgacat ataacacatt ggggacccta 3780 ttttcataac tttaacaatc aatgacacct cttaaccccc ttaaattccc cactcaaagg 3840 caagactagg gtttcaagaa attggtcatc tagggctcta cgagtgattt cttcttcaaa 3900 tttcttgggg attaaggcat gtatctctat ccctaaactt ttttttcatt atgtaattaa 3960 ttggtttatt attcacatgg ttttgatgtt gggtttagca tgatgggttg agtgttttgg 4020 atgtaatttg tttaaatgct tttcccttgc ttattatgga ataattttat ttgaattgat 4080 gattagtaaa atcatttggg tgcttgggaa tggtgaatga aataggggta caaggattcc 4140 ctaaatttgt aaacaatgga aataggggtt caaggatcac ccaaataatt ggatttttga 4200 ataattggat ttttgtattg aaattgataa gaacctcaac acacttgcat aattggttct 4260 agaatgtgat taattaattt tctaggccta ctttcttaga attagcgcat tgcataagag 4320 gataacatac aagaatgatc ttaaaaacgt tgtgaggtac aaggattcac ctaagtgaat 4380 gatttttctt gaaaaccttg tgcggtacaa ggattcccca aagtgtatga taaatggagt 4440 ttgggtgtac aaggattctt ccaagtaatg gattaattga atttctagta agatttagtc 4500 agtatgacga tgccacttca taatgcctta cttatgtttc agactatctt tcgaattctt 4560 cttttgggct atcgtcgggg gcatgtccaa actttgattg atttttggtt ctatttagag 4620 gatttgtgga tttctatgga ttgggatggt attattgatg catagaactt tccctatttt 4680 gaatttctct atcttgttat atttttgaaa ttcatccact actagctgtg ttgtgttcta 4740 tttggctagg caaaaaaggg tggtctccgg tcattaccaa acttgggaga cccttcatgg 4800 ccaggccctg gtttgggtca tgatattttc aacctcaaac aaaaatccat tctgaccatg 4860 agcacgattg attccacatc tttcatttga atattaatga tctttcaact 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SCC07a primer <400> 24 gtcccgacga tagcccaaaa g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR1541-3 primer <400> 25 ggagtttcat catatgaagc c 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FP5416R primer <400> 26 agtggagctt ggggtagtcc 20 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCC07S3-change primer <400> 27 ggtagtaggg tacgg 15 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR1541-3-change primer <400> 28 gggagtttca tcagc 15

Claims

서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산.
서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열 중에서 선택되는 일련의 염기서열을 포함하는 CMV(cucumber mosaic virus) 저항성 식물체 검출용 프라이머.
제2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 23 내지 서열번호 28로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 프라이머.
제1항의 핵산 또는 제2항의 프라이머를 포함하는 CMV 저항성 식물체 검출용 키트.
제1항의 핵산 또는 제2항의 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는, CMV 저항성 식물체의 검출 방법.
제5항에 있어서, 상기 분석은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 및 PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 식물체는 오이, 수박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 핵산 또는 제2항의 프라이머의 존재 하에서 식물체의 게놈 DNA를 분석하는 것을 포함하는, CMV 저항성 식물체의 유전자형(genotype)을 결정하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 분석은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 및 PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 식물체는 오이, 수박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
조직배양에 의해 무성번식되고, 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 함유하는 CMV 저항성 식물체.
제11항에 있어서, 상기 식물체는 오이, 수박, 고추, 메론, 배추, 담배, 페튜니아, 목화 및 장미로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CMV 저항성 식물체.
제11항 또는 제12항의 CMV 저항성 식물체로부터 수득되고, 서열번호 2 또는 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 핵산을 함유하는 종자.