JP2007509626A - CMV抵抗性連関分子マーカーおよびその用途(MolecularMarkerAssociatedWithCMVResistanceAndUseThereof) - Google Patents
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Abstract
Description
(a)CMVの抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムDNAを鋳型として、配列番号2または配列番号22の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基を含むプライマーを用いてPCRを行う段階;
(b)PCR産物を制限酵素で切断する段階;
(c)切断されたDNA断片らをアガロスゲルにローディングして、電気泳動する段階;および
(d)電気泳動が完了したゲルのDNAバンド様相を比較する段階。
(a)CMV抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号2で記載される塩基配列を増幅し得るプライマーを利用してPCRを行う段階;
(b)PCR産物をアガロスゲルにローディングして電気泳動する段階;および
(c)電気泳動が完了したゲルのDNAバンド様相を比較する段階。
(a)CMV抵抗性および罹病性植物体から得た各ゲノムDNAを適当な制限酵素で切断する段階;
(b)切断されたDNA断片をアガロスゲル上で電気泳動する段階;
(c)ゲル上のDNAをナイロン膜へと転移させる段階;
(d)配列番号2で記載される塩基配列を有する核酸を探針としてサザンブロットを行う段階;および
(e)X−rayフィルム上に露出させ、DNAバンド様相を比較する段階。
CMV抵抗性唐辛子植物体の馴化および分子マーカー開発のための交配集団作成とCMV抵抗性の遺伝様式究明
多様な唐辛子植物体にCMVを接種して、抵抗性植物体をスクリーニングした。その結果、アルジエン草系統のうち一つの植物体がCMV抵抗性として確認された。選ばれた植物体を‘FP11’と命名した。選ばれたFP11のCMV抵抗性の遺伝の有無をテストするために、自家受粉の集団および交配集団を作成した。前記交配集団は、FP11を罹病性系統であるFP14と交配させて作成した。交配されたF1の種子を播種して自家受粉させ、F2集団を作り、再び各々のF2植物体を自家受粉させ、F3集団を作った。F2とF3集団を対象にCMV抵抗性をテストした結果、CMV抵抗性はF2集団において3:1の比率で遺伝され、F3世代でホモ(homo)とヘテロ(hetero)の比率が1:2で分離された。これよりCMV抵抗性は優性の単一遺伝子により決定されることが確認された。
植物体からDNA分離
DNA抽出はプリンス等の方法(Prince,J.P., et al., HortScience 32;937-939,1997)を変形して行った。−80℃で保管した唐辛子の葉を液体窒素を利用して磨砕し、25mlのDNA抽出バッファ(7Mウレア、0.35M 塩化ナトリウム、0.05M Tris−HCl、pH8.0、0.02M EDTA、0.25% sarkosyl、5% ペノル、0.2% sodiumbisulfate)と混合した。以降、0.75mlの20%SDSを入れ、65℃で10分毎に揺さぶりながら30分間培養した。
CMV抵抗性連関RAPDのプライマーの選抜
CMV抵抗性形質と連関したDNA分子マーカーを選抜するために、RAPD(Williams、J. G. K. et al.、Nucl. Acids Res. 18、6531-6535、1990)とBSA(BulkedSegregant Analysis)方法(Michelmore、R. W. et al.、Proc. Nat. Acad. Sci.、88:9828-9832、1991)を用いた。前記実施例1のF2集団からのCMV抵抗性検定結果を基に抵抗性F2植物体10個体のDNAプール(pool)と感受性F2植物体10固体のDNAプールを作って、プールで作られたDNA濃度が20ng/μlとなるように調整し、これを鋳型に用いて、PCRを行った。このとき、RAPDプライマーのために、Operon RAPD 10−merキット(Operon、Alameda、CA、USA)の中でシリーズAからシリーズTまでの約400個のプライマーを対象にPCR反応が良好に引き起こされるプライマーを147個選抜し、選抜されたプライマーを用いて、抵抗性DNAプールと感受性DNAプール間に特異的に異なって増幅されるバンドを探索した。
RAPD分子マーカーのクローニングと塩基配列決定
配列番号1で記載される塩基配列を有するOPC−07プライマー(10mer)を利用して増幅されたDNAをゲルから分離・精製して、pGEM−Tベクトル(Promega社)にクローニングした。クローニングされたプラスミドを電気衝撃方法で大腸菌DH10Bに導入し、抗生剤が含まれている培地から形質転換体を選抜した。選抜された形質転換体から組み換えのプラスミドを分離し、前記プラスミド内に挿入されたDNAの塩基配列を分析した。決定された塩基配列を配列番号2で記載した。
CAPS分子マーカーへの転換およびインバスPCRを行うためのサザンブロット実施
抵抗性植物体と罹病性植物体のゲノムDNAを用意して、DNA制限酵素EcoRV、HindIII、XbaIおよびEcoRIで切断した後、アガロズゲールに電気泳動した。ナイロンのメンブレーンにDNAを移動させ、実施例4で増幅されたCMV抵抗性の特異的なDNA(配列番号2)を探針とし、サザンブロットを行った。その結果を図3に示した。図3で見るとおり、EcoRI、XbaI、EcoRVに対して多形性を示し、HindIIIに対しては多形性が表れなかった。前記RFLP分析結果を基にEcoRI、XbaIおよびEcoRV制限酵素をインバスPCRとCAPS分子マーカー転換に用いた。
CMV抵抗性遺伝子の近接DNA塩基配列の決定
実施例5の結果(図3)を基に実施例4で分析されたRAPDの分子マーカーの塩基配列の一部を用いてプライマーを製作した。製作されたプライマーの塩基配列を下記の表1に示した。
CAPS分子マーカーへの転換
前記配列番号22の塩基配列において公知されたDNAの塩基配列の制限酵素の部位を調べ、抵抗性植物体および罹病性植物体のゲノムDNAの制限酵素の部位を比較して、二つのゲノムDNA間に多形性を示す制限酵素のXbaI(T'CTAG_A)、EcoRI(G'AATT_C)およびEcoRV(GAT'ATC)をCAPSに用いる制限酵素として選び、適切な長さの制限パターンを示すDNA断片を増幅できるように位置付けしたプライマーを製作した。つまり、配列番号22の塩基配列の中で選ばれる一連の塩基配列で構成されたプライマーを4個製作した(下記の表2参照)。
CAPS分子マーカーへの転換可能な一連の最少の塩基配列の数の決定
実施例6で決定された配列番号22の塩基配列においてCAPS分子マーカーへの転換可能な最も少ない一連の塩基配列の数を決定するために、次の実験を行った。このため、配列番号23(Forward [SCC07S3]:5'-GTAGTAGGGTACGGACTCATA-3')の塩基配列を配列番号27(Forward [SCC07S3-change]:5'-gGTAGTAGGGTACG-3')の塩基配列に、さらに、配列番号25(Reverse [CR1541-3]:5'-GGAGTTTCATCATATGAAGCC-3')の塩基配列を配列番号28(Reverse[CR1541-3-change]:5'-gGGAGTTTCATCAgc-3')の塩基配列にそれぞれ変形した(小文字は任意の付加/置換)。前記の変形された配列番号27および配列番号28のプライマーを用いてPCRを行った。PCRは94℃で1分間鋳型DNAを変性させ、94℃で1分;50、52、54、56または58℃で1分;および72℃で2分を一サイクルとし、計40回繰り返した後、72℃で10分間反応させ、終結した。増幅されたDNA断片の大きさは1,477bpであった。以降、増幅されたDNAをEcoRIで切断し、アガロズゲルに電気泳動した結果、図7に示した通りに、罹病性と抵抗性親のバンドのパターンが異なることが見られて、このバンドパターンも実施例1における病抵抗性の結果と同伴分離されることが確認できた。
Claims (13)
- 配列番号2または配列番号22の塩基配列からなる核酸。
- 配列番号2または配列番号22の塩基配列のうちで選ばれる一連の塩基配列を含むCMV(cucumber mosaic virus)の抵抗性植物体検出用のプライマー。
- 前記プライマーは配列番号1および配列番号23ないし配列番号28からなる群より選ばれる塩基配列を有することを特徴とする請求項2記載のプライマー。
- 請求項1の核酸または請求項2のプライマーを含むCMV抵抗性植物体検出用のキット。
- 請求項1の核酸または請求項2のプライマーの存在下で植物体のゲノムDNAを分析することを含むCMV抵抗性植物体の検出方法。
- 前記分析はRFLP(restrictionfragment length polymerphism)、RAPD(randomlyamplified polymorphic DNA)、DAF(DNAamplification fingerprinting)、AP−PCR(arbitrarilyprimed PCR)、STS(sequence taggedsite)、EST(expressed sequencetag)、SCAR(sequencecharacterized amplified regions)、ISSR(inter-simple sequence repeat amplication)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)およびPCR−SSCP(single-strand conformationpolymorphism)からなる群より選ばれるいずれか一つの方法で行うことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 請求項1の核酸または請求項2のプライマーの存在下で植物体のゲノムDNAを分析することを含むCMV抵抗性植物体の遺伝子型(genotype)を決定する方法。
- 前記分析はRFLP(restrictionfragment length polymerphism)、RAPD(randomlyamplified polymorphic DNA)、DAF(DNAamplification fingerprinting)、AP−PCR(arbitrarilyprimed PCR)、STS(sequence taggedsite)、EST(expressed sequencetag)、SCAR(sequencecharacterized amplified regions)、ISSR(inter-simple sequence repeat amplication)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)およびPCR−SSCP(single-strand conformationpolymorphism)からなる群より選ばれるいずれか一つの方法で行うことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 組織培養により無性繁殖され、配列番号2または配列番号22の塩基配列からなる核酸を含むCMV抵抗性植物体。
- 前記植物体は胡瓜、スイカ、唐辛子、メロン、白菜、タバコ、ペチュニア、綿花および薔薇からなる群より選ばれることを特徴とする請求項11に記載のCMV抵抗性植物体。
- CMV抵抗性植物体から収得され、配列番号2または配列番号22の塩基配列からなる核酸を含むことを特徴とする請求項11または12に記載の種子。
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