CN1438232A - 玉米醇溶蛋白基因片段及引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在玉米中特有的PCR扩增得到的DNA片段以及用于该扩增的PCR引物。所述片段和引物可特异性地识别玉米DNA成分的存在。
Description
技术领域
本发明涉及核酸，具体地讲，本发明涉及玉米的特异性核酸。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)被广泛应用于各种以DNA为基础的分析。但是，为保证PCR分析的成功，关键在于模板DNA的质量和数量以及所用引物的特异性程度。
不同来源的DNA例如各种加工食品的DNA，常常会受到蛋白质、脂肪、多糖、聚酚及其他物质的污染，这些物质可能与DNA聚合酶及核酸相互作用而影响PCR分析，甚至在某些情况下还会导致假阴性结果。
玉米非常广泛地应用于食品上，如蛋糕、奶粉、朱古力、糖果、果汁、酒精类及非酒精类饮品、雪藏食物及各式各样的酱料等。据估计，含有玉米的加工食物占所有食品的百分之20-40％。食物(包括转基因食品)中是否含有玉米成份，目前尚未有简单可行的测定方法。
以聚合酶链式反应(PCR)为基础的DNA分析方法可用于检测食品中是否含有玉米DNA。玉米醇溶蛋白并不存在于其他农作物中。玉米醇溶蛋白DNA序列与其他的醇溶蛋白不同。因此，可找出其中特有的一段序列，据此设计并合成引物用于PCR扩增。
发明内容
本发明的目的在于找到一种在玉米中特有的DNA序列，以此设计出一段能用于特异性地扩增所述玉米特有DNA片段的引物。本发明的另一目的在于提供由所述引物通过PCR扩增玉米DNA而得到的DNA片段，从而鉴定食品(包括转基因生物)中玉米DNA的存在。
本发明的发明人根据玉米醇溶蛋白基因(Genbank入藏号X07535)的核苷酸序列，设计了并合成了一段特定的DNA序列作为引物，使用该引物已成功地扩增出了玉米及其加工食品中所含的玉米DNA。具体地讲，本发明包括如下方面：
一方面，本发明提供一种DNA，其包含如下SEQ ID NO：1所示的序列或与SEQ ID NO 1所示序列具有至少99％序列同一性的序列：ccattgggta ccatgaaccc atgcatgcag tactgcatga tgcaacaggg gcttgccagcttgatggcgt gtccgtccct gatgctgcag caactgttgg ccttaccgct tcagacgatgccagtgatga tgccacagat gatgacgcct aacatgatgt caccattgat gatgccgagcatgatgtcac caatggtctt gccgagcatg atgtcgcaaa tgatgatgcc acaatgtcactgcgacgccg tctcgcagat tatgct (SEQ ID NO：1)
另一方面，本发明提供一种引物，其具有如下SEQ ID NO：2所示序列中的至少17个连续的核苷酸：
5’-ccattgggtaccatgaacc-3’(SEQ ID NO：2)。
这些引物是用于扩增玉米醇溶蛋白基因片段的正向引物。其中，优选该引物优选具有SEQ ID NO：2所示序列中的至少18个连续的核苷酸。最优选具有SEQ ID NO：2所示的序列：5’-ccattgggtaccatgaacc-3’。
再一方面，本发明提供一种引物，其具有如下SEQ ID NO：3所示序列中的至少17个连续的核苷酸：
5’-agcataatctgcgagacgg-3’(SEQ ID NO：3)。
该引物是用于扩增玉米醇溶蛋白基因片段的反向引物。其中，该引物优选具有SEQ ID NO：3所示序列中的至少17个连续的核苷酸。更优选具有SEQ ID NO：3所示序列中的至少18个连续的核苷酸。最优选该引物具有序列：5’-agcataatctgcgagacgg-3’。
本发明的上述引物(下文中有时称为“本发明引物”)具有高度的特异性。在不同的植物品种(玉米、番茄、土豆和大豆)中提取DNA。以所得DNA为模板并使用本发明的引物，进行PCR扩增，确定玉米醇溶蛋白基因片段引物的特异性。反应结果显示只在玉米中扩增得到了266bp的DNA片段。
具体实施方式
以下以实施例的方式对本发明做进一步的描述，但是无论在何种意义上实施例都不对本发明构成限制。
实施例
玉米醇溶蛋白基因片段的引物的合成
按照本领域公知的常规方法制备引物。例如，在DNA自动合成仪(例如在美国PE公司的ABI3949型全自动DNA合成仪)上按照制造商的说明进行合成。分别合成玉米醇溶蛋白基因的正向引物5’-ccattgggtaccatgaacc-3’(SEQ ID NO：2)和玉米醇溶蛋白基因的反向引物5’-agcataatctgcgagacgg-3’(SEQ ID NO：3)。
玉米醇溶蛋白基因的266bp的DNA片段的扩增
以Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒，按照制造商的说明提取玉米DNA并溶于100微升双蒸水中。取5微升DNA，加入PCR预混液(1倍PCR缓冲液，200微摩尔dNTP，200微摩尔玉米醇溶蛋白基因片段的正向和反向引物和0.25单位Taq DNA聚合酶)。所述PCR缓冲液为：10mM Tris-HCl(pH 8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2和0.1％TritonX-100。PCR反应在Applied Biosystems所生产的GeneampPCRSystem 9700仪上进行，反应程序为：95℃2分钟，随后是94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，反应35个循环，外加10分钟最终延伸反应。PCR产物由1％的琼脂糖胶电泳分离。采用Perkin Elmer ABI 310测序仪对所扩增出的DNA进行测序，结果如SEQ ID NO：1所列。
玉米醇溶蛋白基因片段引物的特异性
以Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒所述方法提取DNA，在不同的植物品种(玉米、番茄、大豆和土豆)中提取DNA并溶于100微升双蒸水。取5微升DNA，按以上PCR反应条件进行PCR扩增。PCR产物由1％的琼脂糖胶电泳分离。实验结果显示，只在玉米中扩增得到了266bp的DNA片段。通过DNA测序，结果证实扩增得到了的该266bp的片段其序列如SEQ ID NO：1所示。
对玉米加工食品进行PCR分析
分别提取5％Bt-176玉米、粟米片、玉米粉、玉米油、玉米的DNA。其中采用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒提取固体材料的DNA，采用乙烷和硫氰酸胍方法提取玉米油的DNA。向2克液体样品中加入10毫升乙烷和1毫升提取液(提取液的组成为100毫摩尔Tris-HCl，pH6.4；500毫摩尔EDTA，pH8.0；2.6克Triton X100和120克硫氰酸胍；通过0.2微米微孔膜进行无菌过滤)，彻底混合均匀。然后5,000Xg离心20分钟将上层和中间层移入新的离心管；加入等体积氯仿后震荡成乳浊液状，再15,000Xg离心10分钟后取上层，移入新的离心管；加入2微升糖原溶液(20微克糖原/微升)和400至600微升的异丙醇，室温中反应30分钟。然后15,000Xg离心10分钟沉淀DNA，并用70％的乙醇洗两次。空气干燥后加入50微升的0.2×TE(10毫摩尔Tris-HCl，pH8.0；1毫摩尔EDTA)缓冲液，此DNA溶液过Pharmacia Microspin S300柱除去残留的RNA并脱盐后保存在4℃。
从固体和液体样品中所提取DNA均用下列方法进行PCR扩增。采用本发明的玉米醇溶蛋白基因片段的正向和反向引物对所提取的DNA进行PCR扩增并以PCR缓冲液为PCR阴性对照。反应程序为：95℃2分钟，随后是94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，反应35个循环，外加10分钟最终延伸反应。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离。结果表明，除阴性对照外，在所有被测试材料中均扩增得到了266bp的片段。
玉米醇溶蛋白基因引物的长度与PCR产物的序列同一性的关系
分别合成具有SEQ ID NO：2中至少17个连续核苷酸的DNA片段以及合成具有SEQ ID NO：3中至少17个连续核苷酸的DNA片段。重复以上PCR反应的条件对玉米DNA进行扩增。所得PCR产物经1％的琼脂糖胶电泳分离后测序。并以SEQ ID NO：1为参考序列，计算所扩增的PCR产物与参考序列相比的序列同一性。结果如表1所示。
表1
| 引物长度 | PCR产物与SEQ ID NO：1相比的同一性 |
| 正向引物17/反向引物19 | 99.8％ |
| 正向引物18/反向引物19 | 99.9％ |
| 正向引物19/反向引物17 | 99.8％ |
| 正向引物19/反向引物18 | 99.9％ |
| 正向引物17/反向引物17 | 99.0％以上 |
| 正向引物18/反向引物18 | 99.7％ |
注：引物后的数字代表与正向引物(SEQ ID NO：2)或反向引物(SEQ ID NO：3)的序列相同的连续核苷酸数。
以上对本发明进行了详细的描述，本领域的技术人员可在不背离本发明精神的前提下对本发明作出一些不脱离本发明范围的修改或改变。只要在所附权利要求的范围内，这些修改和改变就包括在本发明之中。
序列表<110>创念分子标签有限公司(MolecularTaq Limited)<120>玉米醇溶蛋白基因片段及引物<130>SPI020273-09<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>266<212>DNA<213>玉米(Zea mays)<400>1ccattgggta ccatgaaccc atgcatgcag tactgcatga tgcaacaggg gcttgccagc 60ttgatggcgt gtccgtccct gatgctgcag caactgttgg ccttaccgct tcagacgatg 120ccagtgatga tgccacagat gatgacgcct aacatgatgt caccattgat gatgccgagc 180atgatgtcac caatggtctt gccgagcatg atgtcgcaaa tgatgatgcc acaatgtcac 240tgcgacgccg tctcgcagat tatgct 266<210>2<211>19<212>DNA<213>正向引物<400>2ccattgggta ccatgaacc 19<210>3<211>19<212>DNA<213>反向引物<400>3agcataatct gcgagacgg 19
Claims (9)
1.一种DNA，其包含SEQ ID NO：1所示的序列或与SEQ ID NO 1所示序列具有至少99％序列同一性的序列。
2.一种引物，其具有SEQ ID NO：2所示序列中的至少17个连续的核苷酸。
3.权利要求2所述的引物，其具有SEQ ID NO：2所示序列中的至少18个连续的核苷酸。
4.权利要求2所述的引物，其具有序列：5’-ccattgggtaccatgaacc-3’。
5.权利要求1-4中任一项所述的引物，其为用于扩增玉米醇溶蛋白基因片段的正向引物。
6.一种引物，其具有SEQ ID NO：3所示序列中的至少17个连续的核苷酸。
7.权利要求6所述的引物，其具有SEQ ID NO：3所示序列中的至少18个连续的核苷酸。
8.权利要求6所述的引物，其具有序列：5’-agcataatctgcgagacgg-3’。
9.根据权利要求7-9中任一项所述的引物，其为用于扩增玉米醇溶蛋白基因片段的反向引物。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN101544982B (zh) * | 2008-12-09 | 2011-05-04 | 四川农业大学 | 一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用 |
| CN110982826A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-10 | 中国农业大学 | 一种控制玉米籽粒发育基因ZmDek605的克隆、功能研究及标记挖掘 |
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2002
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101544982B (zh) * | 2008-12-09 | 2011-05-04 | 四川农业大学 | 一种新型γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其应用 |
| CN110982826A (zh) * | 2019-11-22 | 2020-04-10 | 中国农业大学 | 一种控制玉米籽粒发育基因ZmDek605的克隆、功能研究及标记挖掘 |
| CN110982826B (zh) * | 2019-11-22 | 2021-08-13 | 中国农业大学 | 一种控制玉米籽粒发育基因ZmDek605的克隆、功能研究及标记挖掘 |
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