CN111690717A

CN111690717A - 基于crispr技术进行目标核酸检测的方法和系统

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Publication number: CN111690717A
Application number: CN202010506420.2A
Authority: CN
Inventors: 梁亚峰; 段志强; 孙洁
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111690717B

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统，具体地，涉及一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有目标核酸的反应体系中加入核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸。该方法可以有效缩短检测时间且具有更高的灵敏度。

Description

基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向。因此，开发新型检测体系和检测方法在核酸检测领域仍具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，所述方法包括：

(1)提供目标核酸、核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；

(2)所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成含有至少部分单链核酸的核酸序列；

(3)所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；

(4)所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；

(5)测试是否能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。

本发明中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成单链核酸，如图1所示，由于核酸外切酶的作用，会将双链的目标核酸切割成含有部分单链核酸的形式。

在一个实施方式中，所述的目标核酸包括DNA、RNA，优选为双链核酸。

在一个实施方式中，所述目标核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述目标核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM扩增的产物。

在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得目标核酸的步骤。

在一个实施方式中，所述待检测的特征序列为病毒特异的序列、细菌特异的序列、与疾病相关的特征序列、特定的突变位点或SNP位点；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。如果目标核酸中存在上述待检测的特征序列，则可以反映出目标核酸来源的样品为某种病毒、细菌，或者是感染了某种病毒、细菌、疾病，或者是具有特定的突变位点或SNP位点。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白为具有双链和/或单链切割活性的蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型CRISPR/CAS效应蛋白，包括：Cas12、Cas13、Cas14家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h；优选Cas12a、Cas12b。

所述Cas12a，又称Cpf1，例如，中国专利申请CN107488710A中公开了Cas12a可以通过trans切割活性切割DNA探针从而用于核酸的检测，本发明在整个体系中加入核酸外切酶，结果显示其能够显著的提高Cas酶的检测灵敏度。

进一步，所述Cas12a选自如下序列组成的蛋白：

(1)SEQ ID No.1所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.1所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas12a蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

所述Cas12b，又称C2c1，例如，中国专利申请CN109689875A公开了C2c1蛋白；中国专利申请CN110551800A中公开了Cas12b可以通过trans切割活性切割DNA探针从而用于核酸的检测，本发明在整个体系中加入核酸外切酶，结果显示其能够显著的提高Cas酶的检测灵敏度。本发明中，所述Cas12b优选如下序列组成的蛋白：

(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.4所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas12b蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA包括靶向所述待检测特征序列的序列(导向序列)和识别Cas蛋白的序列(同向重复序列或其部分)。

在一个实施方式中，所述的导向序列包括10-25bp；优选地，12-23bp；优选地，15-23bp；优选地，16-18bp。

在一个实施方式中，所述gRNA与待检测特征序列至少有50％的匹配度，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％。

在一个实施方式中，当所述的特征序列含有一个或多个特征位点(如特定的突变位点或SNP)时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的特征序列。

在一个实施方式中，所述核酸外切酶选自5’端外切核酸酶或3’端外切核酸酶；优选地，所述核酸外切酶为5’端外切核酸酶；或者称之为，5’→3’核酸外切酶或3’→5’核酸外切酶，优选，5’→3’核酸外切酶。

在一个实施方式中，所述外切核酸酶选自：T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶或exonuclease VIII。

在一个实施方式中，所述的识别所述待检测的特征序列包括结合和/或切割待检测特征序列。

在一个实施方式中，所述步骤(4)和(5)可以通过以下方式实现：所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链寡核苷酸被切割后，可以表现出可检测的报告信号，通过报告信号的有无反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列；能够检测到报告信号，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测到报告信号，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。例如，单链寡核苷酸的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链寡核苷酸被切割后，可以表现出可检测的荧光信号，通过荧光信号的有无反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列；能够检测到荧光信号，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测到荧光信号，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述步骤(4)和(5)还可以通过其他的方式实现：所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式，检测所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的胶体金测试结果以反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列；所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后在胶体金的检测线和质控线上将表现出不同的显色结果。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白与gRNA的用量摩尔比为(0.8-1.2)：1。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述gRNA的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述目标核酸的用量终浓度为5-100nM，优选，10-50nM。

在一个实施方式中，所述单链寡核苷酸的用量终浓度为100-1000nM，优选，150-800nM，优选，200-800nM，优选，200-500nM，优选，200-300nM。

在一个实施方式中，所述核酸外切酶的用量终浓度为0.1-3.0U/μl，优选，0.2-2.0U/μl，更优选，0.5-1.0U/μl。

在一个实施方式中，所述单链寡核苷酸具有3-100个核苷酸，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

在一个实施方式中，所述单链寡核苷酸为单链DNA分子。

在一个实施方式中，所述方法可用于待检测特征序列的定量检测。

另一方面，本发明还提供了一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括：核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；

其中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成含有至少部分单链核酸的核酸序列；

所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性；

所述Cas蛋白通过反式(trans)单链DNA切割活性切割所述单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割后与所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；

如果能够检测出所述可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出所述可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。

另一方面，本发明还提供了一种基于CRISPR技术的用于检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的试剂盒，所述试剂盒包括：核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；

进一步的，所述试剂盒还包括用于扩增得到目标核酸的引物。

另一方面，本发明还提供了上述系统或者上述试剂盒在诊断待测样品中是否存在待检测的特征序列中的用途。

进一步的，所述用途包括从待测样品中获得目标核酸，进一步检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列。

优选的，可以通过基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)从待测样品中获得目标核酸。

在优选的实施方式中，所述待检测的特征序列为病毒特异的序列、细菌特异的序列、与疾病相关的特征序列、特定的突变位点或SNP位点；优选的，所述病毒为植物病毒或动物病毒；优选的，所述病毒为冠状病毒，优选，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。如果目标核酸中存在上述待检测的特征序列，则可以反映出目标核酸来源的样品为某种病毒、细菌，或者是感染了某种病毒、细菌、疾病，或者是具有特定的突变位点或SNP位点。

另一方面，本发明还提供了一种检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括检测装置、反应体系和检测剂；

所述反应体系包括核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；

其中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成含有至少部分单链核酸的核酸序列；所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白具有反式(trans)单链DNA切割活性，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性进而切割所述单链寡核苷酸；

所述单链寡核苷酸的一端连接有第一标记分子，另一端连接有第二标记分子；

所述检测剂连接有第一结合分子，所述第一标记分子能够与第一结合分子结合；

所述检测装置(优选为，试纸条)设置有第一检测线和第二检测线，所述第一检测线设置有可以捕获第一结合分子的第一物质，所述第二检测线设置有可以捕获第二标记分子的第二物质。

在优选的实施方式中，所述检测装置为试纸，优选为侧向流试纸。

在一个实施方式中，按流动的方向，第一检测线在第二检测线的下游。

进一步的，所述检测剂优选置于检测装置上，更优选，按流动的方向，所述检测剂置于第一检测线和第二检测线的上游。

在其他的实施方式中，所述第一检测线和第二检测线也成为质控线、检测线。

在一个实施方式中，在反应体系反应一段时间后，将至少部分检测剂或者全部检测剂与反应体系接触。

检测剂为胶体金属，胶体金属材料可以包括水不溶性金属颗粒或分散在液体、水溶胶或金属溶胶中的金属化合物，优选的金属包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍和钙，其他合适的金属还包括以下它们的各种氧化态：锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂和钆；在优选的实施方式中，胶体金属为胶体金。

检测剂为纳米级颗粒，优选，2nm-100nm，更优选，10nm-80nm，更优选，15nm、20nm、30nm。

检测剂与反应体系接触后，根据反应体系的反应结果，检测剂在第一检测线和第二检测线将呈现出不同的捕获信号。

如果目标核酸中没有待检测的特征序列，单链寡核苷酸不会被切割，检测剂在与反应体系接触后，更多的信号会被第二物质捕获并在第二检测线处积累，第一检测线出现更少的信号或者第一检测线不出现信号。

如果目标核酸中存在待检测的特征序列，单链寡核苷酸将被切割，检测剂在与反应体系接触后，更多的信号会被第一物质捕获并在第一检测线处积累，第二检测线出现更少的信号或者第二检测线不出现信号。

如此，根据第一检测线和第二检测线的信号强度的对比，即可以判断目标核酸中是否有待检测的特征序列。

在优选的实施方式中，所述第一标记分子为荧光素，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)或羧基荧光素(FAM)，或者地高辛(DIG)，5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。所述第二标记分子为生物素(Biotin)；优选的，所述第一标记分子置于所述单链寡核苷酸的5’端，所述第二标记分子置于所述单链寡核苷酸的3’端。

优选的，所述第一结合分子为可以与第一标记分子结合的第一抗体，所述第一物质为可以与第一结合分子结合的第二抗体。在优选的实施方式中，所述第一抗体为抗FITC抗体，抗FAM抗体，抗地高辛抗体，抗5-羧基四甲基罗丹明抗体。

优选的，所述第二物质为可以与生物素结合的亲和素，优选，链霉亲和素。

另一方面，本发明还提供了包含上述系统的用于检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的试剂盒。

另一方面，本发明还提供了上述系统在检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的用途。

另一方面，本发明还提供了上述系统在诊断或检测待测样品中是否存在待检测的特征序列中的用途。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体

亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，

或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上

是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行

比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，Thompson etal.,1994,Nucleic Acids Res 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

特征序列

如本文所用，所述“特征序列”或“待检测特征序列”或“待检测的特征序列”可以互换使用，均指表征生物体特异性或某些特有特征的核酸序列，所述特征序列与gRNA导向序列杂交促进CRISPR复合物的形成。所述的特征序列为DNA多核苷酸，其数量可以包含与gRNA导向序列互补的部分，也可以等同于或略少于gRNA导向序列互补的部分。在某些实施方式中所述的生物体包括动物、植物和微生物。所述微生物包括细菌、真菌、酵母、原生动物、寄生虫或病毒。例如，所述的特征序列可以是表征病毒特性的核酸序列(如果病毒为RNA序列，也包括通过逆转录形成的DNA序列)；例如，所述的特征序列可以是含有特异性突变位点的序列，例如动物细胞中诱发肿瘤的基因突变位点，或者在植物中改变植物性状的某些基因突变位点(如赋予ALS蛋白除草剂抗性的特异性突变位点)。

在某些实施方式中，所述病毒包括双链RNA病毒、正义RNA病毒、负义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起，或者病毒感染由冠状病毒科(Coronaviridae)病毒、小核糖核酸科(Picornaviridae)病毒、杯状病毒科(Caliciviridae)病毒、黄病毒科(Flaviviridae)病毒、披膜病毒科(Togaviridae)病毒、丝状病毒科(Filoviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或Delta virus引起，或者病毒感染由冠状病毒(Corona virus)、SARS、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、甲型肝炎(Hepatitis A)、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、黄热病病毒(Yellow fever virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、丙型肝炎毒(Hepatitis Cvirus)、登革热病毒(Dengue fever virus)、寨卡病毒(Zikavirus)、风疹病毒(Rubella virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)、基孔肯亚病毒(Chikungunya virus)、博尔纳病病毒(Borna disease virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、新型冠状病毒(2019-nCoV)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytialvirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fevervirus)、流感(Influenza)或丁型肝炎病毒(Hepatitis Dvirus)引起。

在某些示例性实施方式中，病毒可以是选自以下的植物病毒：烟草花叶病毒(TMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、RT病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)、梅花痘病毒(PPV)、雀麦花叶病毒(BMV)、马铃薯病毒X(PVX)、柑橘衰退病毒(CTV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、番茄丛生特技病毒(TBSV)、水稻球茎病毒(RTSV)、水稻黄色斑驳病毒(RYMV)、水稻灰白色病毒(RHBV)、玉米雷亚朵菲纳病毒(MRFV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、甘薯羽毛斑驳病毒(SPFMV)、甘薯沉降脉状线虫病毒(SPSVV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄病毒A(GVA)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄斑点病毒(GFkV)、葡萄卷叶病毒相关病毒-1、-2和-3、(GLRaV-1、-2和-3)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、或落叶松茎麻点相关病毒(RSPaV)。

在某些实施方式中，细菌的实例包括但不限于以下的一种或多种(或其组合)：放线杆菌属(Actinobacillus)种、放线菌纲(Actinomycetes)种、放线菌属(Actinomyces)种(例如Actinomyces israelii和Actinomyces naeslundii)、气单胞菌属(Aeromonas)种(例如Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)和Aeromonas caviae)、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale Alcaligenesxylosoxidans、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus actinomycetemcomitans、芽孢杆菌属(Bacillus)种(例如Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis和Bacillus stearothermophilus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、肠杆菌属(Enterobacter)种(例如Enterobacter aerogenes、Enterobacter agglomerans、Enterobacter cloacae和大肠杆菌，包括机会性大肠杆菌，例如enterotoxigenic E.coli、enteroinvasive E.coli、enteropathogenic E.coli、enterohemorrhagic E.coli、enteroaggregative E.coli和uropathogenic E.coli)、肠球菌属(Enterococcus)种(例如Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium)、埃立克体属(Ehrlichia)种(例如Ehrlichia chafeensia和Ehrlichia canis)、Epidermophyton floccosum、Erysipelothrix rhusiopathiae、真细菌属(Eubacterium)种、Francisella tularensis、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、嗜血杆菌属(Haemophilus)种(例如Haemophilus influenzae、Haemophilusducreyi、Haemophilusaegyptius、Haemo p hilus parainfluenza、Haemophilus haemolyticus和Haemophilus parahaemolyticus、螺杆菌属(Helicobacter)种(例如Helicobacterpylori、Helicobacter cinaedi和Helicobacter fennelliae)、Kingella kingii、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)种、乳酸菌属(Lactobacillus)种、Listeria monocytogenes、Leptospira interrogans、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、消化链球菌属(Peptostreptococcus)种、Mannheimia hemolytica、Microsporum canis、Moraxellacatarrhalis、摩根氏菌属(Morganell)种、动弯杆菌属(Mobiluncus)种、微球菌属(Micrococcus)种、分支杆菌属(Mycobacterium)种(例如Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacteriumintracellulare、Mycobacteriumavium、Mycobacterium bovis、和Mycobacteriummarinum)、支原体属(Mycoplasm)种(例如Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma hominis、和Mycoplasma genitalium)、诺卡氏菌属(Nocardia)种(例如Nocardia asteroides、Nocardia cyriacigeorgica和Nocardia brasiliensis)、奈瑟氏菌属(Neisseria)种(例如Neisseria gonorrhoeae和Neisseria meningitidis)、Pasteurella multocida、Pityrosporum orbiculare(Malassezia furfur)、普罗维登斯菌属(Providencia)种(例如Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri和Providencia stuartii)、铜绿假单胞菌、Propionibacterium acnes、Rhodococcus equi、Rickettsia sp.、沙门氏菌属(Salmonella)种(例如Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Salmonella cholerasuis和Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)种(例如Serratia marcesans和Serratia liquifaciens)、志贺氏菌属(Shigella)种(例如Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii和Shigella sonnei)、葡萄球菌属(Staphylococcus)种、链球菌属(Streptococcus)种(例如肺炎链球菌(例如氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌、奇放线菌素抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌、红霉素抗性血清型14肺炎链球菌、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌、四环素抗性血清型19F肺炎链球菌、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌、和甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌、氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌、奇放线菌素抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌、青霉素抗性血清型1 9F肺炎链球菌、或甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)种(例如Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、和Yersiniapseudotuberculosis)和Xanthomonas maltophilia等。

目标核酸

如本文所用，所述“目标核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。

在其他实施方式中，生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官(如根、茎、叶、花、种子、果实)等。

本发明中，所述的目标核酸还包括通过逆转录RNA形成的DNA分子，进一步地，所述的目标核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增，所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术，等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方式中，可以使用非等温扩增方法，其包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)。

进一步的，本发明所述的检测方法还一步包括对目标核酸扩增的步骤；所述的检测系统，还进一步包括对目标核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种：DNA聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。

Cas蛋白

本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链寡核苷酸，优选单链DNA(ssDNA))。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。所述Cas蛋白通过识别与特征序列临近的PAM(protospaceradjacent motif)识别特征序列。

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性。

本发明所述的Cas蛋白包括V型CRISPR/CAS效应蛋白，包括Cas12、Cas13、Cas14等蛋白家族。优选地，例如Cas12蛋白，例如Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h；优选地，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas12b。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta，固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与单链寡核苷酸互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

核酸外切酶

本发明所述的核酸外切酶或者称之为外切核酸酶，是指其可以以特定的方向消化双链DNA中的一条核苷酸链，即水解下单核苷酸，以形成单链核酸(又称粘性末端)，其包括5’端外切酶和3’外切酶。所述5’端外切酶是指其按照5’→3’的方向消化核苷酸链，所述3’外切酶是指其按照3’→5’的方向消化核苷酸链。本发明所述核酸外切酶优选DNA核酸外切酶。所述核酸外切酶包括但不限于：T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶或exonuclease VIII及其功能性变体。

本发明所述的外切核酸酶优选基本不消化单链寡核苷酸的酶。

单链寡核苷酸

本发明所述的单链寡核苷酸是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链寡DNA分子。

在一个实施方式中，所述的单链寡核苷酸可以包含A、T、C、G四种单核苷酸。

所述的单链寡核苷酸在检测方法或系统中用以报告是否含有特征序列。所述的寡核苷酸两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该寡核苷酸被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链寡核苷酸具有连接至5’端第一分子(如FAM或FITC)和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链寡核苷酸的反应体系与流动条配合用以检测特征序列(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述寡核苷酸链中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于待检测特征序列的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统、组合物、组合，所述系统、组合物、组合包括：核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；在一实施方式中，所述的检测系统、组合物、组合还进一步包括缓冲液。

本发明还提供了一种试剂盒，其含有本发明所述的系统、组合物、组合的装置。

本发明所述的系统、组合物、组合、试剂盒还进一步包括用于核酸扩增的试剂、引物。

附图说明

图1.本发明技术方案原理示意图。

图2.T5核酸外切酶对于Cas12a检测体系灵敏度的影响。其中，1为空白对照，2为添加T5核酸外切酶但不添加目标核酸实验组，3为添加目标核酸但不添加T5核酸外切酶实验组，4为同时添加目标核酸和T5核酸外切酶实验组。

图3.不同核酸外切酶对于Cas12b检测体系灵敏度的影响。其中，1为空白对照，2为添加T5核酸外切酶但不添加目标核酸实验组，3为添加T7核酸外切酶但不添加目标核酸实验组，4为添加目标核酸但不添加核酸外切酶实验组，5为同时添加目标核酸和T5核酸外切酶实验组，6为同时添加目标核酸和T7核酸外切酶实验组。

图4.T5核酸外切酶对于Cas12a试纸条检测体系灵敏度的影响。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，如图1所示，在待测样品中通过扩增的方法得到双链目标核酸，目标核酸中含有特征序列，在实际操作时，可根据特征序列设计合适的引物以待测样品为模板扩增目标核酸；在核酸外切酶，例如,5’→3’核酸外切酶的作用下，双链目标核酸会形成含有特征序列的单链核酸；利用可以与特征序列配对的gRNA引导Cas蛋白识别并结合在所述特征序列上；随后，Cas蛋白激发反式(trans)单链DNA切割活性，可以切割体系里的单链寡核苷酸；在本实施方式中，单链寡核苷酸的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链寡核苷酸被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链寡核苷酸的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

实施例1、添加T5核酸外切酶可以提高Cas12a的检测灵敏度

本实施方式中，所述Cas12a选自LbCas12a，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，也可以采用其他的Cas12a。

目标核酸为OsTGW6(双链DNA)，序列如SEQ ID No.2所示。

gRNA:LbCas12a-TGW6-g1，序列如SEQ ID No.3所示。

Reporter为5’6-FAM-TTTTT-3’BHQ1。

所述体系中Cas12a终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，dsDNA(目标核酸)浓度为1nM,Reporter(单链寡核苷酸)终浓度200nM，T5核酸外切酶浓度为0.5U/ul。

结果如图2所示，加入T5核酸外切酶可以明显提高Cas12a的荧光检测的灵敏度，缩短检测时间。

实施例2、添加T5核酸外切酶可以提高Cas12b的检测灵敏度

本实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；在其他的实施方式中，也可以采用其他的Cas12b。

用实施例1的目标核酸、以及Reporter，gRNA为AsCas12b-TGW6-g1，序列如SEQ IDNo.5所示。

加入浓度参见实施例1，验证不同的核酸外切酶，包括T5核酸外切酶、T7核酸外切酶对Cas12b检测效率的影响，如图3所示，加入不同的核酸外切酶均可以明显提高Cas12b的荧光检测的灵敏度，缩短检测时间。

实施例3、采用侧向流(胶体金)试纸条检测灵敏度试验

采用实施例1的目标核酸、Cas12a、gRNA、T5核酸外切酶，在反应完毕后，利用胶体金试纸条进行检测，Reporter为5’-/56-FAM/TTTTT/3Bio/-3’

所述试纸条的检测线标记有可以结合Bio的链霉亲和素，控制线上标记有可以结合胶体金金标抗体的抗体，所述金标抗体可以结合FAM。

如果Reporter被切开，在控制线上将富集更多的胶体金，如果Reporter未被切开，在检测线上将富集更多的胶体金。结果如图4所示，T5核酸外切酶的加入均可以明显提高Cas12a的侧向流试纸条检测灵敏度，缩短检测时间。

试纸条从左至右1-3所检测的反应体系中的样品如下表所示：

编号	1	2	3
				Cas12a	+	+	+
目标核酸	-	+	+
				T5核酸外切酶	+	-	+
Reporter	+	+	+

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 基于CRISPR技术进行目标核酸检测的方法和系统

<130> P2020-1074

<150> CN202010368212.0

<151> 2020-04-30

<150> CN202010368204.6

<151> 2020-04-30

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1228

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

405 410 415

Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

610 615 620

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro

1025 1030 1035

Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser

1040 1045 1050

Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr

1055 1060 1065

Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val

1070 1075 1080

Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu

1085 1090 1095

Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala

1100 1105 1110

Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met

1115 1120 1125

Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly

1130 1135 1140

Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp

1145 1150 1155

Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala

1160 1165 1170

Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala

1175 1180 1185

Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys Ala Glu Asp

1190 1195 1200

Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp

1205 1210 1215

Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

ccagaccgag agcaaatgcg gccgcccgtt aggcctacgg tttcactaca aaaccggcaa 60

cctgtacatc gccgacgcct acatgggatt gatgcgagtt ggtccaaaag gcggggaggc 120

aaccgtgcta gccatgaagg ctgatggcgt gccacttcgc ttcaccaatg gggtggacat 180

tgatcaggtt accggagatg tttatttcac cgacagcagc atgaactacc aacgatctca 240

gcacgagcaa gtcacggcga ccaaggattc gaccggacgg ctcatgaagt atgacccacg 300

aactaaccaa gtcaccgttc ttcaatccaa cataacctac ccgaacggtg tcgccatgag 360

cgctgaccga acacatctga tcgttgcatt gaccgggcca tgtaagttga tgaggcattg 420

gatccgaggc ccgaagactg gcaaatctga accatttgtt gacctgccag gctatcctga 480

taatgtgagg cctgatggaa aaggtggtta ttggatagcg cttcatcgcg agaagtatga 540

gcttcccttt ggtccggata gtcacttggt tgctatgagg gttagtgctg gtgggaagct 600

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga uuuucaccga cagcagcaug a 41

<210> 4

<211> 1129

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Ala Val Lys Ser Ile Lys Val Lys Leu Arg Leu Asp Asp Met Pro

1 5 10 15

Glu Ile Arg Ala Gly Leu Trp Lys Leu His Lys Glu Val Asn Ala Gly

20 25 30

Val Arg Tyr Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Leu Leu Arg Gln Glu Asn Leu

35 40 45

Tyr Arg Arg Ser Pro Asn Gly Asp Gly Glu Gln Glu Cys Asp Lys Thr

50 55 60

Ala Glu Glu Cys Lys Ala Glu Leu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Arg Gln

65 70 75 80

Val Glu Asn Gly His Arg Gly Pro Ala Gly Ser Asp Asp Glu Leu Leu

85 90 95

Gln Leu Ala Arg Gln Leu Tyr Glu Leu Leu Val Pro Gln Ala Ile Gly

100 105 110

Ala Lys Gly Asp Ala Gln Gln Ile Ala Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu

115 120 125

Ala Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Leu Gly Ile Ala Lys Ala Gly Asn

130 135 140

Lys Pro Arg Trp Val Arg Met Arg Glu Ala Gly Glu Pro Gly Trp Glu

145 150 155 160

Glu Glu Lys Glu Lys Ala Glu Thr Arg Lys Ser Ala Asp Arg Thr Ala

165 170 175

Asp Val Leu Arg Ala Leu Ala Asp Phe Gly Leu Lys Pro Leu Met Arg

180 185 190

Val Tyr Thr Asp Ser Glu Met Ser Ser Val Glu Trp Lys Pro Leu Arg

195 200 205

Lys Gly Gln Ala Val Arg Thr Trp Asp Arg Asp Met Phe Gln Gln Ala

210 215 220

Ile Glu Arg Met Met Ser Trp Glu Ser Trp Asn Gln Arg Val Gly Gln

225 230 235 240

Glu Tyr Ala Lys Leu Val Glu Gln Lys Asn Arg Phe Glu Gln Lys Asn

245 250 255

Phe Val Gly Gln Glu His Leu Val His Leu Val Asn Gln Leu Gln Gln

260 265 270

Asp Met Lys Glu Ala Ser Pro Gly Leu Glu Ser Lys Glu Gln Thr Ala

275 280 285

His Tyr Val Thr Gly Arg Ala Leu Arg Gly Ser Asp Lys Val Phe Glu

290 295 300

Lys Trp Gly Lys Leu Ala Pro Asp Ala Pro Phe Asp Leu Tyr Asp Ala

305 310 315 320

Glu Ile Lys Asn Val Gln Arg Arg Asn Thr Arg Arg Phe Gly Ser His

325 330 335

Asp Leu Phe Ala Lys Leu Ala Glu Pro Glu Tyr Gln Ala Leu Trp Arg

340 345 350

Glu Asp Ala Ser Phe Leu Thr Arg Tyr Ala Val Tyr Asn Ser Ile Leu

355 360 365

Arg Lys Leu Asn His Ala Lys Met Phe Ala Thr Phe Thr Leu Pro Asp

370 375 380

Ala Thr Ala His Pro Ile Trp Thr Arg Phe Asp Lys Leu Gly Gly Asn

385 390 395 400

Leu His Gln Tyr Thr Phe Leu Phe Asn Glu Phe Gly Glu Arg Arg His

405 410 415

Ala Ile Arg Phe His Lys Leu Leu Lys Val Glu Asn Gly Val Ala Arg

420 425 430

Glu Val Asp Asp Val Thr Val Pro Ile Ser Met Ser Glu Gln Leu Asp

435 440 445

Asn Leu Leu Pro Arg Asp Pro Asn Glu Pro Ile Ala Leu Tyr Phe Arg

450 455 460

Asp Tyr Gly Ala Glu Gln His Phe Thr Gly Glu Phe Gly Gly Ala Lys

465 470 475 480

Ile Gln Cys Arg Arg Asp Gln Leu Ala His Met His Arg Arg Arg Gly

485 490 495

Ala Arg Asp Val Tyr Leu Asn Val Ser Val Arg Val Gln Ser Gln Ser

500 505 510

Glu Ala Arg Gly Glu Arg Arg Pro Pro Tyr Ala Ala Val Phe Arg Leu

515 520 525

Val Gly Asp Asn His Arg Ala Phe Val His Phe Asp Lys Leu Ser Asp

530 535 540

Tyr Leu Ala Glu His Pro Asp Asp Gly Lys Leu Gly Ser Glu Gly Leu

545 550 555 560

Leu Ser Gly Leu Arg Val Met Ser Val Asp Leu Gly Leu Arg Thr Ser

565 570 575

Ala Ser Ile Ser Val Phe Arg Val Ala Arg Lys Asp Glu Leu Lys Pro

580 585 590

Asn Ser Lys Gly Arg Val Pro Phe Phe Phe Pro Ile Lys Gly Asn Asp

595 600 605

Asn Leu Val Ala Val His Glu Arg Ser Gln Leu Leu Lys Leu Pro Gly

610 615 620

Glu Thr Glu Ser Lys Asp Leu Arg Ala Ile Arg Glu Glu Arg Gln Arg

625 630 635 640

Thr Leu Arg Gln Leu Arg Thr Gln Leu Ala Tyr Leu Arg Leu Leu Val

645 650 655

Arg Cys Gly Ser Glu Asp Val Gly Arg Arg Glu Arg Ser Trp Ala Lys

660 665 670

Leu Ile Glu Gln Pro Val Asp Ala Ala Asn His Met Thr Pro Asp Trp

675 680 685

Arg Glu Ala Phe Glu Asn Glu Leu Gln Lys Leu Lys Ser Leu His Gly

690 695 700

Ile Cys Ser Asp Lys Glu Trp Met Asp Ala Val Tyr Glu Ser Val Arg

705 710 715 720

Arg Val Trp Arg His Met Gly Lys Gln Val Arg Asp Trp Arg Lys Asp

725 730 735

Val Arg Ser Gly Glu Arg Pro Lys Ile Arg Gly Tyr Ala Lys Asp Val

740 745 750

Val Gly Gly Asn Ser Ile Glu Gln Ile Glu Tyr Leu Glu Arg Gln Tyr

755 760 765

Lys Phe Leu Lys Ser Trp Ser Phe Phe Gly Lys Val Ser Gly Gln Val

770 775 780

Ile Arg Ala Glu Lys Gly Ser Arg Phe Ala Ile Thr Leu Arg Glu His

785 790 795 800

Ile Asp His Ala Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Leu Ala Asp Arg Ile

805 810 815

Ile Met Glu Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Ala Leu Asp Glu Arg Gly Lys

820 825 830

Gly Lys Trp Val Ala Lys Tyr Pro Pro Cys Gln Leu Ile Leu Leu Glu

835 840 845

Glu Leu Ser Glu Tyr Gln Phe Asn Asn Asp Arg Pro Pro Ser Glu Asn

850 855 860

Asn Gln Leu Met Gln Trp Ser His Arg Gly Val Phe Gln Glu Leu Ile

865 870 875 880

Asn Gln Ala Gln Val His Asp Leu Leu Val Gly Thr Met Tyr Ala Ala

885 890 895

Phe Ser Ser Arg Phe Asp Ala Arg Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys

900 905 910

Arg Arg Val Pro Ala Arg Cys Thr Gln Glu His Asn Pro Glu Pro Phe

915 920 925

Pro Trp Trp Leu Asn Lys Phe Val Val Glu His Thr Leu Asp Ala Cys

930 935 940

Pro Leu Arg Ala Asp Asp Leu Ile Pro Thr Gly Glu Gly Glu Ile Phe

945 950 955 960

Val Ser Pro Phe Ser Ala Glu Glu Gly Asp Phe His Gln Ile His Ala

965 970 975

Asp Leu Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Gln Arg Leu Trp Ser Asp Phe

980 985 990

Asp Ile Ser Gln Ile Arg Leu Arg Cys Asp Trp Gly Glu Val Asp Gly

995 1000 1005

Glu Leu Val Leu Ile Pro Arg Leu Thr Gly Lys Arg Thr Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Tyr Ser Asn Lys Val Phe Tyr Thr Asn Thr Gly Val Thr Tyr

1025 1030 1035

Tyr Glu Arg Glu Arg Gly Lys Lys Arg Arg Lys Val Phe Ala Gln

1040 1045 1050

Glu Lys Leu Ser Glu Glu Glu Ala Glu Leu Leu Val Glu Ala Asp

1055 1060 1065

Glu Ala Arg Glu Lys Ser Val Val Leu Met Arg Asp Pro Ser Gly

1070 1075 1080

Ile Ile Asn Arg Gly Asn Trp Thr Arg Gln Lys Glu Phe Trp Ser

1085 1090 1095

Met Val Asn Gln Arg Ile Glu Gly Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg

1100 1105 1110

Ser Arg Val Pro Leu Gln Asp Ser Ala Cys Glu Asn Thr Gly Asp

1115 1120 1125

Ile

<210> 5

<211> 105

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60

cguugaacuu caagcgaagu ggcacuuuca ccgacagcag cauga 105

Claims

1.一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，其特征在于，所述方法包括：

(2)所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成包含至少部分单链核酸的核酸序列；

(5)测试是否能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(4)所述的可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列；

所述的Cas蛋白为具有trans切割活性的蛋白，优选，Cas12a和/或Cas12b。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸外切酸酶包括5’→3’核酸外切酶或3’→5’核酸外切酶；优选地，所述核酸外切酶为5’→3’外切核酸酶；更优选的，所述核酸外切酶选自T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶或exonuclease VIII中的一种或任意几种。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，

所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链寡核苷酸被切割后，可以表现出可检测的报告信号，通过报告信号的有无反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列；

或者，所述单链寡核苷酸的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过侧向流试纸，例如，胶体金试纸检测的方式，检测所述单链寡核苷酸被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的结果以反映目标核酸中是否含有待检测的特征序列。

4.一种基于CRISPR技术检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括：核酸外切酶、gRNA、Cas蛋白和单链寡核苷酸；

其中，所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成包含至少部分单链核酸的核酸序列；

如果能够检测出所述可检测的区别，则反映目标核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出所述可检测的区别，则反映目标核酸中不含有待检测的特征序列；所述的Cas蛋白为具有trans切割活性的蛋白，优选，Cas12a和/或Cas12b。

5.一种检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括检测装置、反应体系和检测剂，其特征在于，

所述核酸外切酶用于消化所述目标核酸以形成含有至少部分单链核酸的核酸序列；所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白具有反式(trans)单链DNA切割活性，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发反式(trans)单链DNA切割活性进而切割所述单链寡核苷酸；

所述检测剂连接有第一结合分子，所述第一结合分子能够与第一标记分子结合；

所述检测装置设置有第一检测线和第二检测线，所述第一检测线设置有可以捕获第一结合分子的第一物质，所述第二检测线设置有可以捕获第二标记分子的第二物质；

所述的Cas蛋白优选Cas 12a和/或Cas12b。

6.一种利用权利要求5所述的系统检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，其特征在于，

获得目标核酸，将目标核酸与所述的反应体系反应一段时间后，将所述检测剂与反应体系接触；

根据以下结果判断目标核酸中是否存在待检测的特征序列：

如果目标核酸中没有待检测的特征序列，单链寡核苷酸不会被切割，检测剂在与反应体系接触后，更多的信号会被第二物质捕获并在第二检测线处积累，第一检测线出现更少的信号或者第一检测线不出现信号；

或者，如果目标核酸中存在待检测的特征序列，单链寡核苷酸将被切割，检测剂在与反应体系接触后，更多的信号会被第一物质捕获并在第一检测线处积累，第二检测线出现更少的信号或者第二检测线不出现信号。

7.一种基于CRISPR技术的用于检测目标核酸中是否存在待检测的特征序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4-5任一所述的系统；优选的，所述试剂盒还包括用于扩增得到目标核酸的引物。

8.权利要求5-6任一所述的系统或权利要求7所述的试剂盒在诊断或检测待测样品中是否存在待检测的特征序列中的用途。

9.如权利要求1-3任一所述的方法或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述待检测的特征序列为病毒特异的序列、细菌特异的序列、与疾病相关的特征序列、特定的突变位点或SNP位点；更优选的，所述病毒为植物病毒或动物病毒；更优选的，所述病毒为冠状病毒。

10.如权利要求1-3任一所述的方法或权利要求8所述的用途，其特征在于，所述目标核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体。