CN115044649A - 一种改进的基于crispr技术检测靶核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法，具体地提供了一种改进的基于CRISPR技术检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器接触；所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；所述经改造的tracrRNA根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端可以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构以指导Cas12b靶向所述DNA；检测由所述Cas12b切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体地，涉及一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法，尤其涉及一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒。
背景技术
特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。
目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。
目前，基于Cas酶的核酸检测技术，一般是通过对gRNA的靶向区进行设计从而可以适用于不同靶核酸的检测，例如，CN109837328A和CN110551800A公开的基于Cas12b的核酸检测技术。
本发明对基于Cas酶的核酸检测技术的检测方案进行了改进，从而提供了一种改进的基于CRISPR技术的核酸检测方法，扩展了该技术的应用空间。
发明内容
本发明基于Cas12b，提供了一种改进的靶核酸检测方法。
本领域知晓，Cas12b需要在gRNA(指导RNA)的作用下靶向靶序列，gRNA包括tracrRNA以及crRNA；tracrRNA的3’端能够与crRNA的5’端形成配对区，crRNA的3’端包括与靶序列杂交的区域；例如，现有技术(“Engineering of CRISPR-Cas12b for human genomeediting”，Jonathan Strecker等，NATURE COMMUNICATIONS，2019，10：212)以及(Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering，Teng et al.CellDiscovery，2018，4：63)均记载了tracrRNA和crRNA所形成的复合结构。
在一个实施方式中，本申请提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器接触；
所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；
所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端如此设置以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向所述DNA；
检测由所述Cas12b切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸。
所述DNA选自ssDNA(单链DNA)和/或dsDNA(双链DNA)，优选，ssDNA。
本发明中，所述DNA优选ssDNA；在其他的实施方式中，所述DNA还可以为dsDNA。
本领域技术人员知晓，Cas12b在结合或靶向ssDNA时，不需要PAM序列。Cas12b在结合或靶向dsDNA时，需要PAM序列，因此，当所述DNA为dsDNA时，需要根据Cas12b的特性，在dsDNA与所述靶核酸的第二区段杂交区域需要设置相应的PAM序列，这属于本领域的公知内容。
所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交，是指，所述DNA包含连续的与所述第二区段杂交的区域。
在一个实施方式中，所述靶核酸的第二区段的长度为10bp-50bp。
所述经改造的tracrRNA是能够与Cas12b相互作用的tracrRNA。
本发明中，所述靶核酸优选为RNA。
本发明对基于Cas12b的检测方法进行了改进，例如，CN109837328A和CN110551800A中均是对Cas12b的gRNA的靶向区进行设计从而检测不同的靶核酸(一般是DNA)。本发明中，对tracrRNA进行了改造，针对待检测的靶核酸(本申请中，待检测的靶核酸为RNA)，将tracrRNA的3’端进行设计使其与待检测的RNA可以形成类似于野生型tracrRNA和crRNA的复合结构；另外，本申请的检测体系中还引入了DNA，该DNA包含与待检测的RNA的杂交区域。
通过本发明的技术方案，将Cas12b、tracrRNA、ssDNA或dsDNA、Reporter(单链核酸检测器)加入到检测体系中，如果检测体系中存在待检测的RNA(所述RNA包括与tracrRNA互补配对的区域以及与DNA杂交的区域)，则Cas12b可以靶向DNA从而激发trans切割活性以切割体系中的Reporter；如果检测体系中不存在待检测的RNA，则Cas12b无法靶向DNA，也无法切割体系中的Reporter；基于上述不同的结果，即可反映出检测体系中是否存在待检测的RNA。
本发明基于待检测的RNA，对tracrRNA进行了改造，并且引入了可以与待检测的RNA杂交的DNA，该检测方法不同于常规的基于Cas12b的检测方案，扩展了应用范围。
例如，在一个实施方式中，按照常规的检测方式，采用野生型的tracrRNA和crRNA进行，需要将crRNA的间隔序列(或者，称之为靶向序列)根据检测的靶点进行设计，如图1所示(具体也可见现有技术Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genomeengineering，Teng et al.Cell Discovery，2018，4：63)；采用常规方式利用AaCas12b检测新冠病毒的ORF1ab基因(检测靶DNA位点序列为：agcaaataatagtttaaaaa)，如图2所示，tracrRNA和crRNA均为野生型，其中，tracrRNA的3’端和crRNA的5’端可以配对形成复合结构，crRNA的3’端为包含靶向靶核酸的靶向序列。
本发明的实施方式中，对上述方法进行改进，为了检测来自新冠病毒的靶RNA(序列为cagccauuagaucuguguggccaaccucuucuguaauuuuuaaacuauuauuugcu)；对tracrRNA进行了改造，如下所示，与野生型的tracrRNA相比，基于上述待检测的RNA的5’端，对tracrRNA的3’端进行了改造，改造后的tracrRNA的3’端能够与待检测的RNA的5’端形成类似于野生型tracrRNA和crRNA的复合结构。同时，根据待检测的RNA的3’端的序列信息，提供能够与其杂交的DNA(优选，ssDNA)。改造后的tracrRNA已经无法与野生型的crRNA形成复合结构，但是，改造后的tracrRNA可以与待检测的RNA形成复合结构，根据待检测的RNA的不同，可以对tracrRNA进行适应性的改造，从而用于不同RNA的检测。
在其他的实施方式中，本领域技术人员也可以基于其他的Cas12b的tracrRNA进行改造。
本发明中，所述Cas12b蛋白选自来自Alicyclobacillus acidiphilus的AaCas12b蛋白、来自Alicyclobacillus kakegawensis的AkCas12b蛋白、来自Alicyclobacillusmacrosporangiidus的AmCas12b蛋白、来自Bacillus hisashii的BhCas12b蛋白、来自Bacillus属的BsCas12b蛋白、来自Bacillus属的Bs3Cas12b蛋白、来自Desulfovibrioinopinatus的DiCas12b蛋白、来自Laceyella sediminis的LsCas12b蛋白、来自Spirochaetes bacterium的SbCas12b蛋白、来自Tuberibacillus calidus的TcCas12b蛋白中的一种或任意几种。
在一个具体的实施方式中，所述Cas12b为AaCas12b。
本发明中，所述经改造的tracrRNA可以通过转录得到，也可以直接通过合成得到。
本发明中，待检测的RNA可以是样品中天然存在的RNA，也可以对样品的DNA进行转录得到的RNA。在一个实施方式中，可以通过扩增的方式对样品进行富集。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述系统或组合物或试剂盒包括上述Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器；所述靶核酸的第二区段能够与所述DNA杂交；所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端可以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向DNA。
另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。
另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用。
本发明中，所述单链核酸检测器包括但不限于单链DNA、单链RNA、DNA-RNA杂交体、核酸类似物、碱基修饰物、以及含有无碱基间隔物的单链核酸检测器等；“核酸类似物”包括但不限于：锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基RNA、2’甲氧基乙酰基RNA、2’-氟RNA、2’-氨基RNA、4’-硫RNA及其组合，包括任选的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。
在其他的实施方式中，单链核酸检测器包括一个或多个的修饰，例如碱基修饰，骨架修饰，糖修饰等，以向核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。合适修饰的例子包括修饰的核酸骨架和非天然核苷间连接，具有修饰主链的核酸包括那些在主链中保留磷原子的核酸和那些在主链中不具有磷原子的核酸。合适的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基膦酸酯。在一些实施方式中，单链核酸检测器包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷键。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器可以是核酸模拟物；在某些实施方式中，所述核酸模拟物为肽核酸(PNA)，另一类核酸模拟物是基于具有连接到吗啉环上的杂环碱基的连接吗啉基单元(吗啉基核酸)，其他的核酸模拟物还包括环己烯基核酸(CENA)，还包括核糖或者脱氧核糖链。
所述单链核酸检测器不与所述待检测的靶核酸或者所述经改造的tracrRNA或者所述DNA杂交。
本发明中，所述靶核酸优选为RNA。
本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于试纸条的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量Cas12b产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。
本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。
在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。
在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。
在其他的实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。
由于本发明对基于Cas12b的检测方法进行了改进，因此，在检测体系中需要基于要检测的靶RNA对tracrRNA以及体系中的DNA进行改造；从而使得DNA能够与所述靶RNA的第二区段杂交；所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端如此设置以和所述靶RNA的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向所述DNA；在此情况下，也可以不依赖Cas12b的trans切割活性实现靶RNA的检测，检测体系中不需要再额外的添加单链核酸检测器。
在此情况下，只要在上述经改造的tracrRNA的末端添加第一标记分子，在所述DNA的末端添加第二标记分子，如果整个检测体系中存在靶RNA，则上述第一标记分子和第二标记分子可以在上述tracrRNA、靶RNA和DNA形成的类似“三明治”的复合结构下，与不存在靶RNA的情况下表现出不同的状态，从而通过对上述不同的状态的检测，反映出检测体系中是否存在靶RNA。
因此，在其他的实施方式中，本发明还提供了另一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述系统或组合物或试剂盒包括Cas12b、经改造的tracrRNA和DNA；所述靶核酸的第二区段能够与所述DNA杂交；所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端可以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向DNA，所述tracrRNA的末端添加第一标记分子，所述DNA的末端添加第二标记分子。
在一个实施方式中，所述tracrRNA的5’端或3’端添加第一标记分子，所述DNA的5’端或3’端添加第二标记分子。
另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。
另一方面，本发明还提供了上述系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种改进的检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA和DNA接触；
所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；
所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端如此设置以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向所述DNA；
所述tracrRNA的末端(5’端或3’端)添加第一标记分子，所述DNA的末端(5’端或3’端)添加第二标记分子；
在不存在所述靶核酸的情况下，所述第一标记分子和第二标记分子呈现第一状态；在存在所述靶核酸的情况下，所述第一标记分子和第二标记分子呈现第二状态；
所述第一状态和第二状态表现出可检测信号，根据可检测的信号从而检测所述靶核酸。
所述可检测信号可通过以下方式检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于试纸条的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
例如，在一个实施方式中，所述的tracrRNA的末端添加第一标记分子(如FAM或FITC)，所述DNA的末端添加第二标记分子(如生物素)。采用侧向流试纸条(优选，胶体金检测方式)对检测体系进行检测。所述的流动纸条被设计为具有两条捕获线；在样品接触端(胶体金)设有结合第一标记分子的抗体(即第一标记分子抗体)，在第一线(test line)处含有与第二标记分子结合的第二标记分子的抗体(即第二标记分子抗体，如亲和素)，在第二线(control line)处含有结合第一标记分子抗体的抗体。当反应沿着条带流动时，第一标记分子抗体与第一标记分子结合，如果检测体系中不存在靶RNA，则tracrRNA和DNA不能形成复合结构，从而导致携带第一标记分子的tracrRNA将在第二个捕获线处被捕获；如果检测体系中存在靶RNA，则tracrRNA和DNA可以形成复合结构，从而导致在第一捕获线处被捕获。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。换句话说，如果第一标记分子为FAM，第二标记分子为生物素(Biotin)，test line设置有亲和素(strep)，胶体金连接有FAM一抗，control line设置有FAM二抗，当有靶RNA存在时，胶体金-FAM-Biotin-strep复合物结合在test line；当没有靶RNA存在时，胶体金-FAM不能同Biotin-strep形成复合物，胶体金继续流动到control line，被FAM二抗捕获，control line显色。
在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。
在其他的实施方式中，也可以采用电化学检测的方式，当检测体系中存在靶RNA，则tracrRNA和DNA可以形成复合结构，从而与不存在靶核酸时表现出明显的电势变化。
又如，还可以采用荧光信号对上述检测体系进行检测，例如，第一标记分子和第二标记分子分别设置为荧光基团和淬灭基团，或者，第一标记分子和第二标记分子分别设置为淬灭基团和荧光基团；体系中存在靶RNA时，tracrRNA和DNA可以形成复合结构，从而导致荧光淬灭的效果；当体系中不存在靶RNA时，tracrRNA和DNA出于游离的状态，从而可以激发荧光信号。
在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。
在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。
在一个实施方式中，所述样品为来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物的样品。
在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。
在一些实施方式中，所述靶核酸来源于细胞，例如，来源于细胞裂解液。
在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。
优选的，所述单链核酸检测器在被所述Cas蛋白切割之前产生第一可检测信号，并且在被切割之后产生不同于第一可检测信号的第二可检测信号。
本发明中，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述第一区段长度为10bp-50bp，例如，20bp，25bp，30bp，35bp，40bp，或，45bp；所述第二区段长度为10bp-50bp，例如，20bp，25bp，30bp，35bp，40bp，或，45bp。
术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。
应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。
一般定义：
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，Thompson etal.,1994,Nucleic AcidsRes 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。
如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。
如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
靶核酸
如本文所用，所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。
在其他实施方式中，生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官(如根、茎、叶、花、种子、果实)等。
本发明中，所述的靶核酸还包括通过DNA转录形成的RNA分子，进一步地，所述的靶核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增，所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术，等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方式中，可以使用非等温扩增方法，其包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)。
进一步的，本发明所述的检测方法还一步包括对靶核酸扩增的步骤；所述的检测系统，还进一步包括对靶核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种：DNA聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。
Cas蛋白
本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型或VI型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链核酸检测器，优选单链DNA(ssDNA)、单链DNA-RNA杂交体、单链RNA)。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。
本文所称的Cas蛋白，如Cas12b，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。
在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12b，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。
在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。
所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。
宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
单链核酸检测器
本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。
本发明中，所述单链核酸检测器包括但不限于单链DNA、单链RNA、DNA-RNA杂交体、核酸类似物、碱基修饰物、以及含有无碱基间隔物的单链核酸检测器等；“核酸类似物”包括但不限于：锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基RNA、2’甲氧基乙酰基RNA、2’-氟RNA、2’-氨基RNA、4’-硫RNA及其组合，包括任选的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。
所述的单链核酸检测器在检测方法或系统中用以报告样品中是否靶核酸。所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。
在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。
在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子(如FAM或FITC)和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测特征序列(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。
本发明所述的检测方法，可用于待检测特征序列的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。
序列信息
本发明涉及的部分序列信息提供如下：
附图说明
图1.AaCas12b的野生型tracrRNA和crRNA复合结构示意图。
图2.常规的基于AaCas12b的野生型tracrRNA设计的检测Orf1ab1待测靶DNA的tracrRNA和crRNA复合结构示意图。
图3.本发明基于Orf1ab1基因待测靶RNA改造的AaCas12b的tracrRNA和crRNA复合结构示意图。
图4.采用AaCas12b进行Orflab1靶RNA检测荧光结果图；其中，1为采用ssDNA-1的实验结果，2为采用ssDNA-2的实验结果，3为不添加靶RNA的对照组。
图5.采用AaCas12b进行Orflab1靶RNA检测荧光结果图；其中，1为采用ssDNA-1的实验结果，2为采用ssDNA-3的实验结果。
图6.本发明基于S1基因待测靶RNA改造的AaCas12b的tracrRNA和crRNA复合结构示意图。
图7.采用AaCas12b进行S1基因靶RNA检测荧光结果图；其中，1为采用ssDNA的实验结果，2不添加靶RNA的对照组。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、利用Cas12b检测新冠病毒Orflab1基因
本实施方式中，采用AaCas12b对新冠病毒的Orflab1进行检测。
本实施方式中，选择来自Orflab1的靶RNA为(cagccauuagaucuguguggcc aaccucuucuguaauuuuuaaacuauuauuugcu)。
基于上述靶RNA的序列，对AaCas12b的tracrRNA进行了改造，如图3示，与野生型的tracrRNA相比，基于上述待检测的RNA的5’端，对tracrRNA的3’端进行了改造，改造后的tracrRNA的3’端能够与待检测的RNA的5’端形成类似于野生型tracrRNA和crRNA的复合结构。野生型tracrRNA和crRNA的复合结构如图1或图2所示；同时，根据待检测的RNA的3’端的序列信息，提供能够与其杂交的ssDNA。
如图3所示，根据AaCas12b野生型tracrRNA和crRNA互补配对的原则，待检测的RNA(即靶RNA)的5’至3’端依次包含两个区域，分别为cagccauuagaucuguguggccaaccucuucuguaa(第一区段)和uuuuuaaacuauuauuugcu(第二区段)，根据第一区段的序列，将野生型tracrRNA与crRNA复合的区域进行改造，改造成为“gaagagguaaaaugaccacacagaucuauugucug”；另外，引入包含与第二区段配对序列(agcaaataatagtttaaaaa)的ssDNA。
基于上述序列改造的AaCas12b的tracrRNA的序列如下：Gucuaaaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugagaagagguaaaaugaccacacagaucuauugucug；
所采用的ssDNA的序列如下：
ssDNA-1:agcaaataatagtttaaaaattacagaagaggttggccacacagatctaatggctgccctatagtgagtcgtattaatttc；
ssDNA-2:agcaaataatagtttaaaaattacagaagaggttggccacacagatctaatggctg；
ssDNA-1和ssDNA-2均包含与上述第二区段反向互补配对的序列(agcaaataatagtttaaaaa)。
另外，还采用了不包含与上述第二区段反向互补配对的序列的ssDNA-3(agttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagcttaccctatagtgagtcgtattaatttc)。
采用如下的反应体系验证：
AaCas12b，终浓度50nM；ssDNA(ssDNA-1或ssDNA-2)，终浓度50nM；单链核酸检测器(5'-FAM/TTATT/3'BHQ1)，终浓度500nM；tracrRNA，终浓度50nM；靶RNA，终浓度50nM。37℃孵育，读取FAM荧光/1min。对照组不添加靶RNA。
图4示出了采用AaCas12b进行靶RNA检测荧光结果图；其中，1为采用ssDNA-1的实验结果，2为采用ssDNA-2的实验结果，3为不添加靶RNA的对照组；与对照组相比，实验组1和2均可以快速的报告出荧光信号。
另外，采用ssDNA-3(无法与靶RNA互补的ssDNA)同样验证了AaCas12b的检测效果；与上述反应相比，只有ssDNA进行了改变。结果如图5所示。图5示出了采用AaCas12b以及ssDNA-1和ssDNA-3进行靶RNA检测的荧光结果图；其中，1为采用ssDNA-1的实验结果，2为采用ssDNA-3的实验结果；如图5所示，当ssDNA中不包含与靶RNA互补配对的序列时，无法报告出荧光，即无法用于检测靶RNA。
实施例2、利用Cas12b检测新冠病毒S1基因
本实施方式中，采用AaCas12b对新冠病毒的S1基因进行检测。
本实施方式中，选择来自S1基因的靶RNA(uaagcugcagcaccagcuguccaaccugaagaagaaucaccaggagucaaauaacu)作为检测对象。
基于上述靶RNA的序列，对AaCas12b的tracrRNA进行了改造，如图6示。如图6所示，根据AaCas12b野生型tracrRNA和crRNA互补配对的原则，待检测的RNA(即靶RNA)的5’至3’端依次包含两个区域，分别为uaagcugcagcaccagcuguccaaccugaagaagaa(第一区段)和ucaccaggagucaaauaacu(第二区段)，根据第一区段的序列，将野生型tracrRNA与crRNA复合的区域进行改造，改造成为“cuucagguaaaaugaacagcuggugcuguaguuua”；另外，引入包含与第二区段配对序列(agttatttgactcctggtga)的ssDNA。
改造的AaCas12b的tracrRNA的序列如下：gucuaaaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugacuucagguaaaaugaacagcuggugcuguaguuua；
所采用的ssDNA的序列如下：agttatttgactcctggtgattcttcttcaggttggacagctggtgctgcagctta；
采用如实施例1的反应体系进行检测，对照组不添加靶RNA。
图7示出了采用AaCas12b进行S1基因靶RNA检测荧光结果图；其中，1为采用ssDNA的实验结果，2为不添加靶RNA的对照组；与对照组相比，实验组1可以快速的报告出荧光信号。
序列表
<110> 山东舜丰生物科技有限公司
<120> 一种改进的基于CRISPR技术检测靶核酸的方法
<130> P2021-2074
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Orf1ab1
<400> 1
cagccauuag aucugugugg ccaaccucuu cuguaauuuu uaaacuauua uuugcu 56
<210> 2
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Orf1ab1-tracrRNA
<400> 2
gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60
cguugagaag agguaaaaug accacacaga ucuauugucu g 101
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Orflab1-ssDNA-1
<400> 3
agcaaataat agtttaaaaa ttacagaaga ggttggccac acagatctaa tggctgccct 60
atagtgagtc gtattaattt c 81
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Orflab1-ssDNA-2
<400> 4
agcaaataat agtttaaaaa ttacagaaga ggttggccac acagatctaa tggctg 56
<210> 5
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> Orflab1-ssDNA-3
<400> 5
agttatttga ctcctggtga ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttaccct 60
atagtgagtc gtattaattt c 81
<210> 6
<211> 56
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S1
<400> 6
uaagcugcag caccagcugu ccaaccugaa gaagaaucac caggagucaa auaacu 56
<210> 7
<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S1-tracrRNA
<400> 7
gucuaaagga cagaauuuuu caacgggugu gccaauggcc acuuuccagg uggcaaagcc 60
cguugacuuc agguaaaaug aacagcuggu gcuguaguuu a 101
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> S1-ssDNA
<400> 8
agttatttga ctcctggtga ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agctta 56
Claims (19)
1.一种改进的基于CRISPR技术检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸为RNA，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器接触；
所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；
所述经改造的tracrRNA根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端可以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构以指导Cas12b靶向所述DNA；
检测由所述Cas12b切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA为ssDNA或dsDNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经改造的tracrRNA可以通过转录得到，也可以直接通过合成得到。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于试纸条的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测，或者，基于半导体的检测。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、非人动物或植物的样品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、非人动物或植物等样品。优选的，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸选自样品中天然存在的RNA，以及对样品的DNA进行转录得到的RNA。
8.一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述靶核酸为RNA，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述系统或组合物或试剂盒包括权利要求1-7任一权利要求中所述的Cas12b、经改造的tracrRNA、DNA和单链核酸检测器。
9.权利要求8所述的系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用，所述靶核酸为RNA。
10.权利要求8所述的系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用，所述靶核酸为RNA。
11.一种改进的检测样品中靶核酸的方法，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述靶核酸为RNA，所述方法包括将样品与Cas12b、经改造的tracrRNA和DNA接触；
所述DNA能够与所述靶核酸的第二区段杂交；
所述经改造的tracrRNA是根据能够与Cas12b相互作用的野生型tracrRNA和crRNA所形成的复合结构进行改造，以使得所述经改造的tracrRNA的3’端如此设置以和所述靶核酸的第一区段互补配对从而形成类似野生型tracrRNA和crRNA互补配对所形成的复合结构从而指导Cas12b靶向所述DNA；
所述经改造的tracrRNA的末端添加第一标记分子，所述DNA的末端添加第二标记分子；
在不存在所述靶核酸的情况下，所述第一标记分子和第二标记分子呈现第一状态；在存在所述靶核酸的情况下，所述第一标记分子和第二标记分子呈现第二状态；
所述第一状态和第二状态表现出可检测信号，根据可检测的信号从而检测所述靶核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可检测信号可通过以下方式检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于试纸条的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光信号，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述DNA为ssDNA或dsDNA。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述样品为来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、非人动物或植物的样品。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、非人动物或植物等样品。优选的，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶核酸选自样品中天然存在的RNA，以及对样品的DNA进行转录得到的RNA。
17.一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述靶核酸具有5’至3’端依次连接的第一区段和第二区段，所述靶核酸为RNA，所述系统或组合物或试剂盒包括权利要求11-16任一权利要求中所述的Cas12b、经改造的tracrRNA和DNA。
18.权利要求17所述的系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用，所述靶核酸为RNA。
19.权利要求17所述的系统或组合物在制备检测样品中靶核酸的试剂或试剂盒中的应用，所述靶核酸为RNA。
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| JONATHAN STRECKER等人: "Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing", NATURE COMMUNICATIONS, pages 1 - 8 * |
| 李林显: "CRISPR-Cas12b的反式切割活性研究及其介导的核酸检测技术开发", 中国优秀硕士学位论文电子论文库 * |
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