CN114058735A

CN114058735A - 一种基于crispr技术检测手足口病的方法

Info

Publication number: CN114058735A
Application number: CN202010771023.8A
Authority: CN
Inventors: 段志强; 陈莹
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-02-18

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测手足口病的方法，包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤，所述单链核酸检测器可以为单链DNA、单链RNA或者单链DNA‑RNA杂交体。

Description

一种基于CRISPR技术检测手足口病的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测手足口病的方法、系统和试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种儿童常见传染病，5岁以下儿童多发。手足口病是全球性疾病，我国各地全年均有发生，发病率为37.01/10万～205.06/10万，近年报告病死率在6.46/10万～51.00/10万之间。肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。手足口病由肠道病毒引起，主要致病血清型包括柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)A组4～7、9、10、16型和B组1～3、5型，埃可病毒(Echovirus)的部分血清型和肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV-A71，或EV 71)等，其中以CV-A16和EV-A71最为常见，重症及死亡病例多由EV-A71所致。

目前临床上的检测还是以qPCR为主，但是qPCR所需要的时间太长(2h)、需要复杂的仪器设备、对操作人员熟练程度及专业要求较高。而最近兴起的等温扩增技术LAMP/RPA等能在恒温条件下(LAMP的反应温度是65℃，RPA的反应温度37℃)，有高效、特异、快速的扩增目标片段、不需要复杂的仪器设备等优点。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物，所述系统或组合物包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；所述靶核酸为引发手足口病的病毒的核酸。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

另一方面，本发明还提供了上述系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在检测样品中靶核酸中的应用；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

如上所述的应用，所述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在与样品中的靶核酸结合或杂交后，可以切割体系中的单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在制备检测样品中靶核酸的试剂中的应用；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

另一方面，本发明还提供了一种用于诊断和/或检测手足口病的系统或组合物或试剂盒，所述系统或组合物或试剂盒包括上述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与引发手足口病的病毒的核酸杂交的导向序列。在一个优选的实施方式中，所述系统或组合物或试剂盒还包括用于扩增病毒核酸的引物；优选的，所述引物为LAMP引物，优选的，所述LAMP所用的引物组如SEQ ID NO：1-6所示。

在一个实施方式中，所述靶核酸为肠道病毒核酸，优选的，所述肠道病毒选自柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组6型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒B组1型、柯萨奇病毒B组2型、柯萨奇病毒B组3型、柯萨奇病毒B组5型、肠道病毒71型(EV 71)中的一种或任意几种组合；更优选的，所述肠道病毒为肠道病毒71型(EV 71)。

另一方面，本发明还提供了一种用于诊断和/或检测手足口病的方法，所述方法包括将待测核酸与V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与引发手足口病的病毒的核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而诊断和/或检测手足口病。

进一步的，还包括从待测样品中获得待测核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从待测样品中获得待测核酸。

本发明所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。在优选的实施方式中，所述扩增为LAMP。

在一个优选的实施方式中，所述LAMP所用的引物组如SEQ ID NO：1-6所示。

本发明中，所述样品可以为来自受试者的样品，包括但不限于受试者的咽拭子、血液、痰液、肺泡灌洗液样本、脑脊液、疱疹液和肛拭子。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测或诊断受试者是否感染手足口病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与手足口病病毒核酸杂交的导向序列。在一个优选的实施方式中，所述试剂盒还包括用于扩增手足口病病毒的引物；优选的，所述引物为LAMP引物，优选的，所述LAMP所用的引物组如SEQ ID NO：1-6所示。

另一方面，本发明还提供了一种用于扩增或检测肠道病毒71型(EV 71)的LAMP引物组，所述引物组包括引物EV71-FIP、EV71-BIP、EV71-F3、EV71-B3、EV71-LF和EV71-LR；所述引物EV71-FIP、EV71-BIP、EV71-F3、EV71-B3、EV71-LF和EV71-LR的序列分别如SEQ IDNO：1-6所示。

另一方面，本发明还提供了上述LAMP引物组在检测或诊断手足口病中的用途。

另一方面，本发明还提供了上述LAMP引物组在制备检测或诊断手足口病的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种检测手足口病的试剂盒，所述试剂盒包扩上述LAMP引物组；优选的，所述试剂盒还包括上述V型或VI型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器。

本发明所述的手足口病可以为柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组6型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒B组1型、柯萨奇病毒B组2型、柯萨奇病毒B组3型、柯萨奇病毒B组5型、肠道病毒71型(EV 71)中的一种或任意几种引起的手足口病；优选的，为肠道病毒71型(EV 71)所引起的手足口病。

进一步的，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体，所述VI型CRISPR/CAS效应蛋白包括Cas13家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，或者，将SEQ ID No.7所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在其他的实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，或者，将SEQID No.8所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b，优选的，所述Cas13a选自Lshcas13a。

在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：9所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：9所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

所述Cas12j蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：10所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：10所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

本发明中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA-RNA杂交体的组合物、单链RNA和单链DNA-RNA的组合物。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器还包括对碱基的修饰。

在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器为单链寡核酸检测器。

所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量CRISPR/CAS效应蛋白(Cas蛋白)产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。

在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。

在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。

在一个实施方式中，所述的靶核酸包括DNA、RNA，优选为单链核酸或双链核酸或核酸修饰物。

在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。

优选的，所述单链核酸检测器在被所述Cas蛋白切割之前产生第一可检测信号，并且在被切割之后产生不同于第一可检测信号的第二可检测信号。

在其他的实施方式中，单链核酸检测器包括一个或多个的修饰，例如碱基修饰，骨架修饰，糖修饰等，以向核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。合适修饰的例子包括修饰的核酸骨架和非天然核苷间连接，具有修饰主链的核酸包括那些在主链中保留磷原子的核酸和那些在主链中不具有磷原子的核酸。合适的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基膦酸酯。在一些实施方式中，单链核酸检测器包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷键。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器可以是核酸模拟物；在某些实施方式中，所述核酸模拟物为肽核酸(PNA)，另一类核酸模拟物是基于具有连接到吗啉环上的杂环碱基的连接吗啉基单元(吗啉基核酸)，其他的核酸模拟物还包括环己烯基核酸(CENA)，还包括核糖或者脱氧核糖链。

本发明中，所述gRNA包括靶向靶核酸的序列(导向序列)和识别Cas蛋白的序列(同向重复序列或其部分)。

本发明中，所述的导向序列包括10-40bp；优选地，12-25bp；优选地，15-23bp；优选地，16-18bp。

本发明中，所述gRNA与待检测特征序列至少有50％的匹配度，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的特征序列。

在一个实施方式中，所述的识别所述待检测的特征序列包括结合和/或切割待检测特征序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白与gRNA的用量摩尔比为(0.8-1.2)∶1。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述gRNA的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述靶核酸的用量终浓度为5-100nM，优选，10-50nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的用量终浓度为100-1000nM，优选，150-800nM，优选，200-800nM，优选，200-500nM，优选，200-300nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器具有2-300个核苷酸，优选，3-200个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

在一个实施方式中，所述方法可用于待检测特征序列的定量检测。

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。

本发明发现V型或VI型CRISPR/CAS蛋白(包括Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas13a)一旦通过结合靶核酸而被激活，就可以混杂地切割非靶向单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)或者单链DNA-RNA杂交体。因此，当靶核酸存在于样品中时，可以利用所述CRISPR/CAS蛋白切割单链核酸检测器(包括，单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体)，通过单链核酸检测器所表现出的检测信号来进行检测。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体

亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，

或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上

是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行

比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482Pearson&Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85：2444，Thompson etal.，1994，Nucleic Acids Res 22：467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

LAMP

LAMP又称作环介导的等温扩增(LAMP)法(WO00/28082)。该LAMP法是由Notomi等人开发的，它可以在恒定的温度下进行。该法中，使模板核苷酸的3’末端退火，从那里开始合成互补链，而且其中与之组合使用了一种与由上述合成而形成的环退火的引物。这使得核酸扩增可以在等温条件下完成。在LAMP法中，引物3’末端总是与一个衍生自样品的区域退火，且由此，一种核查核苷酸序列互补键合的机制不断重复的起作用。结果，实现了高灵敏度和特异性的核酸扩增。

手足口病

手足口病由肠道病毒引起，主要包括柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)A组4～7、9、10、16型和B组1～3、5型，埃可病毒(Echovirus)的部分血清型和肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV-A71，或EV 71)等，其中以CV-A16和EV-A71最为常见，重症及死亡病例多由EV-A71所致。优选的，在本发明中检测手足口病是指检测肠道病毒71型(Enterovirus A71，EV-A71，或EV 71)。

Cas蛋白

本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型或VI型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链核酸检测器，优选单链DNA(ssDNA)、单链DNA-RNA杂交体、单链RNA)。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性。

本发明所述的Cas蛋白包括V型和VI型CRISPR/CAS效应蛋白，包括Cas12、Cas13、Cas14等蛋白家族。优选地，例如Cas12蛋白，例如Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j；优选地，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j。Cas13蛋白家族包括Cas13a、Cas13b等。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

在一个实施方式中，Cas蛋白选自如下序列组成的蛋白：

(1)SEQ ID NO：7-10所示的蛋白；

(2)SEQ ID NO：7-10所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

所述的单链核酸检测器在检测方法或系统中用以报告样品中是否存在靶核酸。所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映能够检测出靶核酸；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映无法检测出靶核酸。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至一端第一分子(如FAM或FITC)和连接至另一端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测靶核酸(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于靶核酸的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

序列信息

本发明涉及的部分序列信息提供如下：

序号	描述	类型
			SEQ ID NO：1	EV71-FIP	DNA
SEQ ID NO：2	EV71-BIP	DNA
			SEQ ID NO：3	EV71-F3	DNA
SEQ ID NO：4	EV71-B3	DNA
			SEQ ID NO：5	EV71-LF	DNA
SEQ ID NO：6	EV71-LR	DNA
			SEQ ID NO：7	LbCas12a	Protein
SEQ ID NO：8	Cas12b	Protein
			SEQ ID NO：9	Cas12i	Protein
SEQ ID NO：10	Cas12j	Protein
			SEQ ID NO：11	gRNA	RNA

附图说明

图1.采用3组LAMP引物进行手足口病检测的结果：泳道1-4分别是第1组引物在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下的扩增结果，泳道5是第1组引物的阳性对照，泳道6是第1组引物的阴性对照，第1组引物在以上条件下均不能扩增出目标条带；泳道7-10分别是第2组引物在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下的扩增结果，泳道11是第2组引物的阳性对照，泳道12是第2组引物的阴性对照，第2组引物在以上条件下均不能扩增出目标条带；泳道13-16分别是第3组引物在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下的扩增结果，泳道17是第3组引物的阳性对照，泳道18是第3组引物的阴性对照，第3组引物在在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下均能扩增出目标条带，同时阳性对照有条带，阴性对照无条带。

图2.采用3种不同浓度的第3组LAMP引物进行手足口病检测的结果：泳道1-4分别是在样品浓度为200aM、20aM、2aM和阴性对照的情况下扩增反应22min的结果，底物浓度为200aM和20aM时可扩增出目标条带，2aM和阴性对照无条带；泳道5-8分别是在样品浓度为200aM、20aM、2aM和阴性对照的情况下扩增反应24min的结果，3种底物浓度皆可扩增出目标条带，阴性对照无条带；泳道9-12分别是在样品浓度为200aM、20aM、2aM和阴性对照的情况下扩增反应26min的结果，3种底物浓度皆可扩增出目标条带，阴性对照无条带。

图3.采用第3组LAMP引物进行扩增后，利用Cas酶荧光检测手足口病的结果：不同样品浓度均可以快速的报告出荧光。

图4.采用第3组LAMP引物进行扩增后，试纸条检测手足口病的结果。样品浓度为20fM、200aM、20aM时试纸条检测结果为阳性，阴性对照的试纸条检测为阴性。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，获得待测样品的核酸，比如，可以通过扩增的方法得到靶核酸，利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas蛋白激发单链DNA、单链RNA或单链DNA-RNA杂交体的切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

实施例1、采用3组LAMP引物进行手足口病(肠道病毒71型，EV71)的检测

LAMP扩增手足口病(肠道病毒71型，EV71)基因，设计引物3组LAMP引物，序列如表1所示。

表1. 3组用于扩增EV71病毒的LAMP引物

按照以下体系加样，65℃条件下，反应30min。将LAMP扩增产物跑胶，3组LAMP引物分别扩增手足口病病毒的跑胶结果如图1所示，第1组引物和第2组引物在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下均不能扩增出目标条带，第3组引物在样品浓度为20fM、200aM、20aM、2aM的情况下均可以扩增出目标条带。

实施例2、采用3种不同浓度的第3组LAMP引物进行手足口病的检测

采用实施例1的反应体系，按照200aM、20aM、2aM梯度样品浓度进行反应，在65℃下反应，分别取22min、24min、26min的反应结果跑胶。凝胶电泳图如图2所示，样品浓度为200aM和20aM时，反应22min、24min、26min时都可以扩增出目标条带；样品浓度为2aM时，反应24min和26min时可以扩增出目标条带。

实施例3、采用第3组LAMP引物进行扩增后，利用Cas12i进行荧光检测

采用实施例1的反应体系，按照200aM、20aM、2aM梯度样品浓度进行反应，在65℃下反应，取24min的反应结果进行CRISPR检测。

检测系统中分别加入Cas12i(SEQ ID NO：9)、gRNA(SEQ ID NO：11、LAMP产物和单链核酸检测器Reporter(5’-FAM-TTGTT-3’BHQ)；Cas12i的终浓度为100nM，gRNA的终浓度为50nM，LAMP产物1ul，Reporter(5’-FAM-TTGTT-3’BHQ)的终浓度500nM。

检测结果如图3所示，200aM、20aM、2aM样品浓度下的扩增产物均可以在10min内检测到明显荧光信号。

实施例4、采用第3组LAMP引物进行扩增后，试纸条检测手足口病的结果

采用实施例1的反应体系，按照20fM、200aM、20aM梯度样品浓度进行反应，在65℃下反应，取30min的反应结果进行CRISPR检测。

实验体系为：Cas12i的终浓度为100nM，gRNA的终浓度为50nM，LAMP产物1ul，单链核酸检测器Reporter(5’-FAM-TTGTT-3’BIO)的终浓度500nM，总体系为20ul的反应体系。

纳米金试纸条显色的结果如图4所示，42℃反应3min后，向反应体系中插入试纸条，20fM、200aM、20aM样品浓度下的扩增产物检测结果均为阳性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种基于CRISPR技术检测手足口病的方法

<130> 11

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tgtggaacaa cttccccggt gcatgcgctt tgatgcagag t 41

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tatgtttgtg ccacctggag ccagtggcag tttgccatgc 40

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gcgtaggaag gtggagct 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ctggagggtc tgacagct 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tgtgcacgca acaaaagt 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aagccagatt caagggaat 19

<210> 7

<211> 1228

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

405 410 415

Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

610 615 620

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp Ser

1010 1015 1020

Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro Glu Glu

1025 1030 1035 1040

Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr Asp

1045 1050 1055

Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Arg Ile

1060 1065 1070

Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val Phe Asp Trp Glu Glu

1075 1080 1085

Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile

1090 1095 1100

Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp

1105 1110 1115 1120

Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln

1125 1130 1135

Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser

1140 1145 1150

Pro Val Lys Asn Ser Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu

1155 1160 1165

Ala Gln Glu Asn Ala Ile Leu Pro Lys Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala

1170 1175 1180

Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys

1185 1190 1195 1200

Ala Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys

1205 1210 1215

Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225

<210> 8

<211> 1129

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Ala Val Lys Ser Ile Lys Val Lys Leu Arg Leu Asp Asp Met Pro

1 5 10 15

Glu Ile Arg Ala Gly Leu Trp Lys Leu His Lys Glu Val Asn Ala Gly

20 25 30

Val Arg Tyr Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Leu Leu Arg Gln Glu Asn Leu

35 40 45

Tyr Arg Arg Ser Pro Asn Gly Asp Gly Glu Gln Glu Cys Asp Lys Thr

50 55 60

Ala Glu Glu Cys Lys Ala Glu Leu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Arg Gln

65 70 75 80

Val Glu Asn Gly His Arg Gly Pro Ala Gly Ser Asp Asp Glu Leu Leu

85 90 95

Gln Leu Ala Arg Gln Leu Tyr Glu Leu Leu Val Pro Gln Ala Ile Gly

100 105 110

Ala Lys Gly Asp Ala Gln Gln Ile Ala Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu

115 120 125

Ala Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Leu Gly Ile Ala Lys Ala Gly Asn

130 135 140

Lys Pro Arg Trp Val Arg Met Arg Glu Ala Gly Glu Pro Gly Trp Glu

145 150 155 160

Glu Glu Lys Glu Lys Ala Glu Thr Arg Lys Ser Ala Asp Arg Thr Ala

165 170 175

Asp Val Leu Arg Ala Leu Ala Asp Phe Gly Leu Lys Pro Leu Met Arg

180 185 190

Val Tyr Thr Asp Ser Glu Met Ser Ser Val Glu Trp Lys Pro Leu Arg

195 200 205

Lys Gly Gln Ala Val Arg Thr Trp Asp Arg Asp Met Phe Gln Gln Ala

210 215 220

Ile Glu Arg Met Met Ser Trp Glu Ser Trp Asn Gln Arg Val Gly Gln

225 230 235 240

Glu Tyr Ala Lys Leu Val Glu Gln Lys Asn Arg Phe Glu Gln Lys Asn

245 250 255

Phe Val Gly Gln Glu His Leu Val His Leu Val Asn Gln Leu Gln Gln

260 265 270

Asp Met Lys Glu Ala Ser Pro Gly Leu Glu Ser Lys Glu Gln Thr Ala

275 280 285

His Tyr Val Thr Gly Arg Ala Leu Arg Gly Ser Asp Lys Val Phe Glu

290 295 300

Lys Trp Gly Lys Leu Ala Pro Asp Ala Pro Phe Asp Leu Tyr Asp Ala

305 310 315 320

Glu Ile Lys Asn Val Gln Arg Arg Asn Thr Arg Arg Phe Gly Ser His

325 330 335

Asp Leu Phe Ala Lys Leu Ala Glu Pro Glu Tyr Gln Ala Leu Trp Arg

340 345 350

Glu Asp Ala Ser Phe Leu Thr Arg Tyr Ala Val Tyr Asn Ser Ile Leu

355 360 365

Arg Lys Leu Asn His Ala Lys Met Phe Ala Thr Phe Thr Leu Pro Asp

370 375 380

Ala Thr Ala His Pro Ile Trp Thr Arg Phe Asp Lys Leu Gly Gly Asn

385 390 395 400

Leu His Gln Tyr Thr Phe Leu Phe Asn Glu Phe Gly Glu Arg Arg His

405 410 415

Ala Ile Arg Phe His Lys Leu Leu Lys Val Glu Asn Gly Val Ala Arg

420 425 430

Glu Val Asp Asp Val Thr Val Pro Ile Ser Met Ser Glu Gln Leu Asp

435 440 445

Asn Leu Leu Pro Arg Asp Pro Asn Glu Pro Ile Ala Leu Tyr Phe Arg

450 455 460

Asp Tyr Gly Ala Glu Gln His Phe Thr Gly Glu Phe Gly Gly Ala Lys

465 470 475 480

Ile Gln Cys Arg Arg Asp Gln Leu Ala His Met His Arg Arg Arg Gly

485 490 495

Ala Arg Asp Val Tyr Leu Asn Val Ser Val Arg Val Gln Ser Gln Ser

500 505 510

Glu Ala Arg Gly Glu Arg Arg Pro Pro Tyr Ala Ala Val Phe Arg Leu

515 520 525

Val Gly Asp Asn His Arg Ala Phe Val His Phe Asp Lys Leu Ser Asp

530 535 540

Tyr Leu Ala Glu His Pro Asp Asp Gly Lys Leu Gly Ser Glu Gly Leu

545 550 555 560

Leu Ser Gly Leu Arg Val Met Ser Val Asp Leu Gly Leu Arg Thr Ser

565 570 575

Ala Ser Ile Ser Val Phe Arg Val Ala Arg Lys Asp Glu Leu Lys Pro

580 585 590

Asn Ser Lys Gly Arg Val Pro Phe Phe Phe Pro Ile Lys Gly Asn Asp

595 600 605

Asn Leu Val Ala Val His Glu Arg Ser Gln Leu Leu Lys Leu Pro Gly

610 615 620

Glu Thr Glu Ser Lys Asp Leu Arg Ala Ile Arg Glu Glu Arg Gln Arg

625 630 635 640

Thr Leu Arg Gln Leu Arg Thr Gln Leu Ala Tyr Leu Arg Leu Leu Val

645 650 655

Arg Cys Gly Ser Glu Asp Val Gly Arg Arg Glu Arg Ser Trp Ala Lys

660 665 670

Leu Ile Glu Gln Pro Val Asp Ala Ala Asn His Met Thr Pro Asp Trp

675 680 685

Arg Glu Ala Phe Glu Asn Glu Leu Gln Lys Leu Lys Ser Leu His Gly

690 695 700

Ile Cys Ser Asp Lys Glu Trp Met Asp Ala Val Tyr Glu Ser Val Arg

705 710 715 720

Arg Val Trp Arg His Met Gly Lys Gln Val Arg Asp Trp Arg Lys Asp

725 730 735

Val Arg Ser Gly Glu Arg Pro Lys Ile Arg Gly Tyr Ala Lys Asp Val

740 745 750

Val Gly Gly Asn Ser Ile Glu Gln Ile Glu Tyr Leu Glu Arg Gln Tyr

755 760 765

Lys Phe Leu Lys Ser Trp Ser Phe Phe Gly Lys Val Ser Gly Gln Val

770 775 780

Ile Arg Ala Glu Lys Gly Ser Arg Phe Ala Ile Thr Leu Arg Glu His

785 790 795 800

Ile Asp His Ala Lys Glu Asp Arg Leu Lys Lys Leu Ala Asp Arg Ile

805 810 815

Ile Met Glu Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Ala Leu Asp Glu Arg Gly Lys

820 825 830

Gly Lys Trp Val Ala Lys Tyr Pro Pro Cys Gln Leu Ile Leu Leu Glu

835 840 845

Glu Leu Ser Glu Tyr Gln Phe Asn Asn Asp Arg Pro Pro Ser Glu Asn

850 855 860

Asn Gln Leu Met Gln Trp Ser His Arg Gly Val Phe Gln Glu Leu Ile

865 870 875 880

Asn Gln Ala Gln Val His Asp Leu Leu Val Gly Thr Met Tyr Ala Ala

885 890 895

Phe Ser Ser Arg Phe Asp Ala Arg Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys

900 905 910

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Pro Leu Arg Ala Asp Asp Leu Ile Pro Thr Gly Glu Gly Glu Ile Phe

945 950 955 960

Val Ser Pro Phe Ser Ala Glu Glu Gly Asp Phe His Gln Ile His Ala

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Tyr Ser Asn Lys Val Phe Tyr Thr Asn Thr Gly Val Thr Tyr Tyr Glu

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<210> 9

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<212> PRT

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180 185 190

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<211> 47

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

agagaaugug ugcauaguca cacaugcaga guucacuuuu guugcgu 47

Claims

1.一种基于CRISPR技术检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触；所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与所述靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测所述靶核酸；所述靶核酸为病毒核酸，所述病毒可以引发手足口病。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒核酸为来源于肠道病毒的核酸；

优选的，所述肠道病毒选自柯萨奇病毒A组4型、柯萨奇病毒A组5型、柯萨奇病毒A组6型、柯萨奇病毒A组7型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒A组16型、柯萨奇病毒B组1型、柯萨奇病毒B组2型、柯萨奇病毒B组3型、柯萨奇病毒B组5型、肠道病毒71型(EV 71)中的一种或任意几种组合；

更优选的，所述肠道病毒为肠道病毒71型(EV 71)。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas12家族蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物；所述VI型Cas蛋白选自Cas13家族蛋白，优选的，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤；优选的，采用扩增的方法从样品中获得靶核酸；更优选的，所述扩增选自PCR、基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)中的一种或任意几种。

6.一种用于检测手足口病的系统或组合物或试剂盒，所述系统或组合物或试剂盒包括权利要求1-5任一权利要求中所述的V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA和单链核酸检测器；所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与所述病毒核酸杂交的导向序列。

7.用于扩增或检测肠道病毒71型(EV 71)的LAMP引物组，所述引物组包括引物EV71-FIP、EV71-BIP、EV71-F3、EV71-B3、EV71-LF和EV71-LR；其特征在于，所述引物EV71-FIP、EV71-BIP、EV71-F3、EV71-B3、EV71-LF和EV71-LR的序列分别如SEQ ID NO：1-6所示。

8.一种检测手足口病的试剂，所述试剂包括权利要求7所述的引物组；优选的，所述试剂还包括权利要求1-5任一权利要求中所述的V型或VI型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器。

9.权利要求7所述的引物组或权利要求8所述的试剂在检测手足口病中的用途。

10.权利要求7所述的引物组或权利要求8所述的试剂在制备用于检测和/或诊断手足口病中的用途。