CN102532278A - 一种提高原核生物抗胁迫能力的多头绒泡菌蛋白psti1及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高原核生物抗胁迫能力的多头绒泡菌蛋白PSTI1及其用途，具体地说是提供一种从真核生物多头绒泡菌中分离的PSTI1蛋白和编码基因，以及利用该产品提高原核生物抗胁迫能力的用途。本发明通过实验证明在原核生物中过表达PSTI1可以广泛提高原核生物耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化作用、缺氧和酸碱变化胁迫的能力，表明PSTI1可以广泛影响原核细胞的胁迫应答功能。因此，本发明提供了利用该PSTI1，转化原核生物，从而用于改善细菌等原核生物处理环境污染的能力，也可用于提高生物工程领域用生物工程菌的生产效率。

Description

一种提高原核生物抗胁迫能力的多头绒泡菌蛋白PSTI1及其用途

技术领域

本发明涉及一种提高原核生物抗胁迫能力的多头绒泡菌蛋白PSTI1及其用途，具体地说是提供一种从真核生物多头绒泡菌中分离的PSTI1蛋白和编码基因，以及利用该产品提高原核生物抗胁迫能力的用途。

背景技术

STI1蛋白(Stress-inducible protein 1)是一种在人^[1]、鼠^[2]、利什曼原虫^[3]、大豆^[4]和酵母^[5]中发现的一类进化保守的、与生物胁迫和非生物胁迫应答有关的共分子伴侣蛋白。STI1家族成员的共同特征是含有2个以上的TPR结构域(tetratricopeptide repeat domain)，每个结构域通常由3个TPR motifs(长度为34氨基酸的重复序列，含有helix-turn-helix二级结构)构成^[6，7]。细胞在应答热胁迫作用时，STI1通过其TPR motifs与热休克蛋白(Heatshock proteins，HSPs)Hsp70和Hsp90等作用^[6-10]，并调节Hsp70和Hsp90的构像及其ATPase酶活性^[11-15]，指导Hsp70和Hsp90与其配体蛋白作用^{[8，13，15-18]}，参与Hsp90对配体蛋白生物活性的调节^[13，16-19]。此外，STI1还通过HSPs复合体调节蛋白折叠和变性蛋的重折叠^{[11，17，20-22]}，调节细胞胁迫应答，影响细胞的生长、分化和繁殖^{[10，16，18，19，23，24]}。

当细胞受到胁迫作用时，STI1家族成员的表达水平都会提高^[1-5]，从而赋予细胞/细菌能够耐受外界环境逆向不利因素的能力。细菌等原核生物在处理环境污染物，降解生物废弃物，保持生态平衡中扮演着重要角色，在工业生产和生物工程领域也具有广泛的应用。随着气候变暖、环境污染进一步加重，微生物也面临着前所未有的生存危机。因此，提高细菌等微生物耐受温度、重金属、高盐、渗透压、缺氧等胁迫作用的能力，是应对环境污染加重以及提高工业生产效率等问题的主要对策之一。

研究显示，STI1通常通过其TPR motifs与热休克蛋白作用^[6，7，19]并调节热休克蛋白与其配体蛋白作用^{[8，13，15-18]}，参与热休克蛋白对配体蛋白生物活性的调节^[13，16-19]。原核生物也含有多种小分子热休克蛋白和其它种类的分子伴侣蛋白，原核生物的分子伴侣蛋白能否与PSTI1作用尚不得而知。然而，Hernández等^[25]分析多种细菌的编码蛋白的序列后发现，原核生物中也存在TPR-DP结构蛋白，但尚未发现STI1蛋白。

考虑到原核生物(如大肠杆菌等)具有生长速度快、表达效率高、容易进行基因工程改造、实验效率高、容易定向表达和生长控制的优点，因此，获得表达STI1蛋白的大肠杆菌或其它原核生物，将为解决环境日益恶化以及促进生物工程产业的发展带来更有效的手段。

发明内容

本发明基于以下原理：既然原核生物不存在能协调热休克蛋白功能，提高细胞抗胁迫能力的STI1蛋白，那么从进化最接近的真核生物材料中分离并获得STI1蛋白，并将该蛋白的编码基因转化原核生物表达，获得抗胁迫能力提高的宿主，从而提高细菌等原核生物抗众多不利胁迫环境的能力并将这些重组的原核生物应用于环境治理和基因工程产品的生产效率。

因此，本发明以多头绒泡菌14-3-3蛋白(P14-3-3)为饵蛋白^[26]，通过酵母双杂交，从多头绒泡菌cDNA文库^[27]中分离出一个696bp的STI1基因的完整cDNA及其编码蛋白序列，并在大肠杆菌中表达了该蛋白，测试了转基因大肠杆菌在不同胁迫条件下的耐受性，为将该基因用于提高原核生物的胁迫耐受能力做了有益的探索。

多头绒泡菌(Physarum Polycephalum)是一种介于原核和真核生物之间的过渡态真核生物，具有最基本、最保守的胁迫应答机制，其只有细胞核和线粒体两类细胞器，是一种进化程度较低的真核古菌。当环境不利时，多头绒泡菌以孢子形式生存；在环境条件适合时，则以原质团(多核体细胞，同一原质团内的细胞核按同步化有丝分裂方式增殖)形式繁殖。由于多头绒泡菌PSTI1的一级结构特点与前期研究中发现的多头绒泡菌SR蛋白激酶PSRPK相似，只含有SRPKs家族成员最保守的结构序列^[29]，说明多头绒泡菌表达的真核生物特有的蛋白只含有最简单的保守结构序列是该物种的特征之一，因此，本发明选用多头绒泡菌作为获得能适用于原核生物的PSTI蛋白的来源材料。

因此，本发明第一个目的是提供一种能提高原核生物抗胁迫能力的蛋白PSTI1，其由以下之一序列组成：

(1)如SEQ ID NO.1序列所示的蛋白质；

(2)如SEQ ID NO.1中部分序列所示的活性片段或保守性变异蛋白质；

优选的，所述蛋白质为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

本发明第二个目的是提供编码所述蛋白PSTI1的基因序列，该核苷酸序列由下述DNA序列之一组成：

(1)编码SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA序列；

(2)如SEQ ID NO.2序列所示的DNA序列；

(3)与SEQ ID NO.2所示序列中具有缺失、添加、插入或取代一个或多个核苷酸并能编码SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA序列；

优选的，所述基因为SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

在本发明中，由于体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或由于编码蛋白基因的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现氨基酸的缺失、添加、插入、取代或其他变异。事实上，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同变异体同样适用于通过人工手段向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

例如，人白介素2(IL2)的氨基酸序列中用丝氨酸替换特定的半胱氨酸残基所得到的多肽仍保留着IL2的活性[Science，224，1431(1984)]。

此外，在用基因工程方法生产蛋白质时，常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例如，把源于其他蛋白质的N末端肽链加到所需蛋白质的N末端以提高所需蛋白质的表达，或者把一个合适的肽链加到所需蛋白的N或C末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链具有亲和力的载体使所需蛋白的纯化变得更加容易。

就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，每种氨基酸存在1到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然界中，基因并不稳定，常发生核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)，这种情况下，会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分离出了编码特定氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的传代，仍不可避免地会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。

用各种基因工程技术人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。例如，当编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中可利用性较低、表达的蛋白量不够时，可以人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。因此，这类人工生产的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码出本发明公开的氨基酸序列即可。

另外，由至少一种改变(如蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白的活性，编码这类多肽或蛋白的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工生产的。

一般的，编码功能等同变异体的基因是同源的。因此，能与本发明的基因杂交且编码具有PSTI1活性的蛋白质的核酸分子也包括在本发明的范围内。

在本发明第三个目的方面中，还提供了一种包含所述核苷酸序列的的载体。所述载体载体包括重组克隆载体或重组表达载体，或中间载体等。重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。优选的，所述重组载体包含编码如SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列，或者包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明第四个目的，还提供了一种宿主，包含上述重组载体，或已用上述基因序列转化或转染。在一个实施方案中，所述宿主是原核生物，包括但不限于细菌、放线菌、蓝藻菌等。在一个具体实施方案中，宿主优选细菌。在另一个更具体实施方案中，细菌优选是肠杆菌科(Enterobacteriales)的细菌，如大肠杆菌(E.coli)。

本发明第五个目的，提供一种利用所述基因提高原核生物抗胁迫能力的用途。

在一个实施方案中，所述原核生物包括：肠杆菌科(Enterobacteriales)的细菌，如大肠杆菌(E.coli)。

在另一个实施方案中，所述抗胁迫能力包括耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化作用、缺氧或酸碱变化胁迫的能力。

技术效果

1、本发明首次提出从低等真核生物中获得具有抗胁迫能力的STI1蛋白，并成功转化原核生物，获得多项抗胁迫能力提高的原核生物宿主。

2、本发明用实验证明在原核生物中过表达PSTI1可以广泛提高原核生物耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化作用、缺氧和酸碱变化胁迫的能力，表明PSTI1可以广泛影响原核细胞的胁迫应答功能。

3、本发明提供了利用真核生物来源的PSTI1，转化原核生物，从而用于环境处理胁迫因素(处理废水废气等)和相关工业生产(如提取贵重金属、石油污染处理等)的用途。

附图说明

图1：PSti1与其它物种STI1氨基酸序列比对的结果。

图2：E.Western Blot检测E coli Origami^TM(DE3)表达的Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2。其中M泳道色带：预染的标准分子量蛋白；1-4泳道色带：分别为与鼠抗Trx多克隆抗体反应的Trx-PSTI1、Trx-TPR1、Trx-TPR2和Trx蛋白。

图3：PSTI1对E.coli耐盐胁迫的影响。其中，在不同浓度NaCl培养板上生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

图4：Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2对E.coli耐盐胁迫的影响。其中，在不同浓度NaCl培养板上生长的菌落第1-4列分别为Trx、Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2表达菌PSTI1(-)、PSTI1(+)、TPR1(+)和TPR2(+)。

图5：PSTI1对E.coli耐渗透压胁迫的影响。其中，在不同浓度山梨醇培养板上生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

图6：PSTI1、TPR1和TPR2对E.coli耐渗透压胁迫的影响。其中，在不同浓度山梨醇培养板上生长的菌落第1-4列分别为Trx、Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2表达菌PSTI1(-)、PSTI1(+)、TPR1(+)和TPR2(+)。

图7：PSTI1对E.coli耐Cu²⁺胁迫的影响。其中，在不同浓度CuSO₄培养板上生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

图8：PSTI1对E.coli耐氧化作用胁迫的影响。其中，在不同浓度H₂O₂培养板上生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

图9：PSTI1对E.coli耐缺氧胁迫的影响。其中，-◆-和-□-分别为PSTI1(+)和PSTI1(-)在200rpm摇速下的生长曲线；-▲-和-○-分别为PSTI1(+)和PSTI1(-)在100rpm摇速下的生长曲线。

图10：PSTI1对E.coli耐酸碱变化的影响。其中，在不同PH培养板上生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

图11：过表达PSTI1引起E.coli对温度敏感。其中，在不同温度下生长的菌落列+和-分别为Trx-PSTI1和Trx表达菌PSTI1(+)和PSTI1(-)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。但以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

实施例1：PSTI1完整cDNA的分离

参照Daniel等^[28]的方法悬浮培养多头绒泡菌(p.polycephalum PpII(+/-))菌株，该菌株由德国雷根斯堡大学生物物理所惠赠，也可从美国典型培养物保藏中心购买获得(保藏编号ATCC NO：24467)，或者从商业公司购买多头绒泡菌菌株，例如Promega公司、Invitrogen公司等。

取100mg(湿重)多头绒泡菌微原质团，用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，德国)提取总RNA。用GeneRacer^TM Kit(Invitrogen，美国)将含5′-帽子结构的mRNA制备成完整cDNA。根据PSTI1的3′-cDNA序列设计两条符合GeneRacer^TM Kit要求的下游PCR引物R1和R2(见表1)。用表1的引物对GeneRacer^TM 5′Primer/R1和GeneRacer^TM 5′Nested Primer/R2，即引物序列SEQ ID NO：3-6，从完整cDNA中克隆PSTI1的5′-cDNA，用PCR Cleave kit(Axygen，美国)纯化PCR产物，并将PCR片段连接到pMD18-T Vertor(TaKaRa)上，在E.coli Top10(Novagen，美国)中克隆重组质粒。用Mini-Preps Kit(TaKaRa)提取重组质粒，用GeneRacer^TM 5′Nested Primer和引物R2进行PCR鉴定，并测定插入片段的基因序列。拼接PSTI1的5′-cDNA和3′-cDNA序列获得PSTI1的完整cDNA序列。

表1用于克隆PSTI1 cDNA的5′-RACE引物

Table 1.Primers used for PCR the 5′-RACE of PSTI1 cDNA

通过5′-RACE技术，从完整的多头绒泡菌mRNA中克隆出一段773bp的cDNA片段，与PSTI1 3′-cDNA序列拼接，得到一个996bp的完整cDNA(SEQ ID NO：2)，其中1-66位为非编码区，第67-849为编码区(第67-69为起始密码子ATG)。该cDNA编码的蛋白含260个氨基酸(SEQ ID NO：1)，理论分子量为29kD，理论等电点为8.9。与其它物种STI1相比，PSTI1的序列最短，与利什曼原虫性STI1(LmSTI1)最接近，但与LmSTI1的同源序列(即mSTI1)也只有38％。序列比对结果(见图1)显示，PSTI1与其它物种STI1的同源序列主要集中在N-端和C-端的两个TPR结构域上，本发明将这两个TPR结构域分别命名为TPR1(15-107aa，理论分子量10kD)和TPR2(135-233aa，理论分子量11kD)。图1还显示，TPR1与TPR2间的连接序列(109-126aa)比其它物种对应序列短很多，C-末端序列也比其它物种STI1的对应序列短，说明PSTI1是STI1家族的原始蛋白，同时也是一种新发现的STI1家族蛋白。

本发明人发现：哺乳动物(如人和鼠)、低等动物(如利什曼原虫和锥虫)、禾本科植物(如高粱和玉米)、双子叶植物(如大豆)以及酵母的STI1分别由543、546、580、569和589个氨基酸组成，而多头绒泡菌STI1类似蛋白PSTI1只有260个氨基酸，是STI1家族成员中序列最短的蛋白。哺乳动物STI1含有3个TPR结构域(TPR1、TPR2A和TPR2B)和2个DP结构域(DP1和DP2)^[8，9]。序列比对结果显示，PSTI1与其它物种同源的序列主要集中在两个TPR结构域上；序列间的最大差异出现在两个TPR结构域间的连接序列(PSTI1的该序列为18个氨基酸，而酵母的对应序列却长达250个氨基酸)和C-末端非TPR序列(PSTI1只有2个氨基酸，而酵母的对应序列却长达68个氨基酸)上，说明PSTI1只拥有STI1家族成员的2个保守TPR结构域，没有DP结构域，是结构最简单的STI1蛋白。

实施例2：PSTI1及其功能结构域TPR1和TPR2的重组表达

以完整cDNA为模板，用表2的引物对psti1-F/psti1-R克隆PSTI1编码基因。将PCR产物插入到载体pET-32a(+)(Novagen，美国)的BamH I和Sal I酶切位点上，在E.coliTop10(Invitrogen，美国)中克隆重组质粒pET-psti1：

提取质粒pET-psti1，转化E.coli Origami^TM(DE3)(Invitrogen，美国)，在含50μg/mlAmp和30μg/ml Kan的LB培养板上筛选阳性转化子PSTI1(+)得到重组质粒pET-psti1。

以pET-psti1为模版，用表2(即引物序列SEQ ID NO：7-12)的引物对tpr1-F/tpr1-R和tpr2-F/tpr2-R分别克隆PSTI1保守肽段TPR1(15-107aa)和TPR2(135-233aa)的基因片段tpr1和tpr2，并重组到载体pET-32a(+)上，制备得到质粒pET-tpr1和pET-tpr2。

然后分别转化E.coli Origami^TM(DE3)，制备成转化子TPR1(+)和TPR2(+)。通过Western Blot检测与硫氧还蛋白Thioredoxin(Trx-Tag)融合表达的PSTI1、TPR1和TPR2。实验以含pET-32a(+)质粒的E.coli Origami^TM(DE3)转化子PSTI1(-)作为对照。

表2用于克隆PSTI1、TPR1和TPR2基因片段的PCR引物

Table 2.Primers used for PCR the gene fragments of PSTI1，TPR1 and TPR2

实施例3、Western Blot测试

用LB培养基培养PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)至OD₆₀₀＝0.5～0.6，加终浓度为1mmol/L的IPTG继续培养4h(30℃)以诱导Trx融合的PSTI1、TPR1和TPR2表达。

取1ml菌液的菌体与等体积的2×loading buffer混合并沸浴10min，之后取上清在12％聚丙烯凝胶上进行SDS-PAGE。将聚丙烯凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维膜后，用脱脂奶粉封闭过夜，用鼠抗Trx Tag多抗(ABGENT，美国)和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(Proteintech，美国)检测Trx、Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2[显色底物使用BCIP/NBT(Bromo-Chloro-Indolyl Phosphate/NitroBlue Tetrazolium)]。

Trx的分子量为17kD，Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2的理论分子量分别为46kD、27kD和28kD。通过Western Blot检测发现，PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)表达产物中与抗Trx抗体结合的蛋白的分子量分别为46、27、28和17kD(图2的1-4泳道)，与预测结果一致，说明PSTI1、TPR1和TPR2能在E.coli Origami^TM(DE3)中与Trx融合表达。

实施例4、PSTI1、TPR1和TPR2表达菌的筛选和胁迫培养

按照以下模式，分别测试各种胁迫对于PSTI1表达菌生长的影响，以评价PSTI1蛋白及其编码基因对于提高原核生物抗胁迫能力的作用。

①盐和渗透压胁迫对PSTI1、TPR1和TPR2表达菌生长的影响：用LB培养基培养大肠杆菌转化子PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)至OD₆₀₀＝0.5-0.6，加终浓度为1mmol/L的IPTG诱导PSTI1、TPR1和TPR2表达，30℃继续培养4h后，取3μl菌液进行倍比稀释，之后将不同浓度的菌液分别滴加到含不同浓度NaCl和山梨醇的培养板上，37℃下培养3天，观察PSTI1(+)、TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)的生长差异。

②重金属胁迫对PSTI1表达菌生长的影响：观察PSTI1(+)和PSTI1(-)在含不同浓度CuSO₄的LB培养板上的生长差异；

③氧化胁迫对PSTI1表达菌生长的影响：在LB培养板上涂布不同浓度的H₂O₂，20min后，吸去多余的H₂O₂液，再观察PSTI1(+)和PSTI1(-)在培养板上的生长差异；

④缺氧胁迫对PSTI1表达菌生长的影响：取1mL OD₆₀₀为0.6的PSTI1(+)和PSTI1(-)菌液，分别加到100mL的LB培养液(含1mmol/L IPTG)中，其中一组培养在100rpm的摇瓶中，另一组培养在200rpm的摇瓶中，之后定期取样测量PSTI1(+)和PSTI1(-)菌液的OD₆₀₀值。

⑤酸碱胁迫对PSTI1表达菌生长的影响：用NaOH和HCl调节LB培养基至不同PH值，再观察PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同酸碱度LB培养基上的生长差异；

⑥温度胁迫对PSTI1表达菌生长的影响：观察PSTI1(+)和PSTI1(-)在不同温度下的生长差异。

实施例4-1、盐和渗透压胁迫作用对PSTI1表达菌生长的影响

将处于对数生长期的测试菌PSTI1(+)和阴性对照PSTI1(-)倍比稀释，分别滴加到含0.5、0.8、1.0和1.2mol/L NaCl的LB培养板上培养，结果显示，表达Trx-PSTI1的PSTI1(+)(图3的+列菌落)比表达Trx的PSTI1(-)(图3的-列菌落)生长效果好，甚至在含有1.2mol/LNaCl的LB培养板上仍然能够长出菌落，说明PSTI1能提高E.coli Origami^TM(DE3)抗盐胁迫的能力。

采用同样的方法检测表达Trx-TPR1的TPR1(+)和表达Trx-TPR2的TPR2(+)抗盐胁迫的能力，结果如图4显示。其中，菌落第1-4列分别为Trx表达菌(即PSTI1(-))、Trx-PSTI1表达菌(即PSTI1(+))、Trx-TPR1表达菌(即TPR1(+))和Trx-TPR2表达菌(即TPR2(+))。

由图4可知，在含有不同浓度NaCl的LB培养板上，TPR1(+)(图4第3列菌落)与PSTI1(-)(图4第1列菌落)的生长没有显著差异；

TPR2(+)(图4第4列菌落)的生长能力甚至比PSTI1(-)差，而PSTI1(+)(图4第2列菌落)的生长能力普遍优于另外3组：TPR1(+)、TPR2(+)和PSTI1(-)。

以上实验说明完整的PSTI1能提高E.coli抗盐胁迫的能力，但PSTI1的保守肽段TPR1和TPR2则不能提高E.coli抗盐胁迫的能力，这意味着保守肽段TPR1和TPR2在PSTI1的功能上扮演着不同的角色。

实施例4-2、PSTI1、TPR1和TPR2片段对PSTI1原核细胞耐渗透压胁迫的影响

为确定PSTI1以及PSTI1两个保守结构域肽段TPR1和TPR2对原核细胞耐渗透压胁迫的影响，我们观察了Trx-PSTI1、Trx-TPR1和Trx-TPR2表达菌PSTI1(+)、TPR1(+)和TPR2(+)在含不同浓度山梨醇的LB培养板上的生长差异。

其中，图5中的+表示PSTI1阳性测试样本，-表示PSTI1阴性对照。图6中菌落第1-4列分别为Trx表达菌(即PSTI1(-))、Trx-PSTI1表达菌(即PSTI1(+))、Trx-TPR1表达菌(即TPR1(+))和Trx-TPR2表达菌(即TPR2(+))。

图5、图6的结果表明：

PSTI1(+)(图5的+列和图6第2列菌落)均比PSTI1(-)(图5的-列和图6第1列菌落)生长旺盛，说明过表达PSTI1能提高E.coli耐渗透压胁迫的能力。

与PSTI1(+)(图6第2列菌落)相比，TPR1(+)和TPR2(+)在山梨醇胁迫下的生长情况(图6第3、4列菌落)显然不如PSTI1(+)好，但TPR1(+)比PSTI1(-)(图6第1列菌落)生长旺盛，而TPR2(+)与PSTI1(-)相比差异不显著，说明过表达TPR1也能提高E.coli耐渗透压胁迫的能力，但不如完整PSTI1的效果好，而过表达TPR2对E.coli耐渗透压胁迫的能力没有显著的影响。

实施例4-3、PSTI1对原核细胞耐重金属胁迫的影响

为确定PSTI1对原核细胞耐重金属胁迫的影响，我们观察了Trx-PSTI1表达菌PSTI1(+)和阴性对照-Trx表达菌PSTI1(-)在不同浓度CuSO₄培养板上的生长差异(图7)，发现PSTI1(+)(图7的+列菌落)均比Trx表达菌PSTI1(-)(图7的-列菌落)生长旺盛，说明过表达PSTI1能提高E.coli耐Cu²⁺胁迫的能力。

实施例4-4、PSTI1对原核细胞耐氧化胁迫的影响

为确定PSTI1对原核细胞耐氧化胁迫的影响，我们观察了Trx-PSTI1表达菌PSTI1(+)在不同浓度H₂O₂培养板上的生长情况(图8)，发现PSTI1(+)(图8的+列菌落)均比Trx表达菌PSTI1(-)(图8的-列菌落)生长旺盛，说明过表达PSTI1能提高E.coli耐氧化胁迫的能力。

实施例4-5、PSTI1对原核细胞耐缺氧胁迫的影响

为确定PSTI1对原核细胞耐缺氧胁迫的影响，我们测定了Trx-PSTI1表达菌PSTI1(+)和Trx表达菌PSTI1(-)在不同摇速下的增殖曲线。

如图9所示，当摇速为200rpm时，PSTI1(+)的生长曲线与PSTI1(-)的生长曲线没有显著差异；

当摇速为100rpm时，PSTI1(+)和PSTI1(-)的增殖速率都呈现出明显下降，PSTI1(-)增殖速率下降的幅度比PSTI1(+)的增殖速率下降的幅度大，说明过表达PSTI1能提高E.coli耐缺氧胁迫的能力。

实施例4-6、PSTI1对原核细胞耐受酸碱胁迫的影响

为确定PSTI1对原核细胞耐受酸碱胁迫的影响，我们又观察了Trx-PSTI1表达菌PSTI1(+)和Trx表达菌PSTI1(-)在不同PH培养板上的生长差异(图10)，发现PSTI1(+)(图10的+列菌落)均比Trx表达菌PSTI1(-)(图10的-列菌落)生长旺盛，但差异不显著，说明过表达PSTI1能在一定程度上提高了E.coli耐酸碱胁迫的能力。

实施例4-7、PSTI1对原核细胞耐受温度胁迫的影响

为确定PSTI1对原核细胞耐受温度胁迫的影响，我们观察了Trx-PSTI1表达菌PSTI1(+)和Trx表达菌PSTI1(-)在不同温度下的生长差异(图11)，发现PSTI1(+)(图11的+列菌落)在各种温度下的生长均不如Trx表达菌PSTI1(-)(图11的-列菌落)好，PSTI1(+)和PSTI1(-)菌株在低于28℃时的生长差异没有高温时显著，说明过PSTI1会引起E.coli高温“过敏”。

从上述检测结果可以看出，过表达PSTI1可以全面提高大肠杆菌耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化作用、缺氧和酸碱变化胁迫的能力，但也会导致大肠杆菌对高温敏感。因此，利用真核生物来源的PSTI1，转化原核生物，从而可用于环境处理胁迫因素(处理废水废气等)和相关工业生产(如提取贵重金属、石油污染处理等)的用途。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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Claims (10)

1.一种能提高原核生物抗胁迫能力的蛋白PSTI1，其由以下之一的序列组成：

(1)如SEQ ID NO.1序列所示的蛋白质；

(2)如SEQ ID NO.1中部分序列所示的活性片段或保守性变异蛋白质；

2.权利要求1所述的蛋白PSTI1，其中优选为SEQ ID NO.1序列所示的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述蛋白PSTI1的基因序列，该核酸序列由下述序列之一组成：

(1)编码SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA序列；

(2)如SEQ ID NO.2序列所示的DNA序列；

(3)与SEQ ID NO.2所示序列中具有缺失、添加、插入或取代一个或多个核苷酸并能编码SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA序列；

4.权利要求3所述的基因序列，优选为SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

5.包含权利要求3或4所述基因序列的载体。

6.权利要求6所述的载体，其中包含编码如SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列，或者包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

7.包含权利要求5或6所述载体的宿主。

8.权利要求7所述的宿主，其中所述宿主是原核生物，优选是细菌，更优选是肠杆菌科(Enterobacteriales)的细菌。

9.权利要求3或4的基因用于提高原核生物抗胁迫能力的用途。

10.权利要求9的用途，其中原核生物是权利要求8所述的宿主，并且所述抗胁迫能力是耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化作用、缺氧或酸碱变化胁迫的能力。

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