CN101570756A

CN101570756A - 新型标签蛋白及其应用

Info

Publication number: CN101570756A
Application number: CNA200810036879XA
Authority: CN
Inventors: 杨淑伟; 魏星
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: CN101570756B

Abstract

本发明公开了一种表达目的蛋白的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达亮氨酸拉链1、类泛素分子羧基端区域和目的蛋白的融合蛋白；将所述的融合蛋白与含有类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2的类泛素分子重建蛋白混合，生成重建产物，用类泛素分子的特异性蛋白酶处理该重建产物，从而获得所述的目的蛋白。本发明还公开了一种用于目的蛋白表达的试剂盒，所述的试剂盒含有：用于表达目的蛋白的构建物，其含有亮氨酸拉链1的编码基因和类泛素分子羧基端区域的编码基因；以及类泛素分子重建蛋白或重建构建物。

Description

新型标签蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型标签蛋白，所述的标签蛋白可以使用在原核和真核表达系统中，大量，经济，快速的获得具有高活性的同源重组蛋白质。

背景技术

在过去的研究中，一个庞大的与泛素相关的小分子蛋白家族Ubls(ubiquitin like proteins)相继被发现，包括了NEDD8，ISG15等，以及类似泛素的小修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)。

SUMO的同源物Smt3最早在酿酒酵母的遗传突变筛选中发现。在1996年，SUMO(Smt3)最早被发现能够共价地结合一个小G蛋白的激活蛋白RanGAP1，影响了此蛋白在细胞核与核质的运输，随后此类小蛋白被命名为SUMO，然后SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物)中被发现，得到阐释。在低等的真核生物如酿酒酵母，昆虫，线虫中只有一种SUMO基因表达，在哺乳动物中已经发现4种，在植物中有8种之多。

在生物学研究和后基因组时代的研究中，研究一个基因的重要方面就是研究它在体外实验中的功能分析，要求能够方便快捷经济地实现重组蛋白质表达。然而，最为普遍使用的大肠杆菌表达系统中，人类基因组中只有约25％的基因能够正常表达、具有活性，大量的基因不能表达或者是形成包涵体(inclusion body)，即大量错误折叠丧失活性的目的蛋白在大肠杆菌菌体的不溶沉淀中，无法用于后续生化功能分析。为了获得所需的具有活性的目的蛋白，常用的方法有通过包涵体蛋白的变复性获得正确折叠的蛋白质，然而这种方法耗时耗力，并且具有很大的实验偶然性。因而最常用的方法就是使用促溶蛋白表达标签(tag)，比如葡萄糖亲和标签(maltose-binding protein MBP)，谷胱甘肽转移酶标签(glutathioneS-transferase GST)等，由于它们的促进翻译效率和帮助蛋白折叠的作用，极大的方便了目的蛋白的表达，纯化和检测。

除了上述的蛋白表达标签外，SUMO已经证明是最好的促溶蛋白表达标签之一。由于SUMO具有的高度类似泛素的桶状蛋白结构，具有相当的保守性，能够提供蛋白正确折叠的核心，极大提高了目的蛋白的溶解性。并且SUMO这个融合的蛋白标签可以在体外用源于酵母的SUMO特异的蛋白水解酶Ulp1极为高效的切割掉，从而获得与目的蛋白完全相同的重组蛋白质。

然而，在真核表达系统中，由于存在大量的内源的SUMO特异性的蛋白水解酶(如酿酒酵母中的Ulp1和哺乳动物细胞中的SENPn系列蛋白质)，SUMO蛋白标签会被迅速的切割掉，从而失去了作为蛋白标签所起的促溶和增进表达量作用，因而在真核系统中作用不显著。为了能够在真核表达系统中使用SUMO，将SUMO分为氨基端和羧基端结构域(NTHS和CTHS)两部分，将羧基端与目的蛋白融合，由于羧基端继承了SUMO的大部分保守蛋白结构域，具有甚至优于SUMO的促溶效果，并且无法被内源性的蛋白水解酶识别和切割，从而可以在真核系统中使用。在纯化好的SUMO羧基端融合的目的蛋白中，加入SUMO的氨基端蛋白分子，重组成为完整的SUMO分子，被外加的Ulp1c所识别，可以将融合的SUMO羧基端标签移除得到所需的目的蛋白。系统为Half SUMO互补表达系统，其一种操作流程例如图1所示。

在Half SUMO互补表达系统中，虽然能够在真核表达系统中使用SUMO蛋白标签，但是在去除蛋白标签的后续加工过程中，切割效率低下。

因此，本领域还有必要进一步研究改良的，更适合用于真核和原核表达系统的标签蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型标签蛋白及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的标签蛋白表达目的蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供一种表达目的蛋白的方法，所述方法包括：

(a)提供一种构建物，从5至3依次含有以下可操作性相连的元件：亮氨酸拉链1的编码基因，类泛素分子羧基端区域的编码基因，和目的蛋白的编码基因(如置于适当的可对转录和翻译元件进行严格调控的载体中，例如pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP和pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP)；

(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达亮氨酸拉链1，类泛素分子羧基端区域和目的蛋白的融合蛋白，分离所述的融合蛋白；

(c)提供一种类泛素分子重建蛋白，所述的蛋白含有类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2，所述亮氨酸拉链2与亮氨酸拉链1可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体；

(d)混合(c)的类泛素分子重建蛋白与(b)的融合蛋白，从而生成重建产物，所述的重建产物包含：由亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2相互作用形成的亮氨酸拉链二聚体，重建的类泛素分子，和目的蛋白；和

(e)用类泛素分子的特异性蛋白酶处理(d)的重建产物，从而将亮氨酸拉链二聚体和重建的类泛素分子切割下来，分离获得所述的目的蛋白。

在另一优选例中，(a)中，所述的亮氨酸拉链1的编码基因和类泛素分子羧基端区域的编码基因之间，具有0-60bp(优选12-36bp，更佳的18-36bp)的间隔序列；或者(c)中，所述的类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2之间具有0-20aa(优选4-12aa；更佳的5-10aa)的间隔序列。

在另一优选例中，所述类泛素分子羧基端区域具有30-50aa(更佳地35-45aa)；或所述类泛素分子氨基端区域具有30-50aa(更佳地35-45aa)。

在另一优选例中，所述的类泛素分子选自：SUMO，泛素(ubiqutin)，NEDD8(neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8)，干扰素刺激蛋白15(ISG15 Interferon-stimulated protein15)，延伸素B(Elongin B)，泛素类似物1(Rub1 RELATED TO UBIQUITIN1)。更优选的，所述的类泛素分子是SUMO。

在另一优选例中，所述的类泛素分子(SUMO)的羧基端区域具有SEQ ID NO：3中第52-96位的氨基酸序列；或者

所述的类泛素分子的氨基端区域具有SEQ ID NO：4中第9-62位的氨基酸序列；或者

所述的亮氨酸拉链1具有SEQ ID NO：3中第14-43位的氨基酸序列；或者

所述的亮氨酸拉链2具有SEQ ID NO：4中第69-97位的氨基酸序列。

在另一优选例中，(a)中，在所述的亮氨酸拉链1的编码基因和类泛素分子羧基端区域的编码基因之间，还包括一连接序列，所述的连接序列编码SEQ ID NO：3中第44-51位的氨基酸序列；或者

(c)中，在所述的类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2之间，还包括一连接序列，所述的连接序列如SEQ ID NO：4中第63-68位所示。

在另一优选例中，(a)中，所述的构建物含有：

SEQ ID NO：5中31-288所示的核苷酸序列；或

SEQ ID NO：5中5-288所示的核苷酸序列；或

SEQ ID NO：5中1-288所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，(a)中，所述的构建物还含有至少一个纯化用标签的编码基因；或者

(c)中，所述的类泛素分子重建蛋白还包含至少一个纯化用标签。

在另一优选例中，所述的纯化用标签选自(但不限于)：6His，GST，Halo，Avi，MBP，SNAP。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在本发明的第二方面，提供一种用于目的蛋白表达的试剂盒，所述的试剂盒含有：

(1)一种用于表达目的蛋白的构建物，从5至3依次含有以下可操作性相连的元件：亮氨酸拉链1的编码基因，类泛素分子羧基端区域的编码基因；和

(2)一种类泛素分子重建蛋白，所述的蛋白从氨基端至羧基端依次含有类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2；或一种类泛素分子重建构建物，其含有可操作性相连的元件，所述元件编码所述的类泛素分子重建蛋白；

其中，所述的亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体。

在另一优选例中，(1)中，在所述的类泛素分子羧基端区域的编码基因的3端后，含有多克隆位点，该位点中可插入目的蛋白。

在另一优选例中，所述试剂盒中还含有：用于目的蛋白表达的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括：真核细胞、原核细胞。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：类泛素分子的特异性蛋白(水解)酶。

在另一优选例中，所述的类泛素分子是SUMO，其特异性蛋白水解酶是Ulp1(酵母来源的)或其活性片段(优选Ulp1c)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了重组SUMO(Half SUMO)表达系统示意图。

图2显示了本发明的增强SUMO重组蛋白(Enhanced half SUMO)表达系统示意图。

图3显示了各重组表达质粒转化大肠杆菌，不同浓度IPTG诱导表达后的蛋白表达检测。其中，Neg表示未诱导全菌，S表示上清，W表示全菌，P表示沉淀。电泳上样体积4μl。

图4显示了各融合蛋白的结构域示意图。

图5显示了在不同用量Ulp1c的切割下，6His-SUMO-EGFP(泳道1-7)以及6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)&6His-Zipper-NTHS(泳道9-15)系统切割效率比较。

图6显示了在不同用量Ulp1c的切割下，6His-CTHS-EGFP&6His-NTHS和6His-Zipper-CTHS-EGFP&6His-Zipper-NTHS增强重组SUMO系统切割效率比较。

图7显示了Western Blot分析HEK293T细胞中融合蛋白的表达情况和不同蛋白表达标签的不同促溶效果。泳道1是转染空白质粒对照(LacZ)的细胞的蛋白表达，2-3是转染内参EGFP质粒EGFP-N1的细胞的蛋白表达，4-5是转染pM02-6His-EGFP质粒的细胞的蛋白表达，6是转染pM02-6His-SUMO-EGFP(SE)的细胞的蛋白表达，8是转染pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)的细胞的蛋白表达，比较EGFP的蛋白表达量，证明在真核系统中，改造过的CZE tag具有很好的促进表达的效果。

图8显示了改造过的CZE蛋白表达标签极大的提高了体内或者体外的切割效率。1-5泳道表示在体内共转pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP和pM02-6His-NTHS-Zipper，在体外随着Ulp1c酶量的增加，大概两单位就能将所有过量表达的蛋白完全切割而形成EGFP，而7-11泳道表示在体内共转pM02-6His-CTHS-EGFP和pM02-6His-NTHS，在体外随着Ulp1c酶量的增加，8单位也不能有效切割表达的蛋白，形成EGFP，12-13泳道表示在体内减半共转pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP和pM02-6His-NTHS-Zipper，也能被相应的酶量切割。

图9显示了蛋白原核表达载体示意图，其中A为pET28a-6His-NTHS-Zipper；B为pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP。

图10显示了蛋白真核表达载体示意图，其中A为pM02-6His-NTHS-Zipper；B为pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，意外地发现，在Half SUMO互补表达系统中，分别在SUMO的羧基端结构域和氨基端结构域上连接亮氨酸拉链相关结构，非但不影响SUMO羧基端结构域和氨基端结构域的相互作用，还可非常有效地增强SUMO羧基端结构域和氨基端结构域在重建SUMO时的相互作用，从而大大提高目的蛋白的切割效率。与SUMO具有较高结构相同性的其它类泛素分子也具有类似的现象。

如本文所用，所述的“增强的SUMO互补表达系统”是指在Half SUMO互补表达系统中，分别在SUMO的羧基端结构域和氨基端结构域上连接有亮氨酸拉链相关结构，从而形成的蛋白表达系统。凭借两种亮氨酸拉链之间形成亮氨酸拉链二聚体，可增强SUMO的羧基端结构域和氨基端结构域在重建SUMO时的相互作用，有利于目的蛋白与SUMO的羧基端结构域之间的切割分离。

如本文所用，所述的“可操作性相连(或连接)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。可以发生可操作性相连的核酸序列包括但不限于：启动子，裂解位点，纯化标签，转录终止子，增强子等。这些序列的可操作性相连可产生功能性产物，如蛋白或RNA分子。

如本文所用，所述的“亮氨酸拉链(leucine zipper)二聚体”是指来自不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面(常常含有亮氨酸残基)相互作用形成一种圈对圈的二聚体结构。通常，亮氨酸拉链是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在α-螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2条多肽相互接近时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，从而形成“拉链”。

如本文所用，所述的“亮氨酸拉链1”或“亮氨酸拉链2”是指当它们分别位于两条多肽链上时，并且两条多肽链相互接近时，可以发生相互作用并形成亮氨酸拉链二聚体的分子。

如本文所用，术语“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由构成”、“基本上由构成”、和“由构成”。

利用增强的SUMO互补表达系统表达目的蛋白

本发明人发现，Half SUMO互补表达系统中，在去除蛋白标签的后续加工过程中，切割效率低下。进一步研究发现，这是由于重组的过程依赖于half SUMO两部分的相互作用，而NTHS和CTHS两部分分子之间疏水氨基酸的范德华力作用相对较弱。为了提高切割效率，本发明人进行了深入的研究，结果发现分别在SUMO的羧基端结构域和氨基端结构域上连接亮氨酸拉链(Zipper)相关结构，非但不影响蛋白的相互作用，而且还大大增强了SUMO羧基端CTHS和氨基端NTHS两部分结构域的相互作用，极大的提高了体外切割的效率。同时，由于羧基端从结构上继承了SUMO的大部分保守蛋白结构域，具有甚至优于SUMO的促溶效果，并且无法被内源性的蛋白水解酶识别和切割，从而可以在真核系统中使用。在体外系统中，在纯化好的SUMO Zipper-CTHS融合的目的蛋白中，加入纯化好的SUMOZipper-NTHS蛋白分子，在高亲和性的亮氨酸拉链作用下快速高效的重组成为“完整”的SUMO分子，被外加的Ulp1所识别，可以将融合的SUMO羧基端标签移除得到所需的目的蛋白，从而开发出一套可以在真核和原核系统中广泛使用的新型蛋白标签系统，称为增强SUMO互补表达(Enhanced halfSUMO，HalfSUMO)，增强的SUMO互补表达系统表达系统示意图如图2所示。

因此，本发明提供了一种目的蛋白的表达方法，包括：

(a)提供一种构建物，从5至3依次含有以下可操作性相连的元件：亮氨酸拉链1的编码基因，类泛素分子羧基端区域的编码基因，和目的蛋白的编码基因；

(c)提供一种类泛素分子重建蛋白，所述的蛋白含有类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2；

作为本发明的优选方式，所述的构建物是表达载体。“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可用的。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件，优选地还包含一个或多个选择性标记基因。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的重组表达载体。

所述的类泛素分子是指在蛋白三级结构上均具有类似高度紧密压缩桶状的结构(即具有β折叠(sheet)-β折叠-α螺旋-β折叠-β折叠-β折叠的类似泛素结构)，且具有相当的保守性，能够提供蛋白正确折叠的核心，可提高目的蛋白的溶解性的一类分子。作为本发明的优选方式，所述的类泛素分子是与SUMO具有60％或以上的结构同源相似性，更佳地与SUMO具有80％或以上的结构同源相似性，且均具有类似桶状的结构的蛋白。更佳地，所述的类泛素分子选自：SUMO，泛素，NEDD8，干扰素刺激蛋白15，延伸素B，泛素类似物1等泛素超家族成员。所述的类泛素分子的羧基端区域一般具有30-55aa，优选35-45aa，且具有促进目的蛋白溶解性的功能；氨基端区域一般具有30-55aa，优选35-50aa。所述羧基端区域和氨基端区域通常来自同一类泛素分子。在更优选的方案中，所述羧基端区域和所述氨基端区域基本上可组成所述的类泛素分子。其中，“基本上”是指所述氨基端区域可选择类泛素分子位于氨基端的大部分氨基酸(例如可有1-5个(较佳的1-3个)氨基酸的增减)，且其保留有蛋白促溶的功能；所述羧基端区域可选择类泛素分子位于羧基端的大部分氨基酸(例如可有1-5个(较佳的1-3个)氨基酸的增减)，且所述氨基端区域与所述羧基端区域可重建成具有所述类泛素分子特性的分子。

作为本发明的优选方式，所述的类泛素分子是SUMO，其羧基端区域简称为CTHS；其氨基端区域简称为NTHS。更佳地，所述的CTHS具有SEQ ID NO：3中第52-96位的氨基酸序列；或者所述的NTHS具有SEQ ID NO：4中第9-62位的氨基酸序列。

所述的亮氨酸拉链的设计可根据本领域人员已知的技术。作为本发明的优选方式，所述的亮氨酸拉链1具有SEQ ID NO：3中第14-43位的氨基酸序列，经验证其与CTHS和目的蛋白的相连不影响目的蛋白的表达以及CTHS与NTHS的重建；或者，所述的亮氨酸拉链2具有SEQ ID NO：4中第69-97位的氨基酸序列。

所述的亮氨酸拉链1和类泛素分子羧基端区域之间，通常具有0-20aa(优选4-12aa，更佳的6-12aa)的间隔序列。作为本发明的优选方式，所述的间隔序列(连接序列)编码SEQ ID NO：3中第44-51位的氨基酸序列。本发明人发现，与过长或过短的连接序列相比，具有SEQ ID NO：3中第44-51位序列的连接序列更有利于后续的蛋白切割。

所述的类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2之间，通常具有0-20aa(优选4-12aa；更佳的5-10aa)的间隔序列。作为本发明的优选方式，所述的间隔序列(连接序列)编码SEQ ID NO：4中第63-68位的氨基酸序列。具有SEQ ID NO：4中第63-68位序列的连接序列也有利于后续的蛋白切割。

本发明人还对用于表达目的蛋白的构建物进行了密码子优化，从而使之可更好地在多种细胞(包括E.coli，酵母HEK293T细胞和Hela)中均能很好的表达。因此，作为本发明的优选方式，所述的用于表达目的蛋白的构建物含有SEQ ID NO：5中31-288所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO：5中5-288所示的核苷酸序列；或SEQ IDNO：5中1-288所示的核苷酸序列。

更佳地，所述的类泛素分子重建蛋白的编码基因具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

用于目的蛋白表达的宿主细胞是较为广泛的，包括了真核细胞、原核细胞。例如，所述的宿主细胞是(但不限于)：大肠杆菌细胞，酵母细胞，HEK293T细胞，CHO细胞等。

所述的类泛素分子的特异性蛋白(水解)酶是指一类可特异性识别类泛素分子的三级结构的蛋白酶，当所述的类泛素分子的羧基端还连接有其它蛋白分子的时候，其可特异性地在羧基端进行切割，从而将类泛素分子与其它蛋白分子进行分离。当所述的类泛素分子是SUMO时，其特异性的蛋白酶可以是Ulp1或其活性片段(优选Ulp1c)，或是来源于哺乳动物细胞的SENPn系列蛋白。

为了便于蛋白的分离或纯化，本发明所述的用于表达目的蛋白的构建物还含有至少一个纯化用标签的编码基因；或者所述的类泛素分子重建蛋白还包含至少一个纯化用标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，GST，Halo，Avi，MBP，SNAP，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。较佳地，对于表达目的蛋白的构建物，所述的纯化标签的编码基因位于相互作用蛋白编码序列的5端，从而使得在重建产物被类泛素分子的特异性蛋白酶切割后，分离获得的目的蛋白的序列中不存在纯化标签序列。作为本发明的优选方式，所述的纯化用标签是6His标签。

用于目的蛋白表达的试剂盒

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于目的蛋白表达的试剂盒(或系统)，所述的试剂盒含有：

(1)一种用于表达目的蛋白的构建物，从5至3依次含有以下可操作性相连的元件：亮氨酸拉链1的编码基因，和类泛素分子羧基端区域的编码基因；和

其中，所述的亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2可相互作用形成的亮氨酸拉链二聚体。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有：用于目的蛋白表达的宿主细胞。所述的宿主细胞包括：真核细胞、原核细胞。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有：类泛素分子的特异性蛋白水解酶。

作为本发明的优选方式，(1)中，所述的用于表达目的蛋白的构建物还含有至少一个纯化用标签的编码基因；或者(2)中，所述的类泛素分子重建蛋白还包含至少一个纯化用标签。

此外，所述的试剂盒中还可含有其它在目的蛋白表达过程中有用的试剂，这些试剂均是本领域人员所熟悉的。例如基因转染用试剂，宿主细胞的培养基，限制性内切酶等。

此外，所述的试剂盒中还可含有使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

质粒和菌株

大肠杆菌DH5α和BL21菌种，用于酵母表达的毕赤酵母菌株GS115(获自Invitrogen)。用于蛋白质原核表达的质粒载体为pET28a(Novagen公司)，用于酵母表达的pPIC3.5K和pPIC9K来自Invitrogen公司。哺乳动物细胞株HEK293T购自ATCC，用于哺乳动物细胞中表达的质粒载体为pM02R.x(GeneCopoeia公司)。

培养基或缓冲液的配方：

(1)Luria Bertani(LB)培养基

Bacto-胰蛋白胨10g/L；Bacto-酵母抽提物5g/L；NaCl 10g/L；灭菌。

(2)RbCl化学感受态所需S.O.B培养液

Bacto-胰蛋白胨20g/L；Bacto-酵母抽提物5g/L；NaCl 0.6g/L；KCl0.5g/L；灭菌，使用前加入灭菌的MgCl₂、MgSO₄至终浓度10mM。

(3)大肠杆菌感受态细胞缓冲液1

RbCl 12g/L；MnCl₂·4H₂O 9.9g/L；CaCl₂·2H₂O 1.5g/L；甘油150g/L；Kac 2.94g/L；由10％HAc调至pH5.8，过滤除菌，4℃保存。

(4)大肠杆菌感受态细胞缓冲液2

0.5M pH6.8 MOPS 20mL；RbCl 1.2g/L；CaCl₂·2H₂O 11g/L；甘油150g/L；过滤除菌，4℃保存。

(5)10×taq DNA聚合酶缓冲液(无Mg²⁺)

500mM KCl，100mM Tris HCl(pH 9.0，25℃)，1％Triton X-100。

(6)10×pfu DNA聚合酶缓冲液

200mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，1.0％Triton X-100)。

(7)毕赤酵母培养基配方

培养基配方所用母液：10×YNB(13.4％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸)溶解134gYNB于1000ml水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。

500×生物素(0.02％)：溶解20mg生物素于100ml水中，过滤除菌，放于4℃。

100×H(0.4％组氨酸)：溶解400mg L-组氨酸于100ml水中，低于50℃加热以促溶解，过滤除菌；

10×D(20％葡萄糖)：溶解200g D-葡萄糖于1000ml水中，高压灭菌15min或过滤除菌；

10×M(5％甲醇)：混合5ml甲醇与95ml水，过滤除菌存于4℃，可放2个月；

10×GY(10％甘油)：混合100ml甘油与900ml水，过滤或高压灭菌，室温放置；

1M磷酸钾缓冲液PH6.0：132ml 1M K₂HPO₄，868ml 1M KH₂PO₄，调整PH值为6.0±0.1(如果需调PH值，用磷酸或KOH)。过滤或高压灭菌；

YPD(YPED)培养基(1L)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

MD/MDH培养基1L：1.34％YNB 4×10^-5％生物素，2％葡萄糖，加入湿热灭菌800ml水；于60℃下加入100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×D。制MDH时，加入10ml 100×H，混匀存于4℃；如制备平板，于第一步加入15g琼脂粉；倒置平板，4℃放置。

BMGY培养基：1％酵母浸出物2％蛋白胨，100mM磷酸钾(PH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油；

BMMY培养基：1％酵母浸出物2％蛋白胨，100mM磷酸钾(PH6.0)，1.34％YNB 4×10^-5％生物素，0.5％甲醇；

(8)毕赤酵母裂解缓冲液(BB)：50mM磷酸钠(PH7.4)，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油。

融合蛋白的序列

1.6His-SUMO-CTHS的氨基酸序列

MGHHHHHHERQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ ID NO：1)

2.6His-SUMO-NTHS的氨基酸序列

MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAK(SEQ ID NO：2)

3.6His-Zipper-CTHS的氨基酸序列

MGSSHHHHHHSSGEQLEKKLQALEKKLAQLEWKNQALEKKLAQGGGGG GGSERQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ IDNO：3)

4.6His-Zipper-CTHS经密码子优化的核酸序列

ATGGGCAGCAGCCATCACCACCATCACCATAGCAGCGGCGAGCAGCTGGAAAAGAAGTTACAAGCCCTGGAGAAAAAACTTGCTCAGCTGGAATGGAAAAACCAAGCATTGGAAAAAAAACTCGCGCAGGGCGGTGGCGGTGGCGGTGGATCCGAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTCGCATCCAAGCTGATCAGGCCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGT(SEQ ID NO：5)

5.6His-NTHS-Zipper的氨基酸序列

MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKGGSGSGALKKELQANKKELAQLKWELQALKKELAQ(SEQ IDNO：4)

克隆的构建

通常，在基因的两端通过链式聚合酶反应(PCR)引入合适的限制性内切酶酶切位点，或者已有质粒上得到目的DNA片段，然后用限制性内切酶切割2-3小时，电泳后，用QIAGEN公司的回收试剂盒回收酶切后的DNA片段，连入相应的载体。转化到DH5α感受态细胞中，扩增，获得目的质粒。

RbCl感受态细胞的制备

(1)将大肠杆菌菌种划线到LB平板，37℃培养10～12小时。

(2)挑单克隆于30ml S.O.B(用前1∶100加入1M MgCl₂，1∶100加入1M MgSO₄)中，37℃，培养过夜。

(3)1∶100接过夜菌到200ml S.O.B(用前1∶100加入1M MgCl₂，1∶100加入1M MgSO4)中，37℃培养至OD600＝0.35。

(4)把菌液迅速转移至冰盐浴(-3～-5℃)中，预冷15分钟。

(5)4℃，4500rpm×5min离心，弃上清。加入64ml感受态细胞缓冲液1，悬浮，冰盐浴15分钟。

(6)4℃ 4000rpm×5min离心，弃上清。加入16ml感受态细胞缓冲液2，在冰上悬浮菌体。

(7)立即分装成200μl/管(管预冷)。

(8)液氮速冻，-70℃保存。

转化

(1)将5μl连接产物或者100ng质粒加入200μl感受态细胞中，弹匀后冰上放置30分钟。

(2)42℃温浴2分钟，冰上放置2分钟。加入800μl LB，37℃温浴30～45分钟。

(3)8000rpm离心1分钟，倒去900μl上清，用管底残留的100μl左右的液体将沉淀悬浮，铺盘。

(4)倒置放于37℃培养箱中12～15小时。

毕赤酵母电转化感受态制备

(1)在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30℃过夜。

(2)取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。

(3)在4℃，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

(4)如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

(5)如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

(6)如上离心，用1ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。

毕赤酵母电转化

(1)取80ul上述细胞与5-20μg线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。

(2)在冰上放置5min。

(3)根据所使用装置(Bio-Rad电转仪)推荐的酿酒酵母参数进行电击。

(4)立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。

(5)分成200-600ul等份，涂于MD平板上。

毕赤酵母蛋白表达诱导

(1)挑取单克隆，接种至含100ml BMGY培养基的1L隔板摇瓶中。在摇床中28-30℃，250-300rpm生长至OD₆₀₀＝2-6(约16-18小时)。

(2)室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞(约10-20ml)。

(3)置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养。

(4)每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。

(5)在下列的各个时间点，取1ml培养基至1-5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。

毕赤酵母蛋白纯化

(1)用BB重悬清洗细胞，4℃下3000g离心5-10min。

(2)用BB重悬细胞至OD₆₀₀＝50-100。

(3)加入等体积的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通过替代预测体积。

(4)涡旋混合物30s，冰上孵育30s，重复7次，间隔涡旋并预冷细胞抽提物减少蛋白变性。

(5)在4℃，12000g离心5-10min。

(6)将上清转至干净容器并分析，总蛋白含量应在5-10mg/ml，保留细胞沉淀，用6M尿素或1％Triton X-100抽提来检测不可溶蛋白。

(7)将上清PH调到8.0，NTA-Ni柱(Qiagen)，用含有20mM、50mM咪唑的NTA缓冲液洗涤至本底，用含有250mM咪唑的NTA缓冲液洗脱得到高纯度的蛋白。

用于转染的质粒DNA的小量制备

转染用的质粒，需要纯度很高，本发明人用Qiagen公司的试剂盒QIAprepSpin Miniprep Kit 250，抽提质粒DNA，步骤如下：

(1)分次取3mL过夜菌于1.5mL的离心管中，8,000rpm离心1分钟，去上清。

(2)加250μL Buffer P1(Qiagen)，振荡器充分悬浮菌块。

(3)加250μL Buffer P2(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，室温静置置至溶液变粘稠，不超过5分钟。

(4)加350μL Buffer N3(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，冰上放置10分钟。

(5)13,000rpm离心10分钟，取上清到柱中。13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

(6)加750μL Buffer PE(Qiagen)，13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

(7)13,000rpm离心1分钟，将柱子置于一干净离心管中，室温放置10分钟。

(8)加Elution Buffer(Qiagen)50ul，放置2分钟。

(9)13,000rpm离心2分钟，穿出液接在离心管中，即得到高纯度的质粒DNA。

转染

(1)在1.5ml离心管中加入50μl DMEM培养基，250ng的表达质粒或对照质粒250ng的LacZ质粒作为内参，混匀。然后加入2ul Invitrogen公司的转染试剂PlusTM Reagent，混匀，放置15分钟

(2)在另一1.5ml离心管中加入50μl DMEM培养基和2ul Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine，混匀。

(3)将上述两者混匀，放置15分钟。

(4)将混合液滴加到12孔盘中(细胞生长密度约70％)，3小时后去除滴加液终止反应，换入400ul含胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养24小时。

(5)收集细胞，吸去培养基，将细胞收集到1.5ml离心管中。

通过免疫印迹检测融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达量

(1)转染24小时后取出HEK293T细胞，吸去上清，用2×SDS上样缓冲液(0.1MTris-HCl，4％SDS，β-Mercaptoethanol 2ml，甘油25ml，溴酚兰0.04～0.05g，H2O 23ml)直接裂解细胞，收样。

(2)将上述样品进行SDS-PAGE电泳。

(3)转膜(湿式电转仪，Bio-Rad)：把SDS-PAGE胶浸泡在常规的电转移缓冲液中30分钟。在电转移板上依次铺两层缓冲垫片和一层滤纸，把胶铺在滤纸上，再铺上硝酸纤维素膜覆盖目的蛋白所在区域，再铺一层滤纸和两层缓冲垫片。把电转移板夹好。接通恒流电源(250mA)，转膜60分钟。

(4)将转好的膜放置于5％脱脂牛奶中摇晃封闭1小时。用洗涤缓冲液(10×缓冲液的配方是：Tris 24.2g；NaCl 87.74g；Tween 5g；pH 8.0；加水至1L)漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(5)把膜浸在抗-EGFP的鼠源一抗(购自Sigma)溶液中摇晃1小时。用洗涤缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(6)再将膜浸在含抗小鼠的二抗(购自Rockland)的溶液中摇晃0.5小时，用缓冲液漂洗5分钟，重复洗涤3次。

(7)用红外荧光成像仪(Odyssey)观察结果。

II.实施例

实施例1.原核表达载体构建

SUMO，SUMO-CTHS，Zipper-CTHS的DNA序列通过分别通过NcoI和XhoI位点，插入到pET28a中，再通过EcoRI和XhoI，插入绿色荧光蛋白EGFP作为表达测试的目的蛋白，构建完成原核表达质粒pET28a-6His-SUMO-EGFP，pET28a-6His-CTHS-EGFP，pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP。并且在N端融合了6His标签，利于纯化和检测。

pET28a-6His-EGFP的构建：以pEGFP-N(Clontech公司)为模板，以primer1(SEQ ID NO：6)和primer2(SEQ ID NO：7)为引物，扩增获得EGFP基因，以EcoRI和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a载体(自带的6His tag)中。

pET28a-6His-SUMO-EGFP(SE)的构建：以酿酒酵母基因组为模板，以primer3(SEQ ID NO：8)和primer4(SEQ ID NO：9)为引物，扩增获得SUMO基因，以NcoI和EcoRI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a-6His-EGFP中。

pET28a-6His-CTHS-EGFP(CE)(图9B)的构建：以酿酒酵母基因组为模板，以primer5(SEQ ID NO：10)和primer4为引物，扩增获得SUMO-CTHS基因，以NcoI和EcoRI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a-6His-EGFP中。

pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)的构建：通过4种引物(primer6(SEQID NO：11)，primer7(SEQ ID NO：12)，primer8(SEQ ID NO：13)，primer9(SEQID NO：14))片段搭桥层叠PCR合成Zipper片段，经NdeI和BamHI酶切后插入到经同样酶切的pET28a-6His-CTHS-EGFP中。

pET28a-6His-NTHS的构建：以酿酒酵母基因组为模板，以primer3和primer10(SEQ ID NO：15)为引物，扩增获得SUMO-NTHS基因，以NcoI和EcoRI酶切后插入到经过同样酶切的pET28a中。

pET28a-6His-NTHS-Zipper(图9A)的构建：通过4种引物(primer11(SEQ ID NO：16)，primer12(SEQ ID NO：17)，primer13(SEQ ID NO：18)，primer14(SEQ IDNO：19))片段搭桥层叠PCR合成Zipper片段，经EcoRI和BamHI酶切后插入到经同样酶切的pET28a-6His-NTHS中。

其中，CTHS是SUMO的C末端(C-SUMO)的简写。对应的SUMO的N端简称为NTHS(或NT)，Zipper-NTHS简称为NZHS(或NZ)。

实施例2.原核表达和溶解性测试

本实施例中，证明在大肠杆菌表达系统，Zipper(Zip)-CTHS具有良好的促进融合蛋白溶解性和增进融合蛋白表达的效果。

融合蛋白在E.coli中表达：将重组表达质粒pET28a-6His-SUMO-EGFP、pET28a-6His-CTHS-EGFP、pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP分别转化大肠杆菌(BL21 DE3菌株)后，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养12～14小时；取上述培养菌液按1∶100比例接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，22℃培养16-20h。6000rpm离心收集菌体。将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复3次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO₄至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(18000rpm/min)后取上清S得到破菌抽提物，沉淀P和全菌W，未诱导全菌Neg分别取样，进行SDS-PAGE电泳，结果如图3。

如图中箭头所示，代表了对应的蛋白在不同的IPTG诱导浓度(1mM，100μM，10μM)下的溶解性，证明Zipper-CTHS在原核系统中具有很好的促进融合蛋白溶解性和增进融合蛋白表达的效果。

因此，Zipper-CTHS在原核表达系统中，具有良好的促进融合蛋白溶解性和增进融合蛋白表达的效果，是一种优秀的蛋白表达标签。

此外，6His-Zipper-NTHS和6His-NTHS的表达方法同上。

实施例3.原核表达的蛋白的体外切割生化实验

将收集的表达菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的NTA缓冲液(300mM NaCl，50mM Na₂HPO₄，2mM EDTA，PH 8.0)中，冻融、消化、高速离心，取破菌抽提液上NTA-Ni柱(Qiagen)，用含有20mM、50mM咪唑的NTA缓冲液洗涤至本底，用含有250mM咪唑的NTA缓冲液洗脱得到高纯度的蛋白。

所用蛋白的结构域示意图见图4。其中C-SUMO-EGFP(CTHS-EGFP)简称为CE，Zipper-CTHS-EGFP简称为CZE。

常规方法表达纯化Ulp1c，Ulp1c是Ulp1的C段，其具有Ulp1蛋白(GenBank登录号：NC_001148)的第403-625位蛋白序列。

Ulp1酶学活力定义

按照Invitrogen公司的手册，1单位Ulp1活性定义为在20ul体系的50mMTris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇条件下，30℃1小时能够切割2μg的SUMO-EGFP标准蛋白底物的酶量。

切割反应设定和底物比例

按照4∶1的质量比例混合纯化好的6His-CTHS-EGFP和6His-NTHS(或者6His-Zipper-CTHS-EGFP和6His-Zipper-NTHS)，即2μg∶0.5μg。在30℃温浴半小时重建SUMO，然后加入Ulp1c在30℃切割1小时，然后SDS-PAGE电泳检测。

6His-SUMO-EGFP以及6His-Zipper-CTHS-EGFP&6His-Zipper-NTHS系统切割效率比较见图5。在同样的酶量和反应条件下，可见Zipper融合后的蛋白的重组切割效率远远高于没有引入Zipper的重组系统。

6His-CTHS-EGFP&6His-NTHS和6His-Zipper-CTHS-EGFP&6His-Zipper-NTHS增强重组SUMO系统切割效率比较见图6。在同样的酶量和反应条件下，可见Zipper融合后的蛋白的重组切割效率甚至高于原始的SUMO分子。

因此，在大肠杆菌中表达纯化好的6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)蛋白在体外与6His-Zipper-NTHS(NZ)蛋白重建SUMO，从而被外加的SUMO特异的蛋白水解酶Ulp1c识别，从而切除C端蛋白标签，得到EGFP蛋白，切割效率和速率远远高于6His-CTHS-EGFP(CE)和6His-NTHS(NT)重组切割的效率，甚至好于SUMO-EGFP被Ulp1c切割的效率。

同样，在真核系统中，毕赤酵母GS115菌株中表达和HEK293T细胞中表达的CZE蛋白在纯化后，体外切割具有类似的效果。

综上，证明Zipper的引入，极大的提高了体外切割效率。

利用此套系统可检测两个蛋白之间的相互作用，若存在相互作用，就能重建SUMO，从而被内源的蛋白水解酶识别，切割CZE得到EGFP。

实施例4.真核细胞中表达测试

本实施例中，在真核细胞中利用M02载体构建的克隆转染，证明Zipper-CTHS在体内具有促进表达的效果。

1.载体构建

SUMO，SUMO-CTHS，Zipper-CTHS的DNA序列通过分别通过NspV和XhoI位点，插入到pM02.Rx载体中，再通过EcoRI和XhoI，插入绿色荧光蛋白EGFP作为表达测试的目的蛋白，构建完成真核表达质粒pM02-6His-SUMO-EGFP(SE)，pM02-6His-CTHS-EGFP(CE)，和pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)。

pM02-6His-EGFP表达载体的构建：以pEGFP-N(Clontech公司)为模板，以primer1和primer2为引物，扩增获得EGFP基因，以EcoRI和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.Rx载体。

pM02-6His-SUMO-EGFP(SE)的构建：以pET28a-6His-SUMO-EGFP为模板，以primer15(SEQ ID NO：20)和primer2为引物，扩增获得SUMO基因，以NspV和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.Rx中，获得pM02-6His-SUMO-EGFP。

pM02-6His-CTHS-EGFP(CE)的构建：以pET28a-6His-CTHS-EGFP为模板，以primer15和primer2为引物，以NspV和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.RX中，获得pM02-6His-CTHS-EGFP。

pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(图10B)：以pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP为模板，以primer16(SEQ ID NO：21)和primer2为引物，以NspV和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.RX，获得pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP。

pM02-6His-NTHS：以pET28a-6His-NTHS为模板，以primer17(SEQ ID NO：22)和primer18(SEQ ID NO：23)为引物，扩增获得SUMO-NTHS基因，以NspV和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.Rx中。

pM02-6His-NTHS-Zipper(NZ)(图10A)表达载体的构建：以pET28a-6His-NTHS-Zipper为模板，以primer17和primer19(SEQ ID NO：24)为引物，扩增获得NTHS-Zipper基因，以NspV和XhoI酶切后插入到经过同样酶切的pM02.Rx中。

将上述构建的载体常规方法转染HEK293T细胞，用于表达融合蛋白。

2.融合蛋白的表达情况检测

用Western Blot分析HEK293T细胞中融合蛋白的表达情况。结果如图7所示。可见6His-SUMO-EGFP(SE)在表达过程中SUMO会被切割，而6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)不会被切割，而且极大促进融合蛋白的表达，在真核系统中是一种新的蛋白表达标签。

综上，真核表达系统中，宿主细胞HEK293T内转染的6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)中，Zipper-CTHS不被内源的SUMO蛋白水解酶识别，能够极大的增加表达量，提高目的蛋白溶解性。在毕赤酵母GS115菌株中表达具有类似的效果。

实施例5.真核细胞中表达的蛋白的体外切割生化实验

本实施例中，在真核293T细胞中共转染采用pM02载体构建的克隆，在细胞裂解液中加入Ulp1c证明引入Zipper极大提高了切割效率。

Ulp1c酶学单位如前定义。

细胞裂解缓冲液：1％NP-40，10％甘油，0.135mMNaCl，20mMTris(pH8.0)，1mM NaF，1mM NaVO₄，1mMDTT。

直接往裂解液上清中加入Ulp1c，在30℃温浴1小时，然后取样进行WesternBlot。结果如图8。其中，泳道1-5为pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)与pM02-6His-NTHS-Zipper(NZ)各250ng共转染细胞后，分别加入0，1，2，4，8单位Ulp1c切割后的情况；泳道7-11为pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)与pM02-6His-N-SUMO(NT)各250ng共转染细胞后，分别加入0，1，2，4，8单位Ulp1c切割后的情况；泳道12-13为pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP(CZE)与pM02-6His-NTHS-Zipper(NZ)各125ng共转染细胞后，分别加入0，2单位Ulp1c切割后的情况。

可见Zipper-CTHS极大促进融合蛋白的表达，极大提高了切割效率，增强重组Half SUMO表达系统在真核系统中建立。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>新型标签蛋白及其应用

<130>081202

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>1

Met Gly His His His His His His Glu Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala

20 25 30

Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg

35 40 45

Glu Gln Ile Gly Gly

50

<210>2

<211>62

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>2

Met Gly His His His His His His Gly Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

20 25 30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

35 40 45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys

50 55 60

<210>3

<211>93

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Glu Gln Leu Glu Lys Lys

1 5 10 15

Leu Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln Leu Glu Trp Lys Asn Gln

20 25 30

Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Glu Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly

50 55 60

Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp

65 70 75 80

Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly

85 90

<210>4

<211>0

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>4

<210>5

<211>288

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>核酸

<220>

<221>misc_feature

<223>核苷酸

<400>5

atgggcagca gccatcacca ccatcaccat agcagcggcg agcagctgga aaagaagtta 60

caagccctgg agaaaaaact tgctcagctg gaatggaaaa accaagcatt ggaaaaaaaa 120

ctcgcgcagg gcggtggcgg tggcggtgga tccgaaagac agggtaagga aatggactcc 180

ttaagattct tgtacgacgg tattcgcatc caagctgatc aggcccctga agatttggac 240

atggaggata acgatattat tgaggctcac cgcgaacaga ttggaggt 288

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gcgaattcat ggtgagcaag ggcgag 26

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

cgaattctcg agtcacttgt acagctcgtc catgc 35

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cacctaccat gggtcatcac catca 25

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

ggaattcttt catacctcca atctgttcgc gg 32

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

gaggatccga aagacagggt aaggaaatgg 30

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

ggaacctcat atggaacagc tggaaaagaa actgc 35

<210>12

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

gaacagctgg aaaagaaact gcaggcgctg gagaaaaagt tagcacaact ggaatgg 57

<210>13

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

ctgtgccagc tttttctcta atgcctgatt tttccattcc agttgtgcta actttt 56

<210>14

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

gaggatccac cgccaccgcc accgccctgt gccagctttt tctctaatg 49

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

ggtcgaggat ccttatttag cgaacgcttc catca 35

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

gaggatccgg cggtggcggt ggcggtgcac tgaaaaagga gctgca 46

<210>17

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

gcactgaaaa aggagctgca ggctaataag aaagaattag cacagctgaa gtggg 55

<210>18

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>18

ctgtgcaagt tctttcttca gcgcctgcag ttcccacttc agctgtgcta att 53

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>19

ggactcgagt tactgtgcaa gttctttctt cagc 34

<210>20

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>20

agaaggagtt cgaaaccatg ggtcatcacc atcatc 36

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>21

agaaggagtt cgaaaccatg ggcagcagcc atc 33

<210>22

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>22

agaaggagtt cgaaaccatg ggtcatcacc atca 34

<210>23

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>23

cgaattctcg agtcatttag cgaacgcttc catca 35

<210>24

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

cgaattctcg agtcactgtg caagttcttt cttcagc 37

Claims

1.一种表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的类泛素分子选自：SUMO，泛素，NEDD8，干扰素刺激蛋白15，延伸素B或泛素类似物1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的类泛素分子是SUMO。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的类泛素分子的羧基端区域具有SEQ ID NO：3中第52-96位的氨基酸序列；或者

所述的亮氨酸拉链2具有SEQ ID NO：4中第69-97位的氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(a)中，在所述的亮氨酸拉链1的编码基因和类泛素分子羧基端区域的编码基因之间，还包括一连接序列，所述的连接序列编码SEQ ID NO：3中第44-51位的氨基酸序列；或者

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(a)中，所述的构建物含有：

SEQ ID NO：5中31-288所示的核苷酸序列；或

SEQ ID NO：5中5-288所示的核苷酸序列；或

SEQ ID NO：5中1-288所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，(a)中，所述的构建物还含有至少一个纯化用标签的编码基因；或者

8.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的构建物是表达载体。

9.一种用于目的蛋白表达的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，(1)中，在所述的类泛素分子羧基端区域的编码基因的3端后，含有多克隆位点，该位点用于插入目的蛋白。

11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，其中还含有：

用于目的蛋白表达的宿主细胞；和/或

类泛素分子的特异性蛋白酶。