CN110551193A - 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用 - Google Patents

用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110551193A
CN110551193A CN201910875555.3A CN201910875555A CN110551193A CN 110551193 A CN110551193 A CN 110551193A CN 201910875555 A CN201910875555 A CN 201910875555A CN 110551193 A CN110551193 A CN 110551193A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
egfp
expression
tag
enrichment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910875555.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110551193B (zh
Inventor
宋俊祎
吴文健
胡碧茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National University of Defense Technology
Original Assignee
National University of Defense Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University of Defense Technology filed Critical National University of Defense Technology
Priority to CN201910875555.3A priority Critical patent/CN110551193B/zh
Publication of CN110551193A publication Critical patent/CN110551193A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110551193B publication Critical patent/CN110551193B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用，所述标签蛋白来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白‑‑反光蛋白A1(简称RA1)。用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，包括以下步骤：(a)提供一种构建物，在基因表达载体的开放阅读框内，从5’至3’段依次包含以下可操作性连接元件：eGFP的编码基因，RA1的编码基因；(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达eGFP，RA1标签；(c)提供一组eGFP与RA1标签构成的重组蛋白，所述重组蛋白含有eGFP与RA1功能区域，eGFP在RA1功能区域的作用下发挥：(d)细胞内富集与空间定位，并有利于后续分离纯化。

Description

用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术中的标签蛋白技术领域，具体涉及用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用。
背景技术
在后基因组时代的生物学研究当中，蛋白的功能分析是体外实验的重要方面。实现重组蛋白快速、方便、经济的表达便成为了前提条件。目前常用的蛋白表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞与哺乳动物细胞系统等。
在异源表达的过程当中，常常需要对目的蛋白的表达情况进行检测，因此需要采用一系列的蛋白标签进行标记、辅助。蛋白表达标签在促进蛋白表达、协助蛋白检测、实现蛋白纯化等过程中具有至关重要的作用。
例如，将编码目的蛋白的基因与荧光蛋白(eGFP、eCFP、eYFP)编码基因进行拼接后，可直接通过荧光显微镜在细胞活体状态下实时观察目的蛋白在细胞中的亚细胞定位和表达情况；
例如，将目的基因与GST、TrxA等大分子标签进行连接后，能够促进目的蛋白的可溶性，促进蛋白正确折叠，提高稳定性，并提高蛋白的表达量；
例如，6*His、Flag和c-Myc等小分子标签，则可提供简便有效的目的蛋白纯化途径与检测鉴定。
然而，在进行异源表达过程中存在着一个显著的限制因素：外源蛋白在宿主细胞内的大量表达可能对细胞本身的生理代谢过程产生影响，降低细胞活性甚至致死，限制最终的蛋白产率，提高了生产成本。
因此，若能在异源表达过程中对外源蛋白在细胞内的空间分布进行限制，将在一定程度上缓解异源表达过程对宿主细胞产生的不良影响。
由此可见，具备对目的蛋白进行空间富集、分布约束的新型标签蛋白的研究开发具有鲜明的应用需求和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白，所述标签蛋白可使用在哺乳动物表达系统中，也可使用在原核、酵母、昆虫表达系统中，可大量、快速地获得具有高活性的同源重组蛋白质(即目的蛋白)，并可在细胞内进行目的蛋白富集与空间定位。
本发明的另一目的在于提供用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，即利用新型富集表达、胞内定位标签蛋白表达目的蛋白的方法。
一种新型富集表达、胞内定位标签蛋白，所述标签蛋白来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白(Doryteuthis opalescens)--反光蛋白A1(Reflectin A1，以下简称RA1)；
所述标签蛋白，是指在任何蛋白表达系统中，在目的蛋白的C(羧基)端加上RA1标签后，利用RA1自身的自组装和胞内定位特性，从而形成的蛋白表达系统，凭借RA1在细胞内的自组装富集特性及特殊的胞内空间定位效应，可以促使目的蛋白发生自发富集、形成大型蛋白颗粒，有助于降低外源目的蛋白大量表达、无序分布对宿主细胞正常代谢过程可能产生的毒副作用，并有利于后续的分离纯化工作。
所述的RA1是指最初分离、鉴定自海洋生物枪乌贼虹细胞内的一种蛋白，该蛋白在体外显著的自组装性能及强大的膜上行为特性，由于RA1具备自组装能力，能够使几十、几百、几千个蛋白分子发生聚集，因此使其具备协助与之串联表达的增强绿色荧光蛋白(以下简称eGFP)(或其它目的蛋白)进行富集并形成大型蛋白颗粒的能力；同时，由于RA1特定氨基酸序列还具备与磷脂膜的结合能力，因此能够协助与之串联表达的eGFP(或其它目的蛋白)在宿主细胞内特定空间位置的定位能力。
用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，包括以下步骤：
(a)提供一种构建物，在基因表达载体的开放阅读框内，从5’至3’端依次包含以下可操作性连接元件：eGFP的编码基因，RA1的编码基因；
(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达eGFP，RA1标签；
(c)提供一组eGFP与RA1标签构成的重组蛋白，所述重组蛋白含有eGFP与RA1功能区域；
(d)eGFP在RA1功能区域的作用下发挥细胞内富集与空间定位，并优化后续分离纯化过程。
本发明步骤(a)所述的构建物是表达载体，是指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其它载体；
所述的eGFP的编码基因，根据表达需要替代该基因，即为目的基因；
所述的RA1的编码基因，根据表达需要替换其它工程质粒。
步骤(b)所述的表达eGFP，根据需求更换为其它目的蛋白。
步骤(c)所述的eGFP，根据需求更换为其它目的蛋白。
步骤(d)所述的细胞内富集与空间定位，是降低对细胞正常代谢的影响。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用RA1作为蛋白表达标签，与不添加该标签时的表达情况相比，可令目的蛋白在宿主细胞内的特定空间位置进行富集，降低了外源蛋白表达后广泛、无序分布对宿主细胞自身生理代谢的影响，保持宿主细胞活性，可提高蛋白终产量。
(2)本发明的蛋白表达标签RA1，可使外源目的蛋白在宿主细胞内表达后发生显著的富集作用，形成大型蛋白颗粒。利用RA1自组装特性形成蛋白富集颗粒，将有利于后续的蛋白纯化工作，降低纯化过程中的损耗，并可以提供新的蛋白分离提取方法。例如，可采用激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection(LCM))对蛋白颗粒进行提取，等。
附图说明
图1是在293T细胞中，eGFP单独表达时的蛋白分布情况的显示图。
图2是在293T细胞中，RA1与eGFP串联表达时的蛋白分布情况，图中可见RA1标签使得eGFP在293T细胞中大量富集成团，达到了高效表达的目的，同时其表达并不在细胞内无序、广泛地存在，将有助于降低外源蛋白表达对宿主细胞的毒副作用的显示图。
图3是在Hela细胞中，eGFP单独表达时的蛋白分布情况的显示图。
图4是在Hela细胞中，RA1与eGFP串联表达时的蛋白分布情况，图中可见RA1标签使得eGFP在Hela细胞中大量富集成团，达到了高效表达的目的，同时其表达并不在细胞内无序、广泛地存在，将有助于降低外源蛋白表达对宿主细胞的毒副作用的显示图。
图5是RA1所具备的自组装特性的展示图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
本发明人对反光蛋白A1(Reflectin A1，以下简称RA1)进行了系统的研究，在利用pEGFP-C1对该蛋白胞内定位特性进行测试时发现，RA1在293T、Hela细胞等哺乳动物细胞内可以促使eGFP形成大型蛋白富集体颗粒，使其不致在细胞内无序、广泛分布，从而降低外源蛋白大量表达过程对宿主细胞正常生理代谢产生的毒副作用，同时eGFP以富集体颗粒的形式存在，将有助于实现后续的蛋白纯化分离工作。
如本文所用，所述的“新型标签蛋白”是指在任何蛋白表达系统中，在目的蛋白的C(羧基)端加上RA1标签后，利用RA1自身的富集和胞内定位特性，从而形成的蛋白表达系统。凭借RA1在细胞内的自组装富集特性及特殊的胞内空间定位效应，可以促使目的蛋白发生自发富集、形成大型蛋白颗粒，有助于降低外源蛋白对宿主细胞正常代谢过程可能产生的毒副作用，并有利于后续的分离纯化工作。
如本文所用，所述的“可操作性连接(或相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。可以发生可操作性相连的核酸序列包括但不限于：启动子、蛋白编码序列、转录终止子、增强子等。这些序列的可操作性连接可产生包括mRNA和蛋白在内的功能性产物。
如本文所用，所述的RA1是指最初分离、鉴定自海洋生物枪乌贼虹细胞内的一种蛋白。经系统研究，本发明人发现了该蛋白在体外显著的自组装性能及丰富的膜上行为特性。由于RA1蛋白具备自组装能力，能够使几十、几百、几千个蛋白分子发生聚集，因此使其在本研究中具备协助与之串联表达的eGFP(或其它目的蛋白)进行富集并形成大型蛋白颗粒的能力。同时，由于RA1特定氨基酸序列还具备与磷脂膜的结合能力，因此能够协助与之串联表达的eGFP(或其它目的蛋白)在宿主细胞内特定空间位置的定位能力。
利用RA1新型标签蛋白表达目的蛋白eGFP
本发明所要解决的技术问题包括实现外源蛋白在宿主细胞内的特定空间位置的富集表达，以提高目的蛋白的产率和产量。本发明提供了一种成本低廉、重复性好、操作简便的蛋白表达标签及相关技术流程，具体的技术方案为：
(a)提供一种构建物，在基因表达载体的开放阅读框内，从5’至3’段依次包含以下可操作性连接元件：eGFP的编码基因(可根据表达需要替代该基因，即为目的基因)，RA1的编码基因(实施例中所用载体为pEGFP-C1-RA1，可根据表达需要替换其它工程质粒)；
(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达eGFP(可根据需求更换为其它目的蛋白)，RA1标签；
(c)提供一组eGFP(可根据需求更换为其它目的蛋白)与反光蛋白A1标签构成的重组蛋白，所述蛋白含有eGFP与RA1功能区域；
(d)eGFP(可更换为其它目的蛋白)可在RA1功能区域的作用下发挥细胞内富集与空间定位，以便降低对细胞正常代谢的影响及后续分离纯化步骤。
作为本发明的优选方式，所述构建物是表达载体。“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其它载体。理论上，只要能够在宿主细胞内复制并稳定遗传，任何质粒或载体都是可用的。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的重组表达载体。
Ⅰ.材料和方法
1)RA1基因与eGFP基因拼接：选取eGFP基因作为“目的基因”，同时利用其绿色荧光进行eGFP-RA1串联表达后的定位观察；首先，通过化学合成获得RA1基因全长，设计PCR引物(FP-GAATTCTATGAATAGATATTTGAATAGACA与RP-GGATCCATACATATGATAATCATAATAATTT)，通过聚合酶链式反应进行扩增后使其左右两端分别带上EcoRI、BamHI酶切位点；利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别对RA1、pEGFP-C1进行双酶切后(37℃for 2hr)，酶切产物回收后，采用T4连接酶将RA1基因连接到pEGFP-C1载体上(22℃for 2hr)；
2)重组质粒载体pEGFP-C1-RA1的扩增与浓缩：将T4连接酶酶连后所得pEGFP-C1-RA1质粒通过热激转化的方式导入到DH5α感受态细胞当中，于LB固体培养基(100ng/ml卡那抗性)上进行涂板、筛选；12小时后，挑选单菌落进行菌落PCR验证；选取阳性单菌落加入到3-4ml LB液体培养基中(100ng/ml卡那抗性)进行扩增；37℃过夜培养后采用质粒小提试剂盒(购自Tiangen)进行质粒回收，并利用乙酸钠、乙醇对质粒进行浓缩，浓缩后质粒浓度≥500ng/μl；
3)细胞转染与荧光分析：本发明的两例实施例分别采用Hela细胞、293T细胞对eGFP-RA1串联蛋白表达后的细胞内富集、定位情况进行研究；首先，将液氮冻存细胞在37℃水浴中快速解冻，加入DMEM培养基，1000rpm低速离心3分钟后，弃去上清，重新加入4.5mlDMEM培养基进行过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)；第二天观察细胞状态，细胞汇合度70-90％时进行分瓶传代，分瓶后过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)。第三天观察细胞状态，汇合度70-90％时进行脂质体转染(Lipofectamine 3000，购自Thermo Fisher)，将重组pEGFP-C1-RA1质粒导入到Hela细胞或293T细胞中；完成转染后过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)，24小时后进行荧光观察；
4)DAPI染核，共聚焦显微观察：验证eGFP成功表达后，PBS(pH7.4)润洗后4％多聚甲醛室温固定15分钟，用0.1％TritonX-100的PBS溶液破膜，加入2mg/L DAPI染核15分钟(购自Sangon Biotech)，用甲醇洗去多余染料后，甘油封片，显微观察。
编码反光蛋白A1标签蛋白的核酸序列：
ATGAATCGATATCTGAATCGACAGCGCCTGTACAACATGTACAGAAACAAGTACCGAGGTGTGATGGAACCGATGTCCAGAATGACCATGGACTTCCAAGGAAGATACATGGACTCCCAGGGCAGAATGGTCGACCCCCGATACTACGACCACTACGGAAGAATGCACGACTATGACCGATACTACGGAAGGTCCATGTTCAACCAGGGACACAGCATGGACAGTCAACGCTACGGCGGCTGGATGGACAACCCCGAGAGGTACATGGACATGTCTGGCTACCAGATGGACATGCAGGGACGCTGGATGGACGCCCAGGGGCGCTACAACAACCCATTTAGTCAAATGTGGCACAGCAGGCAAGGCCACTACCCTGGTTACATGTCACATCACTCCATGTATGGTAGAAATATGCACTACCCCTACCACAGCCATTCCGCCAGCCGGCATTTCGATTCCCCTGAAAGATGGATGGACATGTCCGGGTATCAGATGGACATGCAGGGACGCTGGATGGATAACTACGGCCGCTACGTGAACCCGTTCCACCACCACATGTATGGCAGAAACATGTTTTATCCTTACGGCAGCCATTGCAACAATCGGCACATGGAGCACCCCGAGAGGTACATGGACATGTCCGGCTATCAGATGGACATGCAGGGACGCTGGATGGACACACATGGACGTCACTGCAACCCGCTCGGTCAGATGTGGCACAACAGGCACGGTTACTATCCAGGACACCCACATGGTCGCAACATGTTCCAGCCCGAAAGATGGATGGATATGTCCAGCTATCAGATGGACATGCAAGGGCGTTGGATGGATAACTACGGCCGTTATGTGAACCCGTTCAGTCATAACTACGGCAGGCATATGAATTACCCTGGAGGTCACTACAACTACCACCACGGTCGCTACATGAATCACCCCGAGAGACAGATGGACATGTCCGGCTATCAGATGGACATGCACGGACGCTGGATGGACAACCAGGGCCGTTATATTGACAATTTCGATAGAAATTATTACGATTATCACATGTATTAA
反光蛋白A1标签蛋白氨基酸序列：
MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGVMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDPRYYDHYGRMHDYDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYNNPFSQMWHSRQGHYPGYMSHHSMYGRNMHYPYHSHSASRHFDSPERWMDMSGYQMDMQGRWMDNYGRYVNPFHHHMYGRNMFYPYGSHCNNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMDTHGRHCNPLGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERWMDMSSYQMDMQGRWMDNYGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNHPERQMDMSGYQMDMHGRWMDNQGRYIDNFDRNYYDYHMY
RA1 PCR引物设计(添加酶切位点)
Forward Primer：5'gaattct-atgaatagatatttgaatagaca 3'
Reverse Primer：5'ggatcc-atacatatgataatcataataattt 3'
Ⅱ.实施例
实施例1.pEGFP-C1与pEGFP-C1-RA1在293T细胞内的表达情况
图1.pEGFP-C1转染293T细胞24小时后的共聚焦显微观察结果。
A)激发波长488，信号收集通道507，eGFP绿色荧光信号；
B)激发波长364，信号收集通道461，DAPI蓝色荧光信号；
C)eGFP、DAPI信号通道融合后实验结果；
D)局部5倍放大图。
从图1A中可知，成功转染了pEGFP-C1质粒的293T细胞中有大量的绿色荧光信号(来源于eGFP的表达)。图1B中的蓝色信号来源于DAPI，由于破膜剂(TritonX-100)的使用，无论细胞是否成功转染并表达eGFP，细胞核均能够被DAPI染色，因此细胞数量大于图1A。将图1A与1B的图像融合后可发现，发出eGFP绿色荧光的细胞与部分DAPI染色的细胞核重叠。将重叠部分局部放大(5倍)后可以发现，成功转染了pEGFP-C1质粒的293T细胞中绿色荧光信号分布均匀，并在一定程度上对细胞核内DAPI信号进行了遮挡。
图2.pEGFP-C1-RA1转染293T细胞24小时后的共聚焦显微观察结果。
A)激发波长488，信号收集通道507，eGFP绿色荧光信号；
B)激发波长364，信号收集通道461，DAPI蓝色荧光信号；
C)eGFP、DAPI信号通道融合后实验结果；
D)局部5倍放大图。
图2A中，成功转染了pEGFP-C1-RA1质粒的293T细胞中有明显的绿色荧光信号(来源于eGFP的表达)。对比图1A与图2A，发现增加了RA1标签之后，绿色荧光信号的分布并不均匀，eGFP蛋白颗粒在细胞内发生了堆叠、形成了富集体，与此同时，富集体之外的空间则无绿色荧光信号分布。图2B为DAPI染核后的蓝色荧光信号。将图2A与2B的图像融合后可发现，发出eGFP绿色荧光的细胞与部分DAPI染色的细胞核重叠。将重叠部分局部放大(5倍)后可以发现，成功转染了pEGFP-C1-RA1质粒的293T细胞中绿色荧光信号分布并不均匀：1)在RA1标签的作用下，eGFP发生了堆叠形成了较为大型的富集体，在富集体之外的空间上并无eGFP分布；2)在RA1标签协助下形成的eGFP富集体具备特定的空间分布，最为突出的特点是并不进入细胞核：如图2D所示，尽管来自eGFP的绿色荧光与来自细胞核(DAPI染色)的蓝色荧光在空间上存在一定的共定位情况，但细胞核的蓝色信号并未受到绿色荧光的遮挡，与图1D形成了鲜明对比。
由此可见，由于新型蛋白表达标签RA1自身具有的强大自组装特性，能够协助目的蛋白(如eGFP)在表达之后、于宿主细胞内形成较为大型的蛋白富集体颗粒，将有利于后续的分离纯化。同时，由于RA1自身做具有的细胞内空间定位能力，能够将目的蛋白富集体颗粒束缚在宿主细胞特定的空间位置之内，将有效降低外源蛋白表达对宿主细胞自身正常代谢的有害影响，有助于提高最终的蛋白产率。
实施例2.pEGFP-C1与pEGFP-C1-RA1在Hela细胞内的表达情况
从图3A中可知，成功转染了pEGFP-C1质粒的Hela细胞中有大量的绿色荧光信号(来源于eGFP的表达)。图3B中的蓝色信号来源于DAPI，由于破膜剂(TritonX-100)的使用，无论细胞是否成功转染并表达eGFP，细胞核均能够被DAPI染色，因此细胞数量大于图3A。将图3A与3B的图像融合后可发现，发出eGFP绿色荧光的细胞与部分DAPI染色的细胞核重叠。将重叠部分局部放大(5倍)后可以发现，成功转染了pEGFP-C1质粒的Hela细胞中绿色荧光信号分布均匀，并在一定程度上对细胞核内的DAPI信号进行了遮挡。
图3.pEGFP-C1转染Hela细胞24小时后的共聚焦显微观察结果。
A)激发波长488，信号收集通道507，eGFP绿色荧光信号；
B)激发波长364，信号收集通道461，DAPI蓝色荧光信号；
C)eGFP、DAPI信号通道融合后实验结果；
D)局部5倍放大图。
图4A中，成功转染了pEGFP-C1-RA1质粒的Hela细胞中有明显的绿色荧光信号(来源于eGFP的表达)。对比图4A与图3A，发现增加了RA1标签之后，绿色荧光信号的分布并不均匀，eGFP蛋白颗粒在细胞内发生了堆叠形成了富集体，与此同时，富集体之外的空间则无绿色荧光信号(分布。图4B为DAPI染核后的蓝色荧光信号。将图4A与4B的图像融合后可发现，发出eGFP绿色荧光的细胞与部分DAPI染色的细胞核重叠。将重叠部分局部放大(5倍)后可以发现，成功转染了pEGFP-C1-RA1质粒的Hela细胞中绿色荧光信号分布并不均匀：1)在RA1标签的作用下，eGFP发生了堆叠形成了较为大型的富集体，在富集体之外的空间上并无eGFP分布；2)在RA1标签协助下形成的eGFP富集体具备特定的空间分布，最为突出的特点是并不进入细胞核:如图4D所示，尽管来自eGFP的绿色荧光与来自细胞核(DAPI染色)的蓝色荧光在空间上存在一定的共定位情况，但细胞核的蓝色信号并未受到绿色荧光的遮挡，与图3D形成了鲜明对比。
图4.pEGFP-C1-RA1转染Hela细胞24小时后的共聚焦显微观察结果。
A)激发波长488，信号收集通道507，eGFP绿色荧光信号；
B)激发波长364，信号收集通道461，DAPI蓝色荧光信号；
C)eGFP、DAPI信号通道融合后实验结果；
D)局部5倍放大图。
由此可见，由于新型蛋白表达标签RA1自身具有的强大自组装特性，能够协助目的蛋白(如eGFP)在表达之后、于宿主细胞内形成较为大型的蛋白富集体颗粒，将有利于后续的分离纯化。同时，由于RA1自身做具有的细胞内空间定位能力，能够将目的蛋白富集体颗粒束缚在宿主细胞特定的空间位置之内，将有效降低外源蛋白表达对宿主细胞自身正常代谢的有害影响，有助于提高最终的蛋白产率。
图5展示了RA1所具备的自组装特性：
pH4.5时，反光蛋白自组装体的水合直径为8±0.96nm；pH6.5时，反光蛋白自组装体水合直径升高至15.6±3.4nm；pH7.5时，蛋白自组装体大小进一步提高到34.4±8.2nm。
序列表
<110> 中国人民解放军国防科技大学
<120> 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> 乌贼虹细胞的膜上蛋白(Loligo pealei)
<400> 1
atgaatcgat atctgaatcg acagcgcctg tacaacatgt acagaaacaa gtaccgaggt 60
gtgatggaac cgatgtccag aatgaccatg gacttccaag gaagatacat ggactcccag 120
ggcagaatgg tcgacccccg atactacgac cactacggaa gaatgcacga ctatgaccga 180
tactacggaa ggtccatgtt caaccaggga cacagcatgg acagtcaacg ctacggcggc 240
tggatggaca accccgagag gtacatggac atgtctggct accagatgga catgcaggga 300
cgctggatgg acgcccaggg gcgctacaac aacccattta gtcaaatgtg gcacagcagg 360
caaggccact accctggtta catgtcacat cactccatgt atggtagaaa tatgcactac 420
ccctaccaca gccattccgc cagccggcat ttcgattccc ctgaaagatg gatggacatg 480
tccgggtatc agatggacat gcagggacgc tggatggata actacggccg ctacgtgaac 540
ccgttccacc accacatgta tggcagaaac atgttttatc cttacggcag ccattgcaac 600
aatcggcaca tggagcaccc cgagaggtac atggacatgt ccggctatca gatggacatg 660
cagggacgct ggatggacac acatggacgt cactgcaacc cgctcggtca gatgtggcac 720
aacaggcacg gttactatcc aggacaccca catggtcgca acatgttcca gcccgaaaga 780
tggatggata tgtccagcta tcagatggac atgcaagggc gttggatgga taactacggc 840
cgttatgtga acccgttcag tcataactac ggcaggcata tgaattaccc tggaggtcac 900
tacaactacc accacggtcg ctacatgaat caccccgaga gacagatgga catgtccggc 960
tatcagatgg acatgcacgg acgctggatg gacaaccagg gccgttatat tgacaatttc 1020
gatagaaatt attacgatta tcacatgtat taa 1053
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> 乌贼虹细胞的膜上蛋白(Loligo pealei)
<400> 2
Met Asn Arg Tyr Leu Asn Arg Gln Arg Leu Tyr Asn Met Tyr Arg Asn
1 5 10 15
Lys Tyr Arg Gly Val Met Glu Pro Met Ser Arg Met Thr Met Asp Phe
20 25 30
Gln Gly Arg Tyr Met Asp Ser Gln Gly Arg Met Val Asp Pro Arg Tyr
35 40 45
Tyr Asp His Tyr Gly Arg Met His Asp Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Arg
50 55 60
Ser Met Phe Asn Gln Gly His Ser Met Asp Ser Gln Arg Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Trp Met Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Met Asp Met Ser Gly Tyr Gln Met
85 90 95
Asp Met Gln Gly Arg Trp Met Asp Ala Gln Gly Arg Tyr Asn Asn Pro
100 105 110
Phe Ser Gln Met Trp His Ser Arg Gln Gly His Tyr Pro Gly Tyr Met
115 120 125
Ser His His Ser Met Tyr Gly Arg Asn Met His Tyr Pro Tyr His Ser
130 135 140
His Ser Ala Ser Arg His Phe Asp Ser Pro Glu Arg Trp Met Asp Met
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Gln Met Asp Met Gln Gly Arg Trp Met Asp Asn Tyr Gly
165 170 175
Arg Tyr Val Asn Pro Phe His His His Met Tyr Gly Arg Asn Met Phe
180 185 190
Tyr Pro Tyr Gly Ser His Cys Asn Asn Arg His Met Glu His Pro Glu
195 200 205
Arg Tyr Met Asp Met Ser Gly Tyr Gln Met Asp Met Gln Gly Arg Trp
210 215 220
Met Asp Thr His Gly Arg His Cys Asn Pro Leu Gly Gln Met Trp His
225 230 235 240
Asn Arg His Gly Tyr Tyr Pro Gly His Pro His Gly Arg Asn Met Phe
245 250 255
Gln Pro Glu Arg Trp Met Asp Met Ser Ser Tyr Gln Met Asp Met Gln
260 265 270
Gly Arg Trp Met Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Val Asn Pro Phe Ser His
275 280 285
Asn Tyr Gly Arg His Met Asn Tyr Pro Gly Gly His Tyr Asn Tyr His
290 295 300
His Gly Arg Tyr Met Asn His Pro Glu Arg Gln Met Asp Met Ser Gly
305 310 315 320
Tyr Gln Met Asp Met His Gly Arg Trp Met Asp Asn Gln Gly Arg Tyr
325 330 335
Ile Asp Asn Phe Asp Arg Asn Tyr Tyr Asp Tyr His Met Tyr
340 345 350
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 乌贼虹细胞的膜上蛋白(Loligo pealei)
<400> 3
gaattctatg aatagatatt tgaatagaca 30
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 乌贼虹细胞的膜上蛋白(Loligo pealei)
<400> 4
ggatccatac atatgataat cataataatt t 31

Claims (5)

1.用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白，其特征在于：所述标签蛋白来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白--反光蛋白A1，即Reflectin A1，以下简称RA1。
2.用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，所述标签蛋白来源于权利要求1，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供一种构建物，在基因表达载体的开放阅读框内，从5’至3’段依次包含以下可操作性连接元件：eGFP的编码基因，RA1的编码基因；
(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达eGFP，RA1标签；
(c)提供一组eGFP与RA1标签构成的重组蛋白，所述重组蛋白含有eGFP与RA1功能区域；
(d)eGFP在RA1功能区域的作用下发挥细胞内富集与空间定位，优化分离纯化过程。
3.根据权利要求2所述的用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，其特征在于：
步骤(a)所述的构建物是表达载体，是指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒或其它载体；
所述的eGFP的编码基因，根据表达需要替代该基因；
所述的RA1的编码基因，在不改变其编码的蛋白序列的前提下，根据表达体系的需求可进行密码子优化。
4.根据权利要求2所述的用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，其特征在于：步骤(b)所述的表达eGFP，根据需求更换为其它目的蛋白。
5.根据权利要求2所述的用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白的应用，其特征在于：步骤(c)所述的eGFP，根据需求更换为其它目的蛋白。
CN201910875555.3A 2019-09-17 2019-09-17 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用 Active CN110551193B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910875555.3A CN110551193B (zh) 2019-09-17 2019-09-17 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910875555.3A CN110551193B (zh) 2019-09-17 2019-09-17 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110551193A true CN110551193A (zh) 2019-12-10
CN110551193B CN110551193B (zh) 2021-06-04

Family

ID=68740528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910875555.3A Active CN110551193B (zh) 2019-09-17 2019-09-17 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110551193B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111606987A (zh) * 2020-06-03 2020-09-01 长沙馥新合成生物科技有限公司 反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法
CN114085280A (zh) * 2021-11-25 2022-02-25 中国人民解放军国防科技大学 一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056589A1 (ja) * 2003-12-15 2005-06-23 Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. 特定の塩濃度で自己集合性が惹起されるペプチドおよびその自己集合体
CN101570756A (zh) * 2008-04-30 2009-11-04 中国科学院上海生命科学研究院 新型标签蛋白及其应用
CN106222144A (zh) * 2016-08-01 2016-12-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 重组细胞及其制备方法和用途
CN107446916A (zh) * 2017-09-05 2017-12-08 大连理工大学 一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005056589A1 (ja) * 2003-12-15 2005-06-23 Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. 特定の塩濃度で自己集合性が惹起されるペプチドおよびその自己集合体
CN101570756A (zh) * 2008-04-30 2009-11-04 中国科学院上海生命科学研究院 新型标签蛋白及其应用
CN106222144A (zh) * 2016-08-01 2016-12-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 重组细胞及其制备方法和用途
CN107446916A (zh) * 2017-09-05 2017-12-08 大连理工大学 一种用于纯化并定向固定化组氨酸标签蛋白的方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROBERT LEVENSON等: "Cyclable Condensation and Hierarchical Assembly of Metastable Reflectin Proteins, the Drivers of Tunable Biophotonics", 《J BIOL CHEM》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111606987A (zh) * 2020-06-03 2020-09-01 长沙馥新合成生物科技有限公司 反光素蛋白在作为融合标签中的应用，重组蛋白及其表达方法
CN114085280A (zh) * 2021-11-25 2022-02-25 中国人民解放军国防科技大学 一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110551193B (zh) 2021-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Link et al. Non-canonical amino acids in protein engineering
Ohana et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells
CN110408636B (zh) 多重标签串联的dna序列及其在蛋白质表达纯化系统的应用
CN110551193B (zh) 用于蛋白富集表达、胞内定位的新型标签蛋白及其应用
US20160146786A1 (en) Method of monitoring cellular trafficking of peptides
WO2016204198A1 (ja) タンパク質の発現方法
CN108048480B (zh) 一种split-TEV-Fast系统的构建方法及其在检测蛋白相互作用中的应用
Kittanakom* et al. Analysis of membrane protein complexes using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system
JP2022521049A (ja) 標的タンパク質の選択的様式で遺伝子コード拡張によって操作された標的タンパク質を調製するための手段及び方法
Al-Homsi et al. Construction of pRSET-sfGFP plasmid for fusion-protein expression, purification and detection
CN104844691B (zh) Sox2蛋白肽适配子及其鉴定
Trettel et al. Chemical probing provides insight into the native assembly state of a bacterial microcompartment
CN112813049B (zh) 用于活细胞rna标记的融合蛋白及应用
Bogorodskiy et al. Accessing mitochondrial protein import in living cells by protein microinjection
US8067198B2 (en) Protein expression system
CN109553689B (zh) 一种含有ApcE2突变体的融合蛋白及其应用
US20220025355A1 (en) Method for screening protease variant and obtained protease variant
CN114057861B (zh) 一种靶向UBE2C的bio-PROTAC人工蛋白
JP6304683B2 (ja) 標的タンパク質の細胞内導入剤及び標的タンパク質の細胞内導入方法
WO2014015227A1 (en) Engineering cell surfaces for orthogonal selectability
JP6535483B2 (ja) 幼若ホルモンセンサー
WO2002036823A1 (fr) Procede de recherche d&#39;une proteine de transport dans le noyau codant pour un gene
JP2022508558A (ja) 生物学的分析に適した複数のポリペプチドバリアントを生成する方法
CN114085280A (zh) 一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用
US9290559B2 (en) Membrane protein expression vector comprising major envelope protein P9 of systovirus PHI12 as a fusion partner and method for producing membrane protein using the same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant