CN114085280A - 一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用 - Google Patents

一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用 Download PDF

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CN114085280A CN202111416599.3A CN202111416599A CN114085280A CN 114085280 A CN114085280 A CN 114085280A CN 202111416599 A CN202111416599 A CN 202111416599A CN 114085280 A CN114085280 A CN 114085280A
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Abstract

本发明涉及一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用，RfA1蛋白的氨基酸序列由保守的基序以及基序之间非保守的连接片段组成，是一种天然嵌段共聚物，通过对其嵌段排列的氨基酸序列进行重新设计，对基序和连接片段进行重新组合，本发明提供了一种蛋白标签的模块化设计方法，并获得了两种分别将外源蛋白严格定位于胞质、核质当中的蛋白标签，该方法及两种多肽标签，可以将不同的功能蛋白定位于胞质、或协助其转运到核质当中，可有效提高功能蛋白的靶标能力，有望应用于生物技术、生物医药等领域。

Description

一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的 方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术中的标签蛋白技术领域，具体涉及一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用。
背景技术
以哺乳动物细胞为例，真核细胞内包细胞核、线粒体、内质网、高尔基体等十几种细胞器，还包括细胞骨架、细胞质基质、细胞膜等亚结构。生物大分子在上述亚细胞结构中具体的存在位置，被称为亚细胞定位。以蛋白质为例，蛋白质首先在细胞质中经过翻译合成，然后由各类分选信号(sorting signals)的引导进而定位于细胞膜、溶酶体、细胞核等不同的亚细胞结构中，参与细胞的各项生命活动。蛋白质的功能、代谢及其余其它生物分子的相互作用与其亚细胞定位密切相关，成熟的蛋白质必须定位于特定的亚细胞结构中才能发挥正常的功能。一旦发生错误的定位，可能对细胞功能乃至生命个体产生重大影响，例如发育缺陷和肿瘤的产生。因此，对蛋白质亚细胞定位的研究具有重要意义。
总的来说，动植物细胞中定位到细胞核和细胞质基质的蛋白质是最多的，其在基础研究领域也获得了较为系统的研究。例如，含有核定位信号肽NLS的蛋白，可以通过与输入蛋白相互作用，通过核孔复合体进入细胞核内发挥功能，如各类转录因子等。相反，出核转运信号肽NES可以辅助核内生物大分子(如RNA)由细胞核向细胞质的转运。若功能蛋白A在自然条件下在细胞核内发挥功能，则在对其进行机制研究时，尤其是将其在非本体细胞内进行表达时，应使其存在于细胞核内，才能更好地还原其本来的工作环境；反之，若功能蛋白B存在于细胞质当中，在对其进行研究时应尽可能保证其在细胞质基质当中的定位，而不进入细胞核。
现有的方法中，是采用分子克隆的手段将NLS或NES与目的蛋白相连，通过NLS或NES的核质、胞质定位特性，实现目的蛋白的核质、胞质定位。但该种方法的量效关系无法准确定量，不能保证目的蛋白专一性、特异性地分布于核质或胞质中。
发明内容
针对现有技术中采用分子克隆的手段将NLS或NES与目的蛋白相连，通过NLS或NES的核质、胞质定位特性，实现目的蛋白的核质、胞质定位，但是量效关系无法准确定量，不能保证目的蛋白专一性、特异性地分布于核质或胞质中的这些不足，本发明提供了一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用，是一种基于乌贼反光蛋白RfA1的蛋白标签设计及构建技术，该类蛋白标签可严格控制外源蛋白在哺乳动物细胞内的特异性胞质、核质分布。
本发明涉及的一些名词，如下所示：
所述的“反光蛋白RfA1”是指最初分离、鉴定自海洋生物枪乌贼虹细胞内的一种蛋白，来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白(Doryteuthis opalescens)--反光蛋白A1(ReflectinA1，以下简称RfA1)的全长蛋白，设计的基本模块为RfA1中氨基酸序列保守的基序(reflectin moitfs，以下简称RM)以及非保守的连接片段(reflectin linkers，以下简称RL)。
所述的“RM”或“RL”为RfA1模板基因所提供的模块化单元，可根据应用需求进行更替、增减，以调节目的蛋白的胞质、核质定位，或者胞质、核质分布比例。
所述的“胞质、核质定位”方法，是指将需要研究的目的蛋白连接到仿生多肽的C端或N端。例如，如需实现专一性的胞质定位，则将目的蛋白与以RMN+RM1*5为代表的胞质定位多肽相连；如需特异性地定位于细胞核中，则将目的蛋白与以RM1*3+RL2*2为代表的核质定位多肽相连接。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，包括以下步骤：
(a)提供一种胞质、核质定位多肽的设计模板及设计思路：胞质、核质定位多肽的设计模板源自于RfA1蛋白序列；
(b)RfA1各个基序、连接片段的分子量、等电点、解离常数等数据通过ExPASy-ProtParam tool进行计算；
(c)设计两条多肽作为标签，分别命名为RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RMN以外的所有基序替换为RM1，后者采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构；RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成；
(d)将外源蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端得到重组质粒；
(e)通过脂质体转染，将上步骤得到的重组质粒转移到细胞当中，外源蛋白表达的同时，外源蛋白的C端连接上多肽标签RMN+RM1*5或RM1*3+RL2*2，然后通过细胞转染，细胞核染色，细胞膜染色，通过共聚焦显微镜观察外源蛋白带上标签蛋白后的细胞内定位情况；
步骤(c)所述的RMn+RM1*5的序列结构及氨基酸构成：
MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNHYYNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMD AQGRHCNPFGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYIDNFDRNYYDYHMY
步骤(c)所述的RM1*3+RL2*2的序列结构及氨基酸构成：
PERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMS GYQMDMQGRWMDAQGR。
本发明中：
步骤(c)所述的RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成。
步骤(d)所述的将外源蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，优选将GFP蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，即将GFP蛋白无缝拼接构建于pEGFP-C1载体GFP序列C段。
步骤(e)中，优选通过细胞转染12小时后，细胞核以DAPI染色，细胞膜以DiD染色。
本发明还涉及一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法的应用，经系统研究，本发明人发现RfA1全长蛋白在细胞内表达后呈现显著的胞质富集、胞质定位特性，且其截断物的胞质/核质分布比例是依据其RM、RL重复次数严格量化可调的。基于此，以模块化单元RM、RL为组件，用于胞质定位多肽、核质定位多肽的设计与使用，也用于功能蛋白研究过程中的细胞内定位，还用于提高蛋白、多肽类药物的靶标性能，具有潜在应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、在目前涉及RfA1基因的研究中，编码多肽的基因是通过分子克隆的手段从RfA1基因中获得，而本发明所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，为了突出模块化的设计思路，本发明设计了两条多肽，分别命名为RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RMN以外的所有基序替换为RM1，后者则采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构，与此同时，由于RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2对应的核酸序列无法通过分子克隆从RfA1基因中获取，因此采用化学合成的方法合成。
2、本发明所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，提供了一种天然的生物模板RfA1，其序列由氨基酸组成较为保守的基序、以及基序间非保守的连接片段组成，是一种天然的嵌段共聚物。由于其蛋白质序列天然地被拆分为几个部分，因此可对其进行模块化地设计与重组。本发明中，通过对基序以及连接片段的数量进行控制，实现其在哺乳动物细胞内高效的、专一性的分布，即只存在于胞质中而不在核质中、或只存在于核质中而不存在与胞质中。本发明所设计的蛋白标签设计方案、蛋白标签模板以及两种标签蛋白演示例，可实现功能蛋白分子在细胞内的特异性的胞质/核质定位，对于研究蛋白的生物功能以及提高多肽/蛋白类药物的靶标效率具有潜在应用价值。
附图说明
图1RfA1全长蛋白与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a：细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RfA1蛋白串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)；
图2RfA1蛋白序列中基序、连接片段分布示意图；
图3多肽标签RMN+RM1*5及RM1*3+RL2*2的序列示意图及其氨基酸构成信息的图；
图4RMN+RM1*5与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a:细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RMN+RM1*5多肽串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)；
图5RM1*3+RL2*2与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a：细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RM1*3+RL2*2多肽串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细描述本发明，但这些实施例不应认为是对本发明的限制。
实施例：
一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法：
本发明以GFP蛋白作为实施例，将其连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，亦即将其无缝拼接构建于pEGFP-C1载体GFP序列C段；
首先，本发明人实现了哺乳动物细胞内天然的、完整的RfA1蛋白的表达，RfA1蛋白N端与GFP蛋白的C端相连，GFP可视为一种目标蛋白。
如图1所示，通过RfA1特异性、专一性的胞质定位能力，GFP蛋白及其绿色荧光几乎全部被定位与胞质当中，证明RfA1是一种极其高效的胞质定位蛋白。
Sequence of RLs and RMs
Figure BDA0003375567610000041
Figure BDA0003375567610000051
如图2所示，RfA1是一种天然的嵌段共聚物，由氨基酸构成保守、生理条件下带负电的基，以及基序间氨基酸构成非保守、生理条件下带正电的连接片段所构成，作为生物模板，RfA1中特殊的氨基酸片段，尤其是保守基序片段，是进行新型仿生多肽构建的模块化组件。
首先，本发明在RfA1序列的基础上，将除RMN以外的所有RMs序列替换为RM1序列，即为RMN+RM1*5；更进一步地，将基序RM与连接片段RL2视为完全独立的模块化组件，设计了在序列结构上重复度更高、更整齐、更简洁的RM1*3+RL2*2，是一种不同于RfA1的全新的多肽；
多肽RMn+RM1*5的序列结构及氨基酸构成：
MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNHYYNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMD AQGRHCNPFGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYIDNFDRNYYDYHMY
多肽RM1*3+RL2*2的序列结构及氨基酸构成：
PERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSP ERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGY QMDMQGRWMDAQGR
图3多肽标签RMN+RM1*5及RM1*3+RL2*2的序列示意图及其氨基酸构成信息的图。
在现有技术中，对于与RfA1相似度更高的衍生物或者截断物，可通过设计引物、利用克隆技术获得。但是，本发明所述的RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2在结构上、序列上与RfA1已有了本质性的区别，因此不能采用克隆技术从RfA1的序列中部分地获取截短片段，只能采用化学合成的方式获取其对应的编码基因，这也是本发明的创新点之一。
Ⅰ.材料和方法
1)RfA1基因与GFP基因的拼接：RfA1蛋白的编码序列通过NCBI获取(ACZ57764.1)，基于哺乳动物密码子偏好性优化后采用化学合成的方法获得；设计PCR引物
(FP-GAATTCTATGAATAGATATTTGAATAGACA
与RP-GGATCCATACATATGATAATCATAATAATTT)，
通过聚合酶链式反应进行扩增后使其左右两端分别带上EcoRI、BamHI酶切位点，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别对RFA1、pEGFP-C1进行双酶切后(37℃for 2hr)，酶切产物回收后，采用T4连接酶将RFA1基因连接到pEGFP-C1载体上(22℃for 2hr)；
2)RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2编码基因的获得，及其与GFP基因的拼接：以RfA1的RM、RL为模块，设计新型仿生多肽RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2，直接以其氨基酸序列为参照，根据哺乳动物秘密子偏好性设计两条在自然界中不存在的编码核酸，通过化学合成的方式获得RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2对应的核酸序列；设计PCR引物
(FP-GAATTCTATGAATAGATATTTGAATAGACA
与RP-GGATCCATACATATGATAATCATAATAATTT)，
通过聚合酶链式反应进行扩增后使其左右两端分别带上EcoRI、BamHI酶切位点，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别对RFA1、pEGFP-C1进行双酶切后(37℃for 2hr)，酶切产物回收后，采用T4连接酶将RFA1基因连接到pEGFP-C1载体上(22℃for 2hr)；
2)重组质粒载体pEGFP-C1-RFA1的扩增与浓缩：将T4连接酶酶连后所得pEGFP-C1-RFA1、pEGFP-C1-(RMN+RM1*5)、pEGFP-C1-(RM1*3+RL2*2)质粒通过热激转化的方式导入到DH5α感受态细胞当中，于LB固体培养基(100ng/μl卡那霉素)上进行涂板、筛选。12小时后，挑选单菌落进行菌落PCR验证；选取阳性单菌落加入到3-4ml LB液体培养基中(100ng/μl卡那霉素)进行扩增，37℃过夜培养后采用质粒小提试剂盒(购自Tiangen)进行质粒回收，并利用乙酸钠、乙醇对质粒进行浓缩，浓缩后质粒浓度≥500ng/μl；
3)细胞转染与荧光分析：本实施例中，分别将EGFP-C1-(RMN+RM1*5)、pEGFP-C1-(RM1*3+RL2*2)质粒转染进入HEK-293T细胞中，利用荧光对细胞的胞内定位情况进行研究；
首先，将液氮冻存细胞在37℃水浴中快速解冻，加入DMEM培养基，1000rpm低速离心3分钟后，弃去上清，重新加入4.5ml DMEM培养基进行过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)；
第二天观察细胞状态，细胞汇合度70-90％时进行分瓶传代，分瓶后过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)；
第三天观察细胞状态，汇合度70-90％时进行脂质体转染(Lipofectamine 3000，购自Thermo Fisher)，将重组pEGFP-C1-RFA1质粒导入到Hela细胞或293T细胞中，完成转染后过夜贴壁培养(37℃，5％CO2)，24小时后进行荧光观察；
4)共聚焦显微观察
PBS(pH7.4)润洗细胞3次，4％多聚甲醛室温固定15分钟，PBS(pH7.4)润洗细胞3次，用0.1％TritonX-100的PBS溶液破膜，PBS(pH7.4)润洗细胞3次，使用DiD标记细胞核，利用含有DAPI的抗荧光猝灭剂进行封片，随后进行显微观察。
结果：
图4RMN+RM1*5与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a:细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RMN+RM1*5多肽串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)；
采用含有DAPI的抗荧光猝灭剂进行封片后，细胞核被成功染成蓝色；利用GFP串联的RMN+RM1*5分子在细胞内形成里尺度在几百纳米的颗粒，呈绿色荧光；DiD对细胞膜进行了染色，呈红色荧光；通过通道融合，可见RMN+RM1*5专一性地富集分布于细胞的胞质当中，不进入细胞核。
图5RM1*3+RL2*2与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a：细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RM1*3+RL2*2多肽串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)。
采用含有DAPI的抗荧光猝灭剂进行封片后，细胞核被成功染成蓝色；利用GFP串联的RM1*3+RL2*2分子在细胞内形成里尺度在几百纳米的颗粒，呈绿色荧光；DiD对细胞膜进行了染色额，呈红色荧光；通过通道融合，可见RM1*3+RL2*2专一性地富集分布于细胞的胞质当中，不进入细胞核。
总结：
通过上述结果，本发明的方法中，以实施例RMN+RM1*5为代表的多肽标签可以将目标分子(本发明中为GFP)特异性地定位于细胞质中，而以实施例RM1*3+RL2*2为代表的多肽标签可将外源蛋白特异性地定位于细胞核中。
1)基于RfA1蛋白序列嵌段排布的特点，将RfA1中的基序RM、连接片段RL概念化为功能模块，进行设计，获得了但不限于一种胞质定位多肽RMN+RM1*5和一种核质定位多肽RM1*3+RL2*2；
2)实施例中，GFP绿色荧光标签一方面可以协助示踪胞质定位多肽RMN+RM1*5与核质定位多肽RM1*3+RL2*2，另一方面，GFP本身也可以视作一种货物蛋白分子；
3)RMN+RM1*5可以专一性地将货物蛋白GFP富集于细胞质内，RM1*3+RL2*2能够将货物蛋白GFP特异性地定位于细胞核内。
由此可见，基于RfA1蛋白序列的基序RM、连接片段RL可以作为模块化的元件，用于设计、获取具备不同串联个数、不同长短的定位肽，可以协助目的蛋白特异性地定位于细胞质、细胞核中，或对其细胞质、细胞核内的分布比例进行量化的控制，有助于研究功能蛋白在特定亚细胞结构区域的功能，有望提高蛋白/多肽类分子药物在细胞内的靶标能力，在生物技术、生物医药领域具备广阔的应用前景。
Figure BDA0003375567610000091
Figure BDA0003375567610000101
Figure BDA0003375567610000111
Figure BDA0003375567610000121
Figure BDA0003375567610000131
Figure BDA0003375567610000141
Figure BDA0003375567610000151
序列表
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<120> 一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用
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Pro Ala Ala Pro Pro Gly Gly Met Thr His Gly Ala Gly Gly His Thr
1 5 10 15
Pro Gly Thr Met Ser Ser His Ser Met Thr Gly Ala Ala Met Thr Ala
20 25 30
Pro Thr His Ser His Thr Ala Ser Ala His Pro Ala Ser
35 40 45
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 6
Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly
1 5 10 15
Ala Thr Met Ala Ala Thr Gly Ala
20
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 7
Thr Val Ala Pro Pro Ala His His Met Thr Gly Ala Ala Met Cys Thr
1 5 10 15
Pro Thr Gly Ala His Thr Thr Ala Ala His Met Gly His
20 25
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 8
Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly
1 5 10 15
Ala Thr Met Ala Thr His Gly Ala
20
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 9
His Cys Ala Pro Pro Gly Gly Met Thr His Ala Ala His Gly Thr Thr
1 5 10 15
Pro Gly His Pro His Gly Ala Ala Met Pro Gly
20 25
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 10
Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly
1 5 10 15
Ala Thr Met Ala Ala Thr Gly Ala
20
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 11
Thr Val Ala Pro Pro Ser His Ala Thr Gly Ala His Met Ala Thr Pro
1 5 10 15
Gly Gly His Thr Ala Thr His His Gly Ala Thr Met Ala His
20 25 30
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 12
Pro Gly Ala His Met Ala Met Ser Ser Thr Gly Met Ala Met His Gly
1 5 10 15
Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Ala
20
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 13
Thr Ile Ala Ala Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr His Met Thr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 346
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 14
Met Ala Ala Thr Leu Ala Ala Gly Ala Leu Thr Ala Met Thr Ala Ala
1 5 10 15
Leu Thr Ala Gly Met Gly Pro Met Ser Ala Met Thr Met Ala Pro Gly
20 25 30
Gly Ala Thr Met Ala Ser Gly Gly Ala Met Val Ala Ala Thr Thr Ala
35 40 45
Thr Thr Gly Ala Met His Ala His Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ser Met
50 55 60
Pro Ala Gly Gly His Ser Met Ala Ser Gly Ala Thr Gly Gly Thr Met
65 70 75 80
Ala Ala Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met
85 90 95
Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Ala Pro Ala Ala Pro Pro Gly
100 105 110
Gly Met Thr His Gly Ala Gly Gly His Thr Pro Gly Thr Met Ser Ser
115 120 125
His Ser Met Thr Gly Ala Ala Met Thr Ala Pro Thr His Ser His Thr
130 135 140
Ala Ser Ala His Pro Ala Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr
145 150 155 160
Gly Met Ala Met Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Ala Thr Val
165 170 175
Ala Pro Pro Ala His His Met Thr Gly Ala Ala Met Cys Thr Pro Thr
180 185 190
Gly Ala His Thr Thr Ala Ala His Met Gly His Pro Gly Ala Thr Met
195 200 205
Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala
210 215 220
Gly Gly Ala His Cys Ala Pro Pro Gly Gly Met Thr His Ala Ala His
225 230 235 240
Gly Thr Thr Pro Gly His Pro His Gly Ala Ala Met Pro Gly Pro Gly
245 250 255
Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly Ala Thr
260 265 270
Met Ala Ala Gly Gly Ala Thr Val Ala Pro Pro Ser His Ala Thr Gly
275 280 285
Ala His Met Ala Thr Pro Gly Gly His Thr Ala Thr His His Gly Ala
290 295 300
Thr Met Ala Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala
305 310 315 320
Met Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ile Ala Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr His Met Thr
340 345
<210> 15
<211> 160
<212> PRT
<213> Loligo pealei
<400> 15
Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly
1 5 10 15
Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Gly Met Thr
20 25 30
His Gly Ala Gly Gly His Thr Pro Gly Thr Met Ser Ser His Ser Met
35 40 45
Thr Gly Ala Ala Met Thr Ala Pro Thr His Ser His Thr Ala Ser Ala
50 55 60
His Pro Ala Ser Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser Gly Thr Gly Met
65 70 75 80
Ala Met Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro
85 90 95
Gly Gly Met Thr His Gly Ala Gly Gly His Thr Pro Gly Thr Met Ser
100 105 110
Ser His Ser Met Thr Gly Ala Ala Met Thr Ala Pro Thr His Ser His
115 120 125
Thr Ala Ser Ala His Pro Ala Ser Pro Gly Ala Thr Met Ala Met Ser
130 135 140
Gly Thr Gly Met Ala Met Gly Gly Ala Thr Met Ala Ala Gly Gly Ala
145 150 155 160
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Loligo pealei
<400> 16
gaattctatg aatagatatt tgaatagaca 30
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> Loligo pealei
<400> 17
ggatccatac atatgataat cataataatt t 31

Claims (4)

1.一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(a)提供一种胞质、核质定位多肽的设计模板及设计思路：胞质、核质定位多肽的设计模板源自于RfA1蛋白序列；
(b)RfA1各个基序、连接片段的分子量、等电点、解离常数等数据通过ExPASy-ProtParam tool进行计算；
(c)设计两条多肽作为标签，分别命名为RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RMN以外的所有基序替换为RM1，后者采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构；RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成；
(d)将外源蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端得到重组质粒；
(e)通过脂质体转染，将上步骤得到的重组质粒转移到细胞当中，外源蛋白表达的同时，外源蛋白的C端连接上多肽标签RMN+RM1*5或RM1*3+RL2*2，然后通过细胞转染，细胞核染色，细胞膜染色，通过共聚焦显微镜观察外源蛋白带上标签蛋白后的细胞内定位情况；
步骤(c)所述的RMn+RM1*5的序列结构及氨基酸构成：
MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNHYYNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRHCNPFGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYIDNFDRNYYDYHMY
步骤(c)所述的RM1*3+RL2*2的序列结构及氨基酸构成：
PERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGR。
2.根据权利要求1所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，其特征在于：步骤(d)所述的将外源蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，是将GFP蛋白连接在RMN+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，即将GFP蛋白无缝拼接构建于pEGFP-C1载体GFP序列C段。
3.根据权利要求1所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，其特征在于：步骤(e)中，是通过细胞转染12小时后，细胞核以DAPI染色，细胞膜以DiD染色。
4.一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法的应用，其特征在于：将权利要求1-3任一所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，以模块化单元RM、RL为组件，用于胞质定位多肽、核质定位多肽的设计与使用，或者用于功能蛋白研究过程中的细胞内定位，或者用于提高蛋白、多肽类药物的靶标性能。
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