JP7277361B2 - 直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）用途の古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素 - Google Patents

Description

本発明は、核局在化シグナルを欠く及び／又は核外搬出シグナルを含む古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素、前記ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドと該ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化されるｔＲＮＡ又はそのようなｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む真核細胞、非天然アミノ酸残基を含むポリペプチドを作製するための前記細胞の利用方法、並びに、前記方法に有用なキットに関する。

イメージングを可能にする設計された蛍光タグ又は他の標識を用いて生体試料内で生体分子を視覚化する能力は、最新のバイオテクノロジー、細胞生物学及びライフサイエンスにおける主要なツールとなっている。これらの標識ベースのイメージング技術に共通する主な課題は、理想的には可能な限り小さい標識部位を遺伝的にコードすることである。

宿主の機構に直交するｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ／ＲＳ）対を利用した、特に終止コドン抑制を用いた非天然アミノ酸の直接的な遺伝的コード化によるタンパク質の翻訳修飾を結果としてもたらす遺伝暗号の拡張は、非常に優れた特異性、標的タンパク質内での配置の自由度及び最小限の構造変化を提供する。それと同時に、この方法は、目的とするいくつかの非天然アミノ酸残基を遺伝的にコードするために使用されてきた。例えば、設計されたＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｔＲＮＡ／チロシルｔＲＮＡ合成酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ／ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、並びに、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉ ｔＲＮＡ／ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素の対は、ポリペプチド中の様々な機能性を遺伝的にコードするために使用されてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。現在までに、２００を超える様々な非天然アミノ酸（例えば、非特許文献５、非特許文献６を参照）が、残基の適合性（ｒｅｓｉｄｕｅ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）によって組み込まれてきた。

近年、本発明者らは、歪のあるアルキニル又は歪のあるアルケニル基を含む非天然アミノ酸が、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉに由来するｔＲＮＡ／ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素対を利用することでアンバーコドンに応答して生きた哺乳動物細胞においてコードされ得ることを示した（非特許文献７；特許文献１）。歪のあるアルキニル、歪のあるアルケニル又はノルボルネニル基等の反応性基を有する非天然アミノ酸残基を含むポリペプチドは、それぞれテトラジン又はアジドを用いた歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）や歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）等の超高速バイオ直交型クリック反応に使用できる。テトラジンで官能化された色素は、非常に高解像度のイメージング法用に哺乳動物細胞中の表面タンパク質又は細胞骨格タンパク質のいずれかを標識するために、そのようなクリック反応において既に使用されてきた（非特許文献８；特許文献２；非特許文献９）。

遺伝暗号の拡張の一般的な（特にそれに基づく高解像度イメージングについての）最大の問題点としては、宿主内部の翻訳終結機構と終止コドン抑制との競合があり、細胞内のそれほど多くないタンパク質の標識の効率を制限している。真核生物における遺伝暗号の拡張のこの重要な問題に取り組むために、２～３の例を挙げると、プロモータ工学、ＲＳのより望ましい進化、放出因子工学及びｔＲＮＡの複数連鎖（ｍｕｌｔｉ－ｃｈａｉｎｉｎｇ）を含む多くの方法が探求されてきた（例えば、非特許文献１０を参照）。

これらの取り組みにもかかわらず、たとえ存在量の少ないポリペプチドでも効率的に標識して超解像顕微鏡法（ＳＲＭ）の利用を可能にするために、真核細胞における遺伝暗号の拡張の効率（及び細胞によって発現する、標識とイメージングの目的に使用することができる、非天然アミノ酸残基を含む標的ポリペプチドの量）を改善する戦略に対する要求は依然として高い。したがって、本発明の目的はこの課題に取り組むことである。

国際公開第２０１２／１０４４２２号 国際公開第２０１５／１０７０６４号

Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２４：９０２６，２００２ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：９６４，２００３ Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３１：８７２０，２００９ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５：１１８７，２００８ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０ Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４ Ｐｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（１７）：４１６６－４１７０，２０１２ Ｎｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５３（８）：２２４５－２２４９，２０１４ Ｕｔｔａｍａｐｉｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３７（１４）：４６０２－４６０５，２０１５ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１４

本発明者らは、真核細胞において核局在化シグナルとして作用し得る古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素の配列を同定した。本発明者らは、合成酵素のアミノ酸配列が核を対象とせずに修飾されている場合、古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をベースとする遺伝暗号の拡張の効率が高くなり得ることを示した。この目的のために、核局在化シグナルは合成酵素から除去されてもよいし、又は、適切な核外搬出シグナルを導入することによって無効化されてもよい。

本発明者らは、真核細胞内で発現する古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素の核への誤局在が、そのような合成酵素をベースとする遺伝暗号の拡張の効率を制限すると推察する。翻訳が行われる細胞質において利用可能な合成酵素の量が制限されるからである。細胞の細胞質内、特にリボソームにおいて、高濃度の古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素と、合成酵素により非天然アミノ酸でアシル化された高濃度のｔＲＮＡが存在する場合、翻訳中に非天然アミノ酸が成長中のポリペプチド鎖に組み込まれる傾向が強いと考えられている。

したがって、本発明は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠く及び／又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）に関する。また本発明は、本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する。

さらに本発明は、本発明のＰｙｌＲＳをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの組合せを提供する。なおｔＲＮＡ^Ｐｙｌは前記ＰｙｌＲＳによってアシル化され得るｔＲＮＡである。

また本発明は、（ｉ）本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列及び（ｉｉ）前記ＰｙｌＲＳによってアシル化され得るｔＲＮＡ^Ｐｙｌ又はそのようなｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列を含む真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞に関する。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列は、ＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド又は別のポリヌクレオチド上に位置し得る。適切には、真核細胞はＰｙｌＲＳ、また適用可能であれば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを発現することができる。

また本発明は、１つ以上の非天然アミノ酸（ＵＡＡ）残基を含む標的ポリペプチドの作製方法に関し、該方法は下記工程を含む：
（ａ）以下を含む本発明の真核細胞を提供する工程：
（ｉ）本発明のＰｙｌＲＳ；
（ｉｉ）ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；
（ｉｉｉ）ＵＡＡ又はその塩；及び、
（ｉｖ）標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＵＡＡ残基に占められる該標的ポリペプチドの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンによりコードされている）；
但し、ＰｙｌＲＳ（ｉ）は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ｉｉ）を、ＵＡＡ又はその塩（ｉｉｉ）を用いてアシル化することができる；並びに、
（ｂ）真核細胞によるポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能にし、それにより標的ポリペプチドを産生する工程。

また本発明は、下記工程を含むポリペプチド結合体（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の作製方法に関する：
（ａ）本発明の方法を用いて、１つ以上のＵＡＡ残基を含む標的ポリペプチドを作製する工程；及び、
（ｂ）標的ポリペプチドを１つ以上の結合パートナー分子と反応させて、標的ポリペプチドのＵＡＡ残基に結合パートナー分子を共有結合させる工程。

さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせ又は真核細胞を含むキットに関する。一実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのＵＡＡ又はその塩、及び本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのＵＡＡ又はその塩、及び本発明の真核細胞を含むキットを提供する。該キットは、ＰｙｌＲＳによってアシル化できるｔＲＮＡ^Ｐｙｌ又はそのようなｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列は、本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド又は別のポリヌクレオチド上に位置し得る。本発明のＰｙｌＲＳは、ｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＡＡ又はその塩でアシル化することができる。このキットは、真核細胞内において、１つ以上のＵＡＡ残基を有する標的ポリペプチドを発現させるのに有用である。したがって、このキットは、真核細胞内において、１つ以上のＵＡＡ残基を有する標的ポリペプチドを発現させる、例えば本発明の方法を使用するための説明書をさらに含んでもよい。

図１は、ＵＡＡ１及び２の構造；及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ａ）又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ｂ）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。左枠：Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色；中央枠：ラット抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体＋Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で免疫染色；右枠：重ね合わせ。 図２は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ａ）又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ｂ）のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞を示す。左枠：Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色；中央枠：ラット抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体＋Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で免疫染色；右枠：重ね合わせ。 図３は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ａ）又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ｂ）のいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。左枠：Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色；中央枠：ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；右枠：重ね合わせ。 図４は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ａ）又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（ｂ）のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞を示す。左枠：Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色；中央枠：ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；右枠：重ね合わせ。 図５は、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}アンバー抑制レポーター及びアンバー抑制対（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ）の１つを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。各々のアンバー抑制対について、ＵＡＡなし（左）と、ＢＯＣの添加あり（右）のトランスフェクトした試料を示す。アンバー抑制細胞（ゲート「ｉＲＦＰ、ＧＦＰ」）のパーセンテージは、総トランスフェクト集団（ゲート「ｉＲＦＰ」、「ｉＲＦＰ、ＧＦＰ」及び「ＧＦＰ」の細胞の合計）を基準に算出する。また明るい二重陽性細胞（「明るい（Ｂｒｉｇｈｔ）ＤＰ」）のパーセンテージを伴う追加のゲートも示す。 図６は、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}アンバー抑制レポーター及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し、ＵＡＡ１存在下のＰｙｌＲＳ^ＡＦのアンバー抑制効率（左）及びＵＡＡ１存在下（中央）又はＵＡＡ非存在下（右）のＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのアンバー抑制効率を評価する。図６は、以下の実施例３に記載の様々なＤＮＡ濃度にわたるタイトレーションの累積データを示す。 図７は、様々な量のアンバー抑制レポーターｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}（１ウェルあたり１００～５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ）及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ（リファレンス）又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^Ａのいずれかを用いて、低濃度（５０μＭ、左グラフ）又は高濃度（２５０μＭ、右グラフ）のＵＡＡ１の存在下で培養した同時トランスフェクトされた細胞試料において、フローサイトメトリーによって観察されたＧＦＰ蛍光ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「薄暗いＤＰ」、「明るいＤＰ」及び「非常に明るいＤＰ」に分類した）の数の変化を要約する。実施例３も参照のこと。 図８（ａ）は、Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ法の概略図を示す。アンバーコドンをコードするアミノ酸残基を有する目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（「ＰＯＩ（ＴＡＧ）」）は、ｔｒａｎｓ－シクロオクテニル基を含むＵＡＡ（例えばＵＡＡ２）の存在下で、アンバー抑制対ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦで同時トランスフェクトされた真核生物（例えば哺乳動物）細胞において発現する。アンバーコード部位に組み込まれたＵＡＡを含む発現した目的のポリペプチド（ＰＯＩ）は、二段階の標識反応に供され、テトラジン結合－結合ＤＮＡストランドは、ＳＰＩＥＤＡＣ反応によりＰＯＩのＵＡＡ由来アミノ酸残基に化学的に結合する。そして第２に、色素と結合した相補的イメージャストランドを細胞に添加する。さらに図８は、ｐＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ＰＳｍＯｒａｎｇｅとｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるタンパク質発現のコントロールとして使用されるｖｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６a２}－ｍＯｒａｎｇｅ構築物のｍＯｒａｎｇｅ融合タンパク質の蛍光シグナル（ｂ）；ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びｐＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ＰＳｍＯｒａｎｇｅ（ｃ）又はｐＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３（ｄ）のいずれかを同時トランスフェクトし、アンバーコード部位に組み込まれたＵＡＡ２を有するｖｉｍｅｎｔｉｎ－ｍＯｒａｎｇｅ融合体（ｃ）又はＧＦＰ－Ｎｕｐ１５３融合体（ｄ）を発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＤＮＡ－ＰＡＩＮＴに基づくＳＲＭを示す。なお融合タンパク質は、本明細書に記載のＣｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴプロトコルを使用して、ＵＡＡ２由来のアミノ酸残基に標識する（核膜孔の拡大像のスケールバーは１００ｎｍ）。 図９は、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}アンバー抑制レポーター及びアンバー抑制対の１つ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ）を用いて同時トランスフェクトしたＳｆ２１細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。各アンバー抑制対について、ＵＡＡなしで様々な濃度のＵＡＡ１を添加したトランスフェクトした試料を示す。各ドットプロットは４つの区分に分けられる：左上の区分は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現した（すなわち、うまくトランスフェクトされた）が、ＧＦＰを発現しなかった（すなわち、ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}中のアンバー終止コドンを抑制できなかった）「ｍＣｈｅｒｒｙのみ」細胞を示し；右上の区分は、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰの両方を発現した（すなわち、うまくＵＡＡ１をＧＦＰに組み込んだ）「二重陽性」細胞を示し；そして、左下の区分は「二重陰性」細胞（すなわち、うまくトランスフェクトされなかった）を示す。実施例６も参照のこと。 図１０は、図９に示すＳｆ２１細胞試料中の様々なＵＡＡ１濃度について、トランスフェクトされた細胞の総数に対する「二重陽性」の割合を示す。実施例６も参照のこと。 図１１は、図９に示すＳｆ２１細胞試料中の様々なＵＡＡ１濃度について、「二重陽性」におけるＧＦＰシグナルの幾何平均を示す。実施例６も参照のこと。

［発明の詳細な説明］
本明細書中で別途に定義されない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。用語の意味及び範囲は明確であるべきである。しかしながら潜在的な多義性がある場合、本明細書に規定される定義はあらゆる辞書又は外部の定義よりも優先される。さらに、状況による別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

本発明は、（ａ）ＮＬＳを欠く、又は、（ｂ）ＮＥＳを含む、又は（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方である古細菌ＰｙｌＲＳを提供する。

ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（ＰｙｌＲＳ）はアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）である。ＲＳは、ｔＲＮＡをアミノ酸又はアミノ酸類似体でアシル化できる酵素である。適切には、本発明のＰｙｌＲＳは酵素的に活性であり、すなわちｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）を特定のアミノ酸又はアミノ酸類似体、好ましくはＵＡＡ又はその塩でアシル化することができる。

本明細書で使用される「古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素」（「古細菌ＰｙｌＲＳ」と略される）という用語は、少なくともＰｙｌＲＳアミノ酸配列のセグメント又は全ＰｙｌＲＳアミノ酸配列が、古細菌由来の天然ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列又はその天然ＰｙｌＲＳの酵素的に活性な断片のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するＰｙｌＲＳを意味する。

本発明の特定の実施形態では、古細菌は、メタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、例えばＭ．ｍａｚｅｉ又はＭ．ｂａｒｋｅｒｉである。本発明の好ましい実施形態によれば、古細菌はＭ．ｍａｚｅｉある。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、古細菌はＭ．ｂａｒｋｅｒｉである。

本発明のＰｙｌＲＳは、野生型又は変異型古細菌ＰｙｌＲＳ、又はその酵素的に活性な断片を含むことができる。

変異型古細菌ＰｙｌＲＳは、１つ以上のアミノ酸残基の付加、置換及び／又は欠失を含む点で、対応する野生型ＰｙｌＲＳとは異なる。好ましくは、これらは、ＰｙｌＲＳ安定性を改善し、ＰｙｌＲＳ基質特異性を改変し、及び／又はＰｙｌＲＳ酵素活性を増強する修飾である。例えば、変異型古細菌ＰｙｌＲＳは、Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，１５：１１８７又はＥＰ２１９２１８５に記載の変異体である。

特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、Ｍ．ｍａｚｅｉ野生型ＰｙｌＲＳ又はその酵素的に活性な断片を含む。野生型Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳのアミノ酸配列を配列番号１に示す。

別の特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、変異型Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ又はその酵素的に活性な断片を含む。前記変異型Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳは、対応する野生型Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳと比較して（置換、付加及び欠失から独立して選択される）１つ以上のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態によれば、そのアミノ酸改変はアミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆから選択される。例えば、本発明のＰｙｌＲＳは、ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はその酵素的に活性な断片を含む。Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ^ＡＦのアミノ酸配列を配列番号２に示す。

さらなる特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ野生型ＰｙｌＲＳ又はその酵素的に活性な断片を含む。野生型Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉのＰｙｌＲＳのアミノ酸配列を配列番号３に示す。

用語「核外搬出シグナル」（「ＮＥＳ」と略される）は、それを含むポリペプチド（本発明のＮＥＳ含有ＰｙｌＲＳ等）が真核細胞の核から搬出されるように指示できるアミノ酸配列を意味する。該搬出は、大部分がＣｒｍ１（染色体領域維持１；カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）によって媒介されると考えられている。ＮＥＳは当技術分野において公知である。例えば、データベースＶａｌｉｄＮＥＳ（ｈｔｔｐ：／／ｖａｌｉｄｎｅｓｓ．ｙｍ．ｅｄｕ．ｔｗ／）は、実験的に検証されたＮＥＳ含有タンパク質の配列情報を提供する。さらに、例えばＮＥＳｂａｓｅ１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｄａｔａｂａｓｅｄ／ＮＥＳｂａｓｅ－１．０／；Ｌｅ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照）等のＮＥＳデータベースや、ＮＥＳ予測のためのツール、例えばＮｅｔＮＥＳ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＥＳ／；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）、ＮＥＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＮｅｔＮＥＳ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｄ３３８－Ｄ３４３，２０１３；Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）及びＮＥＳｓｅｎｔｉａｌ（ＶａｌｉｄＮＥＳと組み合わせたウェブインターフェース）が一般に向けて利用可能である。疎水性のロイシンに富むＮＥＳが最も一般的であり、現在までに最もよく特徴がわかっているＮＥＳのグループを示す。疎水性ロイシンに富むＮＥＳは、３又は４個の疎水性残基を有する非保存的モチーフである。これらのＮＥＳの多くは、保存されたアミノ酸配列パターンＬｘｘＬｘＬ（配列番号４）又はＬｘｘｘＬｘＬ（配列番号５）を含む。なお、各Ｌはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンのアミノ酸残基から独立して選択される。また各ｘは、任意のアミノ酸から独立して選択される（Ｌａ Ｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １７（６）：５２７－５３６，２００４参照）。

用語「核局在化シグナル」（「ＮＬＳ」と略され、当技術分野では「核局在化配列」とも呼ばれる）は、それを含むポリペプチド（例えば、野生型古細菌ＰｙｌＲＳ）を真核細胞の核に取り込むように指示できるアミノ酸配列を意味する。前記輸送は、核膜孔を通って移動する複合体を形成するための、ＮＬＳ含有ポリペプチドのインポーチン（カリオフェリンとしても知られる）への結合によって媒介されると考えられている。ＮＬＳは当技術分野で公知である。多数のＮＬＳデータベース及びＮＬＳ予測のためのツールが一般に向けて利用可能である。例えば、ＮＬＳｄｂ（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１），２００３参照），ｃＮＬＳ Ｍａｐｐｅｒ（ｗｗｗ．ｎｌｓ－ｍａｐｐｅｒ．ａｉｂ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６（２５）：１０１７１－１０１７６，２００９；Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４（１）：４７８－４８５，２００９参照），ＳｅｑＮＬＳ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７６８６４，２０１３参照）及びＮｕｃＰｒｅｄ（ｗｗｗ．ｓｂｃ．ｓｕ．ｓｅ／～ｍａｃｃａｌｌｒ／ｎｕｃｐｒｅｄ／；Ｂｒａｎｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（９）：１１５９－６０，２００７参照）である。

本発明の古細菌ＰｙｌＲＳは、天然古細菌ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列を改変することによって、特に前記天然ＰｙｌＲＳに見られるＮＬＳを除去する及び／又は少なくとも１つのＮＥＳを導入する１つ以上のアミノ酸改変（アミノ酸置換、欠失及び付加から独立して選択される）を導入することによって作製できる。天然ＰｙｌＲＳ中のＮＬＳは、例えばｃＮＬＳマッパー等の既知のＮＬＳ検出ツールを用いて同定できる。

古細菌ＰｙｌＲＳ等のポリペプチドからのＮＬＳの除去及び／又はポリペプチドへのＮＥＳの導入は、真核細胞で発現したときにこのように改変されたポリペプチドの局在化を変化させること、特に真核細胞の核内のポリペプチドの蓄積を回避又は減少させることができる。したがって、真核細胞において発現する本発明のＰｙｌＲＳの局在化は、それが（依然として）ＮＬＳを含み、そしてＮＥＳを欠くという点で本発明のＰｙｌＲＳとは異なるＰｙｌＲＳと比較して変化することができる。

本発明の古細菌ＰｙｌＲＳがＮＥＳを含むが（依然として）ＮＬＳを含む場合は、ＮＥＳの強度がＮＬＳを無効にし、真核細胞の核内のＰｙｌＲＳの蓄積を妨げるようにＮＥＳが選択されることが好ましい。

本発明のＰｙｌＲＳを得るための、野生型又は変異型ＰｙｌＲＳからのＮＬＳの除去及び／又は野生型又は変異型ＰｙｌＲＳへのＮＥＳの導入は、ＰｙｌＲＳ酵素活性を無効にはしない。好ましくは、ＰｙｌＲＳ酵素活性は基本的に同じレベルに維持される。すなわち、本発明のＰｙｌＲＳは、対応する野生型又は変異型ＰｙｌＲＳの酵素活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％を有する。

ＮＥＳは、ＮＥＳが動作するように本発明のＰｙｌＲＳ内に適切に配置される。例えば、ＮＥＳは、野生型又は変異型古細菌ＰｙｌＲＳのＣ末端（例えば、最後のアミノ酸残基のＣ末端）又はＮ末端（例えば、アミノ酸残基１、Ｎ末端メチオニン、及びアミノ酸残基２の間）に結合することができる。

本発明のＰｙｌＲＳに適したＮＥＳ配列は、当技術分野で公知である（例えば、ＮＥＳデータベースから）。一実施形態では、本発明のＰｙｌＲＳは、疎水性ロイシンに富むＮＥＳ、特にアミノ酸配列ＬｘｘＬｘＬ（配列番号４）又はＬｘｘｘＬｘＬ（配列番号５）を含むＮＥＳを含む。なお、各Ｌは独立してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択される。また各ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される。より具体的には、ＮＥＳは、Ｌ^１ｘｘＬ^２ｘｘＬ^１ｘＬ^３（配列番号６）、Ｌ^１ｘｘｘＬ^２ｘｘＬ^１ｘＬ^３（配列番号７）、Ｌ^１ｘｘＬ^２ｘｘｘＬ^１ｘＬ^３（配列番号８）及びＬ^１ｘｘｘＬ^２ｘｘｘＬ^１ｘＬ^３（配列番号９）から選択されるアミノ酸配列を含む。なお、Ｌ^１はロイシンであり、Ｌ^２はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択され、Ｌ^３はロイシン及びイソロイシンから選択される。また各ｘは独立して任意のアミノ酸から選択される。好ましくは、ＮＥＳは、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖタンパク質に見られるアミノ酸配列ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ（配列番号１０）を含み、又はより好ましくはアミノ酸配列ＡＣＰＶＰＬＱＬＰＰＬＥＲＬＴＬＤ（配列番号１１）を含む。

特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、配列番号２に示すＭ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＡＦのアミノ酸配列の酵素的に活性な断片、及び配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＥＳを含む。そのＰｙｌＲＳの好ましい例は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

そのＰｙｌＲＳのさらに好ましい例は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、配列番号１に示す野生型Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列の酵素的に活性な断片、及び配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＥＳを含む。そのＰｙｌＲＳの好ましい例は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

そのＰｙｌＲＳのさらに好ましい例は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

さらなる特定の実施形態によれば、本発明のＰｙｌＲＳは、配列番号３に示すＭ．ｂａｒｋｅｒｉ ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列の酵素的に活性な断片、及び配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＮＥＳを含む。そのＰｙｌＲＳの好ましい例は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

そのＰｙｌＲＳのさらに好ましい例は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか又は本質的にそれから成る。

本発明のＰｙｌＲＳはｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対で使用される。なお、ＰｙｌＲＳは、好ましくはＵＡＡ又はその塩で、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをアシル化することができる。

特に指示のない限り、本明細書で使用される「ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ」は、本発明のＰｙｌＲＳによって（好ましくは選択的に）アシル化できるｔＲＮＡを意味する。本発明の状況において、本明細書に記載のｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ピロリジンを用いてＰｙｌＲＳによってアシル化することができる野生型ｔＲＮＡ、又はそのｔＲＮＡの変異体、例えば古細菌由来の、例えばメタノサルキナ属（例えばＭ．ｍａｚｅｉ若しくはＭ．ｂａｒｋｅｒｉ）由来の、野生型もしくは変異型ｔＲＮＡであってもよい。ＵＡＡのＰＯＩへの部位特異的組み込みのために本発明のＰｙｌＲＳと共に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンは、適切には、セレクターコドンの逆相補体である。特定の実施形態では、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンはアンバー終止コドンの逆相補体である。例えば、プロテオーム標識化（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２（５）：４６５－４７２，２０１４）等の他の用途では、本発明のＰｙｌＲＳと共に使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンは、真核細胞の内因性ｔＲＮＡによって認識されるコドンであってもよい。

本明細書で使用される「セレクターコドン」という用語は、翻訳過程中にｔＲＮＡ^Ｐｙｌに認識される（すなわち結合する）コドンであって、真核細胞の内因性ｔＲＮＡには認識されないコドンを意味する。またこの用語は、例えばＤＮＡプラスミド等、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ではないポリヌクレオチドのポリペプチドをコードする配列中の対応するコドンにも使用される。好ましくは、セレクターコドンは、天然の真核細胞において少量のコドンである。ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンは、ｍＲＮＡ中のセレクターコドンに結合し、そうしてＵＡＡを前記ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの成長鎖に部位特異的に組み込む。既知の６４個の遺伝的コドン（トリプレット）は、２０個のアミノ酸及び３個の終止コドンをコードする。翻訳の終結には終止コドン１個のみが必要なので、他の２個は原則として非タンパク質原性アミノ酸をコードするために使用できる。例えば、アンバーコドン、ＵＡＧは、非天然アミノ酸の取り込みを指示するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系において、セレクターコドンとしてうまく使用されいる。本発明の方法で利用されるセレクターコドンは、使用される翻訳系のタンパク質生合成機構の遺伝的コドンのフレームワークを拡張する。具体的には、セレクターコドンには、これらには限定されないが、終止コドン（例えばアンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）及びオパール（ＵＧＡ）コドン）等のナンセンスコドン；３個を超える塩基から成るコドン（例えば、４塩基コドン）；並びに天然又は非天然の塩基対に由来するコドンが含まれる。所定の系について、セレクターコドンは天然の３塩基コドン（すなわち天然トリプレット）のうちの１つを含むこともできる。このとき内因性の翻訳系（例えば、該天然トリプレットを認識するｔＲＮＡを欠いている系又は該天然のトリプレットがレアコドンである系）は、前記天然トリプレットを使用しない（又は、ほとんど使用しない）。

所定の翻訳系（例えば、真核細胞）において、終止コドン、４塩基コドン又はレアコドン等を介して読めるように、ｍＲＮＡの読みを変更させる組換えｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡと呼ばれる。セレクターコドンとして働く終止コドン（例えばアンバーコドン）の抑制効率は、（アミノアシル化）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（サプレッサーｔＲＮＡとして作用する）と、終止コドンに結合してリボソームから成長するポリペプチド鎖の放出を開始する放出因子（例えばＲＦ１）との間の競合に依存する。したがって、終止コドンのそのような抑制効率は、放出因子－（例えば、ＲＦ１－）欠損株を用いて増加させることができる。

標的ポリペプチド（本明細書では、目的のポリペプチド又はＰＯＩとも言う）をコードするポリヌクレオチド配列は、１つ以上、例えば２つ以上、３つ以上等のコドン（例えばセレクターコドン）を含むことができる。それらは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列を生成するために、従来の部位特異的変異誘発を使用して、前記コドンをポリヌクレオチド配列の目的の部位に導入することができる。

１以上のＵＡＡ残基を含むＰＯＩは、真核細胞を用いて本発明に従って作製することができる。該真核細胞は、作製されるＰＯＩのＵＡＡ残基に対応する少なくとも１つの非天然アミノ酸又はその塩を含む（例えば、供給される）。該真核細胞はさらに以下を含む：
（ｉ）本発明のＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ＰｙｌＲＳは、好ましくは選択的に、ｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＡＡ又はその塩でアシル化することができる）；及び、
（ｉｉ）ＰＯＡをコードするポリヌクレオチド（ＵＡＡ残基に占められるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補体であるコドン、例えばセレクターコドンにコードされている）。
該真核細胞は、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（ｉｉ）の翻訳をできるように培養され、それによりＰＯＩを産生する。

本発明の方法に従ってＰＯＩ（標的ポリペプチド）を作製するために、工程（ｂ）の翻訳は、真核細胞を好適な条件下で、好ましくはＵＡＡ又はその塩の存在下で（例えば、ＵＡＡ又はその塩を含有する培地中で）、細胞のリボソームにおける翻訳を可能とするのに適した時間の間、培養することにより達成できる。ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド（また場合により、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）に応じて、例えばアラビノース、イソプロピル β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）又はテトラサイクリン等の転写を誘導する化合物を添加することによって発現を誘導することが必要となりうる。標的ポリペプチドをコードする（そして、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である１つ以上のコドンを含む）ｍＲＮＡは、リボソームと結合する。次いで、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡが認識（結合）するコドンがコードする位置に、アミノ酸及びＵＡＡが段階的に結合することによりポリペプチドが形成される。この結果、ＵＡＡは、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンがコードする位置で、標的ポリペプチドに組み込まれる。

真核細胞は、細胞によるＰｙｌＲＳの発現を可能にする本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。同様に、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、細胞に含まれるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列に基づいて、真核細胞によって産生することができる。ＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド配列及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードするポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド又は別々のポリヌクレオチドのいずれかに位置することができる。

したがって、一実施形態において、本発明は、１つ以上のＵＡＡ残基を含むＰＯＩの作製方法を提供し、該方法は下記工程を含む：
（ａ）以下をコードするポリヌクレオチド配列を含む真核細胞を提供する工程：
－本発明の少なくとも１つのＰｙｌＲＳ；
－ＰｙｌＲＳによりアシル化できる少なくとも１つのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；及び、
－少なくとも１つのＰＯＩ（ＵＡＡ残基に占められるＰＯＩの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンの逆相補体であるコドンによりコードされている）；並びに、
（ｂ）ＵＡＡ又はその塩の存在下で、真核細胞によるポリヌクレオチド配列の翻訳を可能にし、それによりＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及びＰＯＩを産生する工程。

本明細書に記載の１つ以上の非天然アミノ酸残基を含むＰＯＩを作製するために使用される真核細胞は、ＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及びＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列を真核（宿主）細胞に導入することによって産生できる。前記ポリヌクレオチド配列は、同じポリヌクレオチド上又は別々のポリヌクレオチド上に位置することができ、（例えば、ウイルス媒介遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等を使用するなど）当技術分野において公知の方法によって細胞に導入することができる。

また本発明は、本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドは、本発明のＰｙｌＲＳに加えて、ＰｙｌＲＳによってアシル化できるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードしてもよい。

さらに本発明は、本発明のＰｙｌＲＳをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、該ＰｙｌＲＳによってアシル化できるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドとの組み合わせを提供する。

本発明のポリヌクレオチド、並びに、本発明の状況で使用されるｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする及び／又はＰＯＩをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞をトランスフェクトし、コードされたＰｙｌＲＳ、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ及びＰＯＩの発現をそれぞれ前記細胞中で可能にするのに適した発現ベクターであることが好ましい。

また本発明は、本発明のＰｙｌＲＳを発現できる真核細胞を提供する。特に、本発明は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせを含む真核細胞を提供する。ここで、前記ポリヌクレオチドは、本発明のＰｙｌＲＳ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードし、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ＰｙｌＲＳにより（好ましくは選択的に）アシル化され得るｔＲＮＡである。適切には、本発明の真核細胞は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌと本発明のＰｙｌＲＳの両方を発現することができる。ここで、ＰｙｌＲＳは、アミノ酸（例えばＵＡＡ）を用いて（好ましくは選択的に）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをアシル化することができる。

本発明の真核細胞は、これらには限定されないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞及び植物細胞から選択することができる。本発明の真核細胞は、個々の細胞として存在してもよく、又は組織の一部であってもよい（例えば、（培養された）組織、器官又は生体全体の中の細胞）。

本発明のＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌは直交性であることが好ましい。

本明細書で使用される「直交」という用語は、目的の翻訳系（例えば、本明細書に記載のＰＯＩの発現に使用される真核細胞）によって低い効率で使用される分子（例えば、直交ｔＲＮＡ及び／又は直交ＲＳ）を意味する。「直交」とは、不能又は効率の低下を意味する。例えば、目的の翻訳系の内因性ＲＳ又は内因性ｔＲＮＡとそれぞれ作用する直交ｔＲＮＡ又は直交ＲＳの効率が、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は例えば１％未満である。

したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の真核細胞の任意の内在性ＲＳは、内在性ＲＳによる内在性ｔＲＮＡのアシル化と比較した場合、低い効率又はゼロの効率で（直交）ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアシル化を触媒する。例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率である。あるいは又はさらに、本発明の（直交）ＰｙｌＲＳは、細胞の内因性ＲＳによるｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアシル化と比較して、本発明の真核細胞の任意の内因性ｔＲＮＡを低い効率又はゼロの効率でアシル化する。例えば、２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率である。

別段の指示がない限り、本明細書で使用される「内因性ｔＲＮＡ」及び「内因性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素」（「内因性ＲＳ」）という用語は、それぞれ本発明の状況で使用される本発明のＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌを導入する前に最終的に翻訳系として使用される細胞に存在するｔＲＮＡ及びＲＳをそれぞれ意味する。

用語「翻訳系」は、一般に、成長するポリペプチド鎖（タンパク質）中に天然アミノ酸を取り込むために必要な一組の構成要素を意味する。翻訳系の構成要素としては、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）、ｍＲＮＡ等を含むことができる。翻訳系は、前記構成要素、細胞抽出物及び生細胞（例えば、生きている真核細胞）の人工混合物を含む。

本発明に従ってＰＯＩを作製するために使用するＰｙｌＲＳとｔＲＮＡ^Ｐｙｌの対は、好ましくは、ＰＯＩを作製するために使用する真核細胞において、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが本発明のＰｙｌＲＳによってＵＡＡ又はその塩（ＵＡＡ）で選択的にアシル化されるという点で直交性である。適切には、前記真核細胞において、直交対は、前記細胞がＵＡＡアシル化ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを使用してＵＡＡ残基をＰＯＩの成長中のポリペプチド鎖に組み込むように機能する。組込みは部位特異的方法で起こり、例えば、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、ＰＯＩをコードするｍＲＮＡ中のコドン（例えば、アンバー終止コドン等のセレクターコドン）を認識する。

本明細書で使用される場合、用語「選択的にアシル化される」は、真核細胞の内因性ｔＲＮＡ又はアミノ酸と比較して、ＰｙｌＲＳがｔＲＮＡ^ＰｙｌをＵＡＡでアシル化する効率が、例えば、約５０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、又は約９９％以上の効率を意味する。ＵＡＡはその後、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体である、特定のコドン（例えば、セレクターコドン）について、高い正確性（例えば約７５％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、又は約９９％以上の効率）で成長中のポリペプチド鎖に組み込まれまる。

本発明によるＰＯＩの作製に適したｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対は、変異型ｔＲＮＡ及びＰｙｌＲＳのライブラリから、例えばライブラリスクリーニングの結果に基づき選択することができる。そのような選択は、例えばＷＯ０２／０８５９２３及びＷＯ０２／０６０７５に記載のｔＲＮＡ／ＲＳ対を進化させる既知の方法と同様に実施できる。本発明のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対を生成するために、野生型又は（依然として）核局在化シグナルを含み、ＮＥＳを欠く変異型の古細菌ＰｙｌＲＳから開始し、適切なｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ対を同定する前又は同定した後に、核局在化シグナルを除去し、及び／又は、ＮＥＳを導入することができる。

翻訳後、本発明に従って作製された標的ポリペプチドは、当技術分野において一般的に知られている手順に従って、部分的に又は実質的に均一になるまで、任意に回収及び精製することができる。標的ポリペプチドが培地に分泌されない限り、回収は通常、細胞破壊を必要とする。細胞破壊の方法は当技術分野において周知であり、例えば超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）処理による物理的破壊、（例えば、フレンチプレスを用いた）液体剪断破壊、機械的方法（例えばブレンダーもしくは粉砕機を利用するもの）又は、凍結融解サイクル、並びに、脂質－脂質、タンパク質－タンパク質及び／又はタンパク質－脂質の相互作用を破壊する薬剤（洗剤等）を用いた化学的溶解、並びに、物理的破壊技術と化学的溶解の組み合わせを挙げることができる。細胞溶解物又は培地からポリペプチドを精製するための標準的な手順もまた当技術分野で周知である。例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、正しく折り畳まれた成熟タンパク質を作製する際に用いることができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法は、高純度が望まれる最終精製工程において使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬として、すなわちポリペプチドの親和性に基づく精製に使用することができる。様々な精製／タンパク質折り畳み法が当技術分野において周知である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；及び本明細書中に引用する参考文献に記載のものが挙げられる。

すでに述べたように、当業者は、合成、発現及び／又は精製の後、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有する場合があることを認識するであろう。例えば、原核細胞系により産生されるポリペプチドは、しばしばカオトロピック剤への曝露により最適化され、適切な折り畳みを達成する。例えばＥ．ｃｏｌｉ由来の溶解物からの精製中に、発現したポリペプチドは、必要に応じて変性され、次いで復元される。これは、例えばグアニジンＨＣｌ等のカオトロピック剤の中にタンパク質を可溶化することにより達成される。一般に、発現したポリペプチドを変性及び破壊し、次いでポリペプチドを好ましい立体構造にリフォールディングすることが時には望ましい。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを目的の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び復元する方法は当業者に周知である。ポリペプチドは、例えば酸化型グルタチオン及びＬ－アルギニンを含有するレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。

本明細書で使用される用語「非天然アミノ酸」（「ＵＡＡ」と略される）は、２０個の標準アミノ酸の１つ又はセレノシステイン又はピロリシンではないアミノ酸を意味する。またこの用語は、アミノ酸類似体を意味する。例えば、アミノ酸とは異なり、α－アミノ基がヒドロキシル基及び／又はカルボン酸官能基で置換され、エステルを形成する化合物である。ポリペプチドに翻訳的に組み込まれた場合、前記アミノ酸類似体は、２０個の標準アミノ酸又はセレノシステイン又はピロリジンに対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を生じる。翻訳系（真核細胞等）において、アミノ酸類似体であるＵＡＡ（カルボン酸官能基が式－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒのエステルを形成している）が、ポリペプチドの作製に使用される場合、Ｒは原位置で、例えば酵素的に、ＰＯＩに組み込まれる前の翻訳系において除去されると考えられる。したがって、Ｒは、ＵＡＡ又はその塩を本発明のＰｙｌＲＳによって認識及び処理される形態に変換する翻訳システムの能力と両立するように適切に選択される。

本発明の方法及びキットに有用なＵＡＡは、先行技術に記載されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８３：３７９－４０８，２０１０；Ｌｅｍｋｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １５：１６９１－１６９４，２０１４を参照のこと）。

ＵＡＡは、他の分子（本明細書では「結合相手分子」という）の適切な基（本明細書では「ドッキング基」という）との反応を促進する基（本明細書では「標識基」という）を有することができ、それにより結合相手分子はＵＡＡに共有結合する。標識基を有するＵＡＡが標的ポリペプチドに翻訳的に組み込まれた場合、標識基は標的ポリペプチドの一部となる。したがって、本発明の方法に従って作製された標的ポリペプチドは、１つ以上の結合相手分子と反応させることができ、それにより、結合相手分子は標的ポリペプチドの非天然アミノ酸残基（の標識基）に共有結合する。この結合反応は、標的ポリペプチドを発現する細胞又は組織内の標的ポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕカップリング、又は単離されたもしくは部分的に単離された標的ポリペプチドの部位特異的結合に使用することができる。

標識基と（結合相手分子の）ドッキング基の組み合わせについて、特に有用な選択肢は、金属フリークリック反応により反応できるものである。このようなクリック反応としては、歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ；例えば、Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：７０１３参照）、並びに、歪のあるシクロアルキニル基、又は、アミノ基で置換された三重結合が結合していない環原子を１つ以上有する歪のあるシクロアルキニル類似体基と、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン及びジアゾカルボニル試薬との環状付加反応（例えば、Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１０，１３３：９４９；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４，１２６：１５０４６参照）、例えば、歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）を挙げることができる。このようなクリック反応は、標的ポリペプチドのＵＡＡ標識基とカップリング相手分子の適切な基との超高速二重直交型共有結合部位特異的カップリングを可能にする。

上記のクリック反応を介して反応できるドッキング基及び標識基の対は当技術分野において公知である。ドッキング基を含む適切なＵＡＡの例としては、これらには限定されないが、例えばＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のＵＡＡが挙げられる。

（結合相手分子に含まれる）ドッキング基と（ＰＯＩのＵＡＡ残基に含まれる）標識基の特定の適切な対の例としては、これらには限定されないが、以下を挙げることができる：
（ａ）アジド基、ニトリルオキシド官能基（すなわち、式で表される基、ニトロン官能基又はジアゾカルボニル基）から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｂ）任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、アジド基、ニトリルオキシド官能基から選択される基を含む（又は本質的になる）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン－アジド環状付加反応（ＳＰＡＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｃ）任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換されたテトラアルキニル基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）；
（ｄ）任意に置換されたテトラジニル基を含む（または本質的にそれから成る）ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む（又は本質的にそれから成る）標識基との組み合わせ（これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）において共有結合的に反応することができる）。

任意に置換された歪のあるアルキニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたｔｒａｎｓ－シクロオクテニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換された歪のあるアルケニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたシクロオクチニル基（例えば、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のもの）が挙げられる。任意に置換されたテトラジニル基としては、これらには限定されないが、ＷＯ２０１２／１０４４２２及びＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のものが挙げられる。

アジド基は式－Ｎ_３の基である。

ニトロン官能基は、式－Ｃ（Ｒ^ｘ）＝Ｎ^＋（Ｒ^ｙ）－Ｏ^－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ_１－Ｃ_６－アルキルから独立して選択される残基である。

ジアゾカルボニル基は、式－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ＝Ｎ_２の基である。

ニトリルオキシド官能基は、式－Ｃ≡Ｎ^＋－Ｏ^－又は好ましくは、式－Ｃ＝Ｎ^＋（Ｒ^ｘ）－Ｏ^－の基である。式中、Ｒ^ｘは有機残基、例えば本明細書に記載のＣ_１－Ｃ_６－アルキルから独立して選択される残基である。

シクロオクチニルは、環構造中に８個の炭素原子及び１個の三重結合を有する不飽和脂環式基である。

「ｔｒａｎｓ－シクロオクテニル」は、環構造中に８個の炭素原子及びトランス配置の１個の二重結合を有する不飽和脂環式基である。

「テトラジニル」は、４個の窒素環原子及び２個の炭素環原子を有する６員単環式芳香族基である。

特に指示のない限り、用語「置換された」は、基が１、２又は３個、特に１又は２個の置換基で置換されていることを意味する。特定の実施形態において、これらの置換基は、水素、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，（Ｒ^ａＯ）_２Ｐ（Ｏ）Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，（Ｒ^ｂＯ）_２Ｐ（Ｏ）－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル，ＣＦ_３，ＣＮ，ヒドロキシル，Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシ，－Ｏ－ＣＦ_３，Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシ，Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシ，Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシ又はＣ_１－Ｃ_４－アルキルチオ，Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノ，ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノ，Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノ，Ｎ－Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｎ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル－アミノ及びジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノ（式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは独立して水素もしくはＣ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルである）から独立して選択することができる。

ハロゲンという用語は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルは、１～４個、特に１～３個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。例としては、メチル並びにエチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、２－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチル等のＣ_２－Ｃ_４－アルキルが挙げられる。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルは、２、３、４又は５個の炭素原子を有する単一不飽和炭化水素基である。例としては、ビニル，アリル（２－プロペン－１－イル），１－プロペン－１－イル，２－プロペン－２－イル，メタリル（２－メチルプロパ－２－エン－１－イル），１－メチルプロパ－２－エン－１－イル，２－ブテン－１－イル，３－ブテン－１－イル，２－ペンテン－１－イル，３－ペンテン－１－イル，４－ペンテン－１－イル，１－メチルブタ－２－エン－１－イル及び２－エチルプロパ－２－エン－１－イルが挙げられる。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルコキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキル基である。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケノキシは、式Ｒ－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシは、式Ｒ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノカルボニルオキシは、式Ｒ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルチオは、式Ｒ－Ｓ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

ジ－（Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル）アミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニルアミノは、式Ｒ－ＮＨ－の基である。式中、Ｒは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｎ－Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル－Ｎ－Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルアミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘは本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルであり、Ｒ^ｙはＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

ジ－（Ｃ_２－Ｃ_５－アルケニル）アミノは、式Ｒ^ｘ－Ｎ（Ｒ^ｙ）－の基である。式中、Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して本明細書で定義されるＣ_２－Ｃ_５－アルケニルである。

Ｃ_２－Ｃ_５－アルカノイルオキシメチルは、式Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－の基である。式中、Ｒ^ｘは本明細書で定義されるＣ_１－Ｃ_４－アルキルである。

本発明の状況で使用されるＵＡＡは、それらの塩の形で使用することができる。本明細書に記載のＵＡＡの塩は、酸又は塩基付加塩、特に生理学的に許容される酸又は塩基との付加塩を意味する。生理学的に許容される酸付加塩は、塩基型のＵＡＡを適切な有機酸又は無機酸で処理することによって形成できる。酸性プロトンを含有するＵＡＡは、適切な有機及び無機塩基で処理することによってそれらの無毒性の金属又はアミン付加塩の形態に変換できる。また本発明の文脈で記載されているＵＡＡ及びその塩は、それらの水和物及び溶媒付加形態、例えば、水和物、アルコラート等をも含む。

生理学的に許容される酸又は塩基は、特に、ＵＡＡ残基を有するＰＯＩの作製に使用される翻訳系により許容されるものである。例えば、生きた真核細胞に対して実質的に非毒性である。

本発明の状況において有用なＵＡＡ及びその塩は、当技術分野において周知であり、例えば本明細書に引用した様々な刊行物に記載の方法と同様に作製することができる。

カップリング相手分子の性質は使用目的に依存する。例えば、標的ポリペプチドは、イメージング法に適した分子と結合していてもよく、又は生物活性分子と結合して官能化されていてもよい。例えば、ドッキング基に加えて、カップリング相手分子は、これらには限定されないが、下記から選択される基を有することができる：色素（例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ又はシアニン色素等の蛍光色素、発光色素又は燐光色素）；試薬と接触して蛍光を発することができる分子；発色団（例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビン等）；放射性標識（例えば、水素、フッ素、炭素、リン、硫黄又はヨウ素の放射性形態、例えば、トリチウム、^１８Ｆ，^１１Ｃ，^１４Ｃ，^３２Ｐ，^３３Ｐ，^３３Ｓ，^３５Ｓ，^１１Ｉｎ，^１２５Ｉ，^１２３Ｉ，^１３１Ｉ，^２１２Ｂ，^９０Ｙ又は^１８６Ｒｈ等）；ＭＲＩ感受性スピン標識；親和性タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン又は補助因子）；ポリエチレングリコール基（例えば、分岐状ＰＥＧ、線状ＰＥＧ、様々な分子量のＰＥＧ等）；光架橋剤（ｐ－アジドヨードアセトアニリド等）；ＮＭＲプローブ；Ｘ線プローブ；ｐＨプローブ；ＩＲプローブ；樹脂；固体支持体及び生物活性化合物（例えば、合成薬）。適切な生物活性化合物としては、これらには限定されないが、細胞傷害性化合物（例えば、癌化学療法化合物）、抗ウイルス化合物、生物学的応答調節剤（例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン等）、微小管作用薬、ホルモン調節剤及びステロイド化合物等が挙げられる。有用なカップリング相手分子の具体例としては、これらには限定されないが、受容体／リガンド対の構成要素、抗体／抗原対の構成要素、レクチン／炭水化物対の構成要素、酵素／基質対の構成要素、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、及び、ジゴキシン／抗ジゴキシンが挙げられる。

特に、本明細書に記載のクリック反応により、結合相手分子（のドッキング基）にｉｎ ｓｉｔｕで共有結合する特定のＵＡＡ残基（の標識基）の能力は、標的ポリペプチドを発現する真核細胞内又は組織内でそのＵＡＡ残基を有する標的ポリペプチドを検出するために、そして標的ポリペプチドの分布と結末を研究するために使用できる。具体的には、真核細胞における発現によって標的ポリペプチドを作製するための本発明の方法は、細胞又はその細胞の組織内の標的ポリペプチドを検出するために超解像顕微鏡法（ＳＲＭ）と組み合わせることができる。いくつかのＳＲＭ法が当技術分野において公知であり、本発明の真核細胞によって発現される標的ポリペプチドを検出するためにクリックケミストリーを利用するように適合させることができる。そのＳＲＭ法の具体例としては、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのためのＤＮＡ点集積（ＤＮＡ ｐｏｉｎｔ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）；例えば、Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３１３－３１８，２０１４に記載）、ｄＳＴＯＲＭ（直接確率的光学再構築顕微鏡法）及びＳＴＥＤ（誘導放出抑制）顕微鏡法が挙げられる。

また本発明は、本発明のＰｙｌＲＳをコードするポリヌクレオチド又はそのＰｙｌＲＳを発現することができる真核細胞を含むキットを提供する。本発明のキットは、ＰｙｌＲＳによって触媒される反応においてｔＲＮＡをアシル化するために使用できる少なくとも１つの非天然アミノ酸又はその塩をさらに含むことができる。また本発明のキットは、ＰｙｌＲＳによってアシル化できるｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）を含むことができる。本発明のキットは、本明細書中に記載されるように、ＵＡＡ残基を含有する標的ポリペプチド又はその結合体の作製方法に使用することができる。

方法
（Ａ）ＵＡＡの合成
化合物２（ＴＣＯ^＊）は、ＷＯ２０１５／１０７０６４に記載のように作製した。

（Ｂ）細胞培養、トランスフェクション及びＵＡＡの補給
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）及びＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）を、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，１０，０００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン，１０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン，０．９％ ＮａＣｌ），２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ），１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、４１９６５－０３９）中で維持した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２雰囲気下で培養し、２～３日ごとに１５～２０継代まで継代した。

全ての場合において、細胞をトランスフェクションの時点で７０～８０％の培養密度となる密度でトランスフェクションの１５～２０時間前に播種した。ＨＥＫ２９３Ｔ実験用のチャンバーを、Ｎｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １０（５）：７８０－７９１，２０１５）に記載のように、ポリ－Ｌ－リシン（Ｓｉｇｍａ）で被覆した。免疫標識及びＦＩＳＨをガラス底付き２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）上で実施した。

全てのトランスフェクションを、ＪｅｔＰｒｉｍｅ試薬（ＰｅｑＬａｂ）を製造元の推奨に従って用いて行った。

使用する全てのＵＡＡのストック及びワーキングソリューションは、Ｎｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １０（５）：７８０－７９１，２０１５）に記載のように作製した。特に明記しない限り、細胞培養培地中の最終ＵＡＡ濃度は２５０μＭであった。

（Ｃ）抗ＰｙｌＲＳ抗体の作製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ細胞をプラスミドｐＴＸＢ３－６Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦで形質転換し、Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＡＦとＴＥＶのコードされたＨｉｓタグ融合体（Ｈｉｓ_６－ＴＥＶ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ）を、０．０２％アラビノース及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導後、１８℃で一晩ＴＢ培地中で組換え発現させた。細胞を遠心分離により収集し、４×ＰＢＳ（ｐＨ８、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）に再懸濁し、次いで、高圧ホモジナイザーを用いて溶解した。破砕物を遠心分離により除去し、４℃で１時間Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズと共にインキュベートしてＨｉｓ_６－ＴＥＶ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦを透明な上清から精製し、濃度を上げながらイミダゾールを用いて洗浄し、次いで、４×ＰＢＳ中の４００ｍＭ イミダゾールで溶出した。タンパク質含有溶出画分をタンパク質フィルター装置（Ｓｐｉｎ－Ｘ ＵＦ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，３０ｋＤａ ｃｕｔｏｆｆ）を用いて濃縮した。分取ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてタンパク質をさらに精製した。タンパク質含有画分を濃縮し、２頭のラット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）の免疫に使用した。得られた抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体は、本明細書に記載の実施例において、ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びその変異型の検出に使用した。

（Ｄ）フローサイトメトリー
特に明記しない限り、細胞をトランスフェクションの２日後に回収し、１×ＰＢＳに再懸濁し、次いで、７０μｍの細胞濾過器に通した。ＰＯＩをコードするプラスミド（ＵＡＡに占められるアミノ酸位置をコードするＴＡＧコドンを含む）、アンチコドンＣＵＡを有するｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（以下、簡単にｔＲＮＡ^Ｐｙｌという）をコードするプラスミド、及び、ＰｙｌＲＳ又はその変異型をコードするプラスミドを、総ＤＮＡを１．２μｇとして、それぞれ１：１：１の比で用いて、フローサイトメトリー用の同時トランスフェクションを行った。細胞培養培地を、トランスフェクションの４～６時間後にＵＡＡを含有する新鮮な培地と交換し、回収時まで放置した。データの取得及び分析は、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ＳＯＲＰ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）と、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて行った。細胞には、最初に細胞型（ＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ａ パラメータを使用）によって、次に単一細胞（ＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ｗ）によって、ゲートをかけた。ＧＦＰ蛍光は、４８８－５３０／３０チャンネルで、ｉＲＦＰ蛍光は６４０－７３０／４５チャンネルで取得した。

（Ｅ）ＰｙｌＲＳ免疫染色及びイメージング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
トランスフェクションの１日後、細胞を１×ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定し、次いで１×ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ中で室温で１５分間透過処理した。透過処理した細胞試料をブロッキング溶液（１×ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）中で９０分間インキュベート（室温で９０分間）し、次いで一次抗体（本明細書記載のように作製した抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体、ブロッキング溶液中に１μｇ／ｍｌ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞試料を１×ＰＢＳで洗浄し、二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合、ブロッキング溶液中２μｇ／ｍｌ）と共に室温で６０分間インキュベートした。ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１×ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）を用いて室温で１０分間染色した。

トランスフェクションの１日後に、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験を行った。ハイブリダイゼーションのプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２２：４１５－４３６，２０１４）を２４ウェルプレートに適合させた。ハイブリダイゼーションプローブ：５’－ＣＴＡＡＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＧＡＴＣ－３’（５’末端をジゴキシゲニンで標識した；配列番号１８）を０．１６μＭで使用した。ＳＳＣで洗浄した後、細胞をブロッキング緩衝液（０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１×ブロッキング試薬（Ｓｉｇｍａ ０００００００１１０９６１７６００１））中で室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をブロッキング緩衝液中１：２００希釈の抗ジゴキシゲニン－フルオレセイン抗体結合（Ｓｉｇｍａ ０００００００１１２０７７４１９１０）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｔｗｅｅｎ緩衝液（０．１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で５分間の洗浄を３回行った。最後に、ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１×ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）を用いて室温で１０分間染色した。

励起のために４０５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２用）及び５９４ｎｍ（Ａｌｅｘａ ５９４用）レーザーラインを用いてＬｅｉｃａ ＳＰ８ ＳＴＥＤ ３Ｘ顕微鏡で共焦点画像を取得した。ＨｙＤ検出器を用いて、放出光をそれぞれ４２０～５００ｎｍ及び６０５～６８０ｎｍで捕集した。

（Ｆ）ビメンチン及びＮｕｐ１５３：構築物及びトランスフェクション
ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発により、目的の構築物のプラスミドＤＮＡ配列に特異的変異を導入し、それによりｃＤＮＡ中にインフレームのアンバーコドンを生成した。ビメンチンについては、ｐＶｉｍｅｎｔｉｎ－ＰＳｍＯｒａｎｇｅプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃３１９２２；Ｓｕｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７７１－７７７，２０１１）をビメンチンのＮ１１６位で変異させて、それによりｐＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ＰＳｍＯｒａｎｇｅ構築物を作製した。Ｎｕｐ１５３については、コドン最適化したＮｕｐ１５３ ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰバックボーンに挿入することによりｐＧＦＰ－Ｎｕｐ１５３プラスミドを構築した。続いて、ＧＦＰ遺伝子のＮ１４９位を変異させて、それによりｐＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３構築物を生成した。哺乳動物細胞におけるアンバー抑制システムの発現のために、細胞をｐｃＤＮＡ３．１ ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦプラスミドでトランスフェクトした。

Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴの実験のために、ｐｃＤＮＡ３．１ ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦと、ｐＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ＰＳｍＯｒａｎｇｅ又はｐＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３のいずれかを１：１の比率で用いて、本明細書に記載の方法（Ｂ）を使用して細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの直後にＵＡＡ２（ＴＣＯ^＊）を添加した。トランスフェクションの８～１０時間後、細胞培養培地を交換し、細胞を新鮮なＵＡＡ溶液と共に一晩培養した。トランスフェクションの約３０～３６時間後、細胞培養培地を新鮮な培地と交換し、細胞をＵＡＡなしで一晩培養した。

（Ｇ）Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ標識
トランスフェクションの約４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１×ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定した。次いで、１×ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ中で室温で１５分間透過処理した。標識化の前に、透過処理した細胞試料をＰＢＳで再度洗浄した。Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ標識のために、細胞を１ｘＰＢＳ中の１５μＭの結合ストランドのオリゴヌクレオチド（５’－ｔｔａｔａｃａｔｃｔａ－３’、５’末端を１，２，４，５－テトラジンで官能化；配列番号１９）中で、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、１×ＰＢＳで洗浄した。イメージングの前と、結合ストランドを用いた細胞のインキュベーションの当日又は最長３日後のいずれかの日に、イメージャストランド（５’－ｃｔａｇａｔｇｔａｔ－３’、３’末端をＡｔｔｏ６５５で官能化、配列番号２０）を細胞に最終濃度８００ｐＭ（１×ＰＢＳ中、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）で添加した（Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３１３－３１８，２０１４に記載の通り）。

（Ｈ）Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴイメージングと画像処理
Ｌｅｉｃａ ＨＣＸ ＰＬＡＰＯ １６０ｘ／ＮＡ １．４３ ｏｉｌ ＣＯＲＲ ＴＩＲＦ ＰＩＦＯＣ対物レンズ並びにＧＦＰ，Ｃｙ３及びＣｙ５フィルターセットを装備したＬｅｉｃａ ＧＳＤ顕微鏡を用いてＣｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法を行った。全ての画像はＴＩＲＦモードで取得した。ビメンチンのイメージングについては、Ｃｙ３チャンネル（５３２ｎｍ励起）を使用し、ｖｉｍｅｎｔｉｎ－ｍＯｒａｎｇｅ融合体をベースにトランスフェクト細胞を同定した。Ｃ末端のｍＯｒａｎｇｅの位置のために、ｖｉｍｅｎｔｉｎ－ｍＯｒａｎｇｅの発現時、ＵＡＡを成功裏に取り込んだ細胞のみが蛍光シグナルに寄与した。Ｎｕｐ１５３については、ＧＦＰ融合体を用いてトランスフェクトされた細胞を同定した。Ａｔｔｏ６５５を６４２ｎｍレーザーで励起し、ＴＩＲＦモードで１００ｍｓの露出で画像を取得した。各画像について、３０，０００～１００，０００フレームを取得した。

ＩｇｏｒＰｒｏ（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＵＳＡ）用のＬｏｃａｌｉｚｅｒ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｅｄｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔ １７：１２６００８，２０１２）を用いて超解像Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ画像を再構築した。最初に、最大尤度比に基づく閾値を適用し、続いてスポットの局在化について対称な２Ｄガウス関数を用いて適合させた。結合ストランドとイメージャストランドの散発的な長期持続性の関連性が観察され、連続的なフレームにおいて反復的な局在が生じた。これを補正するために、同一のエミッタ（１標準偏差内におさまるスポット）を統合し、単一の強度加重局在（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ－ｗｅｉｇｈｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）とした。最後に、検出した全ての事象をビニングし、得られた画像をＮｕｐ１５３についてのフーリエ環相関２σ基準及びビメンチンについての０．１４３基準で決定される解像度に従ったガウス幅で畳み込むことによって、超解像画像を再構築した（Ｂａｎｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８３：３６３－３６７，２０１３）。

（Ｉ）昆虫細胞のバキュロウイルスベースのトランスフェクション
標準的なプロトコルに従って、Ｓｆ２１系統の昆虫細胞を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞用のタンパク質不含無血清標準培地（Ｓｆ－９００（商標）ＩＩＩ ＳＦＭ）中、２７℃で１８０ｒｐｍで振盪しながら培養した。毎日、Ｓｆ２１細胞を０．６ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度に、又は、３日ごとに０．３ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度に分割した。

ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ，ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}及びＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかをコードする発現カセットを有するバキュロウイルスのシャトルベクター（Ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡを、標準的なクローニング及び組換え手順を用いて作製した。

トランスフェクション用に、０．３ｘ１０^６ Ｓｆ２１細胞／ｍｌの３ｍｌ／ウェルを６ウェル細胞培養マルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、次いで、製造元の使用説明書に従って非リポソームトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ（商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後にＶ_０－ウイルスを回収し、Ｖ_１－世代を開始した。すなわち、２５ｍｌのＳｆ２１細胞（０．６ｘ１０^６細胞／ｍｌ）を３ｍｌのＶ_０－ウイルスを用いてトランスフェクトした。細胞増殖が停止した後、さらに培養物を１８０ｒｐｍで振盪しながら、２７℃で４８～６０時間保持した。トランスフェクトされた細胞を遠心分離（５００ｒｐｍ、１０分）によって回収し、上清（すなわちＶ_１－ウイルス）を４℃で保存した。

（Ｊ）トランスフェクトされた昆虫細胞を用いた発現実験
５～２５ｍｌのＳｆ２１細胞（０．６ｘ１０^６細胞／ｍｌ）に、方法（Ｉ）により作製したＶ_１－ウイルスを１００：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）（細胞：ウイルス）の比で用いて形質導入した。１日後、様々な量のＵＡＡ１（最終濃度０～１ｍＭ）を培養物に添加した。３日間の培養後、細胞を遠心分離（５００ｒｐｍ、１０分）により回収し、４℃に冷却し、２ｍｌの滅菌した１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ、７０μｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過し、分析まで氷上に保持した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ＳＯＲＰ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）及びＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｌｏｗＪｏ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ）を使用して、各試料の５００，０００細胞のデータを取得し、分析した。細胞には、最初に細胞型（ＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ａ パラメータを使用）によって、次に単一細胞（ＦＳＣ－Ａ ｘ ＳＳＣ－Ｗ）によって、ゲートをかけた。ＧＦＰ蛍光は、４８８－５３０／３０チャンネルで、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は５６１－６１０／２０チャンネルで取得した。

実施例１：Ｍ．ｍａｚｅｉ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉ ＰｙｌＲＳにおける推定ＮＬＳの同定
Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉ ＰｙｌＲＳのアミノ酸配列（下記に示す）のコンピューター分析は、推定核局在化配列（ＮＬＳ、下記に示すＰｙｌＲＳ配列の下線部分）を予測した。

ＮＬＳモチーフは、「ｃＮＬＳ Ｍａｐｐｅｒ」（Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１０１７１－１０１７６，２００９）を使用して予測された。

実施例２：Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＡＦの細胞内局在
実施例２～５では、Ｍ．ｍａｚｅｉ ＰｙｌＲＳ^ＡＦを使用した（ここでは、簡単に「ＰｙｌＲＳ^ＡＦ」という）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ－７細胞を、真核生物のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦの発現を促進するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１ ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ）を用いてトランスフェクトし、本明細書に記載の方法（Ｂ）及び（Ｅ）を用いて、抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体で免疫染色するか、又は、ｔＲＮＡ^ＰｙｌをＦＩＳＨにより検出した。

図１ａ、２ａ、３ａ及び４ａに示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ－７細胞の両方について、強度な核と推定核小体の免疫染色、及び、ＦＩＳＨシグナルが検出されたが、一方、細胞質にはほとんどシグナルがなかった。これは、ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、翻訳が行われる細胞質内よりも、むしろ核内に主に局在したことを示す。

実施例３：ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦによるアンバー抑制
強度なＮ末端ＮＥＳ（「ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ」、配列番号１２に示すアミノ酸配列）を有する点でＰｙｌＲＳ^ＡＦ（配列番号２に示すアミノ酸配列）とは異なる、ＰｙｌＲＳ^ＡＦ変異型を作製した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、本明細書に記載の方法（Ｂ）を用いて、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}及びＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかをコードするポリヌクレオチドと同時トランスフェクトした。１（ＢＯＣ）の存在下又は非存在下で、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２日後に本明細書に記載のフローサイトメトリー法（Ｄ）を用いてＧＦＰ及びｉＲＦＰ蛍光を分析した。

ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}は、ｉＲＦＰ（赤外蛍光タンパク質）とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の融合体であり、ＧＦＰの許容部位３９はアンバー（ＴＡＧ）終止コドンによりコードされている。適切にトランスフェクトされると細胞は赤くなる（ｉＲＦＰが発現する）が、ＧＦＰはアンバーコドンがＵＡＡ（本明細書ではＢＯＣ）をコードするように抑制されている場合にのみ産生されるので、ｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}はアンバー抑制レポーターとして機能する。したがって、細胞内の緑色蛍光（ＧＦＰ）と赤色蛍光（ｉＲＦＰ）の比率は、アンバー抑制効率の指標となる。

図５に示すように、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦは、ＰｙｌＲＳ^ＡＦと比較して、アンバー抑制効率の有意な増強（６８．６％）を示した。効率低下における相違は、「明るいＤＰ」（二重陽性）集団の調査により特に顕著であった。

本明細書に記載の方法（Ｂ）を用いて追加の実験を行った。該実験においては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、様々な量（１ウェルあたり１００～５００ｎｇのプラスミド）のｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかを用いて、また低高濃度（５０μＭ）又は高濃度（２５０μＭ）のＵＡＡ（ＢＯＣ）を使用し、同時トランスフェクトを行った。本明細書に記載の方法（Ｄ）を用いたこれらの細胞のフローサイトメトリー分析は、変異型ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのアンバー抑制効率が、ＰｙｌＲＳ^ＡＦと比較して有意に増強されたことを確認した（図６及び７参照）。明るいＧＦＰ蛍光細胞（すなわち、成功したｉＲＦＰ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}アンバー抑制）の数により、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦをトランスフェクトし、１の存在下で培養した細胞試料が、ＰｙｌＲＳ^ＡＦをトランスフェクトし、１の存在下で培養した対応する細胞試料と比較して１５倍まで増強されたことが認められた。

実施例４：ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦの細胞内局在
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ－７細胞を、真核生物のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦの発現を促進するプラスミドを用いてトランスフェクトし、次いで、抗ＰｙｌＲＳポリクローナル抗体で免疫染色するか、又は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを本明細書に記載の方法（Ｂ）及び（Ｅ）を用いてＦＩＳＨにより検出した。

図１ｂ、２ｂ、３ｂ及び４ｂに示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ－７細胞の両方について、明瞭な細胞質の免疫染色及びＦＩＳＨシグナルが検出されたが、一方、ＰｙｌＲＳ^ＡＦで観察される核における強い蛍光は存在しなかった（実施例２参照）。これは、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びｔＲＮＡ^Ｐｙｌの細胞質内分布を示す。

実施例５：超解像顕微鏡法におけるＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦの使用
例えば、Ｊｕｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３１３－３１８，２０１４）に記載されたＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ顕微鏡法の原理を使用するＣｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴと呼ばれる方法を用いた超解像顕微鏡法において、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の標的ポリペプチドの分布を調べるために、新規のｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦアンバー抑制対を用いた。

Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴの原理を図８ａに概説する。細胞は、ＵＡＡ残基を含む標的ポリペプチド（ＰＯＩ）を発現する。該ＵＡＡ残基は標識基（例えば、ｔｒａｎｓ－シクロオクテニル基）を含む。該細胞を、クリック反応（ＳＰＡＡＣ又はＳＰＩＥＤＡＣ等）を介してＵＡＡ残基の標識基と反応するドッキング基（例えば、１，２，４，５－テトラジン基）を有する結合ストランドのオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより結合ストランドをＰＯＩに結合させる。次に、イメージング基（例えば、Ａｔｔｏ ６５５等の色素）を担持するイメージャストランドを細胞に加える。結合ストランドのオリゴヌクレオチド内のドッキング基の位置（例えば、５’末端）及びイメージャストランド内のイメージング基の位置（例えば、３’末端）の適切な選択により、イメージャストランドをＰＯＩ結合－結合ストランドとアニーリングすると、イメージング基が標識されたＰＯＩの標識部位（ＵＵＡ残基）に直接的に近接して位置することを可能にする。

新規のＣｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ法は２つのＰＯＩを用いて試験された。

細胞骨格要素は、それらが明らかなフィラメント状パターンを生じさせ、該フィラメントが特有のタンパク質に非常に富んでいるので、ＳＲＭ技術を検証するための理想的な出発点である。故に、第１のＰＯＩ（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ｍＯｒａｎｇｅ）は、Ｎ末端に細胞骨格タンパク質ビメンチンの変異体（Ｎ１１６がアンバーコドン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}）で置換されている）と、Ｃ末端にｍＯｒａｎｇｅを含む融合タンパク質である。ｍＯｒａｎｇｅは、従来の広視野顕微鏡を用いて標識の特異性をチェックするためのリファレンスとして役立つ。

新規のＣｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ法の感度を試験するための第２のＰＯＩ（ＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３）は、核膜孔複合体のタンパク質であり、細胞骨格よりもはるかに少ない構造であった。核膜孔複合体は、約３０の様々なタンパク質から構築され、約６０ｎｍ^３のサイズを有する３２コピーのタンパク質Ｎｕｐ１５３を含むリング様構造である。したがって、Ｎｕｐ１５３上の潜在的な標識部位の密度は、細胞骨格フィラメント上の潜在的な標識部位の密度よりも実質的に低い。具体的には、第２のＰＯＩは、Ｎ末端に変異型ＧＦＰ（Ｎ１４９がアンバーコドン（ＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}）で置換されている）を含み、Ｃ末端にＮｕｐ１５３を含む融合タンパク質であった。

標的ポリペプチドの発現のための構築物を作製し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｔＲＮＡ^Ｐｙｌ／ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ｍＯｒａｎｇｅ又はＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３のいずれかをコードするポリヌクレオチドを用いて同時トランスフェクトし、次いで、トランスフェクトした細胞を本明細書に記載の方法（Ｆ）を用いてＵＡＡ２中で培養した。本明細書に記載の方法（Ｇ）及び（Ｈ）を用いて、Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ標識、イメージング及び画像処理を実施した。

図８ｃは、上記Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ法とＶｉｍｅｎｔｉｎ^{Ｎ１１６ＴＡＧ}－ｍＯｒａｎｇｅを使用して生成したＳＲＭ画像を示す。前記画像は、ｍＯｒａｎｃｅ基準チャネルの回折限界イメージングと比較して明らかに向上した解像度を有する（図８ｂ参照）。

ＰＯＩとしてＧＦＰ^{Ｎ１４９ＴＡＧ}－Ｎｕｐ１５３を使用し、Ｃｌｉｃｋ－ＰＡＩＮＴ法により、核膜孔複合体の特徴的な円形の外観を示す高コントラストの超解像画像を生成した（図８ｄ参照）。細胞は野生型Ｎｕｐ１５３も発現し、これは標識することができず、ＧＦＰ^{Ｎ１４９→２}－Ｎｕｐ１５３タンパク質との核膜孔複合体への取り込みについて競合するため、観察された全ての環構造が閉じているわけではない。

実施例６：バキュロウイルスに基づく昆虫細胞タンパク質発現におけるＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦによるアンバー抑制
Ｓｆ２１細胞をｔＲＮＡ^Ｐｙｌ、ｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}及びＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかをコードするＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いて形質導入し、様々な濃度（０、１０、５０、１００、２５０、５００又は１０００μＭ）のＵＡＡ１（ＢＯＣ）と共に培養し、本明細書に記載の方法（Ｉ）及び（Ｊ）を使用して分析した。

細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いた形質導入の成功を示した。細胞のＧＦＰ蛍光は、ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}レポーター遺伝子のアミノ酸位置３９をコードするアンバー終止コドンの、前記位置へのＵＡＡ１の組込みによる抑制の成功を示した。

フローサイトメトリー分析は、ＰｙｌＲＳ^ＡＦ及びＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦの両方について、ＵＡＡ１用量依存的にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光及びＧＦＰ蛍光（「二重陽性」）細胞が増加することを示した。ここでは、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦ発現細胞の増加はＰｙｌＲＳ^ＡＦ発現細胞より有意に顕著であった。これは、より低いＵＡＡ１濃度であっても、ＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦが、ＰｙｌＲＳ^ＡＦよりも高い効率を可能にしたことを示す。図９、１０、１１、及び表１を参照のこと。

表１：ｔＲＮＡ^Ｐｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ^{Ｙ３９ＴＡＧ}及びＰｙｌＲＳ^ＡＦ又はＮＥＳ－ＰｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかをコードするＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを用いて形質導入し、様々な濃度のＵＡＡ１と共にインキュベートしたＳｆ２１細胞における蛍光細胞亜集団の相対的な大きさ

略語
ＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
ＢＯＣ＝Ｂｏｃ－ｌ－Ｌｙｓ－ＯＨ＝Ｎ－α－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リシン（図１ａ、化合物１）
Ｃｒｍ１＝染色体領域維持１（カリオフェリンエクスポーチン１としても知られる）
ｄＳＴＯＲＭ＝直接確率的光学再構築顕微鏡法
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ＡＩ＝大腸菌株ＢＦ^ーｏｍｐＴ ｇａｌ ｄｃｍ ｌｏｎ ｈｓｄＳ_Ｂ（ｒ_Ｂ ^ーｍ_Ｂ ^ー）λ（ＤＥ３［ｌａｃＩ ｌａｃＵＶ５－Ｔ７ｐ０７ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）［ｍａｌＢ^＋］_Ｋ－１２（λ^Ｓ）ａｒａＢ：：Ｔ７ＲＮＡＰ－ｔｅｔＡ
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ＦＩＳＨ＝蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２＝２’－（４－エトキシフェニル）－５－（４－メチル－１－ピペラジニル）－２，５’－ビ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール三塩酸塩
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド
ｉＲＦＰ＝赤外蛍光タンパク質
ＮＥＳ＝核外搬出シグナル
ＮＬＳ＝核局在化シグナル
ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水
ＰＡＩＮＴ＝ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのための点集積
ＰｙｌＲＳ＝ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＰｙｌＲＳ^ＡＦ＝アミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリジルｔＲＮＡ合成酵素
ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル
ＰＯＩ＝目的のポリペプチド、標的ポリペプチド
ＲＰ－ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＴ＝室温
ＴＣＥＰ＝トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＥＶ＝タバコエッチウイルス核封入体－エンドペプチダーゼ
ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ＝野生型又は改変されたＰｙｌＲＳによってアシル化された、ＵＡＡのＰＯＩへの部位特異的組み込みのための、好ましくはセレクターコドンの逆相補体であるアンチコドンを有するｔＲＮＡ（実施例で使用されたｔＲＮＡ^Ｐｙｌでは、アンチコドンはＣＵＡである）
ＳＰＡＡＣ＝（銅フリー）歪み促進逆アルキン－アジド環状付加反応
ＳＰＩＥＤＡＣ＝（銅フリー）歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環状付加反応
ＳＲＭ＝超解像顕微鏡法
ＴＢ ＝テリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス
ＴＣＯ^＊＝Ｎ－ε－（（ｔｒａｎｓ－シクロオクタ－２－エン－１－イルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リシン（図１ａ、化合物２）
ＵＡＡ＝非天然アミノ酸

Claims (14)

1. 核外搬出シグナルを含む改変された古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素であって、
   ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素活性を維持し、核外搬出シグナルを導入することによって改変されたメタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素の配列を含む、ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
2. 核外搬出シグナルを含み、核局在化シグナルを欠く、請求項１に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
3. ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１もしくは２のＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉのピロリジルｔＲＮＡ合成酵素、配列番号３のＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉのピロリジルｔＲＮＡ合成酵素又は配列番号１～３のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するピロリジルｔＲＮＡ合成酵素を含む、請求項１又は２に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
4. 核外搬出シグナルが、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
5. 核外搬出シグナルが、配列番号６～９に示す配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド。
7. さらにｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする配列を含む請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、該ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが、該ポリヌクレオチドがコードするピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化され得るｔＲＮＡである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
8. 少なくとも１つの請求項６に記載のポリヌクレオチドと、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドの組み合わせであって、該ｔＲＮＡ^Ｐｙｌが請求項６に記載のポリヌクレオチドによってコードされるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化され得るｔＲＮＡである、ポリヌクレオチドの組み合わせ。
9. ｔＲＮＡ^Ｐｙｌのアンチコドンが、終止コドン、４塩基コドン及びレアコドンから選択されるコドンの逆相補体である、請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ。
10. 以下を含む真核細胞：
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド；及び、
    （ｂ）（ａ）の配列によってコードされるピロリジルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化され得るｔＲＮＡ、又はそのｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド。
11. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の真核細胞。
12. １つ以上の非天然アミノ酸残基を含む標的ポリペプチドの作製方法であって、該方法は下記工程を含む：
    （ａ）以下を含む真核細胞を提供する工程：
    （ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載のピロリジルｔＲＮＡ合成酵素；
    （ｉｉ）ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ）；
    （ｉｉｉ）非天然アミノ酸又はその塩；及び、
    （ｉｖ）標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（非天然アミノ酸残基に占められる該標的ポリペプチドの任意の位置が、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌに含まれるアンチコドンの逆相補体であるコドンによりコードされている）；
    但し、ｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌ（ｉｉ）を、非天然アミノ酸又はその塩（ｉｉｉ）を用いてアシル化することができる；並びに、
    （ｂ）真核細胞によるポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能にし、それにより標的ポリペプチドを産生する工程。
13. 下記工程を含むポリペプチド結合体の作製方法：
    （ａ）請求項１２の方法を用いて、１つ以上の非天然アミノ酸残基を含む標的ポリペプチドを作製する工程；及び、
    （ｂ）標的ポリペプチドを１つ以上の結合パートナー分子と反応させて、標的ポリペプチドの非天然アミノ酸残基に結合パートナー分子を共有結合させる工程。
14. 少なくとも１つの非天然アミノ酸又はその塩及び以下を含むキット：
    （ａ）請求項６、７及び９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；又は、
    （ｂ）請求項８もしくは９に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ；又は、
    （ｃ）請求項１０もしくは１１に記載の真核細胞；
    但し、古細菌ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素は、ｔＲＮＡ^Ｐｙｌを非天然アミノ酸又はその塩を用いてアシル化することができる。

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