JP2023514384A - 直交法で使用する古細菌ピロリジルtRNA合成酵素 - Google Patents
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Abstract
本発明は、真核細胞の効率的な直交翻訳システムに関する。具体的には、本発明は、原核生物tRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、及び、原核生物tRNA(ptRNA)と1つ以上のリボザイムとを含むRNA分子(本明細書では「ptRNA-リボザイム」と呼ぶ)を含む真核細胞に関する。また本発明は、当該真核細胞によって、1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を含む目的のポリペプチド(POI)を発現させる方法;並びに、当該方法に有用なキットに関する。さらに本発明は、ptRNA-リボザイムをコードするポリヌクレオチドに関する。
Description
本発明は、真核細胞の効率的な直交翻訳システムに関する。具体的には、本発明は、原核生物tRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、及び、原核生物tRNA(ptRNA)と1つ以上のリボザイムとを含むRNA分子(本明細書では「ptRNA-リボザイム」と呼ぶ)を含む真核細胞;当該真核細胞によって、1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を含む目的のポリペプチド(POI)を発現させる方法;並びに、当該方法に有用なキットに関する。さらに本発明は、ptRNA-リボザイムをコードするポリヌクレオチドに関する。
遺伝暗号の拡張(GCE)は、翻訳後修飾の部位特異的導入、又はタンパク質の構造もしくは動態を研究するための特殊な色素によるタンパク質の標識を含むタンパク質工学のための最も強力なツールの一つである。具体的には、GCEは、宿主細胞の翻訳機構に直交するtRNA/アミノアシルtRNA合成酵素(tRNA/RS)対を用いて、特に終止コドン抑制を用いて、ncAA残基の直接的な遺伝子コード化によるポリペプチドの翻訳修飾を可能にする。
理想的な直交tRNA/RS対は、宿主の翻訳機構と交差反応を示さないため、細胞のハウスキーピング翻訳活性や正常な生理機能に与える影響を最小限に抑えることができる。様々な原核生物(細菌及び古細菌)のtRNA/RS対は、ポリペプチド中の様々なncAA残基を遺伝的にコードするために使用されてきた(例えば、人工のMethanococcus jannaschii tRNA/チロシル-RS、大腸菌tRNA/ロイシル-RS、並びにMethanosarcina mazei及びM.barkeri tRNA/ピロリジル-RS対を含む)。(例えば、非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7を参照のこと)
長年にわたり、GCEの効率を向上させるために様々な開発が行われてきた。これらには、例えば、特許文献1に記載されているように、RSが(核内ではなく)細胞質内に主に局在することを可能にするように核局在シグナル(NLS)を欠く及び/又は核搬出シグナル(NES)を含む古細菌RSの使用が含まれる。探索されてきたGCE効率を高めるためのさらなるアプローチには、いくつか例を挙げると、プロモーター工学、直交RSのより良い進化、放出因子工学、及びtRNAの多鎖化などが含まれる。(総説については、非特許文献8を参照のこと)
しかしながら、真核細胞におけるGCEの効率を向上させる戦略は、依然として高い需要がある。より効率的なGCEにより、細胞は、1つ以上のncAA残基を含むPOIをより大量に発現することができる。標識及び画像化の目的に利用できるより多量のPOIは、例えば、低存在量のポリペプチドが標識される場合に有利である。したがって、本発明の目的は、GCEの効率を(さらに)向上させることであった。
Chin et al.,J Am Chem Soc 124:9026,2002
Chin et al.,Science 301:964,2003
Nguyen et al.,J Am Chem Soc 131:8720,2009
Yanagisawa et al.,Chem Biol 15:1187,2008
Liu et al.,Annu Rev Biochem 83:379-408,2010
Lemke,ChemBioChem 15:1691-1694,2014
Wan et al.,Biochim Biophys Acta 1844:1059-170
Chin et al.,Annu Rev Biochem 83:379-408,2014
本発明者らは、驚くべきことに、tRNAをリボザイムとともに含むRNA分子として直交tRNAを発現させ、二本鎖RNA-(dsRNA-)結合ポリペプチドを共発現させると、真核細胞内でGCEが発現させるPOIの量を増加させることができることを見いだした。理論に束縛されることを望まないが、dsRNA結合ポリペプチドは、プロテインキナーゼR(PKR)による真核生物開始因子2α(eIF-2α)のαサブユニットのリン酸化を阻害し、したがって、前記PKR活性に伴うeIF-2α活性及びタンパク質合成の障害を緩和すると想定される。
理論に束縛されることを望まないが、リボザイムは、真核細胞内で困難なtRNAのプロセシングを改善し、したがって、GCEに利用可能なプロセシングされた機能的直交tRNAの量を増加させると、さらに想定される。プロセシングされた機能的直交tRNAの十分な供給は、特に、直交tRNAがtRNAプロセシング機構及び伸長因子などの細胞内の非翻訳性要素とも相互作用する可能性を考慮すると、GCE(例えば、アンバー抑制など)に不可欠である。
したがって、第1の態様において、本発明は、以下を含む真核細胞に関する:
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、及び
(b)原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、及び
(b)原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
さらなる態様において、本発明は、以下を含む真核細胞に関する:
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、
(b)原核生物tRNA(ptRNA)をコードするポリヌクレオチド、及び
(c)本明細書に記載のdsRNAに結合することができるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチド。
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド、
(b)原核生物tRNA(ptRNA)をコードするポリヌクレオチド、及び
(c)本明細書に記載のdsRNAに結合することができるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチド。
本発明の真核細胞では、項目(a)のポリヌクレオチドによってコードされるpRSは、ptRNAをアシル化することができ、特にptRNAを非標準アミノ酸(ncAA)でアシル化することができる。また項目(b)のポリヌクレオチドに含まれるptRNA及びリボザイムをコードする配列は、転写がptRNA及びリボザイムの両方を含むRNA分子(ptRNA-リボザイム)を生成するように連結している。
本発明の文脈において使用される(例えば、使用されるポリヌクレオチドによってコードされる、又は発現される)dsRNA結合ポリペプチドは、配列番号37及び57~59のいずれか1つに示す配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のptRNAとリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするポリヌクレオチドに関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のptRNA及びリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、
(i)本明細書に記載されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
(ii)本明細書に記載されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方、である。
(i)本明細書に記載されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
(ii)本明細書に記載されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方、である。
前記2つ又は3つのヌクレオチド配列は、同じポリペプチド上に位置することができる。あるいは、前記2つ又は3つのヌクレオチド配列の各々は、別々のポリヌクレオチド上に位置することができる(したがって、それぞれ、2つ又は3つのポリヌクレオチドの組み合わせが生じる)。あるいは、前記3つのヌクレオチド配列のうちの2つは同じポリヌクレオチド上に位置し、第3のヌクレオチド配列(すなわち、ptRNA-リボザイムコード化配列、又はpRSコード化配列、又はtetO結合タンパク質コード化配列)は、別のポリヌクレオチド上に位置することができる(したがって、2つのポリヌクレオチドの組み合わせが生じる)。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製する方法に関し、該方法は、以下の工程を包む:
(a)真核細胞内で、以下を発現させる工程:
- pRS、及び、
- ptRNAと本明細書に記載のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子;
(b)POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、真核細胞内でPOIを発現させる工程;並びに、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程。
(a)真核細胞内で、以下を発現させる工程:
- pRS、及び、
- ptRNAと本明細書に記載のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子;
(b)POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、真核細胞内でPOIを発現させる工程;並びに、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製する方法に関し、該方法は、以下の工程を包む:
(a)真核細胞内で、以下を発現させる工程:
- pRS、
- 原核生物tRNA(ptRNA)、及び、
- 本明細書に記載のdsRNAに結合することができるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド);並びに、
(b)POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、真核細胞内でPOIを発現させる工程;並びに、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程。
(a)真核細胞内で、以下を発現させる工程:
- pRS、
- 原核生物tRNA(ptRNA)、及び、
- 本明細書に記載のdsRNAに結合することができるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド);並びに、
(b)POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、真核細胞内でPOIを発現させる工程;並びに、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程。
本発明による目的のポリペプチド(POI)の調製方法において、pRSは、ncAA又はその塩でptRNAをアシル化することができ、POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされている。前記セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である。
前記方法の工程(a)及び(b)は、同時に又は順々に実施することができる。例えば、発現工程(a)を最初に実施し、その後、発現工程(b)を実施することができる。工程(a)に従ってpRS及びRNA分子(それぞれptRNA-リボザイム又はptRNA)の発現を開始する場合、工程(b)に従ってPOIの発現を開始するときに前記発現を継続することができる。
さらなる態様において、本発明は、そのアミノ酸配列中に1つ以上のncAA残基を有するPOIを調製するためのキットに関し、当該キットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、又はその塩と、以下を含む:
(a)本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ、又は、
(b)本明細書に記載されるdsRN結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、
(c)本明細書に記載の本発明の真核細胞。
(a)本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ、又は、
(b)本明細書に記載されるdsRN結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、
(c)本明細書に記載の本発明の真核細胞。
GCEでは、直交するtRNA/RS対の制御されていない発現により、望ましくない副作用が生じる可能性がある。例えば、未使用のRS及び/又は未使用のtRNAの過剰は、細胞の生存能力を損なう可能性がある。本発明は、GCEのための真核細胞、ポリヌクレオチド、方法及びキットをさらに提供することによって、この問題を解決し、(i)tRNA(ptRNA又はptRNA-リボザイム)、pRS又はその両方をコードするヌクレオチド配列の転写がテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)により制御されるか、(ii)前記ヌクレオチド配列の転写がRNAポリメラーゼ(例えば、T7 RNAポリメラーゼ)によって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。したがって、前記tRNA及び/又はpRSの発現は、例えばテトラサイクリンリプレッサー(tetR)、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)又はリバースtTA(rtTA)などのTRE(内のテトラサイクリンオペレーター(tetO)配列)に結合するタンパク質の同時発現、及びテトラサイクリン又はドキシサイクリンなどのテトラサイクリン誘導体の存在(又は非存在)によって誘導性になる。
[発明の詳細な説明]
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。したがって、例えば、「pRSをコードするポリヌクレオチド」を含むと定義される真核細胞には、1つ以上の当該ポリヌクレオチドを含む真核細胞、並びに、単数又は複数の前記ポリヌクレオチドが1つ以上のpRSをコードする真核細胞が含まれる。
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。したがって、例えば、「pRSをコードするポリヌクレオチド」を含むと定義される真核細胞には、1つ以上の当該ポリヌクレオチドを含む真核細胞、並びに、単数又は複数の前記ポリヌクレオチドが1つ以上のpRSをコードする真核細胞が含まれる。
特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は本明細書中に5’から3’方向で示される。特に明記しない限り、アミノ酸配列は本明細書中にN末端からC末端の方向で示される。
1.原核生物アミノアシルtRNA合成酵素/原核生物tRNA(pRS/ptRNA)
本発明の真核細胞は、原核生物RS/tRNA(pRS/ptRNA)対をコードするポリヌクレオチドを含む(pRSはptRNAをアシル化することができる)。特に、pRSは、アミノ酸又はアミノ酸類似体(例えば、α-アミノ基がヒドロキシル基で置換され、及び/又はカルボン酸官能基がエステルを形成することで、アミノ酸と異なる化合物)、好ましくは非標準アミノ酸(ncAA)でtRNAをアシル化することができる。
本発明の真核細胞は、原核生物RS/tRNA(pRS/ptRNA)対をコードするポリヌクレオチドを含む(pRSはptRNAをアシル化することができる)。特に、pRSは、アミノ酸又はアミノ酸類似体(例えば、α-アミノ基がヒドロキシル基で置換され、及び/又はカルボン酸官能基がエステルを形成することで、アミノ酸と異なる化合物)、好ましくは非標準アミノ酸(ncAA)でtRNAをアシル化することができる。
本発明の文脈で使用されるptRNA及びpRSは、前記ptRNA及びpRSを発現させる真核生物(宿主)細胞(組換え)の翻訳機構に直交する。本明細書で使用される「直交」という用語は、この特定の分子(例えば、直交tRNA(O-tRNA)及び/又は直交RS(O-RS))が、目的の翻訳システム(例えば、宿主細胞)によって、低下した効率で使用されることを示す。
「翻訳システム」という用語は、一般に、成長するポリペプチド鎖(タンパク質)に天然に存在するアミノ酸を組み込むために必要な一連の構成要素を指す。翻訳システムの構成要素には、例えば、リボソーム、tRNA、アミノアシルtRNA合成酵素、mRNAなどが含まれる。本発明の文脈で使用される翻訳システムは、好ましくは真核細胞である。
具体的には、「直交」とは、O-tRNA又はO-RSが、目的の翻訳システムの内因性RS又は内因性tRNAをそれぞれ用いて機能できないこと又は効率が低下すること(例えば、20%未満の効率、10%未満の効率、5%未満の効率、又は1%未満の効率等)をいう(前記直交RS又は直交tRNAが使用される)。例えば、目的の翻訳システムにおけるO-tRNAは、内因性RSによる内因性tRNAの(アミノ)アシル化と比較した場合、翻訳システムの任意の内因性RSによって、低下した又はゼロにさえなる効率で(アミノ)アシル化される。例えば、O-RSは、内因性RSによる内因性tRNAの(アミノ)アシル化と比較した場合、低下した又はゼロにさえなる効率で、目的の翻訳システム内の任意の内因性tRNAを(アミノ)アシル化する。本明細書で使用される「直交翻訳システム」は、成長するポリペプチド鎖にncAA残基を導入することができるRS/O-tRNAncAA対を用いた翻訳システムをいう。
別段の指示がない限り、本明細書で使用される「内因性tRNA」及び「内因性アミノアシルtRNA合成酵素」(「内因性RS」)という用語は、それぞれ本発明の状況で使用されるpRSとptRNAを導入する前に最終的に翻訳システムとして使用される細胞に存在するtRNA及びRSをそれぞれ意味する。
本発明の方法及び/又は融合タンパク質で使用されるptRNA及びpRSは、天然に存在することができ(すなわち、自然界の原核生物に見られるptRNA及びpRSである)又は天然に存在するptRNA又はpRSの変異によってそれぞれ誘導されうる。様々な実施形態において、ptRNA及びpRSは、原核生物、例えば、真正細菌又は古細菌から誘導される(例えば、大腸菌;M.jannaschiiなどのMethanococcus種;M.mazei、M.barkeri、M.acetivorans、M.thermophileなどのMethanosarcina種;M.burtoniiなどのMethanococcoides種;D.hafnienseなどのDesulfitobacterium種)。別の実施形態では、ptRNAは、第1の原核生物由来の天然に存在するptRNA又は天然に存在するptRNAの変異体であり、RSは、第2の原核生物由来の天然に存在するpRS又は天然に存在するpRSの変異体から誘導される。
適切な(直交する)ptRNA/pRS対は、例えばライブラリスクリーニングの結果に基づいて、変異ptRNA及びpRSのライブラリから選択することができる。tRNA/RS対を進化させる方法は、例えば、WO 02/085923及びWO 02/06075に記載されている。
いくつかの原核生物のRS(Methanococcus jannaschiiチロシルtRNA合成酵素、大腸菌チロシルtRNA合成酵素、大腸菌ロイシルtRNA合成酵素、及び、特定のMethanosarcina種(M.mazei,M.barkeri,M.acetivorans,M.thermophila等)、Methanococcoides種(M.burtonii等)、Desulfitobacterium種(D.hafniense等)又はMethanomethylophilus種(M.alvus等)由来のピロリジルtRNA合成酵素が挙げられる)は、遺伝暗号の拡張に使用されてきた。
対応する直交pRS/ptRNA対は、ポリペプチドの様々な機能性を遺伝的にコードするために使用されている(Chin,Annu Rev Biochem 2014,83:379-408;Chin et al.,J Am Chem Soc 2001,124:9026;Chin et al.,Science 2003,301:964;Nguyen et al.,J Am Chem Soc 2009,131:8720;Willis and Chin,Nat Chem 2018,10:831-837);Yanagisawa et al.,Chem Biol 2008,15:1187)。このようなpRS及びptRNAは、本発明において使用することができる。
本発明の文脈においてpRSとして使用することができるピロリジルtRNA合成酵素(PylRS)は、野生型PylRS、又は、遺伝子操作されたPylRSとすることができる。野生型PylRSの例としては、Methanosarcina maize、Methanosarcina barkeri、Methanococcoides burtonii、Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina thermophila、Methanomethylophilus alvus及びDesulfitobacterium hafnienseなどの古細菌及び真正細菌由来のPylRSが挙げられるが、これらには限定されない。遺伝子操作されたPylRSは、例えば、Neumannら(Nat Chem Biol 2008,4:232)、Yanagisawaら(Chem Biol 2008,15:1187)、及びEP2192185A1において記載されている。
PylRSを用いた遺伝暗号の拡張の効率は、PylRSのアミノ酸配列を核に向かわないように改変することで向上させることができる。この目的のために、核局在化シグナル(NLS)は、PylRSから除去することができ、又は適切な核搬出シグナル(NES)を導入することによって無効にすることができる。したがって、本発明の特定の実施形態では、pRSは、本明細書に記載されるPylRS、又は機能的断片若しくは変異体であり、NLSを欠き、及び/又はNESを含む(例えばWO2018/069481に記載される)。例えば、当該PylRSはNESを有することができ、好ましくは、pRSの(メチオニン残基の)アミノ酸の1位と、pRSのアミノ酸の2位の間に挿入される。
用語「核外搬出シグナル」(「NES」と略される)は、それを含むポリペプチド(本発明のNES含有pRS又は本明細書で使用されるNES-T7RNAP等)が真核細胞の核から搬出されるように指示できるアミノ酸配列を意味する。前記搬出は、大部分がCrm1(染色体領域維持1;カリオフェリンエクスポーチン1としても知られる)によって媒介されると考えられている。NESは当技術分野において公知である。
例えば、データベースValidNES(http://validness.ym.edu.tw/)は、実験的に検証されたNES含有タンパク質の配列情報を提供する。さらに、例えばNESbase1.0(www.cbs.dtu.dk/databased/NESbase-1.0/;Le Cour et al.,Nucl Acids Res 31(1),2003参照)等のNESデータベースや、NES予測のためのツール、例えばNetNES(www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/;La Cour et al.,Protein Eng Des Sel 17(6):527-536,2004参照)、NESpredictor(NetNES,http://www.cbs.dtu.dk/;Fu et al.,Nucl Acids Res 41:D338-D343,2013;La Cour et al.,Protein Eng Des Sel 17(6):527-536,2004参照)及びNESsential(ValidNESと組み合わせたウェブインターフェース)が一般に向けて利用可能である。
疎水性のロイシンに富むNESが最も一般的であり、現在までに最も特徴がわかっているNESのグループを示す。疎水性ロイシンに富むNESは、3又は4個の疎水性残基を有する非保存的モチーフである。これらのNESの多くは、保存されたアミノ酸配列パターンLxxLxL(配列番号28)又はLxxxLxL(配列番号29)を含む。なお、各Lはロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンのアミノ酸残基から独立して選択される。また各xは、任意のアミノ酸から独立して選択される(La Cour et al.,Protein Eng Des Sel 17(6):527-536,2004参照)。
本発明で使用されるpRS(特にPylRS)のシグナルペプチドとして好適な特定のNESは、当技術分野で知られており(例えば、NESデータベースから)、WO2018/069481等に記載されている。
特定の実施形態では、本発明で使用されるpRSは、疎水性ロイシンに富むNES、特にアミノ酸配列LxxLxL(配列番号28)又はLxxxLxL(配列番号29)を含むNESを含む。なお、各Lは独立してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択される。また各xは独立して任意のアミノ酸から選択される。より具体的には、NESは、L1xxL2xxL1xL3(配列番号30)、L1xxxL2xxL1xL3(配列番号31)、L1xxL2xxxL1xL3(配列番号32)及びL1xxxL2xxxL1xL3(配列番号33)から選択されるアミノ酸配列を含む。なお、L1はロイシンであり、L2はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン及びメチオニンから選択され、L3はロイシン及びイソロイシンから選択される。また各xは独立して任意のアミノ酸から選択される。好ましくは、NESは、HIV-1 Revタンパク質に見られるアミノ酸配列LPPLERLTL(配列番号34)を含み、又はより好ましくはアミノ酸配列ACPVPLQLPPLERLTLD(配列番号35)を含む。
「核局在化シグナル」(「NLS」と略され、当技術分野では「核局在化配列」とも呼ばれる)は、それを含むポリペプチド(例えば、NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His)を真核細胞の核に取り込むように「タグ」する(すなわち、指示できる)アミノ酸配列である。
前記輸送は、核膜孔を通って移動する複合体を形成するための、NLS含有ポリペプチドのインポーチン(カリオフェリンとしても知られる)への結合によって媒介されると考えられている。NLSは当技術分野で公知である。
多数のNLSデータベース及びNLS予測のためのツールが一般に向けて利用可能である。例えば、NLSdb(Nair et al.,Nucl Acids Res 31(1),2003参照),cNLS Mapper(www.nls-mapper.aib.keio.ac.jp;Kosugi et al.,Proc Natl Acad Sci USA.106(25):10171-10176,2009;Kosugi et al.,J Biol Chem 284(1):478-485,2009参照),SeqNLS(Lin et al.,PLoS One 8(10):e76864,2013参照)及びNucPred(www.sbc.su.se/~maccallr/nucpred/;Branmeier et al.,Bioinformatics 23(9):1159-60,2007参照)である。
古典的なNLSは、単節型(monopartite)と双節型(bipartite)とすることができる。双節型NLSは、2つの塩基性アミノ酸クラスターと、前記クラスターを連結する約10アミノ酸のスペーサーからなる。単節型NLSに含まれる典型的なコア配列は、KX1X2X3(配列番号:20)である。なお、X1及びX3は独立してK及びRから選択され、X2は任意のアミノ酸である。例示的なNLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号:21)を含むNLSを含む。
本発明の文脈で使用することができる特定のpRSの例には以下が含まれるが、これらに限定はされない:
- Methanococcus jannaschii チロシルtRNA合成酵素;
- 大腸菌チロシルtRNA合成酵素;
- 大腸菌ロイシルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina barkeri ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina acetivorans ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina thermophila ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanococcoides burtonii ピロリジルtRNA合成酵素;
- Desulfitobacterium hafniense ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanomethylophilus alvus ピロリジルtRNA合成酵素;
並びに、これらのポリペプチドの機能的(すなわち、酵素的活性)断片及び変異体。
- Methanococcus jannaschii チロシルtRNA合成酵素;
- 大腸菌チロシルtRNA合成酵素;
- 大腸菌ロイシルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina barkeri ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina acetivorans ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanosarcina thermophila ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanococcoides burtonii ピロリジルtRNA合成酵素;
- Desulfitobacterium hafniense ピロリジルtRNA合成酵素;
- Methanomethylophilus alvus ピロリジルtRNA合成酵素;
並びに、これらのポリペプチドの機能的(すなわち、酵素的活性)断片及び変異体。
前記機能的断片及び変異体は、それらが由来するアミノアシルtRNA合成酵素に対して、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を含むことができる。
M.mazei PylRSである本発明において有用なpRSの特定の例として以下が挙げられるが、これらには限定されない:
- PylRSAF(Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素二重変異体:Y306A、Y384F;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号22);
- PylRSAA(Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素二重変異体:N346A、C348A;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号23);
- PylRSAAAF(Methanosarcina mazeiピロリジルtRNA合成酵素四重変異体:Y306A、N346A、C348A、Y384F;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号24);
並びに、これらのポリペプチド断片の機能的(すなわち、酵素的活性)断片及び変異体。
- PylRSAF(Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素二重変異体:Y306A、Y384F;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号22);
- PylRSAA(Methanosarcina mazei ピロリジルtRNA合成酵素二重変異体:N346A、C348A;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号23);
- PylRSAAAF(Methanosarcina mazeiピロリジルtRNA合成酵素四重変異体:Y306A、N346A、C348A、Y384F;ユニプロット:Q8PWY1;配列番号24);
並びに、これらのポリペプチド断片の機能的(すなわち、酵素的活性)断片及び変異体。
前記機能的断片及び変異体は、それらが由来するPylRSに対して、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を含むことができる。
特定の実施形態によれば、本明細書に記載の野生型及び変異型M.mazei PylRSは、WO2012/104422又はWO2015/107064に記載のncAAによるtRNAのアミノアシル化に使用される。この目的のための典型的なncAAとしては以下が挙げられるが、これらには限定されない:2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(BOC);2-アミノ-6-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(SCO);2-アミノ-6-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシエトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイド酸;2-アミノ-6[(4E-シクロオクタ-4-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸(TCO);2-アミノ-6[(2E-シクロオクタ-2-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸(TCO*);2-アミノ-6-(プロパ-2-イノキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(PrK);
2-アミノ-6-(9-ビオシクロ[6.1.0]ノナ-4-イニルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイド酸(BCN);及び、特にこれらのアミノ酸の2S-(L-)エナンチオマー。
2-アミノ-6-(9-ビオシクロ[6.1.0]ノナ-4-イニルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイド酸(BCN);及び、特にこれらのアミノ酸の2S-(L-)エナンチオマー。
本明細書に記載されるpRSの機能的断片及び変異体は、親pRSのアシル化酵素活性を有する点で機能的であり、断片又は変異体の前記酵素活性の程度は、親pRSのそれよりも高くても低くてもよく、又はほぼ同じであってもよい。当該断片及び変異体は、本明細書に記載されるように、配列同一性の最小の程度によって特徴付けることができる。
本明細書で使用されるアミノ酸又はヌクレオチド配列の同一性は、それぞれ、このように特徴付けられたアミノ酸又はヌクレオチド配列の全長にわたる同一性を意味する。パーセンテージの同一性の値は、BLASTアラインメント、blastpアルゴリズム(タンパク質-タンパク質BLAST)に基づいて、又はClustal法を使用して、当技術分野で知られているように決定することができる(Higgins et al.,Comput Appl.Biosci.1989,5(2):151-1)。
本発明において有用な特定のpRSの機能的断片及び変異体は、例えば保存的アミノ酸置換、すなわちアミノ酸残基を、当技術分野で知られている類似の生化学的特性(例えば電荷、疎水性、及びサイズ)を有する異なるアミノ酸残基で置換することで得ることができる。典型的な例は、LeuのIleによる置換又はその逆、AspのGluによる置換又はその逆、AsnのGlnによる置換又はその逆などである。
本発明の文脈で使用できるptRNAには、M.mazeiのピロリジルtRNA及びその機能的変異体が含まれるが、これらには限定されない。好適には、ptRNAのアンチコドンは、例えば、アンバー終止コドンTAGに対するCUAアンチコドン、オパール終止コドンTGAに対するUCAアンチコドン、又はオーカー終止コドンTAAに対するUUAアンチコドンなどのセレクタコドンに対するアンチコドンである。このピロリジルtRNAの例としては、これには限定されないが、配列番号25(tRNAPyl,CUA)、配列番号26(tRNAPyl,UCA)又は配列番号27(tRNAPyl,UUA)のヌクレオチド配列によりコードされるものである。
本発明の文脈で用いられるptRNAは、所定の翻訳システム(例えば、本発明の真核細胞)においてメッセンジャーRNA(mRNA)の読み取りを変化させるサプレッサーtRNAとして作用することができる。サプレッサーtRNAは、例えば、終止コドン、4塩基コドン、又は希少コドンを介して読み取ることができる。
本発明で用いられるO-RS/O-tRNA(pRS/ptRNA)対は、好ましくは以下の性質を有する:O-tRNAがO-RSによって優先的に(ncAAで)アシル化される。さらに、直交対は(ncAAでアシル化された)O-tRNAが、POIの成長するポリペプチド鎖に前記アミノ酸又はncAA残基を組み込むために使用されるように、目的の翻訳システム(例えば、本発明の真核細胞)で機能する。組み入れは部位特異的に行われる。具体的には、O-tRNAは、POIをコードするmRNA中のセレクタコドン(例えば、Amber、Ochre又はOpal終止コドン)を認識する(そのアンチコドンを介して特異的に結合する)。
「優先的にアシル化する」という用語は、目的の翻訳システムの内因性tRNA又はアミノ酸と比較して、O-RSがO-tRNAをncAAでアシル化する効率が、例えば、約50%の効率、約70%の効率、約75%の効率、約85%の効率、約90%の効率、約95%の効率、又は約99%以上の効率であることをいう。ncAA残基は次に、例えば、所定のセレクタコドンに対して約75%超の効率、所定のセレクタコドンに対して約80%超の効率、所定のセレクタコドンに対して約90%超の効率、所定のセレクタコドンに対して約95%超の効率、又は所定のセレクタコドンに対して約99%超の効率で、高い適合度で成長するポリペプチド鎖に取り込まれる。
2.リボザイムとptRNA-リボザイム
本発明の一態様では、ptRNAは、ptRNA配列と1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子の形態で発現する。
本発明の一態様では、ptRNAは、ptRNA配列と1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子の形態で発現する。
本明細書で使用する「リボザイム」という用語は、部位特異的な自己切断が可能なRNA分子、又はその一部を意味する。具体的には、リボザイムは、(同じ)リボザイムのリボヌクレオチド配列内の2つのリボヌクレオチド間のホスホジエステル結合の部位特異的切断を触媒することができる。
リボザイムは、当技術分野で周知である。本発明のptRNA-リボザイムに使用できるリボザイムの例としては、これには限定されないが、ハンマーヘッドリボザイム(例えば、配列番号4のハンマーヘッドリボザイム)、ヘアピンリボザイム(例えば、配列番号5のヘアピンリボザイム)、Varkud satellite(VS)リボザイム(例えば、配列番号6のVSリボザイム)、グルコサミン-6-リン酸合成酵素(glmS)リボスイッチ(例えば、配列番号7のglmSリボスイッチ)及び肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイム(例えば、配列番号1、2又は3のHDVリボザイム)を挙げることができる。
これらのリボザイムに関する情報は、例えば、Ferre-D’Amareら(Cold Spring Harb Perspect Biol 2010,2:a003574)、Cochraneら(Chem Biol 2007,14(1):97-105)及びSchuererら(Nucl Acids Res 2002,30(12):e56)で見出すことができる。本発明の好ましい実施形態では、リボザイムは、配列番号1のHDVリボザイムである。
本発明で用いられるptRNAとリボザイムを含むRNAは、RNAのリボザイム触媒による部位特異的(自己)切断により、ptRNAの5’末端及び/又は3’末端を遊離するようにptRNAに対して位置する1つ以上のリボザイムを含む。したがって、前記リボザイム触媒による(自己)切断により、ptRNA配列を含むRNA分子が得られる。なお、ptRNA配列の5’末端及び/又は3’末端は、それぞれ前記RNA分子の5’末端又は3’末端に一致する。
特定の実施形態では、ptRNAとリボザイムを含むRNAのリボザイム触媒による(自己)切断により、ptRNAからなるRNA分子が得られる。好ましい実施形態では、リボザイムは、HDVリボザイム、特に配列番号1のHDVリボザイムであり、連続したptRNA-リボザイム融合を形成するように、ptRNAの3’末端に直接(すなわち、間にリボヌクレオチドなしで)共有結合(融合)している。
3.ptRNA及び/又はpRSの誘導性発現及び構成的発現
さらなる態様として、本発明は、ptRNA(もしくはptRNA-リボザイム)もしくはpRS又はその両方の発現が(構成的とは対照的に)誘導性である、本明細書に記載の真核細胞、POIを調製する方法及び関連する主題を提供する。具体的には、前記誘導性は、pRSもしくはptRNA/ptRNA-リボザイム又はその両方をコードするヌクレオチド配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって(直接)制御されるか、その転写がRNAポリメラーゼによって触媒される(前記RNAポリメラーゼの発現は、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって制御されている)という点で達成されている。
さらなる態様として、本発明は、ptRNA(もしくはptRNA-リボザイム)もしくはpRS又はその両方の発現が(構成的とは対照的に)誘導性である、本明細書に記載の真核細胞、POIを調製する方法及び関連する主題を提供する。具体的には、前記誘導性は、pRSもしくはptRNA/ptRNA-リボザイム又はその両方をコードするヌクレオチド配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって(直接)制御されるか、その転写がRNAポリメラーゼによって触媒される(前記RNAポリメラーゼの発現は、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメントによって制御されている)という点で達成されている。
TRE制御転写に適したシステムは当技術分野で周知であり、誘導性遺伝子発現のための標準的なツールとなっている。例えば、Gossen and Bujard,Proc Natl Acad Sci USA.1992,89(12):5547-5551;Yao et al.,Hum Gene Ther.1998,9(13):1939-1950;Das et al.,Curr Gene Ther,2016,16(3):156-167を参照のこと。
用語「テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント」(「テトラサイクリン応答性エレメント」又は「TRE」と略記)は、1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7以上、例えば2又は7)のテトラサイクリンオペレーター(tetO)配列を含むプロモーター配列のことをいう。tetOは、例えば、テトラサイクリンリプレッサー(tetR)、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)又はリバースtTA(rtTA)タンパク質などのtetO結合タンパク質に結合することができる配列番号8の配列又はその機能的変異体を有するポリヌクレオチドセグメントである。TREは、配列番号9に示す最小限のCMVプロモーター配列の少なくとも一部をさらに含むことができる。
本発明の文脈では、TRE制御配列の転写は、特に、本明細書に記載のRNA分子(ptRNA又はptRNA-リボザイム)の転写合成、pRSコード化配列の転写、又は本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイムの転写合成を触媒するRNAポリメラーゼ(例えば、T7R NAポリメラーゼ)の転写合成である。
pRS、ptRNA/ptRNA-リボザイム及びT7RNAPの1つ以上の発現が本明細書に記載のTREによって制御される本発明の真核細胞は、好適には、本明細書に記載のテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体のそれぞれの存在又は不在下で、前記TRE制御されたコード化配列を発現誘導できるよう、本明細書に記載のtetO結合タンパク質(tetR、rtTA又はtTA)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明の文脈で使用できるTREの特定の例には、配列番号10~12のいずれか1つの配列を含む(又は有する)TREが含まれる。配列番号10又は配列番号11の配列を含む(又は有する)TREは、tTAと同様に、rtTAと組み合わせて有用である。配列番号12の配列を含む(又は有する)TREは、tetRと組み合わせると特に有用である。
tetO結合タンパク質と、本明細書に記載のRNA分子(ptRNA又はptRNA-リボザイム)、pRS-mRNA、及び/又はRNAポリメラーゼmRNAの転写合成を制御するために選択されたTREは、したがって、好適には、誘導的転写制御が可能となるように互いに一致(結合)するように選択される。
rtTA及びtTAは、例えば、Dasら(Curr Gene Therapy 2016,16:156-167)及びそこに引用される文献から、当技術分野において一般的に知られている。例示的なrtTAタンパク質は、Dasら(supra)の図2Bに記載されたものから選択することができる。
rtTAは、テトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体の存在下(特にドキシサイクリンの存在下)でtetO配列に結合する第1ポリペプチドを含む融合タンパク質である。前記第1ポリペプチドは、真核細胞内で転写を活性化する第2ポリペプチドに(作動的に)連結している。
第1ポリペプチドは、好ましくは、例えば、Dasら(supra)の図2に示されるrtTAのリストから選択される207aa TetRの変異体である。第2ポリペプチドは、好ましくは、単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の127aa転写活性化ドメインである。第1及び第2のポリペプチドは、好ましくは、配列番号14の配列及びその機能的等価物を含む融合タンパク質等の融合タンパク質を形成するように共有結合している。
rtTAは、ドキシサイクリン又はその機能的類似体の存在下で、TRE(のtetO配列)に結合する。rtTAの前記結合は、RNAポリメラーゼの結合を促進又は増強し、それによってTRE制御配列の転写を促進する。このいわゆる「Tet-On」システムでは、TRE制御配列の転写は、このように、ドキシサイクリン又はその機能的類似体を加えることによって、rtTAの存在下で誘導される。したがって、pRS、ptRNA/ptRNA-リボザイム及びT7RNAPの1つ以上の転写(したがって発現)が、このTet-Onシステムによって制御される、本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む:
- 真核細胞内でrtTAを発現させる工程;及び、
- 前記細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させる(それにより、TRE制御配列の転写を誘導する)工程。
rtTAは、少なくともTRE制御配列の発現と同時に(すなわち、TRE制御配列の発現の前に、及び/又は同時に)細胞内で発現する。
- 真核細胞内でrtTAを発現させる工程;及び、
- 前記細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させる(それにより、TRE制御配列の転写を誘導する)工程。
rtTAは、少なくともTRE制御配列の発現と同時に(すなわち、TRE制御配列の発現の前に、及び/又は同時に)細胞内で発現する。
tTAは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の非存在下でtetO配列に結合する第1ポリペプチドを含む融合タンパク質である。前記第1ポリペプチドは、真核細胞内で転写を活性化する第2ポリペプチドに(作動的に)連結している。第1ポリペプチドは、好ましくは、207aa TetR又はその機能的誘導体である。第2ポリペプチドは、好ましくは、単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の127aa転写活性化ドメインである。第1及び第2ポリペプチドは、好ましくは、融合タンパク質を形成するように共有結合している。
tTAは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の非存在下(又は低濃度下)で、TRE(のtetO配列)に結合する。前記tTAの結合は、RNAポリメラーゼの結合を促進又は増強し、それによってTRE制御配列の転写を促進する。このいわゆる「Tet-Off」システムでは、TRE制御配列の転写は、このように、以前に存在したテトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体を除去(又は濃度を低下)することによって、tTAの存在下で誘導される。したがって、pRS、ptRNA/ptRNA-リボザイム及びT7RNAPの1つ以上の転写(したがって発現)が、このTet-Offシステムによって制御される本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む:
- 真核細胞内でtTAを発現させる工程;及び、
- TRE制御配列の発現前の前記細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体との接触を保ち(それによってtTAのTREへの結合を抑制し、したがって前記TRE制御配列の転写合成の(トランス)活性化を抑制する)、次いで、TRE制御配列の転写を誘導するように前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
- TRE制御配列の発現前の前記細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体との接触を保ち(それによってtTAのTREへの結合を抑制し、したがって前記TRE制御配列の転写合成の(トランス)活性化を抑制する)、次いで、TRE制御配列の転写を誘導するように前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
tTAは、少なくともTRE制御配列の発現と同時に(すなわち、TRE制御配列の発現の前に、及び/又は同時に)細胞内で発現する。
テトラサイクリンリプレッサー(tetR)タンパク質は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、Hillen and Berens,Annu Rev Microbiol 1994,48:345-369を参照のこと。本発明の文脈において好適に使用できる例示的なtetRタンパク質は、配列番号13に示すアミノ酸配列及びその機能的等価物を含む(又は有する)ポリペプチドを含む。
tetRは、ドキシサイクリン又はその機能的類似体の非存在下(又は低濃度下)で、TRE(のtetO配列)に結合する。tetRの前記結合は、RNAポリメラーゼの結合を阻害又は阻止し、それによってTRE制御配列の転写を阻害する。
このいわゆる「T-REx」システムでは、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体を添加することにより、TRE制御配列の転写がtetRの存在下でこのように誘導される。したがって、pRS、ptRNA/ptRNA-リボザイム及びT7RNAPの1つ以上の転写(したがって発現)が、このT-RExシステムによって制御される、本発明の方法は、好適には、以下の工程をさらに含む:
- 真核細胞内でtetRを発現させる工程;及び、
- 前記細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させる(それによって、TRE制御配列の転写を誘導する)工程。
tetRは、少なくともTRE制御配列の発現前(すなわち、発現前、又は発現前と同時の両方の前)に細胞内で発現する。
- 前記細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させる(それによって、TRE制御配列の転写を誘導する)工程。
tetRは、少なくともTRE制御配列の発現前(すなわち、発現前、又は発現前と同時の両方の前)に細胞内で発現する。
本明細書に記載されたRNA分子(ptRNA又はptRNA-リボザイム)の転写及び/又はpRSコード化配列の転写は、構成型プロモーターにより制御することができる。構成型プロモーター及び当該プロモーターに結合するRNAポリメラーゼは当技術分野でよく知られており、例えば、CMVプロモーター(ヒトサイトメガロウイルス由来)、SV40プロモーター(シミアン空胞形成ウイルス40由来)、U6プロモーター(ヒトU6小核プロモーター由来)及びH1プロモーター(ヒトポリメラーゼIII RNAプロモーター由来)等の真核生物プロモーター、並びに、例えば、T7プロモーター(T7バクテリオファージ由来)、Sp6プロモーター(Sp6バクテリオファージ由来)等の原核生物プロモーターを挙げることができる。
本明細書に記載されたRNA分子(ptRNA又はptRNA-リボザイム)の転写及び/又は構成型プロモーター転写によって制御されるpRSコード化配列の転写は、構成的であっても誘導的であってもよい。構成的転写は、特に、前記プロモーターを介した転写を触媒するRNAポリメラーゼが真核細胞内で構成的に発現している場合に達成されうる。
あるいは、前記プロモーターを介して転写を触媒するRNAポリメラーゼが、例えばTREの(直接)制御下で、真核細胞内で誘導的に発現する場合、転写は誘導性となりうる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるRNA分子(ptRNA又はptRNA-リボザイム)の発現及び/又はpRSコード化配列の転写が構成型プロモーターによって制御され、前記プロモーターを介して転写を触媒するRNAポリメラーゼの誘導性発現によって誘導可能となる場合、構成型プロモーターは原核生物プロモーター、特に真核細胞に自然に存在しないRNAポリメラーゼを必要とするプロモーターである。特に、Sp6プロモーター、及び、好ましくはT7プロモーターが挙げられる。
用語「T7プロモーター」は、T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)により特定の遺伝子の転写を開始させるDNAの領域を指す。特定の実施形態によれば、本発明の文脈において使用されるT7プロモーターは、配列番号15~17のいずれか1つに示す配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む(又はそれから構成される)。本発明の好ましい実施形態では、T7プロモーターは、配列番号15又は16のアミノ酸配列を含む。
本発明の好ましい実施形態において、pRS及びptRNAの一方もしくは両方、又はptRNA-リボザイムのそれぞれの転写(及びそれによる発現)が構成型プロモーターによって制御される場合、前記構成型プロモーターはT7プロモーターであり、好ましくは配列番号15~17のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む(又はそれから構成される)。T7プロモーターが使用される実施形態では、真核細胞は、好適には、さらにT7RNAPを発現させる。前記T7RNAPは、構成的に発現してもよいし、誘導的に、例えば、TREの(直接的な)制御下で発現してもよい。
「T7 RNAポリメラーゼ」(T7RNAP)は、T7プロモーターに結合し、T7プロモーターの下流の配列の転写を触媒するタンパク質である。天然に存在するT7RNAPのアミノ酸配列は当技術分野で知られている。例えば、UniProtKB/Swiss-Prot アクセッション番号:P00573.2を参照のこと。特定の実施形態によれば、本発明の文脈において使用されるT7RNAPは、配列番号18に示す配列又は配列番号19に示す配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む(アミノ酸位置2~17をカバーするNESを含む)。
真核細胞内のその局在を指示するために、T7RNAP(又は、真核細胞内で組換え発現した別のRNAポリメラーゼ)は、特にそのN末端に、例えば、RNAポリメラーゼのアミノ酸位置1と2の間に挿入されたシグナルペプチドを有することができる。一実施形態では、T7RNAPは、核局在化シグナル(NLS)又は核搬出シグナル(NES)のそれぞれを、本明細書の上記(セクション1参照)で定義したように有することができる。このNES-T7RNAPのアミノ酸配列を配列番号19に示す。別の実施形態では、T7RNAPは、この核局在化又は搬出タグ/シグナルを有さない可能性がある。
4.dsRNA結合ポリペプチド
本発明の一態様は、本明細書に記載のPOIを調製するための真核細胞及び方法を提供する。ここで、真核細胞は、ptRNA/pRS対(ptRNAはptRNA-リボザイムとして発現できる)をコードするポリヌクレオチドを含み、さらにdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また当該POIを調製するための方法は、このptRNA/pRS対を真核細胞内で発現させること、及びdsRNA結合ポリペプチドを発現させることを含む。
本発明の一態様は、本明細書に記載のPOIを調製するための真核細胞及び方法を提供する。ここで、真核細胞は、ptRNA/pRS対(ptRNAはptRNA-リボザイムとして発現できる)をコードするポリヌクレオチドを含み、さらにdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また当該POIを調製するための方法は、このptRNA/pRS対を真核細胞内で発現させること、及びdsRNA結合ポリペプチドを発現させることを含む。
本発明で用いられるdsRNA結合ポリペプチドは、30個以上、好ましくは80個以上の塩基対を有する二本鎖RNA分子(dsRNA)に結合可能なポリペプチドであり、その結合はdsRNAの特定のヌクレオチド配列に依存しない。当該結合は、リンカー領域に隣接する2つのdsRNA結合モチーフ(それぞれα-β-β-αフォールドを含む)を含むプロテインキナーゼR(PKR)のdsRNA結合ドメインによってもたらされる。本発明で用いられる好ましいdsRNA結合ポリペプチドは、配列番号36のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
したがって、本発明で使用されるdsRNA結合ポリペプチドは、配列番号37、及び57~59のいずれか1つに示される配列に対して、少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれから構成されている。より好ましくは、本発明で使用されるdsRNA結合ポリペプチドは、配列番号:38、及び57~59のいずれか1つに記載の配列と少なくとも80%(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はそれから構成される。
好適には、dsRNA結合ポリペプチドは、機能的なPKRキナーゼドメインを欠き、好ましくは、真核生物開始因子2α(eIF-2α)をリン酸化することができない。
POIを調製するための本発明の方法において、dsRNA結合ポリペプチドは、少なくともptRNA/pRS対の発現と同時に(すなわち、同時に、又は発現前と同時の両方で)発現する。
5.ポリヌクレオチド
また本発明は、ポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、以下を含む:
- 本明細書に記載のRNA分子をコードするヌクレオチド配列であって、前記RNAがptRNAとリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むヌクレオチド配列;及び、任意に、
(i)本明細書に記載のtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方;
及び/又は、
(a)前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
また本発明は、ポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、以下を含む:
- 本明細書に記載のRNA分子をコードするヌクレオチド配列であって、前記RNAがptRNAとリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むヌクレオチド配列;及び、任意に、
(i)本明細書に記載のtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方;
及び/又は、
(a)前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
さらに本発明は、ポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関し、以下を含む:
- 本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び、
(i)本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方;
及び、任意に、
- 本明細書に記載のtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列;
及び/又は、
(a)前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
- 本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び、
(i)本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方;
及び、任意に、
- 本明細書に記載のtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列;
及び/又は、
(a)前記コードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド分子」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド及びリボヌクレオチドのポリマーをいう。すなわち、cDNA及びmRNAを含む一本鎖又は二本鎖のDNA分子及びRNA分子などの核酸及びリボ核酸の両方をいう。
特に明記しない限り、又は文脈上必要とされない限り、「[発現産物]をコードするヌクレオチド配列」という表現は、前記発現産物を直接コードする配列及び/又はそれに相補的なヌクレオチド配列を指すことを意図する。
本発明のポリヌクレオチド又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに含まれると規定されたコード化ヌクレオチド配列は、同一のポリペプチド上に位置すること、又は2つ以上の異なるポリヌクレオチド上に分布することができ、したがって、前記異なるポリペプチドの組み合わせが結果として得られる(例えば、各コード化ヌクレオチド配列は、異なる組み合わせのポリペプチド上に位置することができる)。
さらに本発明は、調節ヌクレオチド配列の遺伝的制御下に、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせの(特定のコード化)ヌクレオチド配列を含む、特に組換え、発現構築物又は発現カセットに関する。
本発明の一態様において、本発明の発現カセットは、本明細書に記載のptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の前記態様において、前記発現カセットは、以下を含む1つ以上のさらなる発現カセットを任意にさらに含んでもよく、又は、任意に組み合わされてもよい:
(i)本明細書に記載されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
(i)本明細書に記載されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
本発明のさらなる態様において、本発明の発現カセットは、本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の前記態様において、前記発現カセットは、以下を含む1つ以上のさらなる発現カセットをさらに含んでもよく、又は、任意に組み合わされてもよい:
(i)本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
(i)本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)本明細書に記載のpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方。
また本発明は、これらの発現カセットの1つ以上、又は発現カセットの組み合わせを含むベクター(発現ベクター)、特に組換えベクターにも関する。
発現カセットは、発現産物をコードするヌクレオチド配列(その5’(上流)に位置するプロモーター配列に機能的に連結している)と、典型的には前記コード化配列の3’(下流)に位置するターミネーター配列(例えば、T7ターミネーター配列)と、任意にさらなる調節エレメントを含む。当該さらなる調節エレメントの例としては、ターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられるが、これらには限定されない。
適切な調節配列は、例えば、「Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)」に記載されている。
ポリヌクレオチド(例えば、発現カセット)のエレメント、例えばプロモーター、コード化配列、ターミネーター、レギュレーターなどの「機能的」連結は、これらのエレメントが、コード化配列が転写され、任意の調節エレメントが前記転写のその調節を行うことができるように配置されることを意味する。これは、1つの同じ核酸分子におけるエレメントの直接的な連結によって達成することができる。しかし、このような直接的な連結は必ずしも必要ではない。
遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、又は別のDNA分子からさえも標的配列にその機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の下流(すなわち3’末端)に配置され、2つの配列が共有結合される配置が好ましい。プロモーター配列と発現させる核酸配列との間の距離は、200塩基対より小さくても、100塩基対より小さくても、50塩基対より小さくてもよい。
細胞における発現のために、発現カセットは、有利には、発現ベクターに挿入される。発現ベクターは、細胞内でコード化ヌクレオチド配列の最適な発現を可能にする発現に使用する細胞に応じて選択される。ベクターは当業者には周知であり、例えば「Cloning vectors」(Pouwels P.H.et al.,Ed.,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)に示されている。
発現ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター(ファージ)、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、及び直鎖状もしくは環状DNAが挙げられるが、これらに限定はされない。例えば、書籍「Cloning Vectors」(Eds.Pouwels P.H.et al.Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)を参照のこと。これらのベクターは、(宿主)細胞内で自律的に複製することができ、又は染色体上で複製することもできる。本発明の1つ以上の発現カセットを含む発現ベクターは、本発明のさらなる態様を表す。
本発明による真核細胞内でのPOIの発現のために、例えば、POIをコードするポリヌクレオチド(例えば、発現ベクター)を細胞に導入することが可能である。あるいは、POIがncAA残基を有することを意図するそれらのアミノ酸位置にセレクタコドンが含まれるように、細胞の既存の遺伝子を改変することができる。(組換え)ポリペプチドをコードする核酸分子を細胞に導入する、又は細胞の既存の遺伝子を改変する方法は、当技術分野で知られている。
用語「発現」は、本発明の文脈において、真核細胞内の対応するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの産生を説明する。用語「発現」は、真核細胞内のヌクレオチド配列によってコードされるRNA分子(本明細書に記載のptRNA又はptRNA-リボザイム)の産生にも使用される。
本発明の発現カセット及び発現ベクターを含む本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の一般的なクローニング技術を使用して調製することができる。一般的な組換え技術及びクローニング技術は、例えば、下記文献中に記載の通り使用される:T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989);及び、T.J.Silhavy,M.L.Berman and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984);及び、Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience(1987)。
本発明の発現カセット及び発現ベクターを含む本発明のポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの組み合わせは、例えば、当技術分野で既知の方法によって単離することができる。
「単離された」ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「単離された」組み合わせは、ポリヌクレオチドの天然源(例えば、細胞)に存在する他のポリヌクレオチドから分離される。さらに、組み換え技術によって生産される場合は、他の細胞材料又は培養液を本質的に含まないことが可能であり、化学的に合成される場合は、化学的前駆体又は他の化学物質を含まないことが可能である。
本発明によるポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術及び本発明に従って提供される配列情報によって単離することができる。例えば、cDNAは、具体的に開示された完全配列又はそのセグメントの1つをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、また標準的なハイブリダイゼーション技術を使用して、適切なcDNAバンクから単離することができる。(例えば、下記文献中に記載の通り:Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)
さらに、開示された配列の1つ又はそのセグメントを含むポリヌクレオチドは、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅されたポリヌクレオチドは、適切なベクターにクローニングすることができ、DNA配列解析によって特徴づけることができる。
6.ncAA残基を1つ以上有するPOI
本発明は、1つ以上のncAA残基を有するPOIを調製する方法を提供する。POIのncAA残基は、セレクタコドンによってコードされる。
本発明は、1つ以上のncAA残基を有するPOIを調製する方法を提供する。POIのncAA残基は、セレクタコドンによってコードされる。
本明細書で使用される「セレクタコドン」という用語は、翻訳過程中にptRNAに認識される(すなわち結合する)コドンであって、真核細胞の内因性tRNAには認識されないコドンを意味する。
またこの用語は、例えばDNAプラスミド等、メッセンジャーRNA(mRNA)ではないポリヌクレオチドのポリペプチドをコードする配列中の対応するコドンにも使用される。好ましくは、セレクタコドンは、天然の真核細胞において少量のコドンである。好適には、本発明で用いられるptRNAのアンチコドンは、mRNA中のセレクタコドンに特異的に結合し(ハイブリダイズし)、そうしてncAA残基を前記mRNAによってコードされるポリペプチドの成長鎖に部位特異的に組み込む。既知の64個の遺伝的コドン(トリプレット)は、20個の標準アミノ酸残基及び3個の終止コドンをコードする。
翻訳の終結には終止コドン1個のみが必要なので、他の2個は原則として非タンパク質原性アミノ酸をコードするために使用できる。例えば、アンバーコドン、UAGは、ncAAの取り込みを指示するin vitro及びin vivo翻訳システムにおいて、セレクタコドンとしてうまく使用されてきた。本発明の方法で利用されるセレクタコドンは、使用される翻訳システムのタンパク質生合成機構の遺伝的コドンのフレームワークを拡張する。
具体的には、セレクタコドンには、これらには限定されないが、終止コドン(例えばアンバー(UAG)、オーカー(UAA)及びオパール(UGA)コドン)等のナンセンスコドン;3個を超える塩基から成るコドン(例えば、4塩基コドン);並びに天然又は非天然の塩基対に由来するコドンが含まれる。所定のシステムについて、セレクタコドンは天然の3塩基コドン(すなわち天然トリプレット)のうちの1つを含むこともできる。このとき内因性の翻訳システム(例えば、該天然トリプレットを認識するtRNAを欠いているシステム又は該天然のトリプレットがレアコドンであるシステム)は、前記天然トリプレットを使用しない(又は、ほとんど使用しない)。
所定の翻訳システムにおいて、終止コドン、4塩基コドン又はレアコドン(本発明の真核細胞におけるptRNAなど)等を介して読めるように、mRNAの読みを変更させる組換えtRNAは、サプレッサーtRNAと呼ばれる。セレクタコドンとして機能する終止コドン(例えばアンバーコドン)の抑制効率は、サプレッサーtRNAとして機能する(アミノアシル化)組み換えtRNA(ptRNA)と、終止コドンに結合してリボソームから成長するポリペプチド鎖の放出を開始する放出因子(例えばRF1)との間の競合に依存する。したがって、終止コドンのそのような抑制効率は、放出因子-(例えば、RF1-)欠損株を用いて高めることができる。
標的ポリペプチド(本明細書では、目的のポリペプチド又はPOIとも言う)をコードするヌクレオチド配列は、1つ以上、例えば2つ以上、3つ以上等のコドン(例えばセレクタコドン)を含むことができる。それらは、ptRNAに含まれるアンチコドンの逆相補体である。POIをコードするヌクレオチド配列を生成するために、従来の部位特異的変異誘発法を使用して、前記セレクタコドンをヌクレオチド配列の目的の部位に導入することができる。
略語「ncAA」は、一般に、20種の天然に存在する「標準」タンパク質を構成するアミノ酸(R、H、K、D、E、S、T、N、Q、C、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W)ではなく、セレノシステイン又はピロリシンでもない非標準アミノ酸又は非天然アミノ酸(又はアミノ酸残基)をいう。多数のncAAが当技術分野で周知である。本発明の方法及びキットに有用なncAAは、先行技術に記載されている(例えば、Liu et al.,Annu Rev Biochem 83:379-408,2010;Lemke,ChemBioChem 15:1691-1694,2014を参照のこと)。
本明細書で使用される用語「ncAA」はアミノ酸類似体、例えば、アミノ酸とは異なり、α-アミノ基がヒドロキシル基(α-ヒドロキシル酸)及び/又はカルボン酸官能基で置換され、エステルを形成する化合物も指す。ポリペプチドに翻訳的に組み込まれた場合、α-ヒドロキシル酸(残基)はそのα-ヒドロキシル基を介して、隣接するアミノ酸(類似体)残基のカルボン酸官能基にエステル結合で結合される。
翻訳システム(真核細胞等)において、アミノ酸類似体であるncAA(カルボン酸官能基が式-C(O)-O-Rのエステルを形成している)が、ポリペプチドの調製に使用される場合、Rは原位置で、例えば酵素的に、POIに組み込まれる前の翻訳システムにおいて除去されると考えられる。したがって、Rは、ncAA又はその塩を本発明のPylRSによって認識及び処理される形態に変換する翻訳システムの能力に適合するように適切に選択される。
本発明の文脈において特に好ましいncAAは、翻訳後にさらに修飾することができるものである。例えば、ncAAは、他の分子(本明細書では「結合相手分子」という)の適切な基(本明細書では「ドッキング基」という)との反応を促進する基(本明細書では「標識基」という)を有することができ、それにより結合相手分子はncAAに共有結合する。標識基を有するUAAがPOIに翻訳的に組み込まれた場合、標識基はPOIの一部となる。
したがって、本発明の方法に従って調製されたPOIは、1つ以上の結合相手分子と反応させることができ、それにより、結合相手分子はPOIの非標準アミノ酸(ncAA)残基(の標識基)に共有結合する。この結合反応は、POIを発現させる細胞又は組織内のPOIのin situカップリング、又は単離されたもしくは部分的に単離されたPOIの部位特異的結合に使用することができる。
標識基と(結合相手分子の)ドッキング基の組み合わせについて、特に有用な選択肢は、金属フリークリック反応により反応できるものである。このようなクリック反応としては、歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応(SPIEDAC;例えば、Devaraj et al.,Angew Chem Int Ed Engl 2009,48:7013参照)、並びに、歪のあるシクロアルキニル基、又は、アミノ基で置換された三重結合が結合していない環原子を1つ以上有する歪のあるシクロアルキニル類似体基と、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン及びジアゾカルボニル試薬との環状付加反応(例えば、Sanders et al.,J Am Chem Soc 2010,133:949;Agard et al.,J Am Chem Soc 2004,126:15046参照)、例えば、歪み促進アルキン-アジド環状付加反応(SPAAC)を挙げることができる。このようなクリック反応は、POIのncAA標識基とカップリング相手分子の適切な基との超高速二重直交型共有結合部位特異的カップリングを可能にする。
上記のクリック反応を介して反応できるドッキング基及び標識基の対は当技術分野において公知である。ドッキング基を含む適切なncAAの例としては、これらには限定されないが、例えばWO2012/104422及びWO2015/107064に記載のncAAが挙げられる。
(結合相手分子に含まれる)ドッキング基と(POIのncAA残基に含まれる)標識基の特定の適切な対の例としては、これらには限定されないが、以下を挙げることができる:
(a)アジド基、ニトリルオキシド官能基(すなわち、式で表される基、ニトロン官能基又はジアゾカルボニル基)から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン-アジド環状付加反応(SPAAC)において共有結合的に反応することができる);
(b)任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、アジド基、ニトリルオキシド官能基から選択される基を含む(又は本質的になる)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン-アジド環状付加反応(SPAAC)において共有結合的に反応することができる);
(c)任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換されたテトラアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応(SPIEDAC)において共有結合的に反応することができる);
(d)任意に置換されたテトラジニル基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応(SPIEDAC)において共有結合的に反応することができる)。
(a)アジド基、ニトリルオキシド官能基(すなわち、式で表される基、ニトロン官能基又はジアゾカルボニル基)から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン-アジド環状付加反応(SPAAC)において共有結合的に反応することができる);
(b)任意に置換された歪のあるアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、アジド基、ニトリルオキシド官能基から選択される基を含む(又は本質的になる)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進アルキン-アジド環状付加反応(SPAAC)において共有結合的に反応することができる);
(c)任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換されたテトラアルキニル基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応(SPIEDAC)において共有結合的に反応することができる);
(d)任意に置換されたテトラジニル基を含む(又は本質的にそれから成る)ドッキング基と、任意に置換された歪のあるアルキニル基、任意に置換された歪のあるアルケニル基及びノルボルネニル基から選択される基を含む(又は本質的にそれから成る)標識基との組み合わせ(これらの基は、銅フリー歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応(SPIEDAC)において共有結合的に反応することができる)。
任意に置換された歪のあるアルキニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたtrans-シクロオクテニル基(例えば、WO2012/104422及びWO2015/107064に記載のもの)が挙げられる。任意に置換された歪のあるアルケニル基としては、これらには限定されないが、任意に置換されたシクロオクチニル基(例えば、WO2012/104422及びWO2015/107064に記載のもの)が挙げられる。任意に置換されたテトラジニル基としては、これらには限定されないが、WO2012/104422及びWO2015/107064に記載のものが挙げられる。
アジド基は式-N3の基である。
ニトロン官能基は、式-C(Rx)=N+(Ry)-O-の基である。式中、Rx及びRyは有機残基、例えば本明細書に記載のC1-C6-アルキルから独立して選択される残基である。
ニトロン官能基は、式-C(Rx)=N+(Ry)-O-の基である。式中、Rx及びRyは有機残基、例えば本明細書に記載のC1-C6-アルキルから独立して選択される残基である。
ジアゾカルボニル基は、式-C(O)-CH=N2の基である。
ニトリルオキシド官能基は、式-C≡N+-O-又は好ましくは、式-C=N+(Rx)-O-の基である。式中、Rxは有機残基、例えば本明細書に記載のC1-C6-アルキルから選択される残基である。
ニトリルオキシド官能基は、式-C≡N+-O-又は好ましくは、式-C=N+(Rx)-O-の基である。式中、Rxは有機残基、例えば本明細書に記載のC1-C6-アルキルから選択される残基である。
「シクロオクチニル」は、環構造中に8個の炭素原子及び1個の三重結合を有する不飽和脂環式基である。
「trans-シクロオクテニル」は、環構造中に8個の炭素原子及びトランス配置の1個の二重結合を有する不飽和脂環式基である。
「テトラジニル」は、4個の窒素環原子及び2個の炭素環原子を有する6員単環式芳香族基である。
「trans-シクロオクテニル」は、環構造中に8個の炭素原子及びトランス配置の1個の二重結合を有する不飽和脂環式基である。
「テトラジニル」は、4個の窒素環原子及び2個の炭素環原子を有する6員単環式芳香族基である。
特に指示のない限り、用語「置換された」は、基が1、2又は3個、特に1又は2個の置換基で置換されていることを意味する。特定の実施形態において、これらの置換基は、水素、ハロゲン、C1-C4-アルキル,(RaO)2P(O)O-C1-C4-アルキル,(RbO)2P(O)-C1-C4-アルキル,CF3,CN,ヒドロキシル,C1-C4-アルコキシ,-O-CF3,C2-C5-アルケノキシ,C2-C5-アルカノイルオキシ,C1-C4-アルキルアミノカルボニルオキシ又はC1-C4-アルキルチオ,C1-C4-アルキルアミノ,ジ-(C1-C4-アルキル)アミノ,C2-C5-アルケニルアミノ,N-C2-C5-アルケニル-N-C1-C4-アルキル-アミノ及びジ-(C2-C5-アルケニル)アミノ(式中、Ra及びRbは独立して水素もしくはC2-C5-アルカノイルオキシメチルである)から独立して選択することができる。
ハロゲンという用語は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。
C1-C4-アルキルは、1~4個、特に1~3個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。例としては、メチル並びにエチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、2-ブチル、イソブチル及びtert-ブチル等のC2-C4-アルキルが挙げられる。
C1-C4-アルキルは、1~4個、特に1~3個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。例としては、メチル並びにエチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、2-ブチル、イソブチル及びtert-ブチル等のC2-C4-アルキルが挙げられる。
C2-C5-アルケニルは、2、3、4又は5個の炭素原子を有する単一不飽和炭化水素基である。例としては、ビニル,アリル(2-プロペン-1-イル),1-プロペン-1-イル,2-プロペン-2-イル,メタリル(2-メチルプロパ-2-エン-1-イル),1-メチルプロパ-2-エン-1-イル,2-ブテン-1-イル,3-ブテン-1-イル,2-ペンテン-1-イル,3-ペンテン-1-イル,4-ペンテン-1-イル,1-メチルブタ-2-エン-1-イル及び2-エチルプロパ-2-エン-1-イルが挙げられる。
C1-C4-アルコキシは、式R-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキル基である。
C2-C5-アルケノキシは、式R-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
C1-C4-アルコキシは、式R-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキル基である。
C2-C5-アルケノキシは、式R-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
C2-C5-アルカノイルオキシは、式R-C(O)-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C1-C4-アルキルアミノカルボニルオキシは、式R-NH-C(O)-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C1-C4-アルキルチオは、式R-S-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C1-C4-アルキルアミノカルボニルオキシは、式R-NH-C(O)-O-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C1-C4-アルキルチオは、式R-S-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C1-C4-アルキルアミノは、式R-NH-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
ジ-(C1-C4-アルキル)アミノは、式Rx-N(Ry)-の基である。式中、Rx及びRyは、独立して本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C2-C5-アルケニルアミノは、式R-NH-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
ジ-(C1-C4-アルキル)アミノは、式Rx-N(Ry)-の基である。式中、Rx及びRyは、独立して本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
C2-C5-アルケニルアミノは、式R-NH-の基である。式中、Rは本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
N-C2-C5-アルケニル-N-C1-C4-アルキルアミノは、式Rx-N(Ry)-の基である。式中、Rxは本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルであり、RyはC1-C4-アルキルである。
ジ-(C2-C5-アルケニル)アミノは、式Rx-N(Ry)-の基である。式中、Rx及びRyは、独立して本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
C2-C5-アルカノイルオキシメチルは、式Rx-C(O)-O-CH2-の基である。式中、Rxは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
ジ-(C2-C5-アルケニル)アミノは、式Rx-N(Ry)-の基である。式中、Rx及びRyは、独立して本明細書で定義されるC2-C5-アルケニルである。
C2-C5-アルカノイルオキシメチルは、式Rx-C(O)-O-CH2-の基である。式中、Rxは本明細書で定義されるC1-C4-アルキルである。
本発明の文脈で使用されるncAAは、それらの塩の形で使用することができる。本明細書に記載のncAAの塩は、酸又は塩基付加塩、特に生理学的に許容される酸又は塩基との付加塩を意味する。生理学的に許容される酸付加塩は、塩基型のncAAを適切な有機酸又は無機酸で処理することによって形成できる。酸性プロトンを含有するncAAは、適切な有機及び無機塩基で処理することによってそれらの無毒性の金属又はアミン付加塩の形態に変換できる。また本発明の文脈で記載されているncAA及びその塩は、それらの水和物及び溶媒付加形態、例えば、水和物、アルコラート等をも含む。
生理学的に許容される酸又は塩基は、特に、ncAA残基を有するPOIの調製に使用される翻訳システムにより許容されるものである。例えば、生きた真核細胞に対して実質的に無毒である。
本発明の文脈において有用なncAA及びその塩は、当技術分野において周知であり、例えば本明細書に引用した様々な刊行物に記載の方法と同様に調製することができる。
カップリング相手分子の性質は使用目的に依存する。例えば、POIは、イメージング法に適した分子と結合していてもよく、又は生物活性分子と結合して機能化されていてもよい。例えば、ドッキング基に加えて、カップリング相手分子は、これらには限定されないが、下記から選択される基を有することができる:色素(例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、BODIPY又はシアニン色素等の蛍光色素、発光色素又は燐光色素);試薬と接触して蛍光を発することができる分子;発色団(例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビン等);放射性標識(例えば、水素、フッ素、炭素、リン、硫黄又はヨウ素の放射性形態、例えば、トリチウム、18F,11C,14C,32P,33P,33S,35S,11In,125I,123I,131I,212B,90Y又は186Rh等);MRI感受性スピン標識;親和性タグ(例えば、ビオチン、Hisタグ、Flagタグ、Strepタグ、糖、脂質、ステロール、PEGリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン又は補助因子);ポリエチレングリコール基(例えば、分岐状PEG、線状PEG、様々な分子量のPEG等);光架橋剤(p-アジドヨードアセトアニリド等);NMRプローブ;X線プローブ;pHプローブ;IRプローブ;樹脂;固体支持体及び生物活性化合物(例えば、合成薬)。適切な生物活性化合物としては、これらには限定されないが、細胞傷害性化合物(例えば、癌化学療法化合物)、抗ウイルス化合物、生物学的応答調節剤(例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン等)、微小管作用薬、ホルモン調節剤及びステロイド化合物等が挙げられる。有用なカップリング相手分子の具体例としては、これらには限定されないが、受容体/リガンド対の構成要素、抗体/抗原対の構成要素、レクチン/炭水化物対の構成要素、酵素/基質対の構成要素、ビオチン/アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、及び、ジゴキシン/抗ジゴキシンが挙げられる。
特に、本明細書に記載のクリック反応により、結合相手分子(のドッキング基)にin situで共有結合する特定のncAA残基(の標識基)の能力は、POIを発現させる真核細胞内又は組織内でそのncAA残基を有するPOIを検出するために、そしてPOIの分布と結末を研究するために使用できる。したがって、例えば、真核細胞における発現によってPOIを調製するための本発明の方法は、細胞又はその細胞の組織内のPOIを検出するために超解像顕微鏡法(SRM)と組み合わせることができる。いくつかのSRM法が当技術分野において公知であり、本発明の真核細胞によって発現されるPOIを検出するためにクリックケミストリーを利用するように適合させることができる。そのSRM法の具体例としては、DNA-PAINT(ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのためのDNA点集積(DNA point accumulation);例えば、Jungmann et al.,Nat Methods 11:313-318,2014に記載)、dSTORM(直接確率的光学再構築顕微鏡法)及びSTED(誘導放出抑制)顕微鏡法が挙げられる。
7.本発明の真核細胞
本発明の真核細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載のpRSをコードし、ptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入することにより作製できる。そして、1つの態様において、真核細胞に導入されるポリヌクレオチドは、dsRNA結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本発明の真核細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載のpRSをコードし、ptRNA又はptRNA-リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを導入することにより作製できる。そして、1つの態様において、真核細胞に導入されるポリヌクレオチドは、dsRNA結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
任意に、導入されたポリヌクレオチドは、さらに本明細書に記載のtetO結合タンパク質及び/又は構成的RNAポリメラーゼ(例えば、T7RNAP)をコードするヌクレオチド配列を含む。前記ヌクレオチド配列は、同一のポリヌクレオチド上に位置することも、2つ以上の異なるポリヌクレオチド上に分布することも可能である。
本発明の真核細胞は、哺乳類細胞(例えば、ヒト、マウス、ラット、カニクイザル細胞)、鳥類細胞(例えば、ニワトリ細胞)、昆虫細胞、酵母細胞及び植物細胞から選択することができるが、それらに限定されるものではない。本発明の真核細胞は、個々の細胞として存在してもよいし、組織の一部(例えば、(培養)組織、器官又は生体全体の中の細胞)であってもよい。
アミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を含むPOIは、真核細胞、特に本発明の真核細胞を用いて、本発明にしたがって調製することができる。真核細胞は、pRSがptRNAをアシル化できるという点で対となっているpRSとptRNAを発現させる。特定の実施形態では、ptRNAは、本明細書に記載のptRNA-リボザイムの形態で発現する。
真核細胞は、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、さらにPOIを発現させる。この目的のために、真核細胞は、発現されるべきpRS、ptRNA及びPOIをコードするポリヌクレオチドを含み、さらに前記ncAA又はその塩を(例えば、供給により)含む。前記pRS、ptRNA及び/又はPOIの1つの発現がTREの制御下にある場合、真核細胞は、好適には、本明細書に記載のように用いられるそれぞれのTREに一致するように選択されるtetO結合タンパク質をさらに発現させる。そして真核細胞を、本明細書に記載のテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と(例えば、これらを含む培地で培養して)接触させる。
TRE制御発現の誘導を含む、真核細胞内での組換え発現は、当技術分野における標準的な手段である。したがって、当業者は、目的の発現産物(ここでは、少なくともptRNA、pRS及びPOI)の(組換え)発現を可能にするように、真核細胞を培養する条件を選択することが十分に可能である。細胞の種類に応じて、液体培地を用いて培養することができる。培養は、バッチ式でも、セミバッチ式でも、連続式でもよい。栄養分は、培養の初期に供給することも、後から半連続的又は連続的に供給することもできる。
本発明の方法に従ってPOI(標的ポリペプチド)を作製するために、真核細胞を好適な条件下で、好ましくはncAA又はその塩の存在下(例えば、それを含む培地中)で、細胞のリボソームにおける翻訳を可能とするのに適した時間の間、培養する。
POIをコードするポリヌクレオチド(及び任意に、他の要素pRS、ptRNAなど)に応じて、例えばアラビノース、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)又はTRE制御発現の場合には、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、又はそれらの機能的類似体等の転写を誘導する化合物を添加することによって発現を誘導することが必要となりうる。POIをコードする(そして、ptRNAに含まれるアンチコドンの逆相補体である1つ以上のコドンを含む)mRNAは、リボソームと結合する。
次いで、それぞれのアミノアシルtRNAが認識(結合)するコドンがコードする位置に、アミノ酸及びncAAが段階的に結合することによりPOIが形成される。この結果、ncAAは、ptRNAに含まれるアンチコドンの逆相補体である(セレクタ)コドンがコードする位置で、POIに組み込まれる。
本明細書に記載の1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を含むPOIを調製するために使用される真核細胞は、pRS、ptRNA、POI及び/又はさらなる要素、例えば本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチド及び/又はtetO結合ポリペプチドなどをコードするポリヌクレオチドを真核(宿主)細胞に導入することによって産生できる。前記ヌクレオチド配列は、別々の核酸分子(ベクター)上又は同じ核酸分子(例えば、ベクター)上に、任意の組み合わせで位置することができ、組み合わせて又は順々に細胞内に導入することができる。
好ましくは、記載した核酸分子をそれぞれの細胞に導入するために、当業者に知られている一般的なクローニング及びトランスフェクション技術(例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス媒介遺伝子送達、リポフェクション、マイクロインジェクション等)が使用される。好適な技術は、例えば下記文献に記載されている:Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel et al.,Ed.,Wiley Interscience,New York 1997;又は、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989。
翻訳後、本発明に従って調製されたPOIは、任意に、真核細胞から回収することができる。又は分泌される場合には培養液から回収することができる。そして、当技術分野で一般に知られている手順に従って、部分的にもしくは十分に、均質になるように精製することができる。この目的のために、POIは、当業者に知られ、当業者によって使用される手順に従って、部分的にもしくは十分に、均質になるように回収及び精製することができる。
標的ポリペプチドが培地に分泌されない限り、回収は通常、細胞破壊を必要とする。細胞破壊の方法は当技術分野において周知であり、例えば超音波(ultrasound)処理による物理的破壊、(例えば、フレンチプレスを用いた)液体剪断破壊、機械的方法(例えばブレンダーもしくは粉砕機を利用するもの)又は、凍結融解サイクル、並びに、脂質-脂質、タンパク質-タンパク質及び/又はタンパク質-脂質の相互作用を破壊する薬剤(洗剤等)を用いた化学的溶解、並びに、物理的破壊技術と化学的溶解の組み合わせを挙げることができる。細胞溶解物又は培地からポリペプチドを精製するための標準的な手順もまた当技術分野で周知である。例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、正しく折り畳まれた成熟タンパク質を作製する際に用いることができる。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法は、高純度が望まれる最終精製工程において使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬として、すなわちポリペプチドの親和性に基づく精製に使用することができる。様々な精製/タンパク質折り畳み法が当技術分野において周知である。例えば、Scopes,Protein Purification,Springer,Berlin(1993);Deutscher,Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification,Academic Press(1990);及び本明細書中に引用する参考文献に記載のものが挙げられる。
すでに述べたように、当業者は、合成、発現及び/又は精製の後、ポリペプチドが関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有する場合があることを認識するであろう。例えば、過剰発現したポリペプチド、及び原核細胞システムにより産生されたポリペプチドは、しばしばカオトロピック剤への曝露により最適化され、適切な折り畳みを達成する。
例えばE.coli由来の溶解物からの精製中に、発現したポリペプチドは、必要に応じて変性され、次いで復元される。これは、例えばグアニジンHCl等のカオトロピック剤の中にタンパク質を可溶化することにより達成される。一般に、発現したポリペプチドを変性及び破壊し、次いでポリペプチドを好ましい立体構造にリフォールディングすることが時には望ましい。例えば、グアニジン、尿素、DTT、DTE及び/又はシャペロニンを目的の翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び復元する方法は当業者に周知である。ポリペプチドは、例えば酸化型グルタチオン及びL-アルギニンを含有するレドックス緩衝液中でリフォールディングすることができる。
本発明の方法によって発現したPOIは、公知の技術、例えば、Q-セファロース(商品名)クロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー(ゲルろ過)、イオン交換クロマトグラフィー、及び疎水性クロマトグラフィー、並びに、限外ろ過、結晶化、塩析、透析、及びネイティブゲル電気泳動などの一般的な別のタンパク質精製技術等によって精製することが可能である。好適な方法は、例えば下記文献に記載されている:Cooper,T.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemical processes],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York:又は、Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin。
POIを単離するために、POIを、より容易な精製に役立つ可能性のあるタグと連結することが有利であろう。これは、対応するタグをコードする配列を、POIをコードするヌクレオチド配列に導入することによって達成することができる。タンパク質精製のための適切なタグは、当技術分野において周知であり、例えば、ヒスチジンタグ(例えば、His6タグ)及び抗体の抗原として認識できるエピトープ(例えば、Harlow,E. and Lane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Pressに記載)が挙げられる。これらのタグは、タンパク質を固体担体、例えばポリマーマトリックス(例えばクロマトグラフィーカラムの充填物として使用することができ、又はマイクロタイタープレート上もしくは他の担体上で使用することができる)に付着させるのに役立つ場合がある。
POIに連結されたタグは、POIを検出するために機能することもできる。タンパク質検出用のタグは、当技術分野において周知であり、例えば、蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー等が挙げられる。
また、本発明の方法によって生産されるPOIも記載される。当該POIは、本明細書に記載の真核細胞を利用する本発明の方法によって調製することができる。
8.キット
また、本発明は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有するPOIを調製するためのキットを提供する。本発明のキットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、又はその塩を含む。さらに本発明のキットは、本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドの組み合わせ、及び/又は本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び/又は本発明の真核細胞を含むことができる。
また、本発明は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有するPOIを調製するためのキットを提供する。本発明のキットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、又はその塩を含む。さらに本発明のキットは、本発明のポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドの組み合わせ、及び/又は本明細書に記載のdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び/又は本発明の真核細胞を含むことができる。
さらにキットは、容易に検出可能な(例えば蛍光)レポーターポリペプチドをコードする1つ以上のレポーターコンストラクトを含むことができる。レポーターコンストラクトは、レポーターポリペプチドのコード化配列に位置する少なくとも1つのセレクタコドンを含む。前記セレクタコドンによってコードされる位置にアミノ酸又はncAAをうまく組み込むことによって、レポーターポリペプチドの翻訳合成が可能となる。
本発明のキットは、本明細書に記載のncAA残基含有POIを調製するための本発明の方法において使用することができる。
9.具体的な実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態を示す:
1)第1の実施形態によれば、本発明は、以下を含む真核細胞に関する:
(a)原核生物のアミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド;
(b)原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
該真核細胞では、
pRSは、ptRNAをアシル化することができ、
ptRNA及びリボザイムをコードする配列が、転写によってptRNA及びリボザイムの両方を含むRNA分子(ptRNA-リボザイム)を生成するように連結されている。
本発明は、以下の特定の実施形態を示す:
1)第1の実施形態によれば、本発明は、以下を含む真核細胞に関する:
(a)原核生物のアミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド;
(b)原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド。
該真核細胞では、
pRSは、ptRNAをアシル化することができ、
ptRNA及びリボザイムをコードする配列が、転写によってptRNA及びリボザイムの両方を含むRNA分子(ptRNA-リボザイム)を生成するように連結されている。
第2の実施形態は、リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Varkud satelliteリボザイム、グルコサミン-6-リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムから選択される、実施形態1の真核細胞に関する。
第3の実施形態は、リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムである、実施形態1又は実施形態2の真核細胞に関する。
第4の実施形態は、実施形態1~3のいずれか1つの真核細胞に関する:
該真核細胞では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
該真核細胞では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
第5の実施形態は、pRSコード化配列の転写がテトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御される、実施形態1~4のいずれか1つの真核細胞に関する。
第6の実施形態は、テトラサイクリンオペレーター(tetO)配列に結合するタンパク質(tetO結合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、tetO結合タンパク質が以下からなる群から選択される、実施形態4又は実施形態5の真核細胞に関する:
(i)テトラサイクリンリプレッサー(tetR);
(ii)テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA);及び
(iii)リバースtTA(rtTA)。
(i)テトラサイクリンリプレッサー(tetR);
(ii)テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA);及び
(iii)リバースtTA(rtTA)。
第7の実施形態は、実施形態1~6のいずれか1つの真核細胞に関する:
該真核細胞では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御される、及び/又は
(ii)pRSコード化配列の転写がT7プロモーターによって制御され、
該真核細胞は、さらに以下を含む:
(c)T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)をコードするポリヌクレオチド。
該真核細胞では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御される、及び/又は
(ii)pRSコード化配列の転写がT7プロモーターによって制御され、
該真核細胞は、さらに以下を含む:
(c)T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)をコードするポリヌクレオチド。
第8の実施形態は、T7RNAPの発現がTREによって制御される、実施形態7の真核細胞に関する。
第9の実施形態は、実施形態7又は実施形態8の真核細胞に関し、T7RNAPは以下を有する:
(i)核局在化シグナル(NLS);又は、
(ii)核搬出シグナル(NES);又は、
(iii)NES及びNLSを有さない。
(i)核局在化シグナル(NLS);又は、
(ii)核搬出シグナル(NES);又は、
(iii)NES及びNLSを有さない。
第10の実施形態は、下記実施形態11~13のいずれか1つで定義されたdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態1~9のいずれか1つの真核細胞に関する。
第11の実施形態は、以下を含む真核細胞に関する:
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド;
(b)原核生物tRNA(ptRNA)をコードするポリヌクレオチド;及び、
(c)二本鎖RNAに結合可能なポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)をコードし、配列番号37及び57~59のいずれか1つに示す配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
(a)原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド;
(b)原核生物tRNA(ptRNA)をコードするポリヌクレオチド;及び、
(c)二本鎖RNAに結合可能なポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)をコードし、配列番号37及び57~59のいずれか1つに示す配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
第12の実施形態は、dsRNA結合ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列が、配列番号38に示す配列に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する、実施形態11の真核細胞に関する。
第13の実施形態は、dsRNA結合ポリペプチドが、真核生物開始因子2α(eIF-2α)をリン酸化することができない、実施形態11又は実施形態12の真核細胞に関する。
第14の実施形態は、実施形態11~13のいずれか1つの真核細胞に関する:
該真核細胞では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は、
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
該真核細胞では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は、
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
第15の実施形態は、実施形態11~14のいずれか1つの真核細胞に関する:
該真核細胞では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は、
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
該真核細胞では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は、
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される。
第16の実施形態は、テトラサイクリンオペレーター(tetO)配列に結合するタンパク質(tetO結合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、tetO結合タンパク質が以下からなる群から選択される、実施形態14又は実施形態15の真核細胞に関する:
(i)テトラサイクリンリプレッサー(tetR);
(ii)テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA);及び
(iii)リバースtTA(rtTA)。
(i)テトラサイクリンリプレッサー(tetR);
(ii)テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA);及び
(iii)リバースtTA(rtTA)。
第17の実施形態は、実施形態11~16のいずれか1つの真核細胞に関する:
該真核細胞では、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は、
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方、であり、
該真核細胞は、さらに以下を含む:
(c)T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)をコードするポリヌクレオチド。
該真核細胞では、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は、
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方、であり、
該真核細胞は、さらに以下を含む:
(c)T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)をコードするポリヌクレオチド。
第18の実施形態は、T7RNAPの発現がTREによって制御される、実施形態17の真核細胞に関する。
第19の実施形態は、実施形態17又は実施形態18の真核細胞に関し、T7RNAPは以下を有する:
(i)核局在化シグナル(NLS);又は、
(ii)核搬出シグナル(NES);又は、
(iii)NES及びNLSを有さない。
(i)核局在化シグナル(NLS);又は、
(ii)核搬出シグナル(NES);又は、
(iii)NES及びNLSを有さない。
第20の実施形態は、真核細胞が実施形態1~9のいずれか1つの細胞である、実施形態11~13のいずれか1つの真核細胞に関する。
第21の実施形態は、実施形態1~4及び7のいずれか1つに定義される、ptRNA及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするポリヌクレオチドに関する:
より詳細には、
a)リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムであり;又は、
b)ptRNAが、Methanosarcina種、特にM.mazeiのピロリジルtRNAに由来する;又は、
c)ptRNA分子が、3’末端アミノアシル受容体幹モチーフCCAを欠いてコードされる;又は、
d)ptRNAが、以下のヌクレオチド配列(配列番号:60)ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactxxxaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccg(xxxはアンチコドンをコードする)によってコードされる。
より詳細には、
a)リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムであり;又は、
b)ptRNAが、Methanosarcina種、特にM.mazeiのピロリジルtRNAに由来する;又は、
c)ptRNA分子が、3’末端アミノアシル受容体幹モチーフCCAを欠いてコードされる;又は、
d)ptRNAが、以下のヌクレオチド配列(配列番号:60)ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactxxxaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccg(xxxはアンチコドンをコードする)によってコードされる。
第22の実施形態は、実施形態1~4及び7のいずれか1つに定義される、ptRNA及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするヌクレオチド配列;及び、
(i)実施形態6に定義されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)実施形態1、5及び7のいずれか1つに定義されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方、
を含むポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関する。
(i)実施形態6に定義されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)実施形態1、5及び7のいずれか1つに定義されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方、
を含むポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせに関する。
第23の実施形態は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製する方法に関する:
該方法は、以下の工程を含み:
(a)真核細胞内で、
- 原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS);及び、
- 原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子、
を発現させる工程;
並びに、同時又は順々に、
(b)真核細胞内で、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、POIを発現させる工程;及び、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程;
pRSは、ptRNAをncAA又はその塩でアシル化することが可能であり、
POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である。
該方法は、以下の工程を含み:
(a)真核細胞内で、
- 原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS);及び、
- 原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子、
を発現させる工程;
並びに、同時又は順々に、
(b)真核細胞内で、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、POIを発現させる工程;及び、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程;
pRSは、ptRNAをncAA又はその塩でアシル化することが可能であり、
POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である。
第24の実施形態は、リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Varkud satelliteリボザイム、グルコサミン-6-リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムから選択される、実施形態23の方法に関する。
第25の実施形態は、リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムである、実施形態23又は実施形態24の方法に関する。
T7制御全般
第26の実施形態は、ptRNA-リボザイムの転写合成がT7プロモーターによって制御される、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
さらに該方法は、(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる工程を含む。
第26の実施形態は、ptRNA-リボザイムの転写合成がT7プロモーターによって制御される、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
さらに該方法は、(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる工程を含む。
T-REXシステム(tetR、+tet/dox)
第27の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAリボザイムの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
ptRNA-リボザイムの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第27の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAリボザイムの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
ptRNA-リボザイムの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第28の実施形態は、実施形態23~25及び27のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)により制御される;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、RNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
pRSの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)により制御される;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、RNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
pRSの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
第29の実施形態は、実施形態27又は実施形態28の方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でtetRを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法は、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でtetRを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
Tet-Offシステム(tTA、-tet/dox)
第30の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)ptRNA-リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)ptRNA-リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ptRNA-リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第30の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)ptRNA-リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)ptRNA-リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ptRNA-リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第31の実施形態は、実施形態23~25及び30のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、TREによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)pRSの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)pRSの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってpRSコード化配列の転写を抑制し、次いで、pRSコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、TREによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)pRSの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)pRSの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってpRSコード化配列の転写を抑制し、次いで、pRSコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第32の実施形態は、実施形態30又は実施形態31の方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む:
(3)(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
(4)T7RNAPの発現の前に、及びそれと同時に、tTAを真核細胞内で発現させる工程;及び
(5)T7RNAPの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってT7RNAPコード化配列の転写を抑制し、次いで、T7RNAPコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む:
(3)(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
(4)T7RNAPの発現の前に、及びそれと同時に、tTAを真核細胞内で発現させる工程;及び
(5)T7RNAPの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってT7RNAPコード化配列の転写を抑制し、次いで、T7RNAPコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
Tet-Onシステム(rtTA、+dox)
第33の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
ptRNA-リボザイムの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第33の実施形態は、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
ptRNA-リボザイムの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む。
第34の実施形態は、実施形態23~25及び33のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
pRSの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
pRSの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
第35の実施形態は、実施形態33又は実施形態34の方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でrtTAを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法は、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でrtTAを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
第36の実施形態は、さらに下記工程を含む、実施形態23~25のいずれか1つの方法に関する:
真核細胞内で、実施形態11~13のいずれか1つに定義されるdsRNA結合ポリペプチドを発現させる工程。
真核細胞内で、実施形態11~13のいずれか1つに定義されるdsRNA結合ポリペプチドを発現させる工程。
第37の実施形態は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製する方法に関する:
該方法は、以下の工程を含み:
(a)真核細胞内で、
- 原核生物のアミノアシルtRNA合成酵素(pRS);
- 原核生物tRNA(ptRNA);及び
- 二本鎖RNAに結合できるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)、
を発現させる工程;
並びに、同時又は順々に、
(b)真核細胞内で、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、POIを発現させる工程;及び、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程;
pRSは、ptRNAをncAA又はその塩でアシル化することが可能であり、
dsRNA結合ポリペプチドは、配列番号37、及び57~59のいずれか1つに示す配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である。
該方法は、以下の工程を含み:
(a)真核細胞内で、
- 原核生物のアミノアシルtRNA合成酵素(pRS);
- 原核生物tRNA(ptRNA);及び
- 二本鎖RNAに結合できるポリペプチド(dsRNA結合ポリペプチド)、
を発現させる工程;
並びに、同時又は順々に、
(b)真核細胞内で、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、POIを発現させる工程;及び、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程;
pRSは、ptRNAをncAA又はその塩でアシル化することが可能であり、
dsRNA結合ポリペプチドは、配列番号37、及び57~59のいずれか1つに示す配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である。
第38の実施形態は、dsRNA結合ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列が、配列番号38に示す配列に対して、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する、実施形態37の方法に関する。
第39の実施形態は、dsRNA結合ポリペプチドが、真核生物開始因子2α(eIF-2α)をリン酸化することができない、実施形態37又は実施形態38の方法に関する。
T7制御全般
第40の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は、(i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる工程を含む。
第40の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は、(i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる工程を含む。
T-REXシステム(tetR、+tet/dox)
第41の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
ptRNAの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってptRNAの転写合成を誘導することを含む。
第41の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;
ptRNAの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってptRNAの転写合成を誘導することを含む。
第42の実施形態は、実施形態37~39及び41のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
第43の実施形態は、実施形態41又は実施形態42の方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でtetRを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でtetRを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
Tet-Offシステム(tTA、-tet/dox)
第44の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)ptRNAの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)ptRNAの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってptRNAの転写合成を抑制し、次いで、ptRNAの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第44の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)ptRNAの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)ptRNAの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってptRNAの転写合成を抑制し、次いで、ptRNAの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第45の実施形態は、実施形態37~39及び44のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、TREによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)pRSの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)pRSの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってpRSコード化配列の転写を抑制し、次いで、pRSコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、TREによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され、
さらに該方法は下記工程を含む:
(1)pRSの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)pRSの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってpRSコード化配列の転写を抑制し、次いで、pRSコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
第46の実施形態は、実施形態44又は実施形態45の方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む:
(3)(i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
(4)T7RNAPの発現の前に、及びそれと同時に、tTAを真核細胞内で発現させる工程;及び
(5)T7RNAPの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってT7RNAPコード化配列の転写を抑制し、次いで、T7RNAPコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含む:
(3)(i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
(4)T7RNAPの発現の前に、及びそれと同時に、tTAを真核細胞内で発現させる工程;及び
(5)T7RNAPの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってT7RNAPコード化配列の転写を抑制し、次いで、T7RNAPコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。
Tet-Onシステム(rtTA、+dox)
第47の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
ptRNAの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってptRNAの転写合成を誘導することを含む。
第47の実施形態は、実施形態37~39のいずれか1つの方法に関する:
該方法では、
(i)ptRNAの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNAがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;
ptRNAの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってptRNAの転写合成を誘導することを含む。
第48の実施形態は、実施形態37~39及び47のいずれか1つの方法であるる:
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法では、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む。
第49の実施形態は、実施形態47又は実施形態48の方法に関する:
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でrtTAを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
該方法は、
(i)ptRNAの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNAもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でrtTAを発現させる工程;
T7RNAPの発現は、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む。
第50の実施形態は、ptRNAが、1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)をさらに含むRNA分子の一部を発現させる、実施形態37~49のいずれか1つの方法に関する。
第51の実施形態は、実施形態50の方法に関し、該方法は、実施形態23~35のいずれか1つの方法である。
第52の実施形態は、そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製するためのキットに関する:
該キットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、又はその塩;及び
(a)実施形態21のポリヌクレオチド;又は
(b)実施形態22のポリヌクレオチド、もしくは2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ;又は
(c)実施形態11~13のいずれか1つに定義されるdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
(d)実施形態1~20のいずれか1つの真核細胞、
を含む。
該キットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、又はその塩;及び
(a)実施形態21のポリヌクレオチド;又は
(b)実施形態22のポリヌクレオチド、もしくは2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ;又は
(c)実施形態11~13のいずれか1つに定義されるdsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;又は
(d)実施形態1~20のいずれか1つの真核細胞、
を含む。
次に、以下の実験セクションの特定の非限定的な実施形態を参照することにより、本発明をより詳細に説明する。
材料と方法
特に明記しない限り、組換えポリペプチドのクローニング及び発現は、例えばSambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載されている標準的な方法で実施した。
特に明記しない限り、組換えポリペプチドのクローニング及び発現は、例えばSambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載されている標準的な方法で実施した。
A)クローニング
レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His(配列番号:39)は、Nikicら(Angew Chem Int Ed Engl 2016,55:16172-16176)に記載されているように、pCIプラスミド(Promega)にクローニングした。NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6Hisは、GFPの39位がアンバー終止コドンTAGによってコードされるGFPに融合されたiRFP(iRFP-GFPY39TAG)を含む。
レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His(配列番号:39)は、Nikicら(Angew Chem Int Ed Engl 2016,55:16172-16176)に記載されているように、pCIプラスミド(Promega)にクローニングした。NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6Hisは、GFPの39位がアンバー終止コドンTAGによってコードされるGFPに融合されたiRFP(iRFP-GFPY39TAG)を含む。
NESシグナルを有する又は有さないT7 RNAポリメラーゼ遺伝子(NES-T7RNAP又はT7RNAP)のコード化配列を、pcDNA3.1プラスミド又はpCAGGSプラスミドに挿入した。pcDNA3.1プラスミドとpCAGGSプラスミドは、プロモーターが異なる。pcDNA3.1プラスミドはCMVプロモーターを含む。pCAGGSプラスミドは、ニワトリアクチンプロモーターとイントロンを有するCMVエンハンサーを含む(配列番号:56)
構成的発現のために、T7RNAPコード化配列又はNES-T7RNAPコード化配列は、CMVプロモーター(pcDNA3.1プラスミド)の下流、又はニワトリアクチンプロモーターとイントロン(pCAGGSプラスミド)の下流に挿入された。T-RExシステムを介した誘導性発現のために、NES-T7RNAPコード化配列は、2つのtetO配列を含む「T-REx」プロモーター(配列番号:12、ThermoFisher Scientific)の下流に挿入された。Tet-Onシステムを介した誘導性発現のために、NES-T7RNAPコード化配列は、8つのtetO配列を含む「Tet-On」プロモーター(配列番号:10)の下流に挿入された。NES-T7RNAPの構成的「T-REx」及び「Tet-On」発現のための発現カセットを、それぞれ配列番号40~43に示す。
構成的発現のために、NESシグナルを有する又は有さないPylRSAF(Methanosarcina mazei由来)のコード化配列(NES-PylRSAF又はPylRSAF)を、CMVプロモーターの下流のpcDNA3.1プラスミド(Invitrogen)に挿入した。T-RExシステムを介した誘導性発現のために、NES-PylRSAFコード化配列を、2つのtetO配列を含む「T-REx」プロモーター(配列番号:12、ThermoFisher Scientific)の下流でプラスミドpDESTに挿入した。
Tet-Onシステムを介した誘導性発現のために、NES-PylRSAFコード化配列を、8個のtetO配列を含む「Tet-On」プロモーター(配列番号:10)の下流でpcDNA3.1プラスミドに挿入した。NES-PylRSAFの構成的「T-REx」及び「Tet-On」発現のための発現カセットを、それぞれ配列番号44~47に示す。
tRNAPylのT7プロモーター制御発現カセット(配列番号:48)は、tRNAPylコード化配列の上流にT7プロモーター配列をクローニングし、tRNAPylコード化配列の下流にT7終止シグナルをクローニングし、この発現カセットをp2RZプラスミドに挿入して生成した(Avisら,Methods Mol Biol.941:83-98,2012;(図1参照))。HDVリボザイムを有するこの発現カセットの変異体(tRNAPyl-HDV)を、tRNAPylの直接下流にHDVリボザイムコード化配列を挿入するように、制限クローニング、部位特異的変異誘発、及び制限のないクローニングを組み合わせて生成した(配列番号:49、図1参照)。
T-RExシステムを介した誘導性発現のために、tRNAPylコード化配列をU6プロモーターの前に8個のtetO配列、後に2個のtetO配列を含むヒトU6プロモーター又は2個のtetO配列を含むヒトH1プロモーターのいずれかの変異体の下流で、プラスミドpUC57(U6プロモーターの場合)及びpPBEX(H1プロモーターの場合)に挿入することにより、tet誘導性プロモーターの制御下にある2つの異なる発現カセットを生成した(配列番号:50及び51)。
rtTA又はtetRの発現カセットは、CMVプロモーターの下流にrtTAコード化配列(配列番号:14)を含み、CMVプロモーターの下流にtetRコード化配列(配列番号:13)を含んだ。
ヒトプロテインキナーゼRのN末端dsRNA結合ドメイン(残基2-174)(「PKR(2-174)」)を、イントロンA(hCMV主要前初期(IE1)遺伝子の転写領域の最大のイントロンであり、タンパク質の発現を増強させる。サイトメガロウイルス(hCMV)は、ヒトβヘルペスウイルス5(HHV-5)とも呼ばれる;Chapman,B.S. et al NAR,1991,Vol.19,N0 14,2979-3986参照)を融合したCMVプロモーターの制御下でN末端HAタグとともに構成的発現のために、pI.18プラスミド(US 6,187,759 B1;hCMVプロモーター、イントロンA、ターミネーター配列、及び多重クローニング部位を含むpUCベースのプラスミド)にクローニングした。HA-PKR(2-174)のアミノ酸配列は、配列番号36に示す。
B)細胞培養とトランスフェクション
HEK293T細胞(ATCC CRL-3216)及びHEK Flp-In T-REx 293細胞(ThermoFisher Scientific、#R78007)を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma P0781、10,000U/mlペニシリン、10mg/mlストレプトマイシン、0.9%NaCl)、1%L-グルタミン(Sigma #G7513)、1%ピルビン酸ナトリウム(Life Technologies #11360)、及び10%Fetal Bovine Serum(FBS、Sigma #F7524)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies#41965-039)中で維持した。
HEK293T細胞(ATCC CRL-3216)及びHEK Flp-In T-REx 293細胞(ThermoFisher Scientific、#R78007)を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Sigma P0781、10,000U/mlペニシリン、10mg/mlストレプトマイシン、0.9%NaCl)、1%L-グルタミン(Sigma #G7513)、1%ピルビン酸ナトリウム(Life Technologies #11360)、及び10%Fetal Bovine Serum(FBS、Sigma #F7524)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Life Technologies#41965-039)中で維持した。
HEK Flp-In T-REx 293細胞について、メーカーのマニュアルに従って、培地にブラストサイジン(15μg/ml)を添加した。HEK Flp-In T-REx 293細胞株はHEK293細胞(ATCC CRL-1573)に由来し、構成型CMVプロモーターの制御下でtetリプレッサー(tetR)遺伝子を安定して発現する。ユーザーガイド「Growth and Maintenance of the Flp-InTM T-RExTM Cell Line」(カタログ番号:R780-07、文書部分番号:25-0369、出版番号:MAN0000187、改訂2.0、14.09.15、Gibco/Life Technologiesを参照のこと。
細胞を37℃、5% CO2雰囲気下で培養し、2~3日ごとに15~20継代まで継代した。
細胞はトランスフェクションの15~20時間前に播種し(約110,000個/ウェル)、24ウェルプレートの細胞培養プレートで、37℃、5% CO2雰囲気で70~80%の培養密度になるまで増殖させた。HEK TetOn-3G細胞のために、細胞培養プレートは、前もってポリリジン臭化水素酸塩で4~10時間コーティングした。3及び4回のプラスミドトランスフェクションでは、1.2μgの全DNA/ウェルを使用した。5又は6回のプラスミドトランスフェクションでは、1.5μgの全DNA/ウェルを使用した。トランスフェクションは、DNA対PEI比を1対3として、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて行った。
C)発現誘導とncAAの補給
トランスフェクションの4時間後に、培地を新鮮な培地に交換した。実験及びサンプルに応じて、前記新鮮な培地は、1μg/mlテトラサイクリン(T-RExシステム、tetR共発現システムにおける発現誘導用)又は1μg/mlドキシサイクリン(Tet-Onシステムにおける発現誘導用)及び/又は250μMの使用されるncAA(例えばBOC)を含むか、又はこれらのいずれも含まない(表示濃度=細胞培養における終濃度)。
トランスフェクションの4時間後に、培地を新鮮な培地に交換した。実験及びサンプルに応じて、前記新鮮な培地は、1μg/mlテトラサイクリン(T-RExシステム、tetR共発現システムにおける発現誘導用)又は1μg/mlドキシサイクリン(Tet-Onシステムにおける発現誘導用)及び/又は250μMの使用されるncAA(例えばBOC)を含むか、又はこれらのいずれも含まない(表示濃度=細胞培養における終濃度)。
次いで、細胞を37℃、5% CO2雰囲気で2日間培養し、その後、本明細書に記載の方法で解析した。
D)フローサイトメトリー分光法(FCS)による解析
細胞は1xPBSで1回洗浄し、フローサイトメトリー分光法で解析した。データの取得と解析は、BD LSRFortessa装置(BD Bioscience)とFlowJoソフトウェア(FlowJo)を用いて実施した。GFP蛍光は488nmレーザーを用いて530/30nmで検出し、iRFP蛍光は670nmレーザーを用いて730/45nmで検出し、取得した。
細胞は1xPBSで1回洗浄し、フローサイトメトリー分光法で解析した。データの取得と解析は、BD LSRFortessa装置(BD Bioscience)とFlowJoソフトウェア(FlowJo)を用いて実施した。GFP蛍光は488nmレーザーを用いて530/30nmで検出し、iRFP蛍光は670nmレーザーを用いて730/45nmで検出し、取得した。
測定されたイベントは、最初に生細胞のFSC-A x SSC-A散布図で、次に一重項のFSC-A x SSC-W散布図でゲーティングした。図では、一重項ゲートのイベントをGFPシグナル対iRFPシグナルのプロットとして示しており、4つの異なる種を示す4つの領域に分割している:左上はiRFP蛍光を持つ細胞(GFPを欠く);右上はiRFPとGFPの両方の蛍光を持つ細胞(全長タンパク質iRFP-GFPを発現、「ダブルポジティブサンプル」あるいは「DP」と呼ばれる)、右下はGFP蛍光を持つ細胞(iRFPを欠く)、左下はiRFPとGFPの両方を欠く細胞である。
レポーターNLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6Hisは、iRFP(赤外蛍光タンパク質)とGFP(緑色蛍光タンパク質)の融合体であり、GFPのアミノ酸位置39がアンバー(TAG)終止コドンでコードされている。適切にトランスフェクトされると細胞はiRFP(赤色蛍光として検出可能)を発現させ、アンバーコドンを抑制してncAA(ここではBOC又はSCO)をコードした場合のみ、さらにGFP(緑色蛍光として検出可能)を発現させる。したがって、細胞内の緑色蛍光(GFP)と赤色蛍光(iRFP)の比率は、アンバー抑制効率の指標となる。
実施例1:RNAリボザイムとして発現させたtRNAPylを用いたアンバー抑制
PKR(2-174)の存在下、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、及びncAA SCOを用いてアンバー抑制を試験した。
PKR(2-174)は、N-末端HAタグ(配列番号:36)とともにHA-PKR(2-174)として発現させた。tRNAPylはHDVリボザイムとともにtRNA-リボザイムRNA分子(tRNAPyl-HDV)として発現させた。PylRSAFは、CMVプロモーターの制御下で発現させた。細胞はさらにT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させた。
PKR(2-174)の存在下、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、及びncAA SCOを用いてアンバー抑制を試験した。
PKR(2-174)は、N-末端HAタグ(配列番号:36)とともにHA-PKR(2-174)として発現させた。tRNAPylはHDVリボザイムとともにtRNA-リボザイムRNA分子(tRNAPyl-HDV)として発現させた。PylRSAFは、CMVプロモーターの制御下で発現させた。細胞はさらにT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させた。
PylRSAFとT7RNAPを、HEK293T細胞(ATCC CRL-3216)を用いて構成的に発現させた。
HEK293T細胞は、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、CMVプロモーター制御下のPylRSAF、T7プロモーター制御下のtRNAPyl-HDV、及びCMVプロモーター制御下のT7RNAP用発現カセットを有するベクターと、上記A)及びB)のセクションに記載のそれぞれの構築物及びトランスフェクション法を使用して、トランスフェクトした。
HEK293T細胞は、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、CMVプロモーター制御下のPylRSAF、T7プロモーター制御下のtRNAPyl-HDV、及びCMVプロモーター制御下のT7RNAP用発現カセットを有するベクターと、上記A)及びB)のセクションに記載のそれぞれの構築物及びトランスフェクション法を使用して、トランスフェクトした。
コントロールは、細胞にSCO(「-ncAA」)を与えなかったこと、及び/又はHDVリボザイムなしでtRNAPylを発現させたことを除いて、同様に調製した。
細胞を、上記セクションD)に記載のように、FCSによって分析した。図2(pcDNA3.1プラスミドを使用)及び図3(pCAGGSプラスミドを使用)に示す結果は、HDVリボザイムとともにtRNAPylを発現させると、リボザイムなしで発現したtRNAPylと比較して、より効率的なアンバー抑制が得られた。理論に縛られることなく、この効果はリボザイムがtRNAのプロセシングを改善したことに起因すると推測される。
実施例2:様々な誘導性発現システムを用いたアンバー抑制
レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、及びncAA BOCを用いてアンバー抑制を試験した。tRNAPylは、HDVリボザイムとともにtRNA-リボザイムRNA分子(tRNAPyl-HDV)としてT7プロモーター制御下に発現した。PylRSAFはNESシグナルとともに発現させた(NES-PylRSAF)。この細胞はさらにT7 RNAポリメラーゼをNESシグナルとともに発現させた(NES-T7RNAP)。
レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、及びncAA BOCを用いてアンバー抑制を試験した。tRNAPylは、HDVリボザイムとともにtRNA-リボザイムRNA分子(tRNAPyl-HDV)としてT7プロモーター制御下に発現した。PylRSAFはNESシグナルとともに発現させた(NES-PylRSAF)。この細胞はさらにT7 RNAポリメラーゼをNESシグナルとともに発現させた(NES-T7RNAP)。
NES-PylRSAFとNES-T7RNAPは、T-RExシステム又はTet-Onシステムを用いて誘導的に発現させた。
T-RExシステムについては、HEK Flp-In T-REx 293細胞を、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、「T-REx」プロモーターの制御下のNES-PylRSAF、T7プロモーターの制御下のtRNAPyl-HDV、及び「T-REx」プロモーター制御下のNES-T7RNAP用発現カセットを有するベクターと、上記のセクションA)及びB)に記載したそれぞれの構築物及びトランスフェクション方法を使用してトランスフェクションした。HEK Flp-In T-REx 293細胞は、tetリプレッサー(tetR)遺伝子を安定的に発現する。NES-T7RNAP(ひいてはtRNAPyl-HDV)及びNES-PylRSAFの発現をテトラサイクリンの添加により誘導し、細胞に上記セクションC)に記載のncAA BOCを供給した。
Tet-Onシステムについては、HEK293T細胞(ATCC CRL-3216)を、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、「Tet-On」プロモーターの制御下のNES-PylRSAF、T7プロモーター制御下のtRNAPyl-HDV、「Tet-On」プロモーター制御下のNES-T7RNAP、及びrtTA用発現カセットを有するベクターと、PKR(2-174)の存在下で、上記セクションA)及びB)に記載のそれぞれの構築物及びトランスフェクション方法を用いて共トランスフェクトした。PKR(2-174)は、HA-PKR(2-174)として、N末端のHA-tag(配列番号:36)と共に発現させた。NES-T7RNAP(ひいてはtRNAPyl-HDV)及びNES-PylRSAFの発現を、ドキシサイクリンの添加によって誘導し、上記セクションC)に記載のように細胞にncAA BOCを供給した。
コントロールは、テトラサイクリンもドキシサイクリンも添加しないことを除いて、同様に調製した。
この細胞は、上記セクションD)に記載のようにFCSによって分析した。図4に示す結果から、誘導的に発現させたtRNAPyl-HDV及びNES-PylRSAFとともにBOCを用いたアンバー抑制は、T-RExシステム(図4a)及びTet-Onシステム(図4b)の両方で有効に機能することが示された。
実施例3:誘導性及び非誘導性発現システムにおけるPKR(2-174)のアンバー抑制効果
PKR(2-174)の存在下又は非存在下で、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、tetR、及びncAA BOCを用いてアンバー抑制を試験した。
PKR(2-174)の存在下又は非存在下で、レポーター遺伝子NLS-iRFP-Flag-GFPY39->TAG-6His、PylRSAF、tRNAPyl、tetR、及びncAA BOCを用いてアンバー抑制を試験した。
PKR(2-174)は、N-末端TA-タグ(配列番号:36)と共にHA-PKR(2-174)として発現させた。
tRNAPyl用の3つの異なる発現カセットのうちの1つを使用した:T7-tRNAPyl-HDV(T7プロモーターの制御下で、tRNAPylはtRNA-リボザイムRNA分子(tRNAPyl-HDV)としてHDVリボザイム(tRNAPylの3’-末端に位置する)と共に発現した);8xtetO-U6-tetO-tRNAPyl(tRNAPylの発現が、U6プロモーターの前の8つのtetO配列とU6プロモーターの後の2つのtetO配列を含むヒトU6プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体により制御される(配列番号:50));及び、H1-TetO-tRNAPyl(tRNAPylの発現が、2つのtetO配列を含むヒトH1プロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体によって制御される(配列番号:51))。
PylRSAFは、NESシグナルと一緒に発現させた(NES-PylRSAF)。NES-PylRSAF用の2つの異なる発現カセットのうち1つを使用した:CMV-tetO-NES-PylRSAF(NES-PylRSAFの発現が、2つのtetO配列を含むCMVプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体によって制御される(配列番号:46));CMV-NES-PylRSAF(NES-PylRSAFの発現が、(構成型)CMVプロモーターによって制御される(配列番号:45))。
tRNAPylの発現が、T7プロモーター(発現カセットT7-tRNAPyl-HDV)によって制御された細胞は、NESシグナル(NES-T7RNAP)と共に発現されるT7 RNAポリメラーゼ用の2つの異なる発現カセットのうちの1つをさらに含む:CMV-tetO-T7RNAP(NES-T7RNAP発現が、2つのtetO配列を含むCMVプロモーターのテトラサイクリン誘導性変異体の制御下にある(配列番号:12);CMV-NES-T7RNAP(NES-T7RNAP発現が、(構成型)CMVプロモーターの制御下にある(配列番号:43))。
HEK293T細胞に、以下の発現カセットの組み合わせを搭載したベクターをトランスフェクトした(×は組み合わせにおけるそれぞれの発現カセットの存在を示す)。
コントロールは同じ方法で調製したが、HA-PKR(2-174)の発現カセットは含まなかった。
tet誘導性エレメントの発現のためにテトラサイクリンを添加し、上記セクションC)に記載のように、細胞にncAA BOCを供給した。コントロール試料は、テトラサイクリン及びBocの一方又は両方の添加を除外したことを以外は、同様に調製した。
細胞を、上記セクションD)に記載のように、FCSによって分析した。図5に示す結果は、PKR(2-174)の共発現により、ダブルポジティブ細胞で検出されるGFP蛍光の強度が増加し、細胞あたりの完全なレポーター遺伝子発現産物の量が増加する(アンバー抑制が成功した結果)ことを示す。
略語:
BCN=2-アミノ-6-(9-ビオシクロ[6.1.0]ノナ-4-イニルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイド酸
BOC=2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸、実施例において「BOC」は特に(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸=Boc-l-Lys-OH=N-α-tert-ブチルオキシカルボニル-l-リシン
CMV=サイトメガロウイルス
Crm1=染色体領域維持1(カリオフェリンエクスポーチン1としても知られる)
dsRNA=二本鎖RNA
dSTORM=直接確率的光学再構築顕微鏡法
BCN=2-アミノ-6-(9-ビオシクロ[6.1.0]ノナ-4-イニルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイド酸
BOC=2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸、実施例において「BOC」は特に(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸=Boc-l-Lys-OH=N-α-tert-ブチルオキシカルボニル-l-リシン
CMV=サイトメガロウイルス
Crm1=染色体領域維持1(カリオフェリンエクスポーチン1としても知られる)
dsRNA=二本鎖RNA
dSTORM=直接確率的光学再構築顕微鏡法
E.coli BL21(DE3)AI=大腸菌株BF-ompT gal dcm lon hsdSB(rB
-mB
-)λ(DE3[lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5])[malB+]K-12(λS)araB::T7RNAP-tetA
eIF-2α=真核生物開始因子2のαサブユニット
FBS=ウシ胎児血清
FISH=蛍光in situハイブリダイゼーション
GCE=遺伝暗号の拡張
GFP=緑色蛍光タンパク質
glmS=グルコサミン-6-リン酸シンテターゼ
H1プロモーター=ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーター
HDV=デルタ型肝炎ウイルス
eIF-2α=真核生物開始因子2のαサブユニット
FBS=ウシ胎児血清
FISH=蛍光in situハイブリダイゼーション
GCE=遺伝暗号の拡張
GFP=緑色蛍光タンパク質
glmS=グルコサミン-6-リン酸シンテターゼ
H1プロモーター=ヒトRNAポリメラーゼIIIプロモーター
HDV=デルタ型肝炎ウイルス
IPTG=イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド
iRFP=赤外蛍光タンパク質
ncAA=非標準アミノ酸
NES=核外搬出シグナル
NLS=核局在化シグナル
O-tRNA=直交tRNA
O-RS=直交RS
iRFP=赤外蛍光タンパク質
ncAA=非標準アミノ酸
NES=核外搬出シグナル
NLS=核局在化シグナル
O-tRNA=直交tRNA
O-RS=直交RS
PAINT=ナノスケールトポグラフィにおけるイメージングのための点集積
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
PKR=プロテインキナーゼR;別名:dsRNA依存性プロテインキナーゼ、インターフェロン(IFN)誘導性dsRNA活性化セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ、p68キナーゼ
PMSF=フッ化フェニルメチルスルホニル
POI=目的のポリペプチド、標的ポリペプチド
PrK=2-アミノ-6-(プロパ-2-イノキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸
pRS=原核生物RS
ptRNA=原核生物tRNA
ptRNA-リボザイム=ptRNAと少なくとも1つのリボザイムを含む原核生物RNA分子
PylRS=ピロリジルtRNA合成酵素
PylRSAF=アミノ酸置換Y306A及びY384Fを含む変異型M.mazeiピロリジルtRNA合成酵素
PBS=リン酸緩衝生理食塩水
PKR=プロテインキナーゼR;別名:dsRNA依存性プロテインキナーゼ、インターフェロン(IFN)誘導性dsRNA活性化セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ、p68キナーゼ
PMSF=フッ化フェニルメチルスルホニル
POI=目的のポリペプチド、標的ポリペプチド
PrK=2-アミノ-6-(プロパ-2-イノキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸
pRS=原核生物RS
ptRNA=原核生物tRNA
ptRNA-リボザイム=ptRNAと少なくとも1つのリボザイムを含む原核生物RNA分子
PylRS=ピロリジルtRNA合成酵素
PylRSAF=アミノ酸置換Y306A及びY384Fを含む変異型M.mazeiピロリジルtRNA合成酵素
RP-HPLC=逆相高速液体クロマトグラフィー
RS=アミノアシルtRNA合成酵素
RT=室温
rtTA=リバースtTA
SCO=2-アミノ-6-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸
SPAAC=(銅フリー)歪み促進アルキン-アジド環状付加反応
SPIEDAC=(銅フリー)歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応
SRM=超解像顕微鏡法
SV40=シミアン空胞形成ウイルス40
RS=アミノアシルtRNA合成酵素
RT=室温
rtTA=リバースtTA
SCO=2-アミノ-6-(シクロオクタ-2-イン-1-イルオキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸
SPAAC=(銅フリー)歪み促進アルキン-アジド環状付加反応
SPIEDAC=(銅フリー)歪み促進逆電子要請型Diels-Alder環状付加反応
SRM=超解像顕微鏡法
SV40=シミアン空胞形成ウイルス40
T7RNAP=T7 RNAポリメラーゼ
TCO=2-アミノ-6[(2E-シクロオクタ-2-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸
TCO*=2-アミノ-6[(2E-シクロオクタ-2-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸
tetR=テトラサイクリンリプレッサー
tetO=テトラサイクリンオペレーター
tTA=テトラサイクリン制御転写活性化因子
TRE=テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(テトラサイクリン応答性エレメントともいう)
tRNAPyl=野生型又は改変型PylRSによってピロリジンでアシル化され、ncAAをPOIに部位特異的に組み込むために、好ましくはセレクタコドンの逆相補体であるアンチコドンを有するtRNA(実施例で使用したtRNAPylでは、アンチコドンはCUAである)
U6プロモーター=哺乳類細胞内で、通常、U6 RNA(核小体RNA)の発現を制御するプロモーター
VS=Varkud satellite
TCO=2-アミノ-6[(2E-シクロオクタ-2-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸
TCO*=2-アミノ-6[(2E-シクロオクタ-2-エン-1-イル)オキシカルボニルアミノ]ヘキサン酸
tetR=テトラサイクリンリプレッサー
tetO=テトラサイクリンオペレーター
tTA=テトラサイクリン制御転写活性化因子
TRE=テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(テトラサイクリン応答性エレメントともいう)
tRNAPyl=野生型又は改変型PylRSによってピロリジンでアシル化され、ncAAをPOIに部位特異的に組み込むために、好ましくはセレクタコドンの逆相補体であるアンチコドンを有するtRNA(実施例で使用したtRNAPylでは、アンチコドンはCUAである)
U6プロモーター=哺乳類細胞内で、通常、U6 RNA(核小体RNA)の発現を制御するプロモーター
VS=Varkud satellite
Claims (23)
- 以下を含む真核細胞であって:
(a)原核生物のアミノアシルtRNA合成酵素(pRS)をコードするポリヌクレオチド;
(b)原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイムをコードするポリヌクレオチド;
pRSは、ptRNAをアシル化することができ、且つ、
ptRNA及びリボザイムをコードする配列が、転写によってptRNA及びリボザイムの両方を含むRNA分子(ptRNA-リボザイム)を生成するように連結されている、真核細胞。 - リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、Varkud satelliteリボザイム、グルコサミン-6-リン酸合成酵素リボスイッチ、及び肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムから選択される、請求項1に記載の真核細胞。
- リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムである、請求項1又は2に記載の真核細胞。
- (i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムが、RNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御される、
請求項1~3のいずれか一項に記載の真核細胞。 - pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御される、請求項1~4のいずれか一項に記載の真核細胞。
- さらに、テトラサイクリンオペレーター(tetO)配列に結合するタンパク質(tetO結合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含み、
tetO結合タンパク質が、以下からなる群から選択される、請求項4又は5に記載の真核細胞:
(i)テトラサイクリンリプレッサー(tetR);
(ii)テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA);及び
(iii)リバースtTA(rtTA)。 - 請求項1~6のいずれか一項に記載の真核細胞であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御される、及び/又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御される、
さらに、
(c)T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)をコードするポリヌクレオチドを含む、真核細胞。 - T7RNAPの発現がTREによって制御される、請求項7に記載の真核細胞。
- T7RNAPが、以下を有する:
(i)核局在化シグナル(NLS);もしくは、
(ii)核搬出シグナル(NES);又は、
T7RNAPが、
(iii)NES及びNLSを有さない、
請求項7又は8に記載の真核細胞。 - dsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の真核細胞。
- 請求項1~4及び7のいずれか一項に定義される、ptRNA及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするポリヌクレオチドであって、
a)リボザイムが、ptRNA-リボザイムにおいてptRNAの3’末端に直接連結しているHDVリボザイムであるか;又は、
b)ptRNAが、Methanosarcina種、特にM.mazeiのピロリジルtRNAに由来するか;又は、
c)ptRNA分子が、3’末端アミノアシル受容体幹モチーフCCAを欠いてコードされるか;又は、
d)ptRNAが、以下のヌクレオチド配列(配列番号:60)ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactnnnaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccg(nnnはアンチコドンをコードする)によってコードされる、ポリヌクレオチド。 - 請求項1~4及び7のいずれか一項に定義される、ptRNA及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子をコードするヌクレオチド配列;並びに、
(i)請求項6に定義されるtetO結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、
(ii)請求項1、5及び7のいずれか一項に定義されるpRSをコードするヌクレオチド配列、又は、
(iii)(i)及び(ii)の両方、
を含むポリヌクレオチド、又は2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせ。 - そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製する方法であって、
以下の工程を含み:
(a)真核細胞内で、
- 原核生物アミノアシルtRNA合成酵素(pRS);及び、
- 原核生物tRNA(ptRNA)及び1つ以上のリボザイム(ptRNA-リボザイム)を含むRNA分子、
を発現させる工程;
並びに、同時又は順々に、
(b)真核細胞内で、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA又はその塩の存在下で、POIを発現させる工程;及び、
(c)任意に、発現したPOIを回収する工程;
pRSは、ptRNAをncAA又はその塩でアシル化することが可能であり、
POIは、1つ以上のncAA残基をコードする1つ以上のセレクタコドンを含むヌクレオチド配列によってコードされ、且つ、
セレクタコドンは、ptRNAのアンチコドンの逆相補体である、方法。 - ptRNA-リボザイムの転写合成がT7プロモーターによって制御される請求項13に記載の方法であって、
さらに、(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる工程を含む、方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか;又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAリボザイムの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;且つ、
ptRNA-リボザイムの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む、方法。 - 請求項13~15のいずれか一項に記載の方法であって、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)により制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、RNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され;
さらに該方法が、少なくともpRSの発現の前に、真核細胞内でテトラサイクリンリプレッサー(tetR)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。 - 請求項15又は16に記載の方法であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか;又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに該方法は下記工程を含み:
- (i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;及び
- T7RNAPの発現と少なくとも同時に真核細胞内でtetRを発現させる工程;
T7RNAPの発現が、真核細胞をテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体と接触させ、それによってT7RNAPコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか;又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに下記工程を含む方法:
(1)ptRNA-リボザイムの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)ptRNA-リボザイムの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を抑制し、次いで、ptRNA-リボザイムの転写合成を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。 - 請求項13~18のいずれか一項に記載の方法であって、
(i)pRSコード化配列の転写が、TREによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現が、TREによって制御され、
さらに下記工程を含む方法:
(1)pRSの発現の前に、及びそれと同時に、テトラサイクリン制御転写活性化因子(tTA)を真核細胞内で発現させる工程;及び
(2)pRSの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってpRSコード化配列の転写を抑制し、次いで、pRSコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。 - 請求項18又は19に記載の方法であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写が、T7プロモーターによって制御されるか、又は
(iii)(i)及び(ii)の両方であり、
さらに下記工程を含む方法:
(3)(i)ptRNA-リボザイムもしくは(ii)pRS又は(iii)その両方のそれぞれの、それによって制御された発現の前に、又はそれと同時に、真核細胞内でT7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)を発現させる(T7RNAPの発現はTREによって制御される)工程;
(4)T7RNAPの発現の前に、及びそれと同時に、tTAを真核細胞内で発現させる工程;及び
(5)T7RNAPの発現の前の真核細胞と、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体との接触を保ち、それによってT7RNAPコード化配列の転写を抑制し、次いで、T7RNAPコード化配列の転写を誘導するために前記テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はそれらの機能的類似体の濃度を下げるか、好ましくは除去する工程。 - 請求項13に記載の方法であって、
(i)ptRNA-リボザイムの転写合成が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)ptRNA-リボザイムがRNAポリメラーゼによって転写合成され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともptRNAの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;且つ、
ptRNA-リボザイムの発現が、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってptRNA-リボザイムの転写合成を誘導することを含む、方法。 - 請求項13~21のいずれか一項に記載の方法であって、
(i)pRSコード化配列の転写が、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント(TRE)によって制御されるか、又は
(ii)pRSコード化配列の転写がRNAポリメラーゼによって触媒され、前記RNAポリメラーゼの発現がTREによって制御され;
さらに該方法は、少なくともpRSの発現と同時に、真核細胞内でリバースtTA(rtTA)を発現させる工程を含み;且つ、
pRSの発現が、真核細胞をドキシサイクリン又はその機能的類似体と接触させ、それによってpRSコード化配列の転写を誘導することを含む、方法。 - そのアミノ酸配列中に1つ以上の非標準アミノ酸(ncAA)残基を有する目的のポリペプチド(POI)を調製するためのキットであって、
該キットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、もしくは、その塩、及び
(a)請求項11に記載のポリヌクレオチド、又は
(b)請求項12に記載のポリヌクレオチド、もしくは2つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせと、
(c)dsRNA結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それぞれと組み合わせて含むか;あるいは、
該キットは、POIの1つ以上のncAA残基に対応する1つ以上のncAA、もしくは、その塩;及び
(d)請求項1~10のいずれか一項に記載の真核細胞、を含む、キット。
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