CN109553661A - ApcE2蛋白突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：突变体由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过至少一个氨基酸突变得到，且其中氨基酸突变选自loop环外氨基酸位点突变、loop环内氨基酸位点突变、部分缺失突变loop环结构序列中的至少一种。本发明中的ApcE2蛋白突变体，与突变前相比，可溶性提升，在大肠杆菌体内表达的单位产量显著提高。本发明中的ApcE2蛋白突变体可用于荧光标记组织定位、光敏色素PΦB的制备提取、其他藻胆色素，比如藻红胆素PEB，藻蓝胆素PCB等的制备提取以及荧光藻胆蛋白的体外重组应用通过本发明中的制备方法，色素蛋白单位产量更高，可溶性更好。
Description
技术领域
本发明涉及ApcE2蛋白突变体及其应用。
背景技术
现代生物学的发展越来越依赖光学技术，例如荧光成像、光学检测及光诱导操纵等等。在活体中对深层组织进行成像定位，最好选用650nm-900nm波段的荧光。因为这个波段的光自发荧光较小、光散射小且对组织损伤较小。近年来，作为荧光探针研究较多的两类蛋白为绿色荧光蛋白家族和细菌光敏色素蛋白(BphP)。
少数蓝细菌为了更适应环境、从环境中捕获更多的能量，慢慢进化出能利用远红光的藻胆体。这些藻胆体中通常存在不同于传统的核膜连接蛋白和一到三个别藻蓝蛋白亚基，其荧光发光机制类似于细菌光敏色素蛋白(BphP)，发色团为非共价结合的藻蓝胆素PCB。
ApcE2，来自蓝细菌Synechococcussp.PCC7335，由S7335_3294编码，其序列中保守的半胱氨酸被缬氨酸替代，因此与色素是以非共价方式连接，其光谱均比共价连接色素的ApcE1红移近40nm。它与藻红胆素PEB重组，最大吸收峰在614nm，最大荧光峰在628nm；与藻蓝胆素PCB重组，最大吸收峰在700nm，最大荧光峰在714nm；还可以连接光敏色素PΦB，吸收进一步红移至714nm，荧光在726nm，为目前荧光标记所能达到的最长荧光发射波长。
由于ApcE2是膜蛋白，需要在含高浓度变性剂(3.5mol/L尿素)的条件下溶解；在室温下不够稳定，故而会影响标记。已有文献(缪丹.红移藻胆蛋白和光敏色素的研究及分子进化[D].2017.)报道：对蛋白N端、C端的截短及loop环(77-161)的部分缺失改造，并没有提高蛋白的可溶性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ApcE2蛋白突变体及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种野生型ApcE2蛋白突变体，突变体由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过至少一个氨基酸突变得到，且其中氨基酸突变选自loop环外氨基酸位点突变、loop环内氨基酸位点突变、部分缺失突变loop环结构序列中的至少一种。
进一步地，loop环外氨基酸位点选自164，165，47，51，54位中的至少一种；更进一步地，loop环外氨基酸位点突变选自R164K，S165A，L47E，L51N，L54T中的至少一种。
进一步地，loop环内氨基酸位点选自91，92，134，137，133，135位中的至少一种；更进一步地，loop环内氨基酸位点突变选自L91T，V92S，L134E，L137D，W133Y，K135R中的至少一种。
进一步地，缺失突变的loop环结构序列选自88～130位。
进一步地，野生型ApcE2蛋白突变体的氨基酸序列选自SEQ ID No.2～SEQ IDNo.13中的任意一种；优选地，野生型ApcE2蛋白突变体的氨基酸序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.12中的任意一种。
上述的野生型ApcE2蛋白突变体在荧光标记组织定位中的应用。
上述的野生型ApcE2蛋白突变体在光敏色素PΦB、藻胆色素的制备中的应用。
上述的野生型ApcE2蛋白突变体在荧光藻胆蛋白的体外重组中的应用。
编码上述的野生型ApcE2蛋白突变体的序列。
本发明的有益效果是：
1、本发明中公开了一组ApcE2蛋白突变体，与突变前相比，可溶性提升，在大肠杆菌体内表达的单位产量显著提高。
2、本发明中的ApcE2蛋白突变体可用于荧光标记组织定位。
3、本发明中的ApcE2蛋白突变体可用于光敏色素PΦB的制备提取，通过本发明中的制备方法，色素蛋白单位产量更高，可溶性更好。
4、本发明中的ApcE2蛋白突变体可用于其他藻胆色素，比如藻红胆素PEB，藻蓝胆素PCB等的制备提取。
5、本发明中的ApcE2蛋白突变体还可用于荧光藻胆蛋白的体外重组应用。
附图说明
图1为BDFP3在大肠杆菌中的表现；
图2为突变体蛋白可溶性对比图；
图3为色素蛋白PΦB-BDFP3的光谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
本发明中使用的实验方法如下：
1.克隆
蛋白基因编码序列克隆至载体pET28或者pcDNA3.1(Novagen)，得到pET-fp或者pcDNA3.1-fp:ires:egfp。序列可根据需要，直接进行基因合成。fp序列克隆进入pET28载体时，可采用酶切位点BamHI和HindIII。
为了在大肠杆菌体内产生结合光敏色素PΦB的荧光蛋白，质粒pET-fp通过转化操作进入含有质粒pACYC-ho1-hy2的大肠杆菌BL21细胞中。质粒pACYC-ho1-hy2用于表达生成光敏色素，ho1为血红素氧化还原酶基因，hy2为光敏色素合成酶基因。
2.大肠杆菌体内表达及蛋白纯化
将经转化的BL21细胞在18℃，培养在补充有卡那霉素(20μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)LB培养基中。当O.D值达到0.4～0.6时，使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达5～16小时，然后在4℃，12,000×g离心3min，收集细胞，经水冲洗2次，短期保存在4℃或者置于-20℃长期保存。
在上述诱导表达的细胞中加入5mL预冷的上样缓冲液充分重悬，利用超声的方式进行破碎，细胞的重悬液必须放置在冰水混合物中。超声功率设置为300W，时长1s，间隔2s，共240次。超声结束后，放置4℃，12000r/min，离心40min后，即可取上清过镍柱提纯。
镍离子金属螯合亲和层析具体步骤如下：首先向Ni柱中加入2倍柱体积的200mM氯化镍，待溶液流尽以后加单蒸水直至留下来的溶液不再含氯化镍(绿色)为止，然后用5倍柱体积的上样缓冲液平衡Ni柱，之后就可以上样。上样后依次用5倍柱体积的上样缓冲液和10倍柱体积的去杂蛋白液清洗柱子，最后用1mL的目的蛋白洗脱液将目的蛋白洗脱下来。Ni柱使用完毕后需要用Elution Buffer洗脱掉Ni离子，最后用5倍柱体积单蒸水处理。层析柱料于4℃用20％乙醇封存。洗脱下来的目的蛋白需要在4℃，不含咪唑的上样缓冲液中过夜透析。
3.哺乳动物细胞体内表达
将HEK 293T、HeLa或U-2OS细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，将CHO-K1细胞培养在含10％胎牛血清的F-12K培养基中。使用2000(Invitrogen)进行转染。转染时，2000与DNA以3:1(μl:μg)的比率在无血清培养基中混合10分钟后，立即加入到要转染的细胞中。5～6h后，更换新鲜的DMEM培养基。
4.广域和超分辨率显微镜成像
成像要求使用individual模式，和配有100×1.49NA油浸物镜的ECLIPSE Ti-E倒置尼康显微镜上的尼康结构化照明系统，来获取广域和结构化照明显微镜(SIM)照片。使用640nm的半导体激光器(100mW,CUBE 640-100C,COHERENT)激发FR荧光。使用受NIS-Elements AR软件(尼康)控制的电子倍增CCD相机(Andor iXon3DU897)进行数据采集。使用NIS-Elements AR对图像进行处理。
5.蛋白定量和结构模拟分析
蛋白浓度检测使用Bradford法，参照物为牛血清白蛋白。
BDFP荧光蛋白结构比对，在SWISS-MODEL远程服务器上完成。采用的模板序列为钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的藻胆蛋白ApcB(pdb code:1ALL)，对比软件为Swiss-PDBViewer，版本4.1。采用PyMOL(http://www.pymol.org/)创建蛋白结构图。
6.光谱分析
通过分光光度计(DU800，Beckman–Coulter)来检测色素蛋白的紫外-可见吸收光谱。共价结合的胆色素BV，在390nm处的吸收系数ε＝39,900M-1cm-1；非共价结合的光敏色素PΦB(溶于尿素溶液，pH2)，在702nm处的吸收系数ε＝38,000M-1cm-1。
通过荧光分光光度计(F320，天津港东科技发展股份有限公司)来检测荧光光谱。
实施例1
在v0序列(氨基酸序列如SEQ ID No.1)的基础上，突变loop环外的疏水性氨基酸位点(R164K，S165A，L47E，L51N，L54T)，分别得到v1-v4突变体序列，氨基酸序列如SEQ IDNo.2～SEQ ID No.5所示。
在突变体v4的基础上，突变loop环内的疏水性氨基酸位点(L91T，V92S，L134E，L137D)，分别得到v5-v6突变体序列，氨基酸序列如SEQ ID No.6～SEQ ID No.7所示。
在突变体v6的基础上，突变loop环内的疏水性氨基酸位点(W133Y，K135R)，得到v7-v8突变体序列，氨基酸序列如SEQ ID No.8～SEQ ID No.9所示，其中v7突变体被命名为BDFP3。
在突变体v7的基础上，部分缺失突变loop环结构序列(Δ88-106，Δ88-114，Δ88-120，Δ88-130)，得到v9-v12突变体序列，氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.13所示。
将编码突变体的基因序列克隆至大肠杆菌，进行重组表达，纯化得到突变体蛋白。
图1为BDFP3在大肠杆菌中的表现(荧光显微镜成像图)。
大肠杆菌体内重组表达纯化的突变体蛋白可溶性对比图如图2所示，以v1突变体作为本底。
结合光敏色素PΦB的ApcE2突变体的吸收和荧光光谱数据表如下表所示：
样品通过纯化后，在20mM KPB，0.5M NaCl，pH7.0缓冲环境下进行光谱分析。荧光发射光谱的激发波长在620nm。结合光敏色素PΦB的突变体蛋白分子亮度，是通过参比IFP2.0(ε·Φfl＝7.5mM-1cm-1)得到。
a)PΦB-ApcE2(24-245)只能在尿素环境下微溶，样品检测的缓冲环境还包含有3.5M尿素。
实施例2
光敏色素PΦB的制备及其在在标记哺乳动物细胞时的应用
编码突变体的基因序列取代ApcE2(24-245)，与血红素氧化还原酶基因ho1，光敏色素合成酶基因hy2共同转化进入大肠杆菌，重组表达生成色素蛋白PΦB-突变体，并进行提取纯化。光敏色素PΦB可以在变性条件下从色素蛋白PΦB-突变体中萃取得到。还可进一步通过旋蒸，得到色素晶体。
具体地，将取提纯好的色素蛋白将其吸收特征峰稀释到OD＝2，加入终浓度为20μg/mL的蛋白酶K，37℃水浴消化1h。吸收光谱仪测定酶解的程度，待酶解较为完全，除去蛋白酶K，得到含有游离色素的溶液。
突变体v7相比v0(7335ApcE2(24-245))，能结合更多的光敏色素PΦB，在大肠杆菌中的单位产量更高(表1)，色素蛋白PΦB-BDFP3的光谱图如图3所示。
提取的色素溶于DMSO，终浓度1mM；荧光蛋白FP溶于磷酸盐缓冲液(20mM KPB，0.5MNaCl，pH5.6)中，蛋白终浓度为5μM。每1mL纯化后的荧光蛋白FP加入5μL色素。在DMEM培养基中标记哺乳动物细胞时，色素要分3小时持续添加，使得色素能充分扩散进入细胞。以上两种情况，添加后的色素在溶液中的终浓度应为5μM。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> ApcE2蛋白突变体及其应用
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Pro Glu Asp Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala Leu Gln Glu Met Gln
180 185 190
Trp Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu
195 200 205
Val Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val
210 215 220
<210> 9
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
1 5 10 15
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
50 55 60
Pro Glu Glu Leu Val Gly Met Pro Gly Ser Gly Tyr Phe Val Ala Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Ser Pro Lys Ser Arg Arg Gln Thr Gly Asn Gly His Ser
85 90 95
Val Gln Asn Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Trp Glu Arg
100 105 110
Gly Asp Phe Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro Ser Arg Phe Gln Ala
115 120 125
Ile Asn Ile Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met Lys Lys Ala Met Arg
130 135 140
Asp Leu Gly Trp Phe Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr Ala Val Val Ala Gly
145 150 155 160
Asp Thr Ser Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly Leu Arg Gly Ile Ile
165 170 175
Pro Glu Asp Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala Leu Gln Glu Met Gln
180 185 190
Trp Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu
195 200 205
Val Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val
210 215 220
<210> 10
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
1 5 10 15
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
50 55 60
Ser Pro Lys Ser Arg Arg Gln Thr Gly Asn Gly His Ser Val Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Tyr Glu Lys Gly Asp Phe
85 90 95
Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro Ser Arg Phe Gln Ala Ile Asn Ile
100 105 110
Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met Lys Lys Ala Met Arg Asp Leu Gly
115 120 125
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130 135 140
Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly Leu Arg Gly Ile Ile Pro Glu Asp
145 150 155 160
Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala Leu Gln Glu Met Gln Trp Lys Ser
165 170 175
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Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val
195 200
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
1 5 10 15
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
50 55 60
Gly Asn Gly His Ser Val Gln Asn Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro
65 70 75 80
Val Ala Tyr Glu Lys Gly Asp Phe Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Gln Ala Ile Asn Ile Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met
100 105 110
Lys Lys Ala Met Arg Asp Leu Gly Trp Phe Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr
115 120 125
Ala Val Val Ala Gly Asp Thr Ser Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly
130 135 140
Leu Arg Gly Ile Ile Pro Glu Asp Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala
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Leu Gln Glu Met Gln Trp Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp
180 185 190
Tyr Gln Val
195
<210> 12
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
1 5 10 15
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
50 55 60
Gln Asn Ser Ser Ser Ser Ile Thr Asn Pro Val Ala Tyr Glu Lys Gly
65 70 75 80
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Leu Gly Trp Phe Leu Arg Tyr Ile Thr Tyr Ala Val Val Ala Gly Asp
115 120 125
Thr Ser Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly Leu Arg Gly Ile Ile Pro
130 135 140
Glu Asp Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala Leu Gln Glu Met Gln Trp
145 150 155 160
Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Val
165 170 175
Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp Tyr Gln Val
180 185
<210> 13
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Val Ile Asn Gly Ala His Gln Arg Asp Arg Tyr Pro Asn His Ser Glu
1 5 10 15
Met Gln Thr Leu Ser Thr Phe Glu Arg Thr Gly Asn Gln Arg Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Gln Thr Leu Ala Gln His Ala Asn Glu Ile Val Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Lys Arg Ile Phe Val Gly Gly Asn Pro Met Ala Tyr Phe Glu Gln
50 55 60
Val Ala Tyr Glu Lys Gly Asp Phe Phe Ser Gly Lys Pro Ser Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Gln Ala Ile Asn Ile Ala Asp Tyr Gly Ala Val Arg Met
85 90 95
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Ala Val Val Ala Gly Asp Thr Ser Ile Ile Thr Val Asn Thr Arg Gly
115 120 125
Leu Arg Gly Ile Ile Pro Glu Asp Val Thr Val Ala Thr Thr Val Ala
130 135 140
Leu Gln Glu Met Gln Trp Lys Ser Leu Ser Phe Phe Pro Val Asp Ser
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Leu Val Arg Arg Tyr Phe Asp Val Leu Ile Ala Asp
165 170 175
Tyr Gln Val
Claims (9)
1.一种野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：突变体由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过至少一个氨基酸突变得到，且其中氨基酸突变选自loop环外氨基酸位点突变、loop环内氨基酸位点突变、部分缺失突变loop环结构序列中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：loop环外氨基酸位点选自164，165，47，51，54位中的至少一种；更进一步地，loop环外氨基酸位点突变选自R164K，S165A，L47E，L51N，L54T中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：loop环内氨基酸位点选自91，92，134，137，133，135位中的至少一种；更进一步地，loop环内氨基酸位点突变选自L91T，V92S，L134E，L137D，W133Y，K135R中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：缺失突变的loop环结构序列选自88～130位。
5.根据权利要求1～4任一项所述的野生型ApcE2蛋白突变体，其特征在于：野生型ApcE2蛋白突变体的氨基酸序列选自SEQ ID No.2～SEQ ID No.13中的任意一种；优选地，野生型ApcE2蛋白突变体的氨基酸序列选自SEQ ID No.7～SEQ ID No.12中的任意一种。
6.编码权利要求1～5任一项所述的野生型ApcE2蛋白突变体的序列。
7.权利要求1～5任一项所述的野生型ApcE2蛋白突变体在荧光标记组织定位中的应用。
8.权利要求1～5任一项所述的野生型ApcE2蛋白突变体在光敏色素PΦB、藻胆色素的制备中的应用。
9.权利要求1～5任一项所述的野生型ApcE2蛋白突变体在荧光藻胆蛋白的体外重组中的应用。
Priority Applications (1)
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- 2018-11-22 CN CN201811399315.2A patent/CN109553661B/zh active Active
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| CN116036234A (zh) * | 2023-01-17 | 2023-05-02 | 青岛市中心医院 | 一种用于治疗骨质疏松的药剂 |
| CN116036234B (zh) * | 2023-01-17 | 2024-02-06 | 青岛市中心医院 | 一种用于治疗骨质疏松的药剂 |
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