CN116036234A - 一种用于治疗骨质疏松的药剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗骨质疏松的药剂，属于骨质疏松治疗技术领域。本发明发现抗菌肽ApCe1具有促进骨髓间充质干细胞增殖和骨髓间充质干细胞成骨分化的新功能，通过利用该功能可以有效的治疗骨质疏松，因此可以将抗菌肽ApCe1制备成治疗骨质疏松的药剂。
Description
技术领域
本发明属于骨质疏松治疗技术领域，尤其涉及一种用于治疗骨质疏松的药剂。
背景技术
骨质疏松是一种全身性的代谢疾病，患者的主要特点是骨量减少、骨密度降低以及骨组织微结构退化，这导致骨骼强度降低，进而导致骨折风险增加。随着社会老龄化的加剧，骨质疏松的发病率正在逐年攀升，其相关的并发症如骨折等也严重威胁着人们的生活质量。
骨髓是人体的主要造血器官，其主要由骨髓造血干细胞、骨髓脂肪组织和基质细胞组成。骨髓基质细胞产生成骨细胞，成骨细胞可以形成新的骨组织。现有的研究表明，与正常人相比，骨质疏松患者成骨细胞的成骨分化低于正常，由此可知成骨细胞分化水平与骨质疏松病理过程的发生、发展与演化密切相关。因此，骨髓基质细胞成骨分化能力的下降可能是骨质疏松发生的病因，促进骨髓基质细胞的增殖和成骨分化将是治疗骨质疏松的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以通过促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化来治疗骨质疏松的药物。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明首先提供了一种用于治疗骨质疏松的药剂,所述药剂包括有效剂量的抗菌肽ApCe1和药学上可接受的辅料和/或载体。
优选地，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
优选地，所述药剂的剂型包括片剂、注射剂、丸剂，颗粒剂。
本发明其次提供了抗菌肽ApCe1在制备治疗骨质疏松药剂中的应用。
优选地，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
优选地，所述药剂通过提高骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化来治疗骨质疏松。
优选地，所述药剂的剂型包括片剂、注射剂、丸剂，颗粒剂。
本发明其次提供了抗菌肽ApCe1在制备促进骨髓间充质干细胞增殖的培养基中的应用。
优选地，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的浓度为大于等于2.5μg/ml；
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的优化浓度为2.5μg/ml-80μg/ml。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的最优化浓度为20μg/ml。
本发明其次提供了抗菌肽ApCe1在制备促进骨髓间充质干细胞的成骨分化的培养基中的应用。
优选地，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的浓度为大于等于2.5μg/ml；
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的优化浓度为2.5μg/ml-80μg/ml。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的最优化浓度为20μg/ml。
本发明其次提供了抗菌肽ApCe1在制备促进骨髓间充质干细胞的细胞钙化的培养基中的应用。
优选地，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的浓度为大于等于2.5μg/ml；
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的优化浓度为2.5μg/ml-80μg/ml。
优选地，所述培养基中抗菌肽ApCe1的最优化浓度为20μg/ml。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了抗菌肽ApCe1在制备治疗骨质疏松的药剂中的新应用；(2)本发明发现抗菌肽ApCe1促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的新作用；(3)20μg/ml抗菌肽ApCe1能够促进骨髓间充质干细胞的增殖1.78倍，促进细胞的ALP酶活性2.48倍，促进细胞的钙化2.12倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为ApCe1处理对于骨髓间充质干细胞中成骨转化相关蛋白影响的检测结果；
图2为ApCe1处理对于骨髓间充质干细胞的细胞钙化影响的检测结果；
图3为ApCe1处理对于骨髓间充质干细胞的细胞钙化影响的量化结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
实施例1：抗菌肽ApCe1对于骨髓间充质干细胞增殖的促进作用
实验步骤：使用DMEM培养基将如下多肽：GzLEAP-2A，OdTo3，ApCe1，OdMa1，LiVe1，Amolopin P1，Peoriaerin IBSD35，配置成浓度为10μg/ml的细胞培养基；之后，将P3代的骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，按照每孔2×103的量接种在96孔细胞培养板中；待12h细胞完全贴壁后，将培养基更换为含有GzLEAP-2A，OdTo3，ApCe1，OdMa1，LiVe1，Amolopin P1，Peoriaerin IBSD35的培养基，同时设置不含多肽的培养基作为对照，每个处理设置3个重复孔；置于细胞培养箱中，37℃，5％ CO2条件下培养3天后，在每个孔中加入10ul的CCK-8,放到37℃孵育3.5h后，使用酶标仪检测各孔450nm吸光度。
实验结果：实验得到的结果如表2所示，从表2中可以看出，相较于对照，GzLEAP-2A，OdTo3，OdMa1，Peoriaerin IBSD35对于骨髓间充质干细胞的增殖无显著影响；相较于对照，LiVe1对于骨髓间充质干细胞的增殖有小幅度的抑制作用；相较于对照，ApCe1，Amolopin P1对于骨髓间充质的增殖具有显著的促进作用，其中ApCe1的增殖促进效果更加明显，因此本发明选择ApCe1进行后续的实验。
表1本发明所使用多肽的名称、序列和多肽长度
表2多肽培养基对于骨髓间充质干细胞的增殖的影响
| 分组 | OD值 |
| 对照组 | 0.510±0.020 |
| GzLEAP-2A | 0.512±0.039 |
| OdTo3 | 0.484±0.024 |
| ApCe1 | <![CDATA[0.729±0.043<sup>**</sup>]]> |
| OdMa1 | 0.500±0.036 |
| LiVe1 | <![CDATA[0.439±0.031<sup>*</sup>]]> |
| Amolopin P1 | <![CDATA[0.613±0.027<sup>**</sup>]]> |
| Peoriaerin IBSD35 | 0.507±0.035 |
注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
实施例2：筛选出ApCe1对于骨髓间充质干细胞增殖促进的最适浓度
实验步骤：使用DMEM培养基将ApCe1多肽配置成浓度为2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml,40μg/ml，80μg/ml的细胞培养基；之后，将P3代的骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，按照每孔2×103的量接种在96孔细胞培养板中；待12h细胞完全贴壁后，将培养基更换为2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml,40μg/ml，80μg/ml ApCe1的培养基，同时设置不含多肽的培养基作为对照，每个处理设置3个重复孔；置于细胞培养箱中，37℃，5％ CO2条件下培养3天后，在每个孔中加入10ul的CCK-8,放到37℃孵育3.5h后，使用酶标仪检测各孔450nm吸光度。
实验结果：实验得到的结果如表3所示，从表3中可以看出，当含有ApCe1的培养基浓度为2.5μg/ml-80μg/ml时，对于骨髓间充质干细胞的增殖均具有促进作用；当浓度达到20μg/ml时，达到ApCe1对于骨髓间充质干细胞增殖促进的最适浓度。
表3ApCe1对于骨髓间充质干细胞增殖的最适浓度
| 分组 | OD值 |
| 对照组 | 0.495±0.025 |
| 2.5μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.561±0.031<sup>*</sup>]]> |
| 5μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.609±0.041<sup>*</sup>]]> |
| 10μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.737±0.045<sup>**</sup>]]> |
| 20μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.881±0.053<sup>***</sup>]]> |
| 40μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.880±0.058<sup>***</sup>]]> |
| 80μg/ml ApCe1 | <![CDATA[0.886±0.046<sup>***</sup>]]> |
注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001
实施例3：ApCe1对于骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
实验步骤1：检测ApCe1对于骨髓间充质干细胞中ALP酶活性的影响
按照每孔5×103个细胞的量将骨髓间充质干细胞接种在24孔板中；待12h细胞完全贴壁后，将培养基更换为含有5，10，20μg/ml ApCe1的成骨培养基，同时设置对照组，每个处理设置3个重复孔；成骨诱导7天和14天时，使用0.2％聚乙二醇辛基苯基醚冰上裂解细胞，4℃14000rpm离心15min；收集上清，使用ALP活性试剂盒测定ALP活性，计算各浓度与对照组的ALP活性比值。
实验结果：实验得到的结果如表4所示，可以看出使用含有ApCe1的成骨培养基诱导培养时，ALP酶的活性显著高于对照组。上述结果说明ApCe1能够促进成骨分化过程中骨髓间充质干细胞的ALP酶活性,且相较于促增殖的效果，促进ALP酶活性的效果更加显著。
表4ALP活性检测结果
实验步骤2：检测ApCe1对于骨髓间充质干细胞中成骨分化相关蛋白表达水平的影响
按照每孔4×104个细胞的量将骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；待12h细胞完全贴壁后，将培养基更换为含有20μg/ml ApCe1的成骨培养基，同时设置对照组，每个处理设置3个重复孔；成骨诱导7d后，去除培养基，使用PBS轻轻清洗3次后，添加蛋白裂解液冰上裂解30min后，离心取上清；使用BCA法测定蛋白浓度后，添加上样缓冲液得到蛋白样品；参照WB实验步骤，检测对照组和20μg/ml ApCe1组的ALP蛋白，OCN蛋白和RUNX2蛋白的表达水平。
实验结果：
实验得到的结果如图1所示，可以看出使用含有20μg/ml ApCe1成骨培养基诱导的骨髓间充质干细胞中ALP蛋白，OCN蛋白和RUNX2蛋白表达水平显著的高于对照组。
实验步骤3：检测ApCe1对于骨髓间充质干细胞的细胞钙化的影响
按照每孔2×104个细胞的量将骨髓间充质干细胞接种于12孔板中，待12h细胞完全贴壁后，将培养基更换为含有20μg/ml ApCe1的成骨培养基，同时设置对照组，每个处理设置3个重复孔；成骨诱导14d后，去除培养基，使用PBS轻轻清洗3次后，使用多聚甲醛进行固定25min；去除多聚甲醛，使用PBS清洗细胞3次后，加入茜素红进行染色20min；染色完成后，使用PBS清洗3次后，使用倒置显微镜进行拍照；同时使用10％CPC溶解茜素红测定550nm吸光度。
实验结果：
实验得到的结果如图2和图3所示，可以看出使用ApCe1处理的细胞成骨分化诱导后细胞钙化的水平显著高于对照组(对照组的A值为0.82±0.05，20μg/ml ApCe1的A值为2.12±0.07)，说明ApCe1处理能够有效的促进骨髓间充质干细胞的钙化。
Claims (10)
1.一种用于治疗骨质疏松的药剂，其特征在于，所述药剂包括有效剂量的抗菌肽ApCe1和药学上可接受的辅料和/或载体。
2.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
3.根据权利要求1所述的药剂，其特征在于，所述药剂的剂型包括片剂、注射剂、丸剂，颗粒剂。
4.抗菌肽ApCe1在制备治疗骨质疏松药剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药剂通过提高骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化来治疗骨质疏松。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药剂的剂型包括片剂、注射剂、丸剂，颗粒剂。
8.抗菌肽ApCe1在制备促进骨髓间充质干细胞增殖的培养基中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽ApCe1的氨基酸序列为GIYTGRLLPVYIPQPRPPHPRLRR。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述培养基中抗菌肽ApCe1的浓度为大于等于2.5μg/ml。
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