CN118028212A - 土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用、药物 - Google Patents

土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用、药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用、药物;本发明采用超高速离心法获得土元外泌体,并通过实验证明,土元外泌体具有优异的促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的效果,并可显著诱导成骨分化的标志蛋白上调表达,可作为骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂,能够应用于制备抗骨质疏松药物。

Description

土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用、药物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体而言,涉及土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用、药物。
背景技术
骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一类系统性全身性的代谢疾病,其临床病理特症表现为,骨脆性增加,骨折概率增加;在显微结构体现出来的是骨小梁减少及骨微结构的破坏;目前,认为骨代谢的失衡是导致该疾病的主要原因。骨质疏松症可发生于不同性别和任何年龄,但多见于绝经后女性和老人,目前在临床上对该疾病尚无有效干预和预防手段。
细胞外囊泡是细胞分泌到细胞外具有不同大小的脂质膜囊泡。这些囊泡能够将各种分子从产生细胞运送到目标细胞。细胞外囊泡的三种主要亚型是微泡、外泌体和凋亡小体,在不同类型的细胞外囊泡中,外泌体是存在于不同生物体中的纳米大小的囊泡(30-150nm)。越来越多的证据表明,外泌体在细胞间的信息交流中发挥着重要作用,影响着生理和病理过程,已被用作纳米治疗剂、药物传递载体和生物标志物而得到广泛的研究。目前人们主要集中在研究哺乳动物和植物来源的细胞外囊泡,而昆虫类来源的外囊泡其组成和功能未见有报道。
土元别名地鳖虫、地乌龟,属鳖蠊科昆虫药用小动物。现代中医药典称“土鳖虫”,性寒、具有化瘀止血、接筋续骨、通月经的功效,主要用于治疗妇女血淤经闭、跌打损伤、瘀血肿痛等症,但将其应用于治疗骨质疏松疾病的研究未见报道。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用。
为解决上述技术问题,本发明提供了土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用。
较佳地,所述抗骨质疏松药物用作骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂的应用。
较佳地,所述土元外泌体的制备方法包括:
步骤S1、将土元打碎后浸泡到水中,进行孵育处理后,过滤处理,得到第一溶液;
步骤S2、将所述第一溶液进行第一次离心处理,提取上清液,使用第一过滤器进行过滤处理,得到第一上清液;
步骤S3、将所述第一上清液进行第二次离心处理,提取上清液,使用第二过滤器进行过滤处理,得到第二上清液;
步骤S4、将所述第二上清液进行第三次离心处理,所得沉淀即为土元外泌体。
较佳地,所述步骤S1中,所述土元的质量为m克与所述水的体积为v毫升,所述m与所述v之比为1:(10-20)。
较佳地,所述第一次离心处理的转速为4000-5000g,时间为20-30min,所述第二次离心处理的转速为9500-10500g,时间为20-30min,所述第三次离心处理的转速为107000g-109000g,时间为60-70min。
较佳地,所述步骤S1中,所述孵育处理的温度为15-26℃,时间为12-24h。
较佳地,所述步骤S2中,所述第一过滤器的孔径为70μm。
较佳地,所述步骤S3中,所述第二过滤器的孔径为40μm。
较佳地,所述步骤S1中,所述水为双蒸水。
与现有技术相比,本发明采用超高速离心法获得土元外泌体,并通过实验证明,土元外泌体具有优异的促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的效果,并可显著诱导成骨分化的标志蛋白上调表达,可作为骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂,能够应用于制备抗骨质疏松药物。
本发明还提供了一种药物,用于防治骨质疏松疾病,所述药物包括土元外泌体。
附图说明
图1为本发明实施例1中土元外泌体的透射电子显微镜图片;
图2为本发明实施例1中土元外泌体粒径分布图;
图3为实施例3中不同浓度的土元外泌体溶液对hBMSCs细胞活性影响的结果图;
图4为实施例4中不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的碱性磷酸酶染色光镜图;
图5为实施例4中不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的茜素红染色光镜图;
图6为实施例5中不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的标志蛋白凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂,下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例中的特征可以相互组合。术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的,即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。以上术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。如无特殊说明的,材料、设备、试剂均为市售。
本发明实施例提供了土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用。
与现有技术相比,本发明实施例采用超高速离心法获得土元外泌体,并通过实验证明,土元外泌体具有优异的促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的效果,并可显著诱导成骨分化的标志蛋白上调表达,可作为骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂,能够应用于制备抗骨质疏松药物。
本发明的一些实施例中,所述抗骨质疏松药物用作骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂的应用。
本发明的一些实施例中,所述土元外泌体的制备方法包括:
步骤S1、将土元打碎后浸泡到水中,进行孵育处理后,过滤处理,得到第一溶液;
步骤S2、将所述第一溶液进行第一次离心处理,提取上清液,使用第一过滤器进行过滤处理,得到第一上清液;
步骤S3、将所述第一上清液进行第二次离心处理,提取上清液,使用第二过滤器进行过滤处理,得到第二上清液;
步骤S4、将所述第二上清液进行第三次离心处理,所得沉淀即为土元外泌体。
本发明的一些实施例中,所述步骤S1中,所述土元的质量为m克与所述水的体积为v毫升,所述m与所述v之比为1:(10-20)。
本发明的一些实施例中,所述第一次离心处理的转速为4000-5000g,时间为20-30min,所述第二次离心处理的转速为9500-10500g,时间为20-30min,所述第三次离心处理的转速为107000g-109000g,时间为60-70min。
本发明的一些实施例中,所述步骤S1中,所述孵育处理的温度为15-26℃,时间为12-24h。
本发明的一些实施例中,所述步骤S2中,所述第一过滤器的孔径为70μm。
本发明的一些实施例中,所述步骤S3中,所述第二过滤器的孔径为40μm。
本发明的一些实施例中,所述步骤S1中,所述水为双蒸水。
本发明实施例还提供了一种药物,用于防治骨质疏松疾病,所述药物包括土元外泌体。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中使用的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)购于赛业(广州)生物科技有限公司,产品名称为OriCell®成人骨髓间充质干细胞,型号为HUXMA-01001。本发明附图中,使用*表示不同处理之间差异的显著性,其中,*表示p<0.05,**表示p<0.01,ns表示没有差异显著性。
实施例1、土元外泌体的提取
1.1、将土元打碎后浸泡到双蒸水中,在20℃下孵育20h,用医用纱布进行过滤,所得滤液经70μm筛网再次过滤,得到第一溶液;
1.2、将所述第一溶液进行第一次离心处理,提取上清液,使用孔径为70μm的过滤器进行过滤处理,得到第一上清液;所述第一次离心处理的转速为4500g,时间为20min;
1.3、将所述第一上清液进行第二次离心处理,提取上清液,使用孔径为40μm过滤器进行过滤处理,得到第二上清液;所述第二次离心处理的转速为10000g,时间为20min;
1.4、将所述第二上清液进行第三次离心处理,所得沉淀即为土元外泌体;将该沉淀用PBS缓冲液重悬,使用0.22μm的细菌筛过滤,得到土元外泌体悬浮液;所述第三次离心处理的108000g,时间为70min。
对所得土元外泌体进行透射电镜鉴定,图1为土元外泌体的透射电镜图片,从图1可以看出,土元外泌体形态呈典型膜性“杯盘”状结构。利用纳米颗粒跟踪分析仪测定土元外泌体的粒径大小,图2为土元外泌体的粒径分布图。从图2可以看出,土元外泌体粒径集中在100nm左右。
实施例2、土元外泌体蛋白浓度的测定实验
以BCA蛋白测定试剂盒对所获取的土元外泌体进行测试,具体步骤如下:
(1)将蛋白标准品加无菌PBS缓冲液稀释,配制成浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品;各浓度的蛋白标准品取20μL分别加入到96孔板的标准品孔中,用于制备标准曲线;
(2)将实施例1制的土元外泌体溶解于无菌PBS缓冲液中,得到土元外泌体溶液;取1μL土元外泌体溶液用PBS缓冲液稀释至20μL,加入到96孔板的样品孔中;
(3)向96孔板的标准品孔和样品孔中分别加入200μL的BCA工作液,在37℃下放置30min;
(4)用酶标仪测定A562值;
(5)根据标准曲线计算土元外泌体溶液的蛋白质浓度。
经过测定,实施例2中所得的土元外泌体溶液中蛋白浓度为14mg/mL。
实施例3、土元外泌体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)活性的影响实验
具体内容如下:
(1)将实施例1中制得的土元外泌体加入α-MEM完全培养基中,得到第一外泌体溶液和第二外泌体溶液,其中,第一外泌体溶液中土元外泌体的浓度为3.5μg/ml、第二外泌体溶液中土元外泌体的浓度为7μg/ml;以α-MEM完全培养基为空白对照溶液;
(2)将P5代人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)接种培养于96孔板中,接种密度为5×103/孔;待细胞贴壁后,以步骤(1)得到的第一外泌体溶液、第二外泌体溶液和空白对照溶液分别孵育处理1d、3d和7d;每孔按10:1的比例加入CCK-8试剂,在37℃下孵育2h,使用紫外分光光度计检测450nm的吸光度,结果见图3。
图3为不同浓度的土元外泌体溶液对hBMSCs细胞活性影响的结果图。需要说明的是,图3中0μg/ml、3.5μg/ml和7μg/ml分别对应空白对照溶液、第一外泌体溶液和第二外泌体溶液的实验结果。1day、3day和7day分别对应孵育处理1d、3d和7d的实验结果。从图3可以看出,经土元外泌体分别孵育1d、3d、7d后,人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的增殖活性均出现上调,表明本发明的土元外泌体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)没有毒性,并且能促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的增殖活性。
实施例4、土元外泌体促进人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化实验
具体内容如下:
(1)成骨培养基为含地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸酯的α-MEN完全培养基;其中,地塞米松的浓度为100nmol/L,抗坏血酸的浓度为50nmol/L,β-甘油磷酸酯的浓度为10nmol/L;在成骨培养基中分别加入实施例1中制得的土元外泌体,得到第一土元外泌体溶液和第二土元外泌体溶液,其中,第一土元外泌体溶液中土元外泌体的浓度为3.5μg/ml、第二土元外泌体溶液中土元外泌体的浓度为7μg/ml;以成骨培养基为空白对照溶液。
(2)将P5代人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)接种培养于12孔板中,接种密度为5×105/孔;待细胞贴壁后,以步骤(1)得到的第一土元外泌体溶液、第二土元外泌体溶液及空白对照溶液为培养基分别进行培养,每3天更换一次培养基。在细胞成骨分化培养3天后,去除培养基,用4%多聚甲醛固定细胞15min,然后每孔加入碱性磷酸酶染色液进行染色,在室温下孵育60min,使用PBS缓冲液洗去非特异性结合的碱性磷酸酶染色液,染色后的图像见图4。
(3)将P5代人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)接种培养于12孔板中,接种密度为5×105/孔;待细胞贴壁后,以步骤(1)得到的第一土元外泌体溶液、第二土元外泌体溶液及空白对照溶液为培养基分别进行培养,每3天更换一次培养基,在细胞成骨分化培养10天后,去除培养基,用75%乙醇固定细胞15min,然后每孔加入茜素红S染色液进行染色,在室温下孵育20min,使用PBS缓冲液去除非特异性结合的茜素红S染色液,染色后的图像见图5。
图4为不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的碱性磷酸酶染色光镜图,图5为不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的茜素红染色光镜图。图4和图5中0μg/ml、3.5μg/ml和7μg/ml分别对应空白对照溶液、第一土元外泌体溶液和第二土元外泌体溶液的实验结果。从图4和图5可以看出,经空白对照溶液处理的细胞染色、经第一土元外泌体溶液处理的细胞染色和经第二土元外泌体溶液处理的细胞染色的程度依次加深,表明土元外泌体能显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化,人骨髓间充质干细胞已成功分化为成骨细胞。
实施例5、土元外泌体对人骨髓间充质干细胞hBMSCs成骨标志蛋白的影响
通过Western blot检测诱导效果,具体内容如下:
(1)将实施例1中制得的土元外泌体加入α-MEM完全培养基中,得到第三土元外泌体溶液和第四土元外泌体溶液,其中,第三土元外泌体溶液中土元外泌体的浓度为3.5μg/ml、第四土元外泌体溶液中土元外泌体的浓度为7μg/ml;以α-MEM完全培养基为空白对照溶液;
(2)将P5代人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)接种于60mm细胞培养皿中,接种密度为5×105/孔;等细胞密度生长至80%后,以步骤(1)得到的三种溶液(第三土元外泌体溶液、第四土元外泌体溶液和空白对照溶液)分别为培养基分别进行培养,在RIPA裂解缓冲液中裂解细胞30min,在12000g的转速下离心10min,所得上清液用BCA蛋白测定试剂盒测定细胞总蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液进行配平后,放入100℃沸水中煮10min;从上述三种溶液所对应的每个分组中抽取15g蛋白加入10%的SDS-PAGE凝胶中,60V恒定电压电泳分离2h;分离后将蛋白转移至PVDF膜中,然后将膜放在5%脱脂牛奶中封闭1h,将膜置于RUNX2(1:1000)、ALP(1:1000)和GAPDH(1:1000)等特异性一抗中4℃孵育过夜;回收一抗后,用TBST洗膜30min,将膜与羊抗兔的二抗(1:5000)在室温下孵育1h,孵育后再次使用TBST冲洗1h。使用快速化学发光液均匀覆盖于膜上,放置1-2min,随后将膜取出放置于化学发光成像仪中检测,结果见图6。
图6为不同浓度的土元外泌体溶液诱导hBMSCs成骨分化的标志蛋白凝胶电泳图。图6中0μg/ml、3.5μg/ml和7μg/ml分别对应空白对照溶液、第三土元外泌体溶液和第四土元外泌体溶液的实验结果。从图6可以看出,ALP、RUNX2等成骨标志蛋白表达明显上升,表明土元外泌体可显著诱导成骨分化的标志蛋白上调表达,能显著促进人骨髓间充质干细胞成骨分化,并呈剂量依赖性。
另外,需要说明的是,虽然本发明披露如上,但本发明的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下,可进行各种变更与修改,这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.土元外泌体在制备抗骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抗骨质疏松药物用作骨髓间充质干细胞成骨分化诱导剂的应用。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述土元外泌体的制备方法包括:
步骤S1、将土元打碎后浸泡到水中,进行孵育处理后,过滤处理,得到第一溶液;
步骤S2、将所述第一溶液进行第一次离心处理,提取上清液,使用第一过滤器进行过滤处理,得到第一上清液;
步骤S3、将所述第一上清液进行第二次离心处理,提取上清液,使用第二过滤器进行过滤处理,得到第二上清液;
步骤S4、将所述第二上清液进行第三次离心处理,所得沉淀即为土元外泌体。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤S1中,所述土元的质量为m克与所述水的体积为v毫升,所述m与所述v之比为1:(10-20)。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述第一次离心处理的转速为4000-5000g,时间为20-30min,所述第二次离心处理的转速为9500-10500g,时间为20-30min,所述第三次离心处理的转速为107000g-109000g,时间为60-70min。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤S1中,所述孵育处理的温度为15-26℃,时间为12-24h。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤S2中,所述第一过滤器的孔径为70μm。
8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤S3中,所述第二过滤器的孔径为40μm。
9.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤S1中,所述水为双蒸水。
10.一种药物,用于防治骨质疏松疾病,其特征在于,包括土元外泌体。
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