CN105177023B - 一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD - Google Patents
一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种在真核细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD、该光敏降解子desVVD的编码基因、包含该编码基因的重组质粒载体。本发明提供了用该重组质粒载体制备光敏降解子desVVD或其突变体的方法，还提供了包含靶标蛋白融合该光敏降解子desVVD的融合蛋白。本发明的光敏降解子desVVD及融合该降解子的融合蛋白在真核细胞内的稳定性受蓝光调控。本发明提供通过蓝光控制或改变靶标蛋白在宿主细胞中的蛋白质水平的方法。该方法具有改变幅度大、蓝光灵敏度高、作用时间短、可恢复性强、细胞毒性小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域、生物化学领域、细胞生物学和生物物理学领域，涉及一种在真核细胞内其降解速率和稳定性受蓝光调控的光敏蛋白质降解子。具体说，利用蓝光提高光敏降解子在真核细胞内的稳定性，而在避光条件下该光敏降解子在真核细胞内发生降解。融合该光敏降解子的融合蛋白质在真核细胞内的降解和稳定性同样受到蓝光调控。
背景技术
基因敲除和RNA干扰技术是研究细胞内蛋白质功能最常用的方法。但是基因敲除技术无法获得看家基因编码的蛋白质缺失的表型。RNA干扰技术在研究蛋白质功能中最大的缺陷是对于稳定性高的蛋白质来说，编码的mRNA降解后，该蛋白质仍然在细胞内存在很长时间。RNA干扰是一个催化过程，没有浓度依赖的关系。同时，RNA干扰存在明显的非特异性，可能对其它细胞过程产生影响[Raina等：J Biol Chem,2010,285(15):11057-11060]。因此，目前对于研究看家基因编码的蛋白质的功能还没有特别有效和直接的方法。
条件性控制蛋白质降解的蛋白质敲除技术是研究蛋白质功能最直接的方法。目前已经报道的条件性控制蛋白质降解的方法主要有两种方式：温度控制[Dohmen等,Science,1994,263(5151):1273-1276]、化学小分子控制[Schneekloth等,J Am Chem Soc.2004,126(12):3748-3754；Nishimura等,Nature Methods.2009,6(12):917-U978；Pratt等,P NatlAcad Sci USA.2007,104(27):11209-11214；Banaszynski等,Cell.2006,126(5):995-1004；Iwamoto,Chem Biol.2010,17(9):981-988；Bonger等,Nat Chem Biol.2011,7(8):531-537]。温度控制蛋白质降解的方法最大的缺陷在于温度的改变可能较大程度地改变细胞的表型，因而难以区分表型的改变是由于温度改变引起还是蛋白质降解引起的。
化学小分子控制蛋白质降解的方法有以下几种方法：①化学小分子控制蛋白质泛素的发生进而控制靶标蛋白质降解[Schneekloth等,J Am Chem Soc.2004,126(12):3748-3754Nishimura等,Nature Methods.2009,6(12):917-U978]；②化学小分子控制蛋白质二聚化，引起断裂泛素的重组，进而导致泛素碳端连接的蛋白被切割分离，切割分离下来的蛋白质片段保持稳定，而不含化学小分子的情况下，整个融合蛋白在氮端降解子的作用下降解 [Pratt等,P Natl Acad Sci USA.2007,104(27):11209-11214]；③不稳定的蛋白质在化学小分子作用下保持稳定[Banaszynski等,Cell.2006,126(5):995-1004；Iwamoto,ChemBiol.2010,17(9):981-988]；④稳定的蛋白质在化学小分子诱导下暴露降解肽发生降解[Bonger等,Nat Chem Biol.2011,7(8):531-537]。不过，依赖蛋白质相互作用的方式，需要表达两个复杂的融合蛋白，因此在应用上存在一定的限制。目前真正将蛋白质敲除技术应用于基因功能发现或控制细胞生理的只有③这种方法。小分子化合物改变蛋白质稳定性的过程是一个不可逆过程，尤其是在活体内，小分子化合物的清除严重依赖其代谢的速率。同时该方法不具有空间分辨率。另外，可能要考虑到小分子化合物较高的成本，阻碍了该方法的应用。
光遗传学已经成为生命科学研究最炙手可热的一门新兴学科。光遗传学技术可以实现快速地、时空地、非侵入地对系统进行扰动，已经在许多神经科学研究方面获得了应用，包括光控制蛋白质相互作用、光控基因表达、光控信号转导、光控制蛋白质聚集、光控蛋白质活性等方面。光、氧、电压敏感(LOV)结构域是一类对光响应的光敏蛋白结构域，它们普遍存在于细菌、真菌和植物[Crosson等,Biochemistry.2003,42(1):2-10]。LOV结构域可以结合FAD或FMN、对蓝光敏感并发生光化学反应的半胱氨酸黄素加成产物，进而发生结构域构象改变和/或二聚化[Crosson等,Plant Cell.2002,14(5):1067-1075；Christie,Annualreview of plant biology.2007,58:21-45]。
最近，两个基于光遗传学的蛋白质降解调控方法相继获得了报道[Renicke等,Chem Biol.2013,20(4):619-626；Bonger等,Acs Chem Biol.2013]，这两个系统都是基于一个原理，黑暗下Lov2屏蔽降解标签，而蓝光照射下，由于lov2上的Jα螺旋解离，使降解标签暴露，被蛋白酶体识别并降解。由于靶标蛋白质在融合光敏蛋白lov2的同时还融合了一个降解子，因此，该方法最大的缺陷在于无论在光照还是黑暗条件下靶标蛋白质的浓度都发生了下降，同时靶标蛋白质的浓度在光照与黑暗下的区别并不是非常显著。
来自于粗糙麦胞杆菌的vivid(VVD)是一类最小的LOV结构域，利用该结构域构建的光遗传学方法具有响应快速、光灵敏度高、可逆性强、时空分辨率高、细胞毒性低等优点，该光敏蛋白已经应用于蓝光控制基因表达系统[Wang等,Nat Methods.2012,9(3):266-U264]。
本发明者首先发现野生型的VVD在真核细胞内其稳定性没有显著的差别，通过预试验选择，优选稳定性受蓝光调节的一类VVD突变体，称为光敏蛋白质降解子desVVD(简称光敏降解子)。在宿主细胞中，光敏降解子desVVD在蓝光照射下保持稳定，而在避光 处理的环境中发生降解。将靶标蛋白融合在这类蛋白的氮端或碳端都会造成其在真核细胞内的稳定性受到蓝光的调控。融合这类光敏降解子的靶标蛋白的降解调控具有显著的时空分辨率。这类光敏降解子可以适用于酵母细胞、果蝇细胞、哺乳动物细胞内靶标蛋白质稳定性的调控。这类光敏降解子已经成功使功能蛋白质的水平受蓝光的调控，从而完成了本发明。
发明概述
本发明的第一个目的是提供一种光敏降解子desVVD的编码基因。
本发明的第二个目的是提供包含所述光敏降解子desVVD编码基因的质粒载体。
本发明的第三个目的是提供所述光敏降解子desVVD编码基因编码的光敏降解子desVVD。
本发明的第四个目的是提供所述光敏降解子desVVD的制备方法。
本发明的第五个目的是提供所述光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白。
本发明的第六个目的是提供所述光敏降解子desVVD与所述融合蛋白在真核宿主细胞内的蛋白质水平的调控方法。
本发明的第一个方面，提供一种光敏降解子desVVD的编码基因，所述编码基因是在野生型VVD截去氮端36个氨基酸残基基础上至少含有Y50W突变的突变体的编码基因。
优选地，所述编码基因选自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39所示的基因。
本发明的第二个方面，提供包含所述光敏降解子desVVD的编码基因的表达载体。
本发明的第三个方面，提供所述编码基因编码的光敏降解子desVVD，其稳定性在真核细胞内受蓝光调控。
优选地，所述光敏降解子desVVD的序列选自序列表中的序列2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。
本发明的第四个方面，提供光敏降解子desVVD的制备方法。
光敏降解子desVVD的制备方法是利用大肠杆菌克隆菌株将光敏降解子desVVD的编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞表达载体转染/转化真核宿主细胞并表达光敏降解子desVVD。
在构建的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体基础上，设计突变引物，并以 此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表达载体，环化后转化大肠杆菌克隆菌株，可构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体，进而表达并分离纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。
本发明的第五个方面，提供光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白，其中所述靶标蛋白选自mCherry、SFGFP、Fluc、Ura3-mCherry，His3-mCherry，Sir2-mCherry，Hst2-mCherry和mAZ-mCherry。
优选地，本发明的光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白中，所述靶标蛋白选自mCherry、SFGFP和Fluc，所述融合蛋白分别为mCherry-desVVD融合蛋白、SFGFP-desVVD融合蛋白和Fluc-desVVD融合蛋白。
本发明的第六个方面，提供了光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白的融合蛋白在真核宿主细胞内的蛋白质水平的调控方法，即通过控制蓝光的强弱控制蛋白质水平的高低，或通过不断切换光照和黑暗的光照条件使蛋白质水平发生大幅度振荡。
发明详述
野生型的VVD在真核宿主细胞内的稳定性在蓝光照射和避光两种条件下并没有显著的差别。经过突变筛选，本发明提供了一系列在真核细胞内稳定性受蓝光调控的光敏蛋白的突变体。
本文所用术语“光敏蛋白质降解子”、或“光敏降解子”或“desVVD”，指一类在真核宿主细胞内其稳定性受蓝光调控的光敏蛋白结构域，可以结合FAD或FMN、对蓝光敏感并发生光化学反应的半胱氨酸黄素加成产物，进而发生结构域构象变化和/或二聚化[Crosson等,Plant Cell.2002,14(5):1067-1075；Christie,Annual review of plantbiology.2007,58:21-45]。
在蓝光照射下，光敏降解子desVVD在真核宿主细胞中保持稳定，而在避光处理的环境中发生降解。
本文所用术语“真核宿主细胞”指真核细胞，例如酵母细胞、果蝇细胞S2、哺乳动物细胞HEK293和Hela，但不局限于这些种类的真核细胞。
本文所用术语“靶标蛋白”指可在真核细胞内表达的蛋白质，包含mCherry、SFGFP、Fluc、Ura3-mCherry、His3-mCherry、Sir2-mCherry、Hst2-mCherry、mAZ-mCherry等，但不局限于这些蛋白质。
本文所用术语“融合蛋白”指光敏降解子desVVD与靶标蛋白融合而成的蛋白质，其稳定性在真核细胞内受蓝光调控。
本文所用术语“蛋白质水平”指在宿主细胞中光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白融合蛋白的蛋白质含量。
本发明提供了一种光敏降解子desVVD的编码基因，所述编码基因是在野生型VVD截去氮端36个氨基酸残基基础上至少含有Y50W突变的突变体的编码基因，优选地，所述编码基因选自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39所示的基因。
具体地说，本发明的编码基因选自序列1所示VVD(50)的编码基因、序列3所示的VVD(50,56)的编码基因、序列5所示VVD(50,71)的编码基因、序列7所示VVD(50,56,71)的编码基因、序列9所示VVD(40,50,56,71)的编码基因、序列11所示VVD(50,56,71,76)的编码基因、序列13所示VVD(40,50,56,71,76)的编码基因、序列15所示VVD(48,50,56,71)的编码基因、序列17所示VVD(50,51,56,71)的编码基因、序列19所示VVD(48,50,51,56,71)的编码基因、序列21所示VVD(48,50,52,56,71)的编码基因、序列23所示VVD(48,50,55,56,71)的编码基因、序列25所示VVD(50,51,55,56,71)的编码基因、序列27所示VVD(48,50,51,52,56,71)的编码基因、序列29所示VVD(48,50,51,55,56,71)的编码基因、序列31所示VVD(48,50,51,52,55,56,71)的编码基因、序列33所示VVD(48,50,56,67,71)的编码基因、序列35所示VVD(48,50,55,56,67,71)的编码基因、序列37所示VVD(48,50,51,52,56,67,71)的编码基因和序列39所示VVD(50,56,69,71)的编码基因。
本发明提供了一类包含所述光敏降解子desVVD的编码基因的质粒载体(见下表1)。
表1
| 质粒1 | pGADH-mCherry-VVD(50) |
| 质粒2 | pGADH-mCherry-VVD(50,56) |
| 质粒3 | pGADH-mCherry-VVD(50,71) |
| 质粒4 | pGADH-mCherry-VVD(50,56,71) |
| 质粒5 | pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71) |
| 质粒6 | pGADH-mCherry-VVD(50,56,71,76) |
| 质粒7 | pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71,76) |
| 质粒8 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,71) |
| 质粒9 | pGADH-mCherry-VVD(50,51,56,71) |
| 质粒10 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,56,71) |
| 质粒11 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,52,56,71) |
| 质粒12 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,55,56,71) |
| 质粒13 | pGADH-mCherry-VVD(50,51,55,56,71) |
| 质粒14 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,56,71) |
| 质粒15 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,55,56,71) |
| 质粒16 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71) |
| 质粒17 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,67,71) |
| 质粒18 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,55,56,67,71) |
| 质粒19 | pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,56,67,71) |
| 质粒20 | pGADH-mCherry-VVD(50,56,69,71) |
| 质粒21 | pGADH-Fluc-VVD(50,56) |
| 质粒22 | pGADH-Fluc-VVD(50,71) |
| 质粒23 | pGADH-Fluc-VVD(50,56,71) |
| 质粒24 | pGADH-SFGFP-VVD(50,56) |
| 质粒25 | pGADH-SFGFP-VVD(50,71) |
| 质粒26 | pGADH-SFGFP-VVD(50,56,71) |
| 质粒27 | pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry |
| 质粒28 | pGTEF-mCherry-VVD(50,56) |
| 质粒29 | pGADH605-mCherry-VVD(50,56,71) |
| 质粒30 | pAc5.1-mCherry-VVD(50,56) |
| 质粒31 | pAc5.1-mCherry-VVD(50,71) |
| 质粒32 | pAc5.1-mCherry-VVD(50,56,71) |
| 质粒33 | pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56) |
| 质粒34 | pcdna3.1-mCherry-VVD(50,71) |
| 质粒35 | pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56,71) |
| 质粒36 | pcdna3.1-Fluc-VVD(50,56) |
| 质粒37 | pcdna3.1-Fluc-VVD(50,71) |
| 质粒38 | pcdna3.1-Fluc-VVD(50,56,71) |
| 质粒39 | pGADH-Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71) |
| 质粒40 | pGADH-Ura3-mCherry-VVD(50,56,71) |
| 质粒41 | pGADH-His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71) |
| 质粒42 | pGADH-Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71) |
| 质粒43 | pGADH-mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76) |
本发明提供了一种由所述编码基因编码的光敏降解子desVVD，其序列选自序列表中的序列2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。所述光敏降解子desVVD的稳定性在真核细胞内受蓝光调控。在蓝光照射下，真核宿主细胞中的光敏降解子desVVD保持稳定，在黑暗下，光敏降解子desVVD发生降解。
本发明提供的光敏降解子desVVD是粗糙麦胞杆菌的VVD至少包括Y50W突变的突变体，还可以包含Y40E、M48E、L51A、I52S、M55A、N56K、V67A、C71V、C76A等突变的突变体，或是这些突变位点的两个、三个、四个、五个、六个、七个随机组合而成 的突变体。但是突变不局限于在这些突变位点上，突变后的氨基酸残基也不局限于给定的氨基酸残基，突变位点的总数也不局限于七个。
本发明提供了制备稳定的光敏降解子desVVD的方法。利用大肠杆菌克隆菌株将光敏降解子desVVD的编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞表达载体转染/转化真核宿主细胞并表达光敏降解子desVVD。
本发明提供的制备光敏降解子desVVD的方法中，在构建的表达截去氮端36个氨基酸残基的野生型VVD或是已知的一种突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体基础上，设计突变引物，并以此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表达载体，环化后转化大肠杆菌克隆菌株，构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体，表达并分离纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。
本发明提供了靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合的融合蛋白，其稳定性在真核细胞内受蓝光调控。在蓝光照射下，真核宿主细胞中的靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合的蛋白保持稳定，在黑暗下，该融合蛋白发生降解。
本发明提供的靶标蛋白与光敏降解子desVVD融合的融合蛋白中，靶标蛋白可选自mCherry、SFGFP、Fluc、Ura3-mCherry，His3-mCherry，Sir2-mCherry，Hst2-mCherry和mAZ-mCherry。
在一个优选实施方案中，提供了红色荧光蛋白mCherry与光敏降解子desVVD融合的mCherry-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。
在另一个优选实施方案中，提供了绿色荧光蛋白SFGFP与desVVD融合的SFGFP-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。
在另一个优选实施方案中，提供了荧光素酶Fluc与desVVD融合的Fluc-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主细胞内的蛋白质水平受蓝光调控。
本发明提供了调控光敏降解子desVVD或其与靶标蛋白的融合蛋白在真核宿主细胞内的蛋白质水平的方法。可通过控制蓝光的强度控制光敏降解子或其与靶标蛋白的融合蛋白在真核宿主细胞内的蛋白质水平。在不同的蓝光照射强度下，细胞中的光敏降解子或其与靶标蛋白的融合蛋白的蛋白质水平会维持在不同的水平，光照强度越强，蛋白质水平也越高。
本发明还提供了真核宿主细胞内用蓝光控制蛋白质水平振荡的方法，即通过不断切换光照和黑暗的光照条件，可使蛋白质水平发生大幅度的振荡。
本发明还提供了具有高空间分辨率的蛋白质降解调控方法。在空间上保证，在同一块平板上，光敏降解子desVVD保持稳定，而不直接受蓝光照射细胞的光敏降解子被降解。
本发明利用分子生物学手段产生和选择了在真核细胞内其降解速率和稳定性受蓝光调控的光敏降解子desVVD。本发明提供了该光敏降解子desVVD的编码基因、包含所述编码基因的重组质粒载体。本发明用该表达载体制备了光敏降解子desVVD，以及融合了靶标蛋白的融合蛋白。本发明还提供通过蓝光控制或改变靶标蛋白在宿主细胞中的蛋白质水平的方法。该方法具有改变幅度大、蓝光灵敏度高、作用时间短、可恢复性强、细胞毒性小等优点。
附图说明
图1显示酵母细胞的光照处理方式和光照强度。
图2显示表达mCherry-desVVD或mCherry的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的红色荧光值。(A)mCherry-VVD(50,56)；(B)mCherry-VVD(50,71)；(C)mCherry-VVD(50,56,71)；(D)mCherry-VVD(50,56,71,76)；(E)mCherry-VVD(40,50,56,71)；(F)mCherry-VVD(40,50,56,71,76)；(G)mCherry-VVD(48,50,56,71)；(H)mCherry-VVD(50,51,56,71)；(I)mCherry-VVD(48,50,51,56,71)；(J)mCherry-VVD(48,50,52,56,71)；(K)mCherry-VVD(48,50,55,56,71)；(L)mCherry-VVD(50,51,55,56,71)；(M)mCherry-VVD(48,50,51,52,56,71)；(N)mCherry-VVD(48,50,51,55,56,71)；(O)mCherry、mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)和mCherry-Atlov2-sODC；(P)mCherry-VVD(48,50,56,67,71)；(Q)mCherry-VVD(48,50,55,56,67,71)；(R)mCherry-VVD(48,50,51,52,56,67,71)；(S)mCherry-VVD(50,56,69,71)。
图3为表达mCherry-desVVD或mCherry的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的荧光成像图。
图4显示酵母细胞中的mCherry-desVVD经黑暗处理后的降解受MG132的部分抑制。(A)mCherry-VVD(50,56)；(B)mCherry-VVD(50,56,71)。
图5显示多种启动子表达mCherry-desVVD，经黑暗处理mCherry-desVVD都可以发生降解，蓝光处理则仍然保持稳定。
图6显示表达desVVD-mCherry的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的红色荧光值。
图7显示表达SFGFP-desVVD或SFGFP的酵母细胞经光照和黑暗处理后细胞的绿色荧光值(激发485nm，发射528nm)。(A)SFGFP-VVD(50,56)；(B)SFGFP-VVD(50,71)；(C)SFGFP-VVD(50,56,71)。
图8显示表达Fluc-desVVD的酵母细胞经光照或黑暗处理后细胞裂解Fluc活性。(A)Fluc-VVD(50,56)；(B)Fluc-VVD(50,71)；(C)Fluc-VVD(50,56,71)。
图9显示表达mCherry-desVVD的酵母细胞在不同的光照强度下维持不同的荧光水平。(A)mCherry-VVD(40,50,56,71)；(B)mcherry-VVD(40,50,56,71,76)。
图10显示表达mCherry-desVVD的果蝇细胞分别经光照和黑暗处理后细胞的红色荧光值。(A)mCherry-VVD(50,56)；(B)mCherry-VVD(50,56,71)。
图11为表达mCherry-VVD(50,56)的HEK293分别经光照和黑暗处理后细胞成像图。
图12显示表达mCherry-desVVD的HEK293分别经光照和黑暗处理后细胞的红色荧光值。(A)mCherry和mCherry-VVD(50,56)；(B)mCherry-VVD(50,71)；(C)mCherry-VVD(50,56,71)。
图13显示表达Fluc-VVD(50,71)(A)和Fluc-VVD(50,56,71)(B)的HEK293分别经光照和黑暗处理后细胞裂解液的Fluc活性。
图14显示表达Fluc-VVD(50,56)和Fluc的Hela分别经光照和黑暗处理后细胞裂解液的Fluc活性。
图15显示表征Ura3在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
图16显示表征His3在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
图17显示表征Sir2在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
图18显示表征Hst2在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
图19显示表征mAZ在酵母细胞中光照和黑暗处理下蛋白质水平的荧光值。
图20显示表达mCherry-ULD的细胞的荧光可重复性的振荡。
图21显示用不同强度的蓝光照射处理细胞，细胞中mCherry-desVVD的蛋白质可以维持在多种不同的水平。
图22显示空间调控酵母细胞荧光，蓝光只可以照射字母部分的细胞。处理后的细胞利用活体成像仪成像(kodak，美国)。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作进一步阐述。应该理解，这些实施例仅仅用于举例说明本 发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
材料和方法
实施例中主要采用常规基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译的“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中有关章节所述的方法。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按《分子克隆：实验指南》中所述条件，或按照制造提供试剂盒厂商所建议的条件执行。
实施例中所用的酵母表达质粒载体pGADH改造自ClonTech公司购买的pGADT7，将编码gal4AD结构域的基因序列切除获得启动子为ADH的酵母表达空质粒。实施例中所用的果蝇细胞表达质粒载体pAc5.1和哺乳动物细胞表达载体pcdna3.1购买自Life science公司。
实施例中的所用的克隆大肠杆菌菌株Mach1、BL21和酵母菌株BY4742均购自Invitroten公司，Mach1因包含tonA基因缺失突变而对T1和T5噬菌体具有抗性。实施例中表达所用的果蝇细胞S2、哺乳动物细胞HEK293和Hela。
实施例中普遍采用了聚合酶链式反应(PCR)。我们设计的用于PCR的所有引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自上海TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附赠相应聚合酶缓冲液和dNTP。NcoI、NheI、EcoRI、XhoI、HindIII、KpnI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermentas公司，购买时附带有10×TangoTM缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆试剂盒(含同源重组酶)购自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。
本发明实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(上海)，质粒小抽试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
本发明实施例中用到的主要仪器有：Biotek Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)，荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)，活体成像仪(美国Kodak公司)。
本发明实施例中所用的靶标蛋白和野生型光敏蛋白等的基因序列均通过计算机检索NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站获得。检索各蛋白编码基因的具体网站如下：
VVD：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/32405346？report＝genpept
SFGFP：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/379069012
mCherry：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/378532224
Fluc：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AFA52656.1
Ura3：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_010893.3
His3：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_014845.1
Sir2：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_010242.1
Hst2：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_015310.1
mAZ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_032779.2
实施例中用到的常规分子生物学方法
(一)聚合酶链式反应(PCR)：
1.目的片段扩增PCR：
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
2.长片段(>2500bp)扩增PCR：
扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：
或者
(二)核酸内切酶酶切反应：
1.对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：
2.对PCR产物片段进行双酶切的体系(n含义同上)：
3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。
(三)DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应：
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3’端和5’端连接反应。
T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。使5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：
(四)同源重组连接反应(按照CloneEZ克隆试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公司说明书操作)：
PCR产物片段扩增时在两侧加入了15bp与线性化载体两侧的15bp核酸序列同源的核苷酸序列，扩增得到的PCR产物两侧15bp核苷酸序列与线性化载体序列两侧核苷酸序列同源，在同源重组酶的作用下，PCR产物片段与线性化载体同源重组连接成环状。
注：n值视PCR产物片段的大小而不同，小于1kb时n＝4，1-2kb时n＝6，2-3kb时n＝8，大于3kb时n＝10。
(五)重组质粒转化酿酒酵母
酵母首先在YPD培养基(1％酵母粗提粉，2％蛋白胨和2％葡萄糖)中30℃培养，培养至OD600在1.0左右可以用于制备酵母转化感受态或冻存。转化质粒的酵母用营养缺陷型的合成培养基(包含YNB、葡萄糖、除缺陷型以外的氨基酸、核苷酸)30℃培养。
酵母转化方法参照文献[Gietz等,Nat Protoc.2007,2(1):35-37]。酵母细胞首先用1*TE缓冲液洗两次，然后用100μL含5mM醋酸锂的1*TE缓冲液重悬，并于30℃放置10min，之后加入约1μg的质粒，并加入700μL含10mM醋酸锂和40％PEG3350的1*TE缓冲 液稀释并混匀，放入30℃摇床中约30min后，加入88μL的DMSO，42℃热激7-10min。之后离心，并用1*TE缓冲液清洗两次，涂在营养缺陷型的合成培养基平板上。
(六)重组质粒转化果蝇细胞
脂质体转染(购自Invitrogen)：配制复合物1：质粒(单质粒0.2μg/mm2,双质粒各0.1μg/mm2)，opti-MEM(25μL/mm2)和复合物2：lipo2000(0.6μL/mm2)，opti-MEM(25μL/mm2)室温孵育5min。复合物1与2混合，并孵育20min，最后加入预先在孔板中培养的细胞并混匀。
(七)重组质粒转化哺乳动物细胞
哺乳动物细胞传代：用巴氏吸管吸走培养皿中的培养基，PBS清洗一次后用胰酶消化，再用2.5ml的培养基(含10％牛血清的DMEM培养基，购自Gibco)中和胰酶。新的培养皿中先加好信息培养基，再加入1ml重悬的细胞。放入培养箱之前要进行摇匀。用于铺板的细胞，最终1mm2的面积含200μL的培养基，例如分装前直接稀释成12ml(60mm2),但是96孔板除外，100μL/孔。
脂质体转染(购自Invitrogen)：配制复合物1：质粒(单质粒0.2μg/mm2,双质粒各0.1μg/mm2)，opti-MEM(25μL/mm2)和复合物2：lipo2000(0.6μL/mm2)，opti-MEM(25μL/mm2)室温孵育5min。复合物1与2混合，并孵育20min，最后加入铺好细胞的培养板中并混匀。
以下通过实施例和附图对本发明内容作进一步阐述。
实施例1.pGADH-mCherry-VVD(50)酵母细胞表达载体的构建
1.构建酵母细胞表达载体pGADH(不含gal4的AD结构域编码基因序列的pGADT7)
根据pGADT7序列设计gal4的AD结构域编码基因序列两端扩增载体的序列的引物：
引物P1：5’-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCC-3’
引物P2：5’-CTTTGCAAAGCTTGGAGTTGATTGT-3’
P1与gal4的AD结构域编码基因序列下游的25个核苷酸完全一致，P2与AD结构域编码基因序列上游的25个核苷酸完全反向互补。采用P1和P2引物，以pGADT7为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增不含AD结构域编码基因序列的载体序列。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照上面所述DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆菌克隆菌株Mach1，通过提取质粒获得pGADH。
2.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry
根据mCherry基因核苷酸序列设计以下引物：
引物P3：5’-TTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’
引物P4：5’-GACGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCA-3’
P3含NcoI酶切位点(下划线CCATGG)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突变的两个核苷酸，第12-27个核苷酸与mCherry基因的编码序列的5’端16个核苷酸完全一致，P4含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)，第10-26个核苷酸与mCherry基因的编码序列的3’端17个核苷酸(不包含终止密码子)完全反向互补。采用P3和P4引物，以含mCherry基因的pcdna3.1-mCherry载体(本实验室原先构建并保存)中的mCherry基因为模板,按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增mCherry基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和mCherry基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pGADH-mCherry质粒。
3.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry-VVD
根据VVD基因核苷酸序列设计以下引物：
引物P5：5’-CCCGAATTCCATACGCTCTACGCTCCC-3’
引物P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P5含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)，第10-27个核苷酸与VVD基因(不含1-36个氨基酸编码基因序列)的编码序列的5’端18个核苷酸完全一致，P6含XhoI酶切位点(下划线CTCGAG)，第10-25个核苷酸与VVD基因的编码序列的3’端16个核苷酸完全反向互补。采用P5和P6引物，以含VVD基因的pET28a-VVD载体(本实验室原先构建并保存)中的VVD基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用EcoRI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH-mCherry。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pGADH-mCherry-VVD质粒。
4.构建酵母细胞表达载体pGADH-mCherry-VVD(50)
要将VVD第50位的Tyr突变成Trp(Y50W)，根据Trp的密码子TGG设计突变引物：
P7:5’-GGCTGGCTGATTCAGATTATGAA-3’
P8:5’-CATAATGTCATAACCGCCGGGAG-3’
P7的第4-6个核苷酸是Trp的密码子TGG，第7-23个核苷酸与VVD蛋白质51位及下游氨基酸的编码基因序列的17个核苷酸完全相同。P8的序列与VVD蛋白质48位及上游氨基酸的编码基因序列的23个核苷酸完全互补。采用P7和P8引物，以pGADH-mCherry-VVD为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增的载体序列。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照上面所述DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆菌克隆菌株Mach1，通过提取质粒获得pGADH-mCherry-VVD(50)。
以相同的突变体构建方法构建了以下表达其它VVD突变体的pGADH-mCherry-VVD突变质粒载体，所用方法相同，但是所用的引物不同(以下引物对中，前者为正向引物，后者为反向引物)，模板质粒也可能不同。
pGADH-mCherry-VVD(50,56)(含Y50W，N56K突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50)
P9：5’-CCAAACCCCCAAGTAGAAC-3’
P10：5’-CCTCTTCATAATCTGAATCAG-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,71)(含Y50W，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50)
P11：5’-GTTGCTCTGATTCTGTGCGACC-3’
P12：5’-TGACGTGTCAACAGGTCCCAG-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)(含Y50W，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56)
P11：5’-GTTGCTCTGATTCTGTGCGACC-3’
P12：5’-TGACGTGTCAACAGGTCCCAG-3’
pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71)(含Y40E，Y50W，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P13：5’-GAAGCTCCCGGCGGTTATGACATT-3’
P14：5’-GAGCGTATGAGAACCGAATTCC-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,56,71,76)(含Y50W，N56K，C71V，C76A突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P15：5’-GCTGACCTGAAGCAAAAAGAC-3’
P16：5’-CAGAATCAGAGCAACTGACG-3’
pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71,76)(含Y40E，Y50W，N56K，C71V，C76A突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71)
P15：5’-GCTGACCTGAAGCAAAAAGAC-3’
P16：5’-CAGAATCAGAGCAACTGACG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,71)(含M48E，Y50W，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P17：5’-CAGAATCAGAGCAACTGACG-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,51,56,71)(含Y50W，L51A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P19：5’-GCTATTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3’
P20：5’-CCAGCCCATAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,56,71)(含M48E，Y50W，L51A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P19：5’-GCTATTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,52,56,71)(含M48E，Y50W，I52S，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P21：5’-CTGTCTCAGATTATGAAGAGGCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,55,56,71)(含M48E，Y50W，M55A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P22：5’-CTGATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)(含Y50W，L51A，M55A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P23：5’-GCTATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3’
P20：5’-CCAGCCCATAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,56,71)(含M48E，Y50W，L51A，I52S，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P24：5’-GCTTCTCAGATTATGAAGAGGCCAAACCCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,55,56,71)(含M48E，Y50W，L51A，M55A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P23：5’-GCTATTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)(含M48E，Y50W，L51A，I52S，M55A，N56K，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P25：5’-GCTTCTCAGATTGCTAAGAGGCCAAACCCC-3’
P18：5’-CCAGCCTTCAATGTCATAACCG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,67,71)(含M48E，Y50W，N56K，V67A，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,71)
P26：5’-CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3’
P27：5’-CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,55,56,67,71)(含M48E，Y50W，M55A，N56K，V67A，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(48,50,55,56,67,71)
P26：5’-CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3’
P27：5’-CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3’
pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,56,67,71)(含M48E，Y50W，L51A，I52S，N56K，V67A，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,56,71)
P26：5’-CAGGTCCCAGTTCTACTTGG-3’
P27：5’-CTGACACGTCAGTTGCTCTG-3’
pGADH-mCherry-VVD(50,56,69,71)(含Y50W，N56K，T69W，C71V突变)：
模板：pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)
P28：5’-TGGTCAGTTGCTCTGATTCTGTGCG-3’
P29：5’-GTCAACAGGTCCCAGTTCTAC-3’
实施例2.pGADH-Fluc-VVD(50,56)的构建
根据Fluc基因核苷酸序列设计以下引物：
引物P30：5’-GAACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’
引物P31：5’-CCCGAATTCCACGGCGATCTTTCCG-3’
P30含NcoI酶切位点(下划线CCATGG)，第5-23个核苷酸与Fluc基因的编码序列的5’端18个核苷酸完全一致，P31含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)，第10-25个核苷酸与Fluc基因的编码序列的3’端16个核苷酸(不包含终止密码子)完全反向互补。采用P30和P31引物，以含Fluc基因的pcdna3.1-Fluc载体(本实验室原先构建并保存)中的Fluc基因为模板,按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增Fluc基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒pGADH-mCherry-VVD(50,56)。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切mCherry基因序列，用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切的载体，纯化回收较大的片段即为酶切的载体(此时不含mCherry基因)，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pGADH-Fluc-VVD(50,56)质粒。
同样，按照构建pGADH-Fluc-VVD(50,56)的方法构建pGADH-Fluc-VVD(50,71)和pGADH-Fluc-VVD(50,56,71)，其中只有所用的载体不同，分别是pGADH-mCherry-VVD(50,71)和pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)。
同样，按照构建pGADH-Fluc-VVD(50,56)等三个质粒的方法构建pGADH-SFGFP-VVD(50,56)、pGADH-SFGFP-VVD(50,71)和pGADH-SFGFP-VVD(50,56,71)。所用的酶切位点相同，所用的引物如下(前者为正向引物，后者为反向引物)。
P32：GAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG
P33：GACGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCA
实施例3.pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry的构建
1.pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)的构建
根据VVD基因核苷酸序列设计以下引物：
引物P34：5’-CCCCCATGGCTCATACGCTCTACGCTCCC-3’
引物P35：5’-GAAGAATTCAGAAGCTTCCGTTTCGCACTGGAAAC-3’
P34含NcoI酶切位点(下划线CCATGG)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突变的两个核苷酸，第12-29个核苷酸与VVD基因(不含1-36个氨基酸编码基因序列)的编码序列的5’端18个核苷酸完全一致，P35含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)，第16-35个核苷酸与VVD基因的编码序列的3’端20个核苷酸完全反向互补。采用P34和P35引物，以含VVD(48,50,51,52,55,56,71)基因的pGADH-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)载体为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD(48,50,51,52,55,56,71)基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒pGADH。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD(48,50,51,52,55,56,71)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)质粒。
2.pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry的构建
根据mCherry基因核苷酸序列设计以下引物：
引物P36：5’-GTGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’
引物P37：5’-GAGCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCC-3’
P36含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)，第10-31个核苷酸与mCherry基因的编码序列的5’端22个核苷酸完全一致，P37含XhoI酶切位点(下划线CTCGAG)，第10-29个核苷酸与mCherry基因的编码序列的3’端20个核苷酸完全反向互补。采用P36和P37引物，以含mCherry基因的pcdna3.1-mCherry载体(本实验室原先构建并保存)中的mCherry基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增mCherry基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用EcoRI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry质粒。
实施例4.pGTEF-mCherry-VVD(50,56)的构建
设计以下引物扩增TEF启动子：
引物P38：5’-TTCGTTGCTTGCATGCATAGCTTCAAAATGTTTC-3’
引物P39：5’-CATCTTTGCAAAGCTAAACTTAGATTAGATTGC-3’
P38的第1-15个核苷酸(下划线部分)与pGADH载体上ADH启动子上游载体上的15个核苷酸完全相同，第16-34个核苷酸与TEF启动子核苷酸序列完全相同。P39的第1-15个核苷酸(下划线部分)与pGADH载体上ADH启动子下游载体上的15个核苷酸完全反向互补，第16-33个核苷酸与TEF启动子3’端核苷酸序列完全反向互补。采用P5和P9引物，以酵母BY4742基因组为模板，按照上面所述的扩增目的片段的PCR方法，扩增TEF启动子序列。
设计以下引物扩增除ADH启动子序列外的pGADH-mCherry-VVD(50,56)：
引物P40：5’-GCATACAATCAACTCCAAGCTT-3’
引物P41：5’-CTGCAGGCATGCAAGCAACGAA-3’
P40的核苷酸(下划线部分)与pGADH-mCherry-VVD(50,56)载体上ADH启动子下游载体上的22个核苷酸完全相同，P41的核苷酸(下划线部分)与pGADH-mCherry-VVD(50,56)载体上ADH启动子上游载体上的22个核苷酸完全反向互补。采用P40和P41引物，以pGADH-mCherry-VVD(50,56)为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增不含ADH启动子序列的载体序列。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收TEF启动子序列和不含启动子序列的载体序列。按上面所述同源重组连接方法将TEF启动子序列与不含启动子的载体同源重组，用此重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得酵母细胞表达载体pGTEF-mCherry-VVD(50,56)的构建。
实施例5.pGADH605-mCherry-VVD(50,56,71)的构建
设计以下引物：
引物P42：5’-CATGTAGGTGGCGGAGGGGAG-3’
引物P41：5’-CTGCAGGCATGCAAGCAACGAA-3’
P42的核苷酸序列与ADH启动子倒数第605-585个核苷酸序列完全相同。采用P42和P41引物，以pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)为模板，按上面所述长片段的PCR条件扩增不含ADH启动子部分5’端的序列的载体序列。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。按照上面所述DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应的步骤，将环化的反应液转化大肠杆菌克隆菌株 Mach1，通过提取质粒获得pGADH605-mCherry-VVD(50,56,71)。
实施例6.pAc5.1-mCherry-VVD(50,56)的构建
设计以下引物：
引物P43：5’-GGGGGTACCGCAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’
引物P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P43含有KpnI酶切位点(GGTACC)，第10-18个核苷酸是kozak序列，第16-37个核苷酸序列与mCherry编码基因的第1-22个核苷酸序列完全相同。采用P34和P35引物，以含mCherry-VVD(50,56)基因的pGADH-mCherry-VVD(50,56)载体为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD(50,56)基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pAc5.1。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50,56)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pAc5.1-mCherry-VVD(50,56)质粒。
按照上面相同的方法，相同的引物，分别应用pGADH-mCherry-VVD(50,71)和pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)为模板扩增目的片段，构建pAc5.1-mCherry-VVD(50,71)和pAc5.1-mCherry-VVD(50,56,71)。
实施例7.pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56)的构建
设计以下引物
引物P44：5’-GGGAAGCTTGCAACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’
引物P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P43含有HindIII酶切位点(AAGCTT)，第10-18个核苷酸是kozak序列，第16-37个核苷酸序列与mCherry编码基因的第1-22个核苷酸序列完全相同。采用P34和P35引物，以含mCherry-VVD(50,56)基因的pGADH-mCherry-VVD(50,56)载体为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增VVD(50,56)基因。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和EcoRI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pcdna3.1。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50,56)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56)质粒。
按照上面相同的方法，相同的引物，分别应用pGADH-mCherry-VVD(50,71)和pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)为模板扩增目的片段，构建pcdna3.1-mCherry-VVD(50,71)和pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56,71)。
按照上面相同的方法，以下面的引物：
P45：5’-GGAGCTAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
分别以pGADH-Fluc-VVD(50,56)、pGADH-Fluc-VVD(50,71)和pGADH-Fluc-VVD(50,56,71)为模板扩增目的片段，构建pcdna3.1-Fluc-VVD(50,56)、pcdna3.1-Fluc-VVD(50,71)和pcdna3.1-Fluc-VVD(50,56,71)。
实施例8.pGADH-Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)的构建
设计以下引物：
P46：5’-GGGACATGTCTATGACCATCCCACATATGAAATAC-3’
P47：5’-GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’
P48：5’-CATGGACCCAGAACCGAGGGTTTTGGGATGTTCATC-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P46含PstI酶切位点(下划线ACATGT)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突变的两个核苷酸，第12-35个核苷酸与Sir2基因的编码序列的5’端24个核苷酸完全一致。P47的第16-31个核苷酸与Sir2编码基因3’端16个核苷酸(不包含终止密码子)完全反向互补。P48的第16-36个核苷酸与mCherry编码基因3’端21个核苷酸完全相同。P47与P48的5’端15个核苷酸完全反向互补。采用P46、P47、P48、P6为引物，BY4742的基因组和pGADH-mCherry-VVD(48,50,56,71)为模板，按照下面的体系扩增Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)基因片段。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用NcoI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pGADH。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50,56,71)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得 pGADH-Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)质粒载体。
以相同的方式构建了以下几种功能基因和mCherry-VVD的突变体融合表达的酵母细胞表达载体：
pGADH-Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)
P49：5’-GGACCATGGCTATGTCGAAAGCTACATATAAG-3’
P50：5’-CATGGACCCAGAACCGTTTTGCTGGCCGCATC-3’
P51：5’-GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
pGADH-His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)
P52：5’-GGTCCATGGTGATGACAGAGCAGAAAGCC-3’
P51：5’-CATGGACCCAGAACCCATAAGAACACCTTTGG-3’
P53：5’-GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
pGADH-Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)
P54：5’-GGGACATGTCTATGTCTGTTTCTACCGCCTC-3’
P55：5’-GGTTCTGGGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’
P56：5’-CATGGACCCAGAACCTTCTTTAGCGGCTTTTTGTGAAG-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
pGADH-mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76)
P57：5’-GAACCATGGTGAAATCCTCCC-3’
P58：5’-CATAGACCCAGAACCTGCCTCCTCCTCCTCTCCCGAAGAC-3’
P51：5’-CATGGACCCAGAACCCATAAGAACACCTTTGG-3’
P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
实施例9.光敏降解子VVD(50,56,71)的纯化
设计以下引物：
引物P59：5’-CCCGGATCCCATACGCTCTACGCTCCC-3’
引物P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P59含BamHI酶切位点(下划线GGATCC)，第10-27个核苷酸与VVD(50,56,71)基因的编码序列的5’端18个核苷酸完全一致。P6含XhoI酶切位点(下划线CTCGAG)，第10-25个核苷酸与VVD基因的编码序列的3’端16个核苷酸完全反向互补。采用P59、 P6为引物，pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)为模板，按照所述方法扩增VVD(50,56,71)基因片段。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用BamH I和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pET28a。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VVD(50,56,71)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET28a-VVD(50,56,71)质粒载体。
按照萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第一章，方案1.25常规操作，制备感受态大肠杆菌BL21，用于pET28a-VVD(50,56,71)质粒转化。从重组质粒转化平板上挑取单个阳性菌落懿旨5mL LB培养基中，37℃培养过夜。第二天取培养菌转接100mL LB培养基锥形瓶，37℃振荡培养2-3小时。菌液OD600增至约0.6-0.8时加入终浓度0.7mM的IPTG诱导表达，18℃培养22-23小时。4000rpm离心30分钟收菌菌体，-20℃保存。
将含有上述菌体悬液的离心管置于冰上，冰浴超声波破碎细胞，超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司产，型号为SCIENTZ-IID)设定为探头Φ15，功率50％，工作1秒，间隔4秒，总工作时间为300秒。4℃，9600rpm离心破碎后的菌体悬液30分钟，分离上清液与沉淀。
用自装的Ni2+亲和层析柱纯化所需要重组蛋白
凝胶介质：通用公司(GE Healthcare)的Ni2+螯合Sepharose FastFlow，6mL柱(GEHealthcare)和0.22μm滤膜垫片。按照相关说明书，加入Ni2+亲和层析凝胶装柱；
平衡缓冲液：20mM磷酸钠、500mM氯化钠、50mM咪唑，pH7.4
洗涤缓冲液：20mM磷酸钠、500mM氯化钠、50mM咪唑，pH7.4
洗脱缓冲液：20mM磷酸钠、500mM氯化钠、50mM咪唑，pH7.4
采用重力流方式，先用5-10倍柱体积的抽虑脱气去离子水清洗柱。然后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱。取分离的菌体上清液上柱，收集流穿液。上样结束后用20倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后用5倍柱体积的洗涤缓冲液除去未结合的杂蛋白；再用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱的目的蛋白液。
镍柱亲和层析后的蛋白用自装的G25脱盐柱对所得的重组蛋白脱盐，获得溶解在100mM Tris缓冲液(100mM Tris，100mM NaCl，pH7.4)中的VVD(50,56,71)蛋白。
以所述同样的方法纯化VVD(40,50,56,71)、VVD(40,50,56,71)、VVD(40,50,56,71,76)和VVD(48,50,51,52,55,56,71)。
实施例10.mCherry-VVD(40,50,56,71)的纯化
设计以下引物：
引物P60：5’-CCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’
引物P6：5’-GGACTCGAGCTATTCCGTTTCGCAC-3’
P60含BamHI酶切位点(下划线GGATCC)，第10-27个核苷酸与mcherry基因的编码序列的5’端18个核苷酸完全一致。P6含XhoI酶切位点(下划线CTCGAG)，第10-25个核苷酸与VVD基因的编码序列的3’端16个核苷酸完全反向互补。采用P60、P6为引物，pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71)为模板，按照所述方法扩增mCherry-VVD(40,50,56,71)基因片段。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子，序列用BamH I和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pET28a。用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和mCherry-VVD(40,50,56,71)基因序列，按上面所述酶切后连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET28a-mCherry-VVD(40,50,56,71)质粒载体。
按照萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第一章，方案1.25常规操作，制备感受态大肠杆菌BL21，用于pET28a-VVD(50,56,71)质粒转化。从重组质粒转化平板上挑取单个阳性菌落懿旨5mL LB培养基中，37℃培养过夜。第二天取培养菌转接100mL LB培养基锥形瓶，37℃振荡培养2-3小时。菌液OD600增至约0.6-0.8时加入终浓度0.7mM的IPTG诱导表达，18℃培养22-23小时。4000rpm离心30分钟收菌菌体，-20℃保存。参照实施例9所述的方法纯化mCherry-VVD(40,50,56,71)。
以同样的方法纯化mCherry-VVD(50)、mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)等融合蛋白。
实施例11.光敏降解子在酵母细胞中的表达
按照上面所述，将酵母细胞表达质粒转化酵母BY4742，利用营养缺陷型培养基在平板上筛选阳性克隆。挑取阳性克隆至营养缺陷型的液体合成培养基中，在30℃、光照强度为0.67W·m-2和260rpm摇床转速的条件下培养。由于本发明所使用表达光敏降解子的方法均是用组成型启动子，例如TEF、ADH、ADH605，在不添加任何诱导剂的情况下，光敏降解子可以正常表达。
实施例12.在酵母细胞中，mCherry-VVD(50,56)的蛋白质水平受到蓝光调控
按照上面所述，将酵母细胞表达质粒转化酵母BY4742，利用营养缺陷型培养基在平板上筛选阳性克隆。从转化的平板中挑单克隆到48孔板中，每孔中含400μL培养基，在如图1的方式和光照强度下进行光照处理过夜，光照强度为0.67W·m-2(如图1)，大约12h后，对菌液稀释一倍，并平均分成两块48孔板培养，每块板中每孔仍然都是含400μL培养基，其中一块光照培养，另一块则是用两层锡箔纸包裹的方式避光处理。继续培养6h后取样，并用PBS缓冲液将细胞稀释至OD＝0.5的细胞浓度，利用多功能酶标仪(美国，BioTek)检测细胞的590nm激发、645nm发射的红色荧光值。图2A的结果表明表达 mCherry-VVD(50,56)细胞，蓝光照射后细胞的荧光照强度度显著高于黑暗处理细胞的荧光。
按照上面相同的方法，检测表达至少包含Y50W突变位点的mCherry-desVVD的细胞分别经光照和黑暗处理后的荧光。
图2B的结果是表达mCherry-VVD(50,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2C的结果是表达mCherry-VVD(50,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2D的结果是表达mCherry-VVD(50,56,71,76)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2E的结果是表达mCherry-VVD(40,50,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2F的结果是表达mCherry-VVD(40,50,56,71,76)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2G的结果是表达mCherry-VVD(48,50,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2H的结果是表达mCherry-VVD(50,51,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2I的结果是表达mCherry-VVD(48,50,51,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2J的结果是表达mCherry-VVD(48,50,52,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2K的结果是表达mCherry-VVD(48,50,55,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2L的结果是表达mCherry-VVD(50,51,55,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2M的结果是表达mCherry-VVD(48,50,51,52,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2N的结果是表达mCherry-VVD(48,50,51,55,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2O的结果是表达mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2P的结果是表达mCherry-VVD(48,50,56,67,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2Q的结果是表达mCherry-VVD(48,50,55,56,67,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2R的结果是表达mCherry-VVD(48,50,51,52,56,67,71)的细胞在光照和黑暗中的荧光。
图2S的结果是表达mCherry-VVD(50,56,69,71)的细胞分别在光照和黑暗中的荧光。
综合上面图2和图3的结果表明单独表达mCherry的细胞经蓝光照射和避光处理后荧光并无显著差异，说明蓝光照射对酵母细胞并无显著毒性。但是，mCherry-desVVD导致mCherry经黑暗处理后荧光值降低。因此，desVVD导致了在黑暗中整个融合蛋白在细胞中浓度的下降，而在光照处理的条件下，desVVD不会改变靶标蛋白质的浓度水平。图2的结果也表明，本发明方法中，靶标蛋白mCherry融合desVVD后，在光照处理的条件下mCherry的水平可以不发生改变，而在文献报道的光诱导蛋白质降解系统中，即便在 蛋白质相对稳定的状态下(黑暗处理)，与不融合光敏降解子的靶标蛋白相比，蛋白质水平仍然发生显著下降。另外，desVVD光敏降解子稳定性的变化幅度要显著大于基于lov2-sODC的光敏降解子。
实施例13.MG132抑制黑暗下mCherry-VVD(50,56)蛋白质水平的下降
按照上面所述，将酵母细胞表达质粒转化erg6缺失的酵母BY4742，该菌株允许蛋白酶体抑制剂MG132进入酵母细胞。参照实施例9的实验方法，不过在酵母细胞培养接近12小时后，先在细胞中分别加入50μM MG132或1mM PMSF后再分成两份，分别进行蓝光和黑暗处理。继续培养6小时按上面所述的方法检测细胞的荧光。图4A的结果表明MG132提高了表达mCherry-VVD(50,56)细胞在黑暗中的荧光，而对光照中的荧光没有影响，对照的PMSF对细胞的荧光没有影响。这些结果表明表达mCherry-VVD(50,56)的细胞在黑暗中蛋白质水平的下降是由于蛋白酶体介导mCherry-VVD(50,56)降解的结果。
参照以上的方法，表达mCherry-VVD(50,56,71)的酵母细胞经MG132处理后，黑暗下的细胞荧光下降明显受到抑制，光照组细胞的荧光与不用MG132处理的细胞的荧光相近(图4B)。图4A和B的结果表明黑暗下的细胞中mCherry-desVVD被蛋白酶体降解，但是光照处理的细胞仍然较稳定。黑暗处理细胞后由于表达mCherry的细胞在黑暗中荧光值并不下降(图2)，说明是desVVD引起整个融合蛋白质的降解。
实施例14.多种表达水平的mCherry-VVD(50,56,71)都会引起蛋白质降解
分别将pGTEF-mCherry-VVD(50,71)、pGADH-mCherry-VVD(50,71)和pGADH605-mCherry-VVD(50,71)转化酵母BY4742，在酵母细胞中分别在TEF、ADH和ADH605三种启动子启动下表达mCherry-VVD(50,71)，按上面所述的方法检测光照和黑暗处理的细胞的荧光。图5的结果说明在不同的表达水平下mCherry-VVD(50,71)在真核细胞中在光照下都保持稳定，而在黑暗下被降解。图5的结果还表明细胞中融合desVVD蛋白的浓度不会影响黑暗下该蛋白降解。
实施例15.VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry的蛋白质水平受到蓝光调控
按上面所述的方法将pGADH-VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry转化酵母BY4742，参照实施例9的实验方法，检测在黑暗和蓝光处理下VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry在酵母细胞中的蛋白质水平。图6的结果显示，蓝光处理表达VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry细胞的荧光照强度度显著高于黑暗处理细胞的荧光照强度度，在黑暗处理的酵母细胞中，VVD(48,50,51,52,55,56,71)-mCherry发生降解。图6结果表明desVVD无论在整个融合蛋白的N端还是C端，在黑暗下都会发生降解。
实施例16.SFGFP-VVD(50,56)的蛋白质水平受到蓝光调控
按上面所述的方法将pGADH-SFGFP-VVD(50,56)转化酵母BY4742，按照实施例9所述的方法检测蓝光处理表达SFGFP-VVD(50,56)的细胞的绿色荧光(485nm激发，528nm发射)。图7A的结果显示蓝光处理表达SFGFP-VVD(50,56)的细胞的绿色荧光显著高于黑暗处理的细胞，表明在黑暗下的酵母细胞，SFGFP-VVD(50,56)发生了降解。
参照以上的方法检测了表达SFGFP-VVD(50,71)(图7B)和SFGFP-VVD(50,56,71)(图7C)的细胞分别经光照和黑暗处理后细胞的绿色荧光，结果表明SFGFP-desVVD在黑暗处理的宿主细胞中也发生了降解。
实施例17.检测蓝光和黑暗处理表达Fluc-VVD(50,56)的细胞中Fluc的活力
按上面所述方法将pGADH-Fluc-VVD(50,56)转化酵母BY4742，按照上面所述，将酵母细胞表达质粒转化酵母BY4742，利用营养缺陷型培养基在平板上筛选阳性克隆。从转化的平板中挑单克隆到48孔板中，每孔中含400μL培养基，在如图1的方式和光照强度下进行光照处理过夜，光照强度为0.67W·m-2(如图1)，大约12h后，对菌液稀释一倍，并平均分成两块48孔板培养，每块板中每孔仍然都是含400μL培养基，其中一块光照培养，另一块则是用两层锡箔纸包裹避光处理。继续培养6h后取相同细胞量，裂解酵母细胞检测裂解细胞中的Fluc荧光素酶活力。每个样品取10μL三组平行的细胞裂解液到384白板中，加入20μL根据荧光素酶检测试剂盒(promega)配制的Fluc反应工作液，立即在酶标下检测反应液的发光值。根据发光值的高低即表征Fluc荧光素酶活力的高低。图8A的结果显示在黑暗下表达Fluc-VVD(50,56)的细胞的细胞裂解液中，Fluc荧光素酶活力要显著低于蓝光处理的细胞裂解液，表明在黑暗处理的酵母细胞中，Fluc-VVD(50,56)发生了降解。
参照以上的方法检测了表达Fluc-VVD(50,71)(图8B)和Fluc-VVD(50,56,71)(图8C)的细胞分别经光照和黑暗处理后细胞裂解液的荧光素酶，结果表明Fluc-desVVD在黑暗处理的宿主细胞中也发生了降解，而光照下宿主细胞中的Fluc-desVVD则更加稳定。
实施例18.真核细胞中mCherry-VVD(40,50,56,71)的稳定性具有光照强度依赖性
参照实施例9的方法，蓝光照射强度分别设为0.001W·m-2、0.03W·m-2、0.08W·m-2、0.15W·m-2、1W·m-2，检测在不同光照强度照射下表达mCherry-VVD(40,50,56,71)的细胞的荧光值。图9A结果显示随着光照强度增强，荧光值不断增强，说明随着光照强度不断增强，mCherry-VVD(40,50,56,71)的稳定性也在提高。
按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD(40,50,56,71,76)的细胞的荧光值，图9B表 明随着光照强度不断增强，mCherry-VVD(40,50,56,71,76)的稳定性也在提高。图9的结果表明desVVD在宿主细胞中的稳定性具有明显的光照强度依赖性。
实施例19.光敏降解子在果蝇细胞S2中的表达
按照上面所述的方法将果蝇表达质粒载体转染果蝇细胞S2并在培养基中培养，转染的果蝇细胞在蓝光照射的条件下培养24h，为了降低蓝光对果蝇细胞的毒性，蓝光采用照射1s停29s间隔照射，光照强度仍然为0.67W·m-2。由于本发明所使用的果蝇表达载体的启动子是组成型启动子，例如PAc5，因此在培养条件下不需要加入其它的诱导剂光敏降解子可以表达。
实施例20.在果蝇细胞中，mCherry-VVD(50,56)的水平受到蓝光调控
按照上面所述的方法将pAc5.1-mCherry-VVD(50,56)转染果蝇细胞S2，转染的果蝇细胞在所述蓝光照射的条件下培养24h。之后将转染并蓝光处理的细胞平均分成两份，一份继续光照处理，另一份用两层锡箔纸包裹避光处理，6-10h后离心收集细胞，并检测细胞的红色荧光值。图10A显示避光处理的果蝇细胞表达的mCherry-VVD(50,56)显著低于光照处理的样品，表明在黑暗处理的果蝇细胞S2中，mCherry-VVD(50,56)发生降解。
按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD(50,56,71)的果蝇细胞分别经过光照和黑暗处理后的荧光值(图10B)。图10的结果表明desVVD适用于果蝇细胞，在蓝光处理下desVVD稳定存在，而在黑暗下被降解。
实施例21.光敏降解子在哺乳动物细胞中的表达
按照上面所述的方法将pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56)转染两块6孔板上的人肾脏来源的转化细胞株HEK293。转染的细胞在蓝光处理(照射1s停29s)下，在含10％FBS的DMEM培养基中培养。由于本发明所使用的哺乳动物细胞表达载体的启动子是组成型的，例如CMV启动子，因而在不加入任何诱导剂的情况下光敏降解子可以表达。
实施例22.在哺乳动物HEK293中，mCherry-VVD(50,56)的水平受到蓝光调控
按照上面所述的方法将pcdna3.1-mCherry-VVD(50,56)转染两块6孔板上的人肾脏来源的转化细胞株HEK293，转染的细胞经过24h蓝光处理(照射1s停29s)，其中一块继续蓝光照射处理，另一块避光处理。6-10h后，先用荧光显微镜(Nikon，日本)成像(图11)，然后细胞用胰酶消化，消化后的细胞用酶标仪检测细胞的红色荧光值(如图12A)。而单独表达mCherry的细胞经蓝光照射后，荧光并没有发生显著下降，此蓝光照射条件对哺乳动物细胞无显著毒性。
按上面相同的方法检测表达mCherry-VVD(50,71)(图12B)和mCherry-VVD(50,56,71) (图12C)的HEK293细胞分别经过光照和黑暗处理后的荧光值。图11和图12表明在哺乳动物细胞中，desVVD在蓝光处理下desVVD稳定存在，而在黑暗下被降解。
实施例23.在哺乳动物HEK293中，Fluc-VVD(50,71)的蛋白质水平受到蓝光调控
按照上面所述的方法将pcdna3.1-Fluc-VVD(50,71)转染两块6孔板上的人肾脏来源的转化细胞株HEK293，转染的细胞经过24h蓝光处理(照射1s停29s)，其中一块继续光照处理，另一块避光处理。6-10h后，经PBS洗涤一次后，裂解细胞检测裂解细胞中的Fluc荧光素酶活力。每个样品取10μL三组平行的细胞裂解液到384白板中，加入20μL根据荧光素酶检测试剂盒(promega)配制的Fluc反应工作液，立即在酶标下检测反应液的发光值。根据发光值的高低即表征Fluc荧光素酶活力的高低。图13A的结果显示黑暗下表达Fluc-VVD(50,71)的细胞的细胞裂解液中，Fluc荧光素酶活力要显著低于蓝光处理的细胞裂解液。
按上面相同的方法检测表达Fluc-VVD(50,56,71)(图13B)的HEK293细胞裂解液分别经过光照和黑暗处理后的Fluc的活力。在黑暗处理的哺乳动物细胞中，Fluc-VVD(50,71)发生降解。图13的结果表明desVVD适用于哺乳动物细胞，在蓝光处理下desVVD稳定存在，而在黑暗下被降解。
实施例24.在哺乳动物Hela中，Fluc-VVD(50,56)的蛋白质水平受到蓝光调控
按照实施例17的方法将pcdna3.1-Fluc-VVD(50,56)转染两块6孔板上的人宫颈癌细胞Hela并检测在Hela细胞中的分别经蓝光和避光处理后Fluc的活力(图14)。在黑暗处理的哺乳动物细胞癌细胞中，Fluc-VVD(50,56)发生降解，而在蓝光照射下，Fluc-VVD(50,56)仍然保持在较高的浓度水平。图14结果表明desVVD适用于癌细胞中蛋白质降解的调控。
实施例25.Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)的稳定性受蓝光调控
按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pAGDH-Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)转化酵母BY4742，参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方法表征Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)的蛋白质水平，图15的结果表明在黑暗处理的酵母细胞中，Ura3-mCherry-VVD(50,56,71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图15的结果表明融合靶标蛋白Ura3的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
实施例26.His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)的稳定性受蓝光调控
按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)转化酵母BY4742，参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方法表征His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)的蛋白质水平， 图16的结果表明在黑暗处理的酵母细胞中，His3-mCherry-VVD(48,50,51,52,55,56,71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图16的结果表明融合靶标蛋白His3的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
实施例27.Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)的稳定性受蓝光调控
按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)转化酵母BY4742，参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方法表征Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)的蛋白质水平，图17的结果表明在黑暗处理的酵母细胞中，Sir2-mCherry-VVD(48,50,56,71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图17的结果表明融合靶标蛋白Sir2的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
实施例28.Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)的稳定性受蓝光调控
按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)转化酵母BY4742，参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方法表征Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)的蛋白质水平，图18的结果表明在黑暗处理的酵母细胞中，Hst2-mCherry-VVD(50,51,55,56,71)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图15的结果表明融合靶标蛋白Hst2的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
实施例29.mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76)的稳定性受蓝光调控
按照上面所述的酵母细胞表达质粒载体转化酵母细胞的方法，将pGADH-mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76)转化酵母BY4742，参照实施例9的方法，通过检测红色荧光值的方法表征mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76)的蛋白质水平，图19的结果表明在黑暗处理的酵母细胞中，mAZ-mCherry-VVD(50,56,71,76)发生降解，而在蓝光处理的细胞中仍然保持稳定。图15的结果表明融合靶标蛋白mAZ的融合蛋白的稳定性受蓝光调控。
实施例30.通过蓝光和避光的振荡处理，可以使mCherry-VVD(40,50,56,71,76)蛋白质的水平发生振荡
参照实施例9的方法，取转化pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71,76)酵母BY4742菌株的细胞，按所述方法在蓝光照射下培养12h。然后采取避光处理6h，之后切换蓝光处理6h，重复此步操作，共处理24h。在此过程中每2h一次取样检测细胞的红色荧光值。图20的结果表明mCherry-VVD(40,50,56,71,76)的蛋白质水平可以利用光照条件的切换发生反复震荡。
实施例31.蓝光光照强度可以控制mCherry-VVD(50,56,71)的蛋白质水平
参照实施例9的方法，取转化pGADH-mCherry-VVD(50,56,71)酵母BY4742菌株的细胞，按照所述方法在蓝光照射培养12h。然后平均分成五份，蓝光照射强度分别为最大光照(0.67W·m-2)的100％、12.5％、6.25％、3.13％、0，继续培养6h。图21的结果表明，mCherry-VVD(50,56,71)的蛋白质水平在不同的蓝光照射强度下可以维持在一定水平，照射强度越强，蛋白质水平越高，并且非常稳定。
实施例32.mCherry-VVD(40,50,56,71)在避光条件下的降解具有空间分辨率
参照实施例9的方法，取转化pGADH-mCherry-VVD(40,50,56,71)酵母BY4742菌株的细胞，按所述方法在蓝光照射下培养12h。准备一瓶固体培养基，加热，待温度降至50-60℃左右，加入培养的酵母(50ml的培养基加入1ml的菌液)，混匀，倒在平板上，在光照强度为0.67W·m-2的蓝光照射下，28℃培养箱中培养48h。将整个平板用黑色胶带封闭，留下靠菌体底物的一面，贴上区域控制的胶面，只有字母部分可以透光(图22中的Mask)。培养结束后，利用活体成像仪(Kodak，美国)对平板进行荧光成像，激发滤光片570nm，发射滤光片670nm。图22的结果表明mCherry-VVD(40,50,56,71)的降解严格受光调控，只有蓝光直接照射的细胞的蛋白质才不会被降解，未被照射的细胞中的desVVD被降解。图22的结果说明desVVD在细胞中的稳定性调控具有显著的空间分辨率。
应该理解，在实施例或实验材料方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，可根据所需要获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常的操作技术下所得到的较佳数据。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料及可以应用于本发明中。文中所述的较佳实验方法与材料仅作为示范之用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用为参考。此外应该理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围内。
Claims (8)
1.一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：通过控制蓝光的强弱在蛋白质翻译后水平控制蛋白质水平的高低，或通过不断切换光照和黑暗的光照条件使蛋白质水平发生大幅度振荡；所述光敏降解子的稳定性在蛋白质翻译后水平上受蓝光调控；
所述光敏降解子编码基因选自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37和39所示的基因。
2.根据权利要求1所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：包含所述光敏降解子desVVD的编码基因的表达载体。
3.根据权利要求1所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于，所述光敏降解子desVVD的序列选自序列表中的序列2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40。
4.根据权利要求1所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：所述光敏降解子desVVD由以下步骤而制备：利用大肠杆菌克隆菌株将光敏降解子desVVD的编码基因构建到真核宿主细胞表达载体中，将该真核宿主细胞表达载体转染/转化真核宿主细胞并表达光敏降解子desVVD。
5.根据权利要求4所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：所述的制备方法还包括：在构建的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体基础上，设计突变引物，并以此引物扩增包含突变序列的真核宿主细胞表达载体，环化后转化大肠杆菌克隆菌株，构建包含新的突变类型的光敏降解子desVVD的真核宿主细胞表达载体，表达并分离纯化新的突变类型的光敏降解子desVVD。
6.根据权利要求1所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：所述光敏降解子desVVD与靶标蛋白的融合蛋白，其中所述靶标蛋白选自mCherry、SFGFP、Fluc、Ura3-mCherry，His3-mCherry，Sir2-mCherry，Hst2-mCherry和mAZ-mCherry。
7.根据权利要求6所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：所述靶标蛋白选自mCherry、SFGFP和Fluc，所述融合蛋白分别为mCherry-desVVD融合蛋白、SFGFP-desVVD融合蛋白和Fluc-desVVD融合蛋白。
8.根据权利要求7所述一种由编码基因编码的光敏降解子desVVD在真核宿主细胞内调控蛋白质水平的方法，其特征在于：所述融合蛋白在真核宿主细胞内调控蛋白质水平，通过控制蓝光的强弱控制蛋白质水平的高低，或通过不断切换光照和黑暗的光照条件使蛋白质水平发生大幅度振荡。
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