KR20110118231A

KR20110118231A - 형광표지 유전자 라이브러리를 이용한 결합단백질 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20110118231A
Application number: KR1020100037714A
Authority: KR
Inventors: 이지원; 김수현; 황정미; 김건화
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2011-10-31

Abstract

본 발명은 형광표지 유전자 라이브러리를 이용한 새로운 결합단백질 스크리닝 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 (a) (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계; (b) 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및 (c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 본 발명은 세포내에서 일어나는 물질결합(binding) 및 상호작용(interaction)을 살아있는 세포에서 실시간으로 검출하여 목적물질과 결합 또는 상호작용하는 미지의 표적물질을 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 현재까지 알려진 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하였고, 구성물 모두에 표지를 함으로써 정확도를 더욱 높일 수 있을 뿐 아니라 고속/대용량으로 결합여부를 판별할 수 있어 종래의 분석기술과 차별화되는 새로운 고속/대용량 결합단백질 검출 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

형광표지 유전자 라이브러리를 이용한 결합단백질 스크리닝 방법{Method for screening unknown binding partners using fluorescence protein-labeled singleton gene library}

본 발명은 형광표지 유전자 라이브러리를 이용한 새로운 결합단백질 스크리닝 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 (a) (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계; (b) 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및 (c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.

단백질, 펩티드, RNA 등 생체고분자물질들은 생체내의 표적물질과의 결합에 의해 그 기능이 나타낸다. 특히 이들 결합의 기본 단위는 단백질결합에 의해 매개되므로 특정 단백질에 결합하는 또 다른 단백질들을 파악하는 것은 이들 단백질들의 기능적 연관성을 나타내는 지표로 사용된다. 따라서 특정 단백질과 결합하는 미지의 결합단백질(들)을 확인하는 것은 세포 신호전달 기작 연구 뿐 아니라 신약 타겟을 결정할 수 있는 직접적인 기회를 제공함과 동시에 특정 신호전달 체계 내에서의 신약후보물질 발굴을 위한 기반 기술을 제공할 수 있다.

이를 위하여 현재 사용되고 있는 방법들로는 교차결합 (cross-linking), 친화크로마토그래피 (affinity chromatography), 면역침강법 (IP, immunoprecipitation) 등의 전통적인 in vitro 방법들과 효모교잡법 (Y2H, yeast two-hybrid), 형광공명에너지전이 (FRET, fluorescence resonance energy transfer), 분할단백질상보조합 (BiFC, bimolecular fluorescence complementation) 등 살아있는 세포에서 직접 단백질결합을 동정하는 in-cell 방법들이 개발되어 사용되고 있다.

하지만, in vitro 방법들의 경우 단백질의 생산과 분리/정제 과정이 요구되며 시험관내의 완충액의 조건과 추출된 단백질의 2차적인 변형 등의 문제점이 있어 생체내에서 일어나는 실제 상호작용과 상이한 정보를 제공할 수 있다는 가능성과 화학반응 또는 항체를 사용해야만 한다는 단점을 가지고 있으며 있으며, 이를 극복하기 위해 개발된 in-cell 방법들 중 가장 널리 사용되어 온 Y2H 방법의 경우 유전자 라이브러리를 사용하여 대량의 스크리닝을 수행할 수 있다는 장점이 있으나 막단백질이나 전사효소 등과 같은 핵단백질의 탐색이 어렵고 위양성 (false positive)이 높다는 단점을 가지고 있으며, FRET 방법의 경우 정확도는 높으나 형광공명에너지가 전이되기 위한 형광단백질 또는 형광물질의 위치를 결정하기 어려워 실험 성공률이 매우 낮다는 단점이 있고, BiFC 방법의 경우 막단백질과 핵단백질 등의 탐색에 사용할 수 있다는 장점이 있으나 FRET 방법과 마찬가지로 상보결합이 일어나기 위한 단백질의 상대적인 위치를 결정하기 어려워 실험 성공률이 낮다는 단점을 가지고 있다.

이와 같이 Y2H 및 FRET/BiFC 방법들의 경우 특정 단백질(목적물질, bait)에 결합하는 미지의 단백질(들)(표적물질, prey)을 스크리닝하는 가장 유용한 기술로 이용되고 있으나 상기한 바와 같이 높은 위양성과 낮은 성공률로 인해 단일 또는 소수의 단백질들에 대한 결합단백질(들)을 동정하거나 검증하기에는 적합하나 다수의 단백질(들)(목적물질, bait)에 대한 결합단백질(들)(표적물질, prey)을 고속으로 동정하기 위해서는 시간적/경제적 한계점을 지니고 있다.

현재, 제약업체는 새로운 신약발견(drug discovery) 기술에 막대한 투자를 하고 있으며, 이러한 투자의 생산성을 향상시키기 위해 노력하고 있다. 약효 스크리닝의 통상적인 작업과정은 화합물의 분주, 희석, 스크리닝 성분 혼합, 배양 및 검출, 스크리닝 데이터의 분석 및 결과 보고로 구성되며, 이 일련의 과정을 신속하고 효율적으로 처리하기 위해 게놈학, 프로테오믹스, 고속처리 스크리닝(High Throughput Screening, HTS) 등 대규모 고속처리 기술을 활용하고 있으며, 보다 소형화되고, 보다 자동화된 고속의 다중스크리닝 시스템을 지속적으로 개발, 활용하고 있다.

이러한 시스템을 이용하여 신규 작용점 도출시 마다 수백만 종의 화합물 라이브러리를 스크리닝하여 전체 화합물에 대한 생물활성 데이터를 확보하고 있으나, 향후 도출되는 수천종의 신약 작용점에 대해 보유 라이브러리를 보다 신속하고 효율적으로 스크리닝하기 위하여 새로운 스크리닝 방법이 지속적으로 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 종래 방법의 단점을 극복하고, 세포 내에서 일어나는 단백질들 간의 결합/상호작용을 고속으로 탐색하기 위해 형광표지 유전자를 이용하여 결합단백질들의 위치이동이 동시에 일어나게 하는 공동-전좌(co-translocation) 현상과 미지의 결합단백질(들)(표적물질, prey)을 스크리닝 하기 위해 단일 유전자들에 형광단백질 유전자를 결합시킨 라이브러리를 이용함으로써 상기 기술들의 단점인 위양성 및 낮은 검출율을 획기적으로 개선한 고속 결합분석 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 목적물질과 서로 상호작용하는 미지의 표적물질을 고속으로 정확하게 검출할 수 있는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;

(b) 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및

(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) (i) 목적물질(bait) 및 제1표지물질을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey), 제2표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(b) 신호물질을 처리하여 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물을 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 세포를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 키트를 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 기본 개념도를 나타낸다. 세포내에 발현된 제1구성물과 제2구성물의 목적물질과 표적물질의 분포는 모두 일반적으로 세포질 또는 핵질에 해당 단백질의 내재적인 성질에 의해 분포하며, 이동신호를 받은 제1구성물은 이동모듈에 의해 세포막으로 이동하게 되며(목적물질, 적색), 이 때 목적물질과 결합된 표적물질들도 세포막으로 이동하게 된다(binding status; 표적물질, 녹색). 이와는 달리 목적물질과 결합하지 않는 표적물질이라면 원래의 분포가 변하지 않게 된다(non-binding status; 목적물질, 녹색). 따라서 위와 같은 개념에 의해 표적물질의 세포막으로의 이동여부는 목적물질과 표적물질의 결합을 반영하게 된다.

따라서, 본 발명은

본 발명에서 목적물질(bait, molecule of interest) 및 표적물질(prey, target molecule)이란 각각 상호작용이 대상이 되는 물질을 나타낸다. 상기 목적물질은 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 한편, 표적물질은 목적물질과 상호작용 또는 결합하는 미지의 대상(unknown binding partners)이며, 고속, 대량의 분석을 위하여 라이브러리(library) 형태의 집합체 또는 이들의 일부를 나타낸다. 표적물질은 라이브러리를 구성하는 개개의 물질(예를 들어 단백질)일 수 있다. 바람직하게는 표적물질이 포함되는 라이브러리는 오폼 라이브러리(ORFeome library)일 수 있으며, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리일 수 있다.

상호작용의 검출 또는 스크리닝을 위해서 목적물질은 실험자가 알고 있는 물질을 나타내며, 표적물질은 라이브러리를 구성하는 개개의 물질을 지칭하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 목적물질과 표적물질을 서로 바꾸어 제1구성물 또는 제2구성물의 일부를 이룰 수 있다.

본 발명에서 제1표지물질 및 제2표지물질은 당업자가 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 물질을 나타내며, 이의 예로는 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle) 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 이에 제한되지는 않으나, 형광단백질, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 그 중 형광단백질로는 당 업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들어, GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein); RFP(Red Fluorescent Protein); mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein); CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein); YFP(Yellow Fluorescent Protein); AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein), BFP(Blue Fluorescent Protein) 등이 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 이에 제한되지는 않으나, 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 이에 제한되지는 않으나, 콜로이드 금, 철, 착색된 라텍스 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 표지물질의 탐색에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 제1표지물질 및 제2표지물질은 형광 단백질일 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 제1표지물질 및 제2표지물질은 GFP; EGFP, RFP; mRFP; DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein); CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein); YFP(Yellow Fluorescent Protein); AzG(Azami Green), HcR(Heteractis crispa red fluorescent protein, HcRed) 또는 BFP(Blue Fluorescent Protein)일 수 있다. 이 때, 제1표지물질 및 제2표지물질은 서로 구별되게 하기 위하여 별개의 형광 단백질인 것이 바람직하다. 한층 더 바람직하게는 본 발명의 제1표지물질 및 제2표지물질은 각각 서열번호 9(EGFP), 서열번호 11(mRFP), 서열번호 13(AzG) 또는 서열번호 15(HcR)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 10(EGFP), 서열번호 12(mRFP), 서열번호 14(AzG) 또는 서열번호 16(HcR)으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 이동모듈은 부착된 구성물을 세포내의 특정 영역으로 이동시키는 기능을 하는 부위이다. 라이브러리의 제작의 편의상 이동모듈은 목적물질(bait) 및 제1표지물질과 함께 제1구성물을 구성할 수도 있으나, 표적물질(prey) 및 제2표지물질과 함께 제2구성물을 구성할 수도 있다. 상기에서 세포내의 특정 영역으로의 이동은 외부 신호에 의해 또는 내재적으로 이동할 수 있으며, 세포내 특정 영역은 세포내 구조물로서 세포내에 존재하는 구분되고(separate), 구별되며(discreet), 증빙 가능한(identifiable) 요소를 나타낸다. 상기 세포내 특정 영역은 바람직하게는 세포막, 핵막 등의 막 구조물 또는 소포체, 골지체, 미토콘드리아, 리소좀 등의 세포내 소기관 및 그 외 세포내 특정 영역일 수 있다.

본 발명의 이동모듈은 상기 세포내 특정 영역에 따라 다양하게 적용될 수 있으나, 바람직하게는 단백질 인산화효소 C(protein kinase C, PKC)일 수 있으며, 당업계에 공지된 cPKC(classical PKC; PKC-alpha, PKC-beta, PKC-gamma), nPKC(novel PKC; PKC-delta, PKC-epsilon, PKC-eta, PKC-theta)를 비롯하여, 이들의 변이체일 수 있다. 이들은 모두 C1 도메인이라는 부분을 공통적으로 가지고 있으며, C1 도메인에 DAG(diacyl glycerol) 또는 TPA(phorbol ester, PMA)와 결합함으로써 세포막으로의 위치 이동이 유도된다. 본 발명의 이동모듈로 바람직하게는 PKC의 변이체를 사용할 수 있으며, 상기 변이체는 내재적인 신호전달기작으로 인한 교란현상을 최소화하기 위하여 PKC의 내재적인 인산화 활성을 제거한 변이체인 것이 더욱 바람직하다. 더 바람직하게는 본 발명의 이동 모듈은 서열번호 1(PRKCD), 서열번호 3(TMA), 서열번호 5(TMB) 또는 서열번호 7(TMD)로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2(PRKCD), 서열번호 4(TMA), 서열번호 6(TMB) 또는 서열번호 8(TMD)로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포의 검출은 표지물질에 따라서 당업계에 공지된 통상적인 검출방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 표지물질이 형광 단백질인 경우 형광 현미경을 사용하여 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출할 수 있다.

검출 결과, 세포내에 존재하는 제1구성물과 제2구성물은 초기에는 모두 세포질 또는 핵질에 무작위적으로 분포하며(내재적으로 이동하는 이동모듈의 경우 세포내 해당 특정 영역으로 이동), 이동신호를 받은 제1구성물은 이동모듈에 의해 세포막으로 이동하게 되며, 이 때 목적물질과 결합된 표적물질도 세포막으로 이동하게 된다. 이와는 달리 목적물질과 결합하지 않는 표적물질이라면 원래의 분포가 변하지 않게 된다. 따라서 위와 같은 개념에 의해 표적물질의 세포막으로의 이동여부는 목적물질과 표적물질의 결합을 반영하게 된다(도 1 참조).

그 결과, 본 발명의 방법은 기본적으로 살아있는 세포 내에서 일어하는 단백질들간의 직접결합 또는 복합체 결합을 영상분석을 통하여 고속으로 탐색할 수 있게 하며, 이를 확장한 형광표지 유전자 라이브러리를 이용함으로써 종래의 기술에 비해서 다음과 같은 유리한 점을 가지게 된다.

1) 살아있는 세포 내에서 일어나는 모든 결합분석을 대상으로 할 수 있다.

2) 세포 전체를 대상으로 하는 타 방법과 달리 세포내 위치이동 변화를 분석 척도로 사용함으로써 분석의 정확도가 높다.

3) 살아있는 세포 내에서 일어나는 결합을 탐색함으로써 in vitro 방법과는 달리 외부 환경에 영향을 받지 않는다.

4) 목적물질과 표적물질의 실시간 결합 측정이 가능하다.

5) 단일 목적물질과 복수개의 표적물질들 간의 복합체 결합을 검증 가능하다.

6) 목적물질과 탐색물질의 유전자 및 자극물질만을 사용할 경우 외부 물질의 세포내 유입에 의한 결합특성의 혼란을 원천적으로 배제한다.

7) 표적물질의 대량 표지 라이브러리를 사용하여 미지의 생체물질에 대한 결합 스크리닝이 가능하다.

8) HCS(High Contents Screening) 시스템과 연계한 고효율 시스템을 구현할 수 있다.

9) 외부자극의 종류 변경으로 신호전달 경로별 결합 특성을 분석할 수 있다.

10) 제1구성물 및 제2구성물 모두에 표지물질을 사용함으로 목적물질과 표적물질의 상대적인 정량이 가능하며, 표적물질의 외부자극 또는 내재적인 이동현상에 의한 실험적인 오류를 동시에 확인할 수 있어 위-양성 또는 위-음성 반응을 현저히 감소시켜 준다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 외부 신호에 의해서 본 발명의 이동모듈이 세포내 특정 영역으로 이동되도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법은 신호물질을 처리하는 것을 추가적으로 포함하여,

(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 수행될 수 있다.

상기에서 신호물질은 본 발명의 이동모듈의 이동을 유도하는 외부 신호를 발생시키는 물질을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 이동모듈로 PKC를 사용하는 경우 상기 신호물질은 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester), TPA(12-otetradecanoylphorbol-13-acetate), PDBu(phorbol 12, 13-dibutyrate), ATP(Adenosine triphosphate), tridecanoic acid, arachidonic acid, linoleic acid, DiC8, 130C937 및 PKC 활성화 관련 생장인자(growth factor)들을 비롯한 그 외 PKC 활성화 물질들일 수 있다.

상기에서 PMA의 처리농도는 바람직하게는 50nM 내지 5μM일 수 있으며, 더 바람직하게는 1μM로 처리할 수 있다. 상기 PMA의 처리농도가 50nM 미만의 경우 PKC를 사용한 이동모듈의 이동이 충분하지 않고, 5μM 초과의 경우 화학물질의 과다처리에 의한 비정상적인 현상들(세포사멸, 신호교란 등)이 발생하여 바람직하지 못하다.

또한, 본 발명은 (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물을 포함하는 세포를 제공한다.

상기 세포는 동물, 식물, 효모 및 박테리아의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 외의 경우 외부로부터 도입되는 제1구성물을 잘 받아들일 수 있고, 세포질과 핵 등의 세포내 소기관의 경계가 뚜렷하게 구별되는 세포가 바람직하다. 더 바람직하게는 CHO-k1(ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, hamster, Chinese), HEK293(ATCC CRL-1573, Homo sapiens, human), HeLa(ATCC CCL-2, Homo sapiens, human), SH-SY5Y(ATCC CRL-2266, Homo sapiens, human), Swiss 3T3(ATCC CCL-92, Mus musculus, mouse), 3T3-L1(ATCC CL-173, Mus musculus, mouse), NIH/3T3(ATCC CRL-1658, Mus musculus, mouse), L-929(ATCC CCL-1, Mus musculus, mouse), Rat2(ATCC CRL-1764, Rattus norvegicus, rat), RBL-2H3(ATCC CRL-2256, Rattus norvegicus, rat), MDCK(ATCC CCL-34, Canis familiaris)일 수 있다. 또한 그 밖에 각종 줄기세포, 각종 조직에서 추출된 세포 및 인위적으로 만들어진 유사 세포막 구조물일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제1구성물 및 제2구성물을 포함하는 세포를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 제1구성물 및 제2구성물을 포함하는 세포 이외에 표지물질의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명에서 제1구성물 및 제2구성물을 포함하는 세포는 당업계에 공지된 분자생물학적 방법을 통해 제조될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 제1구성물 및 제2구성물을 발현할 수 있는 각각의 발현벡터 또는 제1구성물 및 제2구성물을 모두 발현할 수 있는 발현벡터로 세포를 형질전환한 뒤, 발현벡터에서 제1구성물 및 제2구성물이 발현되도록 하는 방법이 바람직하다. 이를 위하여, 제1구성물의 경우 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적물질, 제1표지물질 및 이동모듈을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작하고, 제2구성물의 경우 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 표적물질 및 제2표지물질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제작한 뒤, 이를 동시에 또는 순차적으로 하나의 세포에 형질전환시킨 후에 발현벡터에서 제1구성물 및 제2구성물이 발현되도록 하는 방법을 사용할 수 있다. 이 때, 목적물질, 제1표지물질 및 이동물질을 암호화하는 뉴클레오티드에서 본 발명의 효과에 따른 기능을 발휘하는 한, 목적물질, 제1표지물질 및 이동물질의 순서는 무관하며, 이는 표적물질 및 제2표지물질을 암호화하는 뉴클레오티드에서도 같다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

세포로의 각각의 발현벡터의 형질전환은 당업계에 공지된 형질전환방법, 예를 들면, 인산칼슘법, 염화칼슘법, 염화루비듐법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 자성나노입자 매개법(magnetic nanoparticle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있다.

한편, 이와 같은 본 발명의 스크리닝은 고속, 대량으로 수행하기 위하여 자동화된 스크리닝 방법에 따라 수행될 수 있다. 도 3은 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 대용량 검출 개념도를 나타낸다. 특정 목적물질을 제1구성물로 제작하고 이미 제작되어 있는 잠재적인 표적물질 라이브러리인 GFP가 표지된 유전자들을 목적물질과 함께 세포에 도입하여 발현시킨 후, 상기의 실험방법과 동일한 과정을 거쳐 각 표적물질의 녹색형광이 세포막으로 이동되었는지를 수동 또는 자동 현미경을 이용하여 영상 분석한다. 여기에서 세포막으로 녹색형광이 이동한 것은 양성(positive), 이동하지 않은 것은 음성(negative)로 나타내고 실험에 사용된 전체 표적물질들에 대한 실험결과를 분석할 경우 특정 목적물질과 결합하는 미지의 표적물질을 검출할 수 있게 된다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987))

따라서, 본 발명은 세포내에서 일어나는 물질결합(binding) 및 상호작용(interaction)을 살아있는 세포에서 실시간으로 검출하여 목적물질과 결합 또는 상호작용하는 미지의 표적물질을 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 현재까지 알려진 시험관내 방법 (in vitro 및 생화학적 방법), 항체결합 방법 (항체침전법), 복합 형광단백질 에너지전이 (FRET), 분할 단백질의 재결합 (Bi-FC) 및 형광간섭 (FCS) 등 기존의 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하였고, 구성물 모두에 표지를 함으로써 정확도를 더욱 높일 수 있을 뿐 아니라 고속/대용량으로 결합여부를 판별할 수 있어 종래의 분석기술과 차별화되는 새로운 고속/대용량 결합단백질 검출 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 기본 개념도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 대용량 검출 개념도를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

동물세포주 및 형질전환

<1-1> 동물세포주 및 이의 배양

본 발명자들은 CHO-k1(ATCC CCL-61, Cricetulus griseus, hamster, Chinese), HEK293(ATCC CRL-1573, Homo sapiens, human), HeLa(ATCC CCL-2, Homo sapiens, human), SH-SY5Y(ATCC CRL-2266, Homo sapiens, human) 세포주를 사용하였으며, 본 발명에 사용된 동물세포주의 배양조건은 각 세포주의 분양기관인 ATCC(American Type Culture Collection)사의 세포주 배양방법을 이용하였다. 단 CHO-k1은 F-12 배양액을 사용하였으며, HEK293, HeLa, SH-SY5Y 세포주는 DMEM 배양액을 사용하였고, 기타 배양조건은 동일하게 사용하였다. 한편, 각 세포들의 공통적인 배양방법은 다음과 같다.(당업자의 목적에 의해 세부적인 배양 조건은 달라질 수 있다.) 25 mM HEPES, 10% FBS(fetal bovine serum, v/v), 100 units/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin이 들어있는 pH7.4의 배양액(F-12 및 DMEM) 속에서 각 세포주를 37℃로 고정된 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다.

<1-2> 세포주의 형질전환

본 발명의 실시예에서 사용된 세포내 유전자 도입방법은 일반적으로 사용되는 리포좀-기반 방법 중의 하나인 ExGene 500(Fermentas Life Science)을 사용하였으며, 유전자의 농도 등 유전자 도입을 위한 모든 조건은 제조사의 지침을 따라 수행하였다. 보다 구체적으로 계대배양되고 있는 세포를 커버슬립이 들어있는 12-플레이트로 옮겨 분주를 하고 1일을 배양한 후, 0.9 ml의 신선한 배양액으로 교환하였다. 약 1 μg 정도의 형질전환 시료들을 0.1 ml의 150 mM NaCl 용액에 첨가한 후 완전히 섞고 3.3 μl의 ExGene 시약을 첨가하여 15초 동안 볼텍싱(Vortex)하여 섞어주었다. 이 용액을 상온에서 10분간 놓아둔 후 세포가 자라고 있는 커버슬립이 들어있는 12-플레이트의 각 웰(well)에 첨가하여 18시간 동안 배양을 하여 형질전환되도록 하였다.

< 실시예 2>

제1구성물 및 제2구성물의 디자인 및 제작

본 발명에서 제1구성물이란 세포질에서 고르게 발현되어 있는 단백질이 세포막으로 이동할 수 있는 모듈(이동모듈)을 포함하며, 이들 현미경을 이용하여 분석할 수 있는 형광단백질이 표지되어 결합되어 있고 마지막으로 목적물질이 결합될 수 있는 융합서열로 구성된다.

제2구성물이란 세포질 또는 핵질에서 고르게 발현되어 있는 단백질 또는 ORF(open reading frame)에 형광단백질이 표지되어 결합되어 있고 여기에 표적물질이 결합된 융합서열로 구성된다. 여기에서 표적물질이란 인간 유전체에서 밝혀진 단일 유전자 서열을 의미하며 현재 알려진 인간 유전자 중 클로닝이 되었거나 클로닝이 가능한 모든 유전자들을 대상으로 한다.

본 발명의 제1구성물 및 제2구성물에 사용한 벡터는 pCMV-SPORT6-PRKCD 벡터(GenBank accession No. BC043350; purchased from Openbiosystem (http://www.openbiosystems.com/); Catalog No. EHS1001-410108-BC043350)를 주형으로 하여 PCR 방법으로 클로닝하여 pEGFP-C3 벡터(GenBank accession No. U57607; Clontech catalog No. #6082-1, 서열번호 21)와 pmRFP-C3 벡터(mRFP; GenBank accession No. DQ903889, 서열번호 22)의 NheI/AgeI 위치에 삽입하여 제작하였다.

본 발명에 사용된 이동모듈은 인산화 효소인데, 인산화 기능에 있어 매우 중요한 위치로 알려진 311번째 아미노산(티로신, tyrosine)을 페닐알라닌(phenylalanine)으로(Y313F), 378번째 아미노산(리신, lysine)을 아르기닌(arginine)으로 각각 치환하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR) 돌연변이 유도방법을 사용하여 최종적으로 이동모듈을 제작하였다.

< 실시예 3>

제1구성물 및 제2구성물의 상호작용 확인

<3-1> 구성물의 발현 확인 및 상호작용 분석

도 2a는 p53 단백질과 mdm2 단백질의 결합을 본 발명 기본 분석 방법을 이용하여 분석한 것이다. 목적물질 p53 단백질과 표적물질 mdm2 단백질의 결합부위를 이용하여 TM-RFP-p53N(제1구성물)과 GFP-mdm2N(제2구성물)를 제작하여 HEK-293T 세포에 당업계에 널리 공지된 유전자 도입방법을 사용하여 과발현시켰다. PMA를 3분간 처리한 결과 세포내에 고르게 분포하고 있던 두 단백질들(a, non)은 이동모듈 및 p53N 단백질을 반영하는 적색형광 뿐 아니라 mdm2N 단백질을 반영하는 녹색형광이 세포막으로 이동(a, PMA)되었다. 따라서 이들 두 가지 단백질은 세포내에서 결합상태를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이와는 달리 도 2b는 p53 단백질과 결합하지 않는 것으로 알려진 CHAMP1 단백질을 제1구성물과 제2구성물로 제작하여 동일한 조건으로 실험을 수행한 결과 CHAMP1 단백질을 반영하는 녹색형광은 세포질에 그대로 유지되고 있으므로 이 단백질은 p53 단백질과 결합하지 않는다는 것을 확인 할 수 있었다.

<3-2> 제1구성물과 제2구성물 라이브러리를 이용한 고속 분석

도 3은 본 발명의 결합 및 비결합에 대한 대용량 검출 개념도를 나타낸다. 특정 목적물질을 제1구성물로 제작하고 이미 제작되어 있는 잠재적인 표적물질 라이브러리인 GFP가 표지된 유전자들을 목적물질과 함께 세포에 도입하여 발현시킨 후, 상기의 실험방법과 동일한 과정을 거쳐 각 표적물질의 녹색형광이 세포막으로 이동되었는지를 수동 또는 자동 현미경을 이용하여 영상 분석한다. 여기에서 세포막으로 녹색형광이 이동한 것은 positive, 이동하지 않은 것은 negative로 나타내고 실험에 사용된 전체 표적물질들에 대한 실험결과를 분석할 경우 특정 목적물질과 결합하는 미지의 표적물질을 검출할 수 있게 된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세포내에서 일어나는 물질결합(binding) 및 상호작용(interaction)을 살아있는 세포에서 실시간으로 검출하여 목적물질과 결합 또는 상호작용하는 미지의 표적물질을 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 현재까지 알려진 생체물질 상호작용 탐색 방법들이 가지는 부정확성 및 복잡성 등의 단점을 극복하였고, 구성물 모두에 표지를 함으로써 정확도를 더욱 높일 수 있을 뿐 아니라 고속/대용량으로 결합여부를 판별할 수 있어 종래의 분석기술과 차별화되는 새로운 고속/대용량 결합단백질 검출 방법을 제공하는 효과가 있다.

<110> Korea basic science institute
<120> Method for screening unknown binding partners using fluorescence
protein-labeled singleton gene library
<130> NP10-0019
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 676
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Pro Phe Leu Arg Ile Ala Phe Asn Ser Tyr Glu Leu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asn Gln Pro Phe Cys Ala Val Lys Met
20 25 30
Lys Glu Ala Leu Ser Thr Glu Arg Gly Lys Thr Leu Val Gln Lys Lys
35 40 45
Pro Thr Met Tyr Pro Glu Trp Lys Ser Thr Phe Asp Ala His Ile Tyr
50 55 60
Glu Gly Arg Val Ile Gln Ile Val Leu Met Arg Ala Ala Glu Glu Pro
65 70 75 80
Val Ser Glu Val Thr Val Gly Val Ser Val Leu Ala Glu Arg Cys Lys
85 90 95
Lys Asn Asn Gly Lys Ala Glu Phe Trp Leu Asp Leu Gln Pro Gln Ala
100 105 110
Lys Val Leu Met Ser Val Gln Tyr Phe Leu Glu Asp Val Asp Cys Lys
115 120 125
Gln Ser Met Arg Ser Glu Asp Glu Ala Lys Phe Pro Thr Met Asn Arg
130 135 140
Arg Gly Ala Ile Lys Gln Ala Lys Ile His Tyr Ile Lys Asn His Glu
145 150 155 160
Phe Ile Ala Thr Phe Phe Gly Gln Pro Thr Phe Cys Ser Val Cys Lys
165 170 175
Asp Phe Val Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Arg Gln Cys
180 185 190
Asn Ala Ala Ile His Lys Lys Cys Ile Asp Lys Ile Ile Gly Arg Cys
195 200 205
Thr Gly Thr Ala Ala Asn Ser Arg Asp Thr Ile Phe Gln Lys Glu Arg
210 215 220
Phe Asn Ile Asp Met Pro His Arg Phe Lys Val His Asn Tyr Met Ser
225 230 235 240
Pro Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Trp Gly Leu Val Lys
245 250 255
Gln Gly Leu Lys Cys Glu Asp Cys Gly Met Asn Val His His Lys Cys
260 265 270
Arg Glu Lys Val Ala Asn Leu Cys Gly Ile Asn Gln Lys Leu Leu Ala
275 280 285
Glu Ala Leu Asn Gln Val Thr Gln Arg Ala Ser Arg Arg Ser Asp Ser
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Gly Val Ala Gly Glu Asp Met Gln Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Gly Lys
325 330 335
Ile Trp Glu Gly Ser Ser Lys Cys Asn Ile Asn Asn Phe Ile Phe His
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Lys Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val Leu Leu Gly Glu Leu
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Lys Gly Arg Gly Glu Tyr Phe Ala Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val
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Val Leu Ile Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val
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Leu Thr Leu Ala Ala Glu Asn Pro Phe Leu Thr His Leu Ile Cys Thr
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Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Asp Lys Gly Arg Phe Glu Leu Tyr
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Asp Ile Leu Glu Lys Leu Phe Glu Arg Glu Pro Thr Lys Arg Leu Gly
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Val Thr Gly Asn Ile Lys Ile His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asn Trp
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Lys Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Asp Lys Asn Leu Ile Asp Ser Met Asp
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Gln Ser Ala Phe Ala Gly Phe Ser Phe Val Asn Pro Lys Phe Glu His
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Leu Leu Glu Asp
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<210> 2
<211> 2028
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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gacgaggcga accagccctt ctgtgccgtg aagatgaagg aggcgctcag cacagagcgt 120
gggaaaacac tggtgcagaa gaagccgacc atgtatcctg agtggaagtc gacgttcgac 180
gcccacatct atgaggggcg cgtcatccag attgtgctaa tgcgggcagc agaggagcca 240
gtgtctgagg tgaccgtggg tgtgtcggtg ctggccgagc gctgcaagaa gaacaatggc 300
aaggctgagt tctggctgga cctgcagcct caggccaagg tgttgatgtc tgttcagtat 360
ttcctggagg acgtggattg caaacagtct atgcgcagtg aggacgaggc caagttccca 420
acgatgaacc gccgcggagc catcaaacag gccaaaatcc actacatcaa gaaccatgag 480
tttatcgcca ccttctttgg gcaacccacc ttctgttctg tgtgcaaaga ctttgtctgg 540
ggcctcaaca agcaaggcta caaatgcagg caatgtaacg ctgccatcca caagaaatgc 600
atcgacaaga tcatcggcag atgcactggc accgcggcca acagccggga cactatattc 660
cagaaagaac gcttcaacat cgacatgccg caccgcttca aggttcacaa ctacatgagc 720
cccaccttct gtgaccactg cggcagcctg ctctggggac tggtgaagca gggattaaag 780
tgtgaagact gcggcatgaa tgtgcaccat aaatgccggg agaaggtggc caacctctgc 840
ggcatcaacc agaagctttt ggctgaggcc ttgaaccaag tcacccagag agcctcccgg 900
agatcagact cagcctcctc agagcctgtt gggatatatc agggtttcga gaagaagacc 960
ggagttgctg gggaggacat gcaagacaac agtgggacct acggcaagat ctgggagggc 1020
agcagcaagt gcaacatcaa caacttcatc ttccacaagg tcctgggcaa aggcagcttc 1080
gggaaggtgc tgcttggaga gctgaagggc agaggagagt actttgccat caaggccctc 1140
aagaaggatg tggtcctgat cgacgacgac gtggagtgca ccatggttga gaagcgggtg 1200
ctgacacttg ccgcagagaa tccctttctc acccacctca tctgcacctt ccagaccaag 1260
gaccacctgt tctttgtgat ggagttcctc aacggggggg acctgatgta ccacatccag 1320
gacaaaggcc gctttgaact ctaccgtgcc acgttttatg ccgctgagat aatgtgtgga 1380
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ttggaccggg atggccacat caagattgcc gactttggga tgtgcaaaga gaacatattc 1500
ggggagagcc gggccagcac cttctgcggc acccctgact atatcgcccc tgagatccta 1560
cagggcctga agtacacatt ctctgtggac tggtggtctt tcggggtcct tctgtacgag 1620
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gctggcttct cctttgtgaa ccccaaattc gagcacctcc tggaagat 2028
<210> 3
<211> 71
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMA
<400> 3
Met Lys Gln Ala Lys Ile His Tyr Ile Lys Asn His Glu Phe Ile Ala
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Trp Gly Leu Asn Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Arg Gln Cys Asn Ala Ala
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<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMA
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMB
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tttatcgcca ccttctttgg gcaacccacc ttctgttctg tgtgcaaaga ctttgtctgg 540
ggcctcaaca agcaaggcta caaatgcagg caatgtaacg ctgccatcca caagaaatgc 600
atcgacaaga tcatcggcag atgcactggc accgcggcca acagccggga cactatattc 660
cagaaagaac gcttcaacat cgacatgccg caccgcttca aggttcacaa ctacatgagc 720
cccaccttct gtgaccactg cggcagcctg ctctggggac tggtgaagca gggattaaag 780
tgtgaagact gcggcatgaa tgtgcaccat aaatgccggg agaaggtggc caacctctgc 840
ggcatcaacc agaagctttt ggctgaggcc ttgaaccaag tcacccagag agcctcccgg 900
agatcagact cagcctcctc agagcctgtt gggatatttc agggtttcga gaagaagacc 960
ggagttgctg gggaggacat gcaagacaac agtgggacct acggcaagat ctgggagggc 1020
agcagcaagt gcaacatcaa caacttcatc ttccacaagg tcctgggcaa aggcagcttc 1080
gggaaggtgc tgcttggaga gctgaagggc agaggagagt actttgccat cagggccctc 1140
aagaaggatg tggtcctgat cgacgacgac gtggagtgca ccatggttga gaagcgggtg 1200
ctgacacttg ccgcagagaa tccctttctc acccacctca tctgcacctt ccagaccaag 1260
gaccacctgt tctttgtgat ggagttcctc aacggggggg acctgatgta ccacatccag 1320
gacaaaggcc gctttgaact ctaccgtgcc acgttttatg ccgctgagat aatgtgtgga 1380
ctgcagtttc tacacagcaa gggcatcatt tacagggacc tcaaactgga caatgtgctg 1440
ttggaccggg atggccacat caagattgcc gactttggga tgtgcaaaga gaacatattc 1500
ggggagagcc gggccagcac cttctgcggc acccctgact atatcgcccc tgagatccta 1560
cagggcctga agtacacatt ctctgtggac tggtggtctt tcggggtcct tctgtacgag 1620
atgctcattg gccagtcccc cttccatggt gatgatgagg atgaactctt cgagtccatc 1680
cgtgtggaca cgccacatta tccccgctgg atcaccaagg agtccaagga catcctggag 1740
aagctctttg aaagggaacc aaccaagagg ctgggagtga cgggaaacat caaaatccac 1800
cccttcttca agaccataaa ctggactctg ctggaaaagc ggaggttgga gccacccttc 1860
aggcccaaag tgaagtcacc cagagactac agtaactttg accaggagtt cctgaacgag 1920
aaggcgcgcc tctcctacag cgacaagaac ctcatcgact ccatggacca gtctgcattc 1980
gctggcttct cctttgtgaa ccccaaattc gagcacctcc tggaagat 2028
<210> 9
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP
<400> 9
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP
<400> 10
tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 60
gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 120
gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 180
tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 240
agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 300
tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 360
tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 420
agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 480
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accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 600
acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 660
tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaag 716
<210> 11
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRFP
<400> 11
Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val
1 5 10 15
Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val
35 40 45
Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln
50 55 60
Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro
65 70 75 80
Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val
85 90 95
Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser
100 105 110
Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn
115 120 125
Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu
130 135 140
Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu
145 150 155 160
Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu
165 170 175
Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala
180 185 190
Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr
195 200 205
Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly
210 215 220
Ala
225
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<211> 674
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRFP
<400> 12
tggcctcctc cgaggacgtc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcgc atggagggct 60
ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 120
cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 180
tgtcccctca gttccagtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 240
actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 300
acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 360
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tgggctggga ggcctccacc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 480
tcaagatgag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgccgaggtc aagaccacct 540
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tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgcgcc gagggccgcc 660
actccaccgg cgcc 674
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<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AzG
<400> 13
Met Asp Pro Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Ile Lys Leu
1 5 10 15
Cys Met Arg Gly Thr Val Asn Gly His Asn Phe Val Ile Glu Gly Glu
20 25 30
Gly Lys Gly Asn Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Ile Leu Asp Leu Asn Val
35 40 45
Thr Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Val
50 55 60
Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr Pro Ala Asp Ile Gln
65 70 75 80
Asp Tyr Phe Lys Gln Thr Phe Pro Glu Gly Tyr His Trp Glu Arg Ser
85 90 95
Met Thr Tyr Glu Asp Gln Gly Ile Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser
100 105 110
Met Arg Gly Asp Cys Phe Phe Tyr Asp Ile Arg Phe Asp Gly Thr Asn
115 120 125
Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Lys Trp Glu
130 135 140
Pro Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Glu Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp
145 150 155 160
Val Asn Met Arg Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp
165 170 175
Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Glu Val Arg Leu Pro Asp Ala
180 185 190
His Lys Ile Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr
195 200 205
Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu
210 215 220
Pro Ser Gln Ala Lys
225
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AzG
<400> 14
atggacccca tggtgagtgt gattaaacca gagatgaaga tcaagctgtg tatgagaggc 60
actgtaaacg ggcataattt cgtgattgaa ggagaaggaa aaggaaatcc ttacgaggga 120
acgcagattt tagacctgaa cgtcactgaa ggcgcacctc tgcctttcgc ttacgatatc 180
ttgacaacag tgttccagta cggcaacagg gcattcacca agtacccagc agatattcag 240
gactatttca agcagacttt tcctgagggg tatcactggg aaagaagcat gacttatgaa 300
gaccagggca tttgcaccgc cacaagcaac ataagcatga ggggcgactg ttttttctat 360
gacattcgtt ttgatggcac caactttcct cccaatggtc cggttatgca gaagaagact 420
cttaaatggg agccatccac tgagaaaatg tacgtagagg atggagtgct gaagggtgat 480
gttaacatgc gcctgttgct tgaaggaggt ggccattatc gatgtgattt caaaactact 540
tacaaagcaa agaaggaggt ccgtttgcca gacgcgcaca aaattgacca ccgcattgag 600
attttgaagc atgacaaaga ttacaacaag gtcaagctct atgagaatgc cgttgctcgc 660
tattctatgc tgccgagtca ggccaag 687
<210> 15
<211> 228
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HcR
<400> 15
Met Val Ser Gly Leu Leu Lys Glu Ser Met Arg Ile Lys Met Tyr Met
1 5 10 15
Glu Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Glu Gly Glu Gly Asp
20 25 30
Gly Asn Pro Phe Ala Gly Thr Gln Ser Met Arg Ile His Val Thr Glu
35 40 45
Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Pro Cys Cys Glu
50 55 60
Tyr Gly Ser Arg Thr Phe Val His His Thr Ala Glu Ile Pro Asp Phe
65 70 75 80
Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr
85 90 95
Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Glu
100 105 110
Gly Asn Cys Leu Ile Tyr Lys Val Lys Val His Gly Thr Asn Phe Pro
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Asn Lys Ser Gly Gly Trp Glu Pro Ser
130 135 140
Thr Glu Val Val Tyr Pro Glu Asn Gly Val Leu Cys Gly Arg Asn Val
145 150 155 160
Met Ala Leu Lys Val Gly Asp Arg His Leu Ile Cys His His Tyr Thr
165 170 175
Ser Tyr Arg Ser Lys Lys Ala Val Arg Ala Leu Thr Met Pro Gly Phe
180 185 190
His Phe Thr Asp Ile Arg Leu Gln Met Leu Arg Lys Lys Lys Asp Glu
195 200 205
Tyr Phe Glu Leu Tyr Glu Ala Ser Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu Pro
210 215 220
Glu Lys Ala Asn
225
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HcR
<400> 16
atggtgagcg gcctgctgaa ggagagtatg cgcatcaaga tgtacatgga gggcaccgtg 60
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agcgacctgc ccgagaaggc caac 684
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<211> 4727
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEGFP-C3 vector
<400> 17
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 660
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gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 780
ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 840
gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 900
cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 960
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aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 1140
gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 1200
cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 1260
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gcccgggatc caccggatct agataactga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg 1440
ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg 1500
caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 1560
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 1620
tcatcaatgt atcttaacgc gtaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1680
aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 1740
aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 1800
ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 1860
ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 1920
aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 1980
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ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 2400
attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca 2460
gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg 2520
ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 2580
tttgcaaaga tcgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga 2640
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cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 2760
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaagacga ggcagcgcgg 2820
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 2880
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cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 3000
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 3060
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 3120
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gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 3420
ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 3480
attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct 3540
ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccaccct agggggaggc 3600
taactgaaac acggaaggag acaataccgg aaggaacccg cgctatgacg gcaataaaaa 3660
gacagaataa aacgcacggt gttgggtcgt ttgttcataa acgcggggtt cggtcccagg 3720
gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt 3780
ccttttcccc accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg 3840
gggcggcagg ccctgccata gcctcaggtt actcatatat actttagatt gatttaaaac 3900
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 3960
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 4020
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 4080
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 4140
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 4200
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 4260
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 4320
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 4380
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4440
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4500
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4560
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4620
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 4680
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc catgcat 4727
<210> 18
<211> 4685
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pmRFP-C3 vector
<400> 18
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggtcgcca ccatggcctc ctccgaggac gtcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 660
cgcatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 720
ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggcggccc cctgcccttc 780
gcctgggaca tcctgtcccc tcagttccag tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 840
gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 900
atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 960
gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 1020
cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 1080
ctgaagggcg agatcaagat gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgccgag 1140
gtcaagacca cctacatggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caagaccgac 1200
atcaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgagcgc 1260
gccgagggcc gccactccac cggcgccctg tcagatctcg agctcaagct tcgaattctg 1320
cagtcgacgg taccgcgggc ccgggatcca ccggatctag ataactgatc ataatcagcc 1380
ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 1440
tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 1500
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 1560
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttaacgcgt aaattgtaag cgttaatatt 1620
ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1680
atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1740
gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1800
gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1860
aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1920
ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1980
gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 2040
ccgctacagg gcgcgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 2100
ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 2160
cttcaataat attgaaaaag gaagagtcct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt 2220
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2280
atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 2340
tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc 2400
cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 2460
tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 2520
tttttggagg cctaggcttt tgcaaagatc gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc 2580
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 2640
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 2700
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 2760
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 2820
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 2880
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 2940
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 3000
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 3060
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 3120
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 3180
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 3240
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 3300
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 3360
gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc 3420
tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg 3480
ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg 3540
cccaccctag ggggaggcta actgaaacac ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg 3600
ctatgacggc aataaaaaga cagaataaaa cgcacggtgt tgggtcgttt gttcataaac 3660
gcggggttcg gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc 3720
aatacgcccg cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag 3780
ggctcgcagc caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc ctcaggttac tcatatatac 3840
tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 3900
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 3960
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 4020
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 4080
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 4140
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 4200
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 4260
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 4320
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 4380
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 4440
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 4500
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 4560
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 4620
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcca 4680
tgcat 4685

Claims

하기 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법:
(a) (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;
(b) 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및
(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계.
하기 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법:
(a) (i) 목적물질(bait) 및 제1표지물질을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey), 제2표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;
(b) 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및
(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계
하기 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법:
(a) (i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;
(b) 신호물질을 처리하여 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및
(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이동모듈은 단백질 인산화효소 C(protein kinase C) 및 이들의 변이체로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 단백질 인산화효소 C 및 이들의 변이체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1표지물질은 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2표지물질은 GFP(Green Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), mRFP(Monomeric Red Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein), CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), AzG(Azami Green), HcR(HcRed, Heteractis crispa red fluorescent protein) 및 BFP(Blue Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
하기 단계를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 방법:
(a) (i) 목적물질(bait), RFP(Red Fluorescent Protein)인 제1표지물질 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)인 제2표지물질을 포함하는 제2구성물이 공동으로 발현하는 세포를 제조하는 단계;
(b) 신호물질을 처리하여 표적물질과 목적물질간 상호작용이 이루어지도록 하는 단계; 및
(c) 제1구성물 및 제2구성물의 세포내 분포를 검출하여 표적물질과 목적물질간 상호작용을 확인하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 신호물질의 처리는 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Phorbol ester)를 50nM 내지 5μM의 농도로 처리하는 것임을 특징으로 하는 방법.
(i) 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 포함하는 제1구성물 및 (ii) 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 포함하는 제2구성물을 포함하는 세포.
제10항에 있어서, 상기 세포는 (i) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적물질(bait), 제1표지물질 및 이동모듈을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 (ii) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 제2표지물질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 공동형질전환된 것임을 특징으로 하는 세포.
제10항에 있어서, 상기 세포는 (i) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 목적물질(bait), RFP(Red Fluorescent Protein)인 제1표지물질 및 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 이동모듈을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 (ii) 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 오폼(ORFeome) 라이브러리에서 선택된 표적물질(prey) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)인 제2표지물질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 공동형질전환된 것임을 특징으로 하는 세포.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CHO-k1 세포, HEK293 세포, HeLa 세포, SH-SY5Y 세포, Swiss 3T3 세포, 3T3-L1 세포, NIH/3T3 세포, L-929 세포, Rat2 세포, RBL-2H3 세포 및 MDCK 세포로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 세포.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 목적물질(bait)과 상호작용하는 표적물질(prey)의 스크리닝 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 자동화된(automated) 방법인 것을 특징으로 하는 방법.