CN104059898A - 一种高效表达v8蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效表达V8蛋白酶的方法，属于酶工程技术领域。本发明将融合了SUMO标签的V8蛋白酶基因，在大肠杆菌中进行表达，获得含有SUMO标签的V8蛋白酶，然后利用SUMO蛋白酶移除SUMO标签，获得具有活性的V8蛋白酶。酶活可达15.5U/mg，已经适用于重组蛋白制备和肽指纹图谱鉴定。

Description

一种高效表达V8蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及一种高效表达V8蛋白酶的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
V8蛋白酶(V8protease又称GluV8或Glu-c)英文名Endoproteinase Glu-Cfrom Staphylococcus aureus V8，属于谷氨酰内切酶I(EC3.4.21.19)家族，是一种丝氨酸蛋白酶，具有严格的底物特异性，能水解多肽链中谷氨酸和(或)天冬氨酸残基的羧基形成的肽键。
目前V8蛋白酶主要来源于金黄色葡萄球菌的提取，由于金黄色葡萄球菌的致病性，使其在生产和应用上受到很大的限制。很多异源表达方法大多存在一定的不足，例如该蛋白酶的强烈活性会对宿主产生伤害致使产量低等。
本发明旨在用Sumo作为酶原来抑制GluC的活性，以提高GluC在大肠杆菌中的产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型V8蛋白酶酶原，是在成熟V8蛋白酶的N端融合SUMO标签形成酶原。
所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，将第一位缬氨酸突变为亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸之外的疏水氨基酸。
所述成熟V8蛋白酶的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列。是将V8蛋白酶第1位的缬氨酸分别突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)。
所述成熟V8蛋白酶还优选在C端进一步融合His Tag。
所述SUMO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述SUMO标签优选在N端还添加His标签和TEV酶切位点，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的融合标签。
本发明要解决的第二个技术问题是构建一种高效表达所述V8蛋白酶酶原的大肠杆菌，是将成熟V8蛋白酶基因与SUMO标签基因融合，形成酶原基因，在大肠杆菌中进行表达，获得含有SUMO标签的V8蛋白酶，然后利用SUMO蛋白酶移除SUMO标签，获得具有活性的V8蛋白酶。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种构建所述大肠杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)人工合成优化过的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶基因(简称V8基因)。
(2)使用PCR方法在V8基因上下游加上与pET21-SUMO载体同源的序列，以便构建包含蛋白酶编码基因的载体质粒。
(3)使用同源重组的方法完成pET21-SUMO载体和V8基因的连接，获得重组表达质粒，序列正确的质粒转化BL21(DE3)，涂板，筛选阳性转化子。
所述重组表达质粒还可以通过先融合SUMO标签和V8基因，再与载体连接获得。
本发明还提供一种应用所述大肠杆菌生产V8蛋白酶的方法，包括如下步骤：
(1)挑取重组菌菌落转接试管培养至OD600约0.8，添加最终浓度为1mMIPTG，诱导培养。
(2)离心收集菌体，缓冲液重悬后破碎菌体，离心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗脱后脱盐，使用SUMO蛋白酶剪切SUMO标签，得到具有活性的V8蛋白酶。
(3)使用MonoQ、MonoS等柱子进一步纯化蛋白。
由于V8蛋白酶对大肠杆菌的毒性，任何没有完全抑制活性的酶原都能使大肠杆菌死亡而不能生产V8蛋白酶。并且，V8蛋白酶是一个很特殊的蛋白酶，它的成熟序列的N端靠近活性中性(图5)，如果N端添加氨基酸，它就会伸向活性中心而显著影响V8蛋白酶的活性。现有技术中，对于重组表达蛋白酶的研究主要是改造蛋白酶自身的酶原序列。Sumo标签有13kd足够大而且是个完整的球状结构域，当向V8蛋白酶N端添加Sumo标签时，既能很好地抑制V8蛋白酶在宿主体内的活性，避免对宿主造成伤害，又能通过Sumo蛋白酶将Sumo tag完全切除不残留一个氨基酸残基。但Sumo tag对与之相连的酶的首位氨基酸有选择性，不能是V、L、P、K。
本发明中，我们将V8蛋白酶首位的缬氨酸突变为丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)，并首次与Sumo tag融合形成一种新型酶原，实现了V8蛋白酶在大肠杆菌中的高效表达，并通过后期处理获得活性很好的V8蛋白酶，大大提高了GluC在大肠杆菌中的产量，摇瓶产量达到20mg/L培养基，酶活可达15.5U/mg，已经适用于重组蛋白制备和肽指纹图谱鉴定。
附图说明
图1：移除标签激活后的v8蛋白酶LC-MS检测结果
图2：V8蛋白酶酶活测定使用底物分子结构
图3：激活后的V8蛋白酶米氏常数双倒数计算图
图4：OD值与底物浓度的标准曲线
图5：原始V8蛋白酶结构
图6：突变后的V8蛋白酶结构，A：V1A突变酶，B：V1G突变酶，C：V1M突变酶，D：V1F突变酶。
具体实施方式
实施例1可溶性表达V8蛋白酶的大肠杆菌基因工程菌株的构建和培养
(1)所用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶基因的出发核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶成熟区氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。SUMO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
从V8蛋白酶的3维结构可以看出，在它成熟序列的N端增加任何氨基酸都会影响它的活性，因此V8蛋白酶的N端不能有任何氨基酸的增加。然而，在成熟区N端添加Sumo Tag时，Sumo Tag之后的氨基酸不能是P、K、L或V，因此，可以通过定点突变将GluC第1位的氨基酸V突变为A、G、M或F。突变后的V8蛋白酶的成熟区氨基酸序列分别如SEQ ID.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示，结构如图6所示。
(2)对于V1A突变体，使用PCR方法在编码突变后的V8蛋白酶的基因上下游加上与pET21-SUMO载体同源的序列，以便构建包含蛋白酶编码基因的载体质粒，其中SUMO标签N端添加了His标签和TEV酶切位点，V8蛋白酶的C端还添加了His tag，氨基酸序列如SEQ ID NO.9。Sumo标签前的His tag在V8蛋白酶激活后被一同切除。pET21-sumo载体来源于pET21a(novagen)和pET-sumo(Invitrogen)。用PCR从pET-sumo载体上获取sumo tag，N端再融合His Tag和TEV酶切位点，并将其插入pET21a载体上得到pET21a-sumo载体。
PCR上游引物：CACAGAGAAC AGATTGGTGG CGCCATCCTGCCGAACAACG AC
PCR下游引物：CACCACCACC ACCACCACTG ATGAGATCCGGCTGCTAACA AAGC
PCR反应体系如表1，反应条件如表2
表1V8基因PCR体系
表2V8基因PCR反应条件
同时对pET21-SUMO载体进行PCR处理，PCR反应体系如表3，反应条件如表4。
PCR上游引物：GCCACCAATC TGTTCTCTGT G
PCR下游引物：CACCACCACC ACCACCACTG A
表3pET21-SUMO载体PCR体系
表4pET21-SUMO载体PCR反应条件
(3)胶回收V8基因和pET21-SUMO载体测定浓度后按照V8基因、pET21-SUMO载体质量比1：1共转化Trans1-T1菌株，使其在菌体内完成同源重组，完成载体和基因的连接。涂板挑取阳性菌落，在试管中过夜培养，提取质粒保存并取样送测序。
(4)测序正确的质粒转化BL21(DE3)菌株，挑取转化正确的菌落测试表达和保存作为生产菌种。
培养基：
LB培养基：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、pH7.0。
固体培养基在此基础上添加2％琼脂粉。
获得工程菌株后，接种100ml三角摇瓶过夜培养，然后按照1：50接种1000ml培养瓶，37℃220rpm培养至OD600约为0.8，降温至16℃，添加IPTG(最终浓度为1mM)，培养10h，离心洗涤收集菌体。
实施例2大肠杆菌表达的V8蛋白酶纯化和激活
(1)Ni2+亲和层析
BufferA(Binding Buffer or Lysis Buffer)：
表5亲和层析Buffer A成分
BufferB(Elution Buffer)：
表6亲和层析Buffer B成分
使用5：1(mL/g)量的BufferA重悬收集的菌体，用高压均质机破碎细胞，离心收集上清，通过HisTrap FF柱亲和吸附蛋白，BufferB洗脱收集，脱盐。
添加SUMO蛋白酶，切除标签。按照SUMO蛋白酶说明书和洗脱蛋白量添加SUMO蛋白酶，4℃酶切3h完成蛋白的标签切除和激活，通过HisTrap HP柱吸附和洗脱激活后的V8蛋白酶。
(2)酶活测定：根据V8蛋白酶特性，参考文献Houmard J,Drapeau G R.Staphylococcal protease:a proteolytic enzyme specific for glutamoyl bonds[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1972,69(12):3506-3509，以及Kakudo S,Kikuchi N,Kitadokoro K,et al.Purification,characterization,cloning,andexpression of a glutamic acid-specific protease from Bacillus licheniformis ATCC14580[J].Journal of Biological Chemistry,1992,267(33):23782-23788，选择使用专一性底物Benzyloxycarbonyl-Phe-Leu-Glu-p-Nitroanilide(Z-Phe-Leu-Glu-pNA)，结构如图2。该物质委托上海吉尔生化公司合成，纯度为99.5％，状态为冻干粉，使用时用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mM，然后使用反应缓冲液稀释至使用浓度。Z-Phe-Leu-Glu-pNA的CAS号：104634-10-8，分子式：C34H39N5O9。
反应缓冲液：50mM Tris-HCl8.0，2mM CaCl2。
5×酶溶液：0.01mg/ml GluC，以反应缓冲液为溶剂。
底物溶液：0.5mM底物(10％DMF于反应缓冲液)。
(3)标准曲线的制作
由于吸光度测得的是OD值，并不能直接反应底物的浓度。我们需要建一个标准曲线，把反应底物的浓度和检测得到的OD值相联系。
表7标准曲线反应体系
将以上体系加入384吸光度孔板(Corning，3702)中，37℃反应，用M1000PRO(TECAN)以动力学模式读取410nm处吸光度的数据，每次采集间隔2min，直至所有检测孔内吸光度数据不增加为止。B1到B7扣除B8(空白)的数据为横坐标，使用底物浓度为纵坐标，作图得到图4所示的标准曲线。由标准曲线我们得知，产生1OD的吸光度消耗量0.3729mM的底物。(4)重组酶活的测定
定义1μg蛋白酶每分钟催化1μmol底物为1个酶活单位，计算的到此方法生产的蛋白酶酶活为15.5U/mg。
测得将第一位缬氨酸分别突变为丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸后的突变体的酶活分别为：15.5、13.7、16.5、15.8U/mg。
对于突变体V1A，按照米氏常数检测原理，进行双倒数计算，得出Km值为3.89mM，Vmax值为0.031mM/min。Kcat＝Vmax/[S]，得出kcat的值为465/min，Kcat/Km值为119/mM.min。由于重组GluC的分子量为29957。重组GluC的酶活U＝Kcat*1000/29957，为15.5U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种V8蛋白酶酶原，其特征在于，是在成熟V8蛋白酶的N端融合SUMO标签形成酶原。
2.根据权利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶是以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，将第一位缬氨酸突变为亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸之外的疏水氨基酸。
3.根据权利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的酶原，其特征在于，所述成熟V8蛋白酶的C端进一步融合His Tag。
5.根据权利要求1所述的酶原，其特征在于，所述SUMO标签的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
6.根据权利要求1所述的酶原，其特征在于，所述SUMO标签的N端还添加了His标签和TEV酶切位点，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的融合标签。
7.编码权利要求1-6任一所述酶原的基因。
8.一种高效表达权利要求1-6任一所述酶原的大肠杆菌，其特征在于，是将成熟V8蛋白酶基因与SUMO标签基因融合，形成酶原基因，在大肠杆菌中进行表达，获得含有SUMO标签的V8蛋白酶。
9.一种构建权利要求8所述大肠杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)人工合成金黄色葡萄球菌V8蛋白酶基因；
(2)使用PCR方法在V8基因上下游加上与pET21-SUMO载体同源的序列，以便构建包含蛋白酶编码基因的载体质粒；
(3)使用同源重组的方法完成pET21-SUMO载体和V8基因的连接，序列正确的质粒转化BL21(DE3)，涂板，筛选阳性转化子。
10.一种应用权利要求8所述大肠杆菌生产V8蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)挑取重组菌培养；
(2)离心收集菌体，缓冲液重悬后破碎菌体，离心取上清；Ni2+柱吸附蛋白，咪唑洗脱后脱盐，使用SUMO蛋白酶剪切SUMO标签，得到具有活性的V8蛋白酶；
(3)使用MonoQ、MonoS柱子进一步纯化蛋白。
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