CN114921444A

CN114921444A - 一种v8蛋白酶的制备方法

Info

Publication number: CN114921444A
Application number: CN202210561954.4A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 张静静; 安文琪; 邢体坤; 宋路萍
Original assignee: Henan Shengming Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Shengming Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114921444B

Abstract

本发明公开了一种V8蛋白酶的制备方法。所述方法包括如下步骤：使融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述V8蛋白酶，所述融合蛋白为将PelB信号肽融合于V8蛋白酶的N端后所得；所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。本发明采用四种不同信号肽Sig、DsbA、PelB和STII制备V8蛋白酶，并通过对V8蛋白酶表达量进行分析发现：PelB信号肽可以高效引导V8蛋白酶分泌至周质空间，其表达量显著高于其它信号肽，是V8蛋白酶周质空间分泌表达的最佳信号肽，可用于V8蛋白酶制品的表达和制备工作。

Description

一种V8蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种V8蛋白酶的制备方法。

背景技术

V8蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族，能特异水解谷氨酸或天冬氨酸残基羧基侧肽键，主要用于蛋白质酶切测序、肽图谱分析和肽质量指纹图谱分析。

V8蛋白酶来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，但该菌种具有很强的致病性，天然提取其限制使用。而且V8蛋白酶天然活性异源表达对宿主细胞产生毒性，表达量低。目前关于V8蛋白酶表达的报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种V8蛋白酶的制备方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了PelB信号肽的新用途。

本发明提供了PelB信号肽在如下A1)-A3)中任一种中的应用：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

与所述PelB信号肽相关的生物材料在如下A1)-A3)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品；

与所述PelB信号肽相关的生物材料为所述PelB信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

所述PelB信号肽的编码基因为如下(a1)-(a3)中任一种：

(a1)SEQ ID No.5第7-69位所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码上述PelB信号肽的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码上述PelB信号肽的DNA分子。

为了实现上述目的，本发明又提供了一种融合蛋白。

本发明提供的融合蛋白为将上述PelB信号肽融合于V8蛋白酶的N端后所得。

与所述融合蛋白相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

与所述融合蛋白相关的生物材料为所述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

所述融合蛋白的编码基因为如下(b1)-(b3)中任一种：

(b1)SEQ ID No.5第7-867位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码上述融合蛋白的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码上述融合蛋白的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的PelB信号肽编码基因或融合蛋白的编码基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的PelB信号肽编码基因或融合蛋白的编码基因75％或者更高同一性的基因序列，只要编码PelB信号肽或融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的序列并且等同于本发明的序列。

上述任一所述编码基因中，所述同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述任一所述编码基因中，所述75％以上的同一性可为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述任一所述编码基因中，所述严格条件可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述任一所述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主菌或宿主细胞中表达V8蛋白酶或上述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体可为含有V8蛋白酶的编码基因或上述融合蛋白的编码基因的表达载体。在本发明的具体实施例中，所述重组载体可为在pET26b表达质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒pET26b-PelB-V8。

所述重组菌可为含有上述编码基因或上述表达盒或上述重组载体的真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，所述重组菌为含有上述重组质粒pET26b-PelB-V8的BL21(DE3)大肠杆菌。

所述重组细胞系可为含有上述编码基因或上述表达盒或上述重组载体的原核生物细胞或真核生物细胞。所述真核生物细胞可为酵母细胞、HEK293细胞、CHO细胞或昆虫细胞。所述原核生物细胞可为细菌细胞，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌细胞。在本发明的具体实施例中，所述重组细胞系为含有重组质粒pET26b-PelB-V8的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。

上述融合蛋白或与上述融合蛋白相关的生物材料在如下A1)-A3)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品。

上述任一所述应用中，所述提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量为提高V8蛋白酶或其融合蛋白在宿主菌或宿主细胞中的表达量或产量。

所述宿主菌可为真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，所述宿主菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

所述宿主细胞可为原核生物细胞或真核生物细胞。所述真核生物细胞可为酵母细胞、HEK293细胞、CHO细胞或昆虫细胞。所述原核生物细胞可为细菌细胞，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌细胞。在本发明中的具体实施例中，所述宿主细胞为BL21(DE3)大肠杆菌细胞。

上述任一所述应用中，所述“V8蛋白酶检测产品”可为本发明制备的V8蛋白酶。本发明制备的V8蛋白酶可作为V8蛋白酶标准品，用于V8蛋白酶检测中的标准曲线绘制，进而实现V8蛋白酶检测。

所述“V8蛋白酶检测产品”还可为以本发明制备的V8蛋白酶为材料制备得到的V8蛋白酶抗体。该V8蛋白酶抗体作为V8蛋白酶检测抗体可用于以免疫法(如ELISA，免疫组化等)为基础的V8蛋白酶检测方法中，进而实现V8蛋白酶检测。

为了实现上述目的，本发明最后还提供了一种制备V8蛋白酶的方法。

本发明提供的制备V8蛋白酶的方法包括如下步骤：使上述融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述V8蛋白酶。

上述方法中，所述宿主菌可为真菌或细菌。所述真菌可为酵母。所述细菌可为大肠杆菌，具体可为携带DE3基因型的大肠杆菌。在本发明的具体实施例中，所述宿主菌为BL21(DE3)大肠杆菌。

进一步的，所述方法包括如下步骤：

1)将上述融合蛋白的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；

2)将所述重组菌进行诱导培养，得到诱导菌液；

3)从所述诱导菌液中提取周质空间蛋白，并从所述周质空间蛋白中纯化得到所述V8蛋白酶。

更进一步的，所述步骤1)中，所述融合蛋白的编码基因通过重组质粒导入宿主菌。所述重组质粒具体为在pET26b表达质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒pET26b-PelB-V8。

所述步骤2)包括如下步骤：培养(在37℃、180rpm振荡条件下培养)所述重组菌至OD_600nm值为0.6-1.0(或0.6-0.8或0.8-1.0或0.6或0.8或1.0)时，向培养体系中添加0.8-1.2mM(或0.8-1.0mM或1.0-1.2mM或0.8mM或1.0mM或1.2mM)的IPTG进行诱导培养。

所述诱导培养的条件可为在28℃、180rpm振荡培养条件下培养16-24小时(或16-20小时或16小时)。

所述步骤3)中，所述提取周质空间蛋白采用渗透休克法。所述纯化采用镍柱亲合层析。

所述渗透休克法中的高渗溶液包括10％蔗糖溶液、15％蔗糖溶液、20％蔗糖溶液、25％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液中的一种。在本发明的具体实施例中，所述渗透休克法中的高渗溶液是将水、蔗糖、EDTA和Tris混匀后得到的溶液，各溶质浓度分别为蔗糖20％、EDTA1mM、Tris 30mM。

所述渗透休克法中的低渗溶液包括1.0mM Mg²⁺溶液、2.5mM Mg²⁺溶液、5.0mM Mg²⁺溶液、10mM Mg²⁺溶液、20mM Mg²⁺溶液的一种。在本发明的具体实施例中，所述渗透休克法中的低渗溶液为5mM MgCl₂溶液(溶剂为水)。

上述任一所述应用或方法中，所述V8蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述V8蛋白酶的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明采用四种不同信号肽Sig、DsbA、PelB和STII制备V8蛋白酶，并通过对V8蛋白酶表达量进行分析发现：PelB信号肽可以高效引导V8蛋白酶分泌至周质空间，其表达量显著高于其它信号肽，是V8蛋白酶周质空间分泌表达的最佳信号肽。本发明提供的利用PelB信号肽制备V8蛋白酶的方法，经渗透休克法提取周质空间蛋白和亲合层析纯化获得的纯化后蛋白浓度为1.47mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳检测V8蛋白酶蛋白纯度大于90％。除此之外，本发明的制备方法不经包涵体纯化变性复性，纯化工艺简单，可有效降低生产成本，在V8蛋白酶制品的表达与制备中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为四种不同信号肽引导的V8蛋白酶表达质粒的酶切鉴定图。其中，泳道1为pET26b-Sig-V8酶切产物；泳道2为pET26b-DsbA-V8酶切产物；泳道3为pET26b-PelB-V8酶切产物；泳道4为pET26b-STII-V8酶切产物。

图2为V8蛋白酶诱导菌液SDS-PAGE电泳图。白色箭头为信号肽-V8蛋白酶条带，黑色箭头为V8蛋白酶条带。其中，泳道1为空BL21(DE3)阴性对照菌液；泳道2为pET26b-Sig-V8/BL21(DE3)诱导菌液；泳道3为pET26b-DsbA-V8/BL21(DE3)诱导菌液；泳道4为pET26b-PelB-V8/BL21(DE3)诱导菌液；泳道5为pET26b-STII-V8/BL21(DE3)诱导菌液。

图3为V8蛋白酶诱导菌液SDS-PAGE电泳图灰度分析图。箭头1为信号肽-V8蛋白酶峰图，箭头2为V8蛋白酶峰图。其中，A为pET26b-Sig-V8/BL21(DE3)诱导菌液；B为pET26b-DsbA-V8/BL21(DE3)诱导菌液；C为pET26b-PelB-V8/BL21(DE3)诱导菌液；D为pET26b-STII-V8/BL21(DE3)诱导菌液。

图4为V8蛋白酶周质空间提取SDS-PAGE电泳图。箭头标注为V8蛋白酶条带，其中，泳道1为空BL21(DE3)阴性对照菌液；泳道2为pET26b-PelB-V8/BL21(DE3)诱导菌液；泳道3为周质空间提取上清；泳道4为纯化后样品。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：

pET26b表达质粒：Novagen公司；

NdeI：NEB公司；

XhoI：NEB公司；

BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Amicon Ultra-0.5离心过滤装置：Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；

蛋白marker：Thermo Fisher公司；

Sure PAGE^TM,Bis-Tris,10x8,4-12％,12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司；

5×上样缓冲液：南京金斯瑞生物科技有限公司；

凝胶成像系统：Protein Simple公司；

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；

eStain^TM L1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司；

HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；

DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；

微量移液器：Eppendorf公司。

下述实施例中的V8蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，V8蛋白酶的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

实施例1、重组表达质粒的构建与鉴定

1、不同信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列的合成

委托上海百力格生物技术有限公司分别合成Sig、DsbA、PelB和STII四种不同信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列。

Sig信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列Sig-V8如SEQ ID No.3所示。

DsbA信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列DsbA-V8如SEQ ID No.4所示。

PelB信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列PelB-V8如SEQ ID No.5所示。

STII信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列STII-V8如SEQ ID No.6所示。

2、重组表达质粒的构建与鉴定

分别将不同信号肽引导的V8蛋白酶全长基因序列克隆至pUC57质粒，分别得到重组质粒pUC57-Sig-V8、pUC57-DsbA-V8、pUC57-PelB-V8和pUC57-STII-V8。然后使用NdeI和XhoI分别对重组质粒pUC57-Sig-V8、pUC57-DsbA-V8、pUC57-PelB-V8和pUC57-STII-V8进行双酶切，连接克隆至pET26b表达质粒中，分别获得重组表达质粒pET26b-Sig-V8、pET26b-DsbA-V8、pET26b-PelB-V8和pET26b-STII-V8。

(1)酶切鉴定

使用NdeI和XhoI对四个重组表达质粒进行双酶切，酶切鉴定结果如图1所示。由图可见，NdeI和XhoI双酶切后质粒片段大小为5225bp，目的片段大小约为870bp，鉴定结果符合预期。

(2)测序鉴定

分别对重组表达质粒进行测序验证，测序结果表明：

重组表达质粒pET26b-Sig-V8为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.3所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.3的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-90位为Sig信号肽的编码基因，第91-888位为V8蛋白酶编码基因，第889-894位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-DsbA-V8为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.4的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-60位为DsbA信号肽的编码基因，第61-858位为V8蛋白酶编码基因，第859-864位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-PelB-V8为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.5的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-69位为PelB信号肽的编码基因，第70-867位为V8蛋白酶编码基因，第868-873位为XhoI酶切位点。

重组表达质粒pET26b-STII-V8为在pET26b表达质粒的酶切位点NdeI和XhoI之间插入SEQ ID No.6所示DNA片段后得到的重组质粒。SEQ ID No.6的第1-6位为NdeI酶切位点，第7-72位为STII信号肽的编码基因，第73-870位为V8蛋白酶编码基因，第871-876位为XhoI酶切位点。

实施例2、蛋白表达

1、重组菌构建

分别将实施例1构建的四个重组表达质粒pET26b-Sig-V8、pET26b-DsbA-V8、pET26b-PelB-V8和pET26b-STII-V8转化BL21(DE3)宿主细胞，分别得到重组菌pET26b-Sig-V8/BL21(DE3)、pET26b-DsbA-V8/BL21(DE3)、pET26b-PelB-V8/BL21(DE3)和pET26b-STII-V8/BL21(DE3)。

转化具体操作步骤如下：

(1)超低温冰箱中取BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞(生工)，冰上解冻；

(2)取1μL质粒加入50μL BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，冰上静置30分钟；

(3)42℃热激90秒，立即冰上静置2分钟；

(4)在800μL LB液体培养基中在37℃摇床180rpm振荡培养条件下培养1小时；

(5)于超净工作台中取适量菌液均匀涂布在LB固体培养板上，倒置培养过夜，次日取出备用。

2、诱导表达

分别挑单克隆接种至5mL LB卡那抗性培养基(空细胞为阴性)中，在37℃摇床180rpm振荡培养条件下培养至OD_600nm值约为0.8，然后加入1mM IPTG在28℃摇床180rpm振荡培养条件下诱导培养16小时，得到诱导菌液。将诱导菌液进行SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳具体操作步骤如下：

(1)全菌样品处理：取100μL诱导菌液，1000g离心1min，弃上清液，收集菌体，并用40μL PBS溶液重悬菌体，得到菌悬液。然后向菌悬液中加入10μL 5×Sample Buffer上样缓冲液(金斯瑞)，混匀100℃处理10min，10000g离心1min，上样5μL；

(2)150V进行SDS-PAGE电泳1小时；

(3)eStain^TM L1蛋白染色仪染色3个循环，脱色一个循环染色；

(4)凝胶成像系统拍照，记录实验结果。

周质空间分泌表达结果如图2所示，结果显示：重组表达质粒pET26b-Sig-V8和pET26b-DsbA-V8几乎无目的蛋白表达，而重组表达质粒pET26b-PelB-V8和pET26b-STII-V8均可表达得到目的蛋白。说明V8蛋白酶天然信号肽Sig和DsbA均无法引导V8蛋白酶在宿主细胞中分泌表达，而PelB和STII两个信号肽可以引导V8蛋白酶在宿主细胞中分泌表达，且表达量相当，但PelB信号肽剪切效率(图2中，白色箭头表示信号肽-V8蛋白酶条带位置，黑色箭头表示V8蛋白酶条带位置，黑色箭头占比越大，说明剪切效率越高)大于STII信号肽。

实施例3、蛋白表达量灰度分析

采用Image J软件进行实施例2中SDS蛋白电泳图灰度分析，分别计算不同信号肽引导的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比及信号肽剪切效率。操作步骤为Image→Type→32-Bit转化为灰度图；Process→Subtract Background→OK去除背景色；矩形工具选择泳道→Analyze→Gel→Select First Lane确定分析泳道，重复选择多条泳道同时分析；Analyze→Gel→Plot Lane生成峰面积；线性工具选择目标条带对应峰图，Wand工具计算对应峰图面积，通过“{(箭头1峰图面积+箭头2峰图面积)/总蛋白峰图面积}×100％”即可求得目标蛋白表达量占总蛋白百分比，通过“{箭头2峰图面积/(箭头1峰图面积+箭头2峰图面积)}×100％”即可求得信号肽剪切效率。

结果如图3所示，箭头1为信号肽未剪切峰图，箭头2为信号肽剪切峰图。含有Sig信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为3.3％，Sig信号肽剪切效率为45.4％；含有DsbA信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为3.2％，DsbA信号肽剪切效率为53.1％；含有PelB信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为15.3％，PelB信号肽剪切效率为77.8％；含有STII信号肽的重组表达质粒中的目标蛋白表达量占总蛋白百分比为14.5％，STII信号肽剪切效率为48.3％。与实施例2结论一致，PelB和STII两个信号肽表达量相当，但PelB信号肽剪切效率大于STII信号肽。

实施例4、V8蛋白酶的制备与纯化

综合实施例3实验结果，采用实施例1构建的重组表达质粒pET26b-PelB-V8进行V8蛋白酶的制备与纯化。具体步骤如下：

1、诱导表达

将实施例1构建的重组表达质粒pET26b-PelB-V8转化BL21(DE3)宿主细胞，得到重组菌pET26b-PelB-V8/BL21(DE3)。挑单克隆接种至5mL LB卡那抗性培养基，在37℃，180rpm条件下过夜培养。次日按照1：100比例扩大培养至100mL，摇菌至OD_600nm值约为0.8，加入1mMIPTG在28℃摇床180rpm振荡培养条件下诱导培养16小时，得到诱导菌液。

2、周质空间蛋白提取

取步骤1获得的诱导菌液，采用渗透休克法进行周质空间蛋白提取。具体步骤如下：

(1)将250mL诱导菌液12000g离心1min，弃上清，收集菌体；

(2)加20mL溶液I悬浮菌体，用枪头轻轻吹打混匀，冰浴并轻轻震荡(将冰浴盒放在摇床上轻轻摇动)10min；

(3)8000g、4℃离心10min，弃上清，收集菌体；

(4)加4mL溶液II悬浮，用枪头轻轻吹打悬起，冰浴并轻轻震荡(将沉淀用溶液冰浴盒放在摇床上轻轻摇动)10min；

(5)12000g离心15min，取上清即为周质空间蛋白；

溶液I：将水、蔗糖、EDTA和Tris混匀，各溶质浓度分别为蔗糖20％、EDTA 1mM、Tris30mM，最后用HCl调节pH至8.0。

溶液II：5mM MgCl₂溶液(溶剂为水)。

3、镍柱亲合层析

取步骤2提取的周质空间蛋白上清，采用Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒(生工)进行纯化，具体步骤如下：

(1)超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，待上柱纯化；

(2)用五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱；

(3)将超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱，如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中；

(4)用10倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；

(5)用4倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白。重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线。

4、超滤置换

(1)纯化后的蛋白溶液加入Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(UFC5010BK，Millipore公司)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μL；

(2)轻轻加入300μL PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μL，重复三次；

(3)PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约为1mL，留样5μL采用紫外吸收法测定纯化后蛋白浓度并进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。

结果表明：纯化后蛋白浓度为1.47mg/mL，SDS-PAGE蛋白电泳检测V8蛋白酶蛋白纯度大于90％，符合预期(图4)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数，浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更，用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河南晟明生物技术研究院有限公司

<120> 一种V8蛋白酶的制备方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Leu Pro Asn Asn Asp Arg His Gln Ile Thr Asp Thr Thr Asn Gly His

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Val Thr Tyr Ile Gln Val Glu Ala Pro Thr Gly Thr Phe

20 25 30

Ile Ala Ser Gly Val Val Val Gly Lys Asp Thr Leu Leu Thr Asn Lys

35 40 45

His Val Val Asp Ala Thr His Gly Asp Pro His Ala Leu Lys Ala Phe

50 55 60

Pro Ser Ala Ile Asn Gln Asp Asn Tyr Pro Asn Gly Gly Phe Thr Ala

65 70 75 80

Glu Gln Ile Thr Lys Tyr Ser Gly Glu Gly Asp Leu Ala Ile Val Lys

85 90 95

Phe Ser Pro Asn Glu Gln Asn Lys His Ile Gly Glu Val Val Lys Pro

100 105 110

Ala Thr Met Ser Asn Asn Ala Glu Thr Gln Val Asn Gln Asn Ile Thr

115 120 125

Val Thr Gly Tyr Pro Gly Asp Lys Pro Val Ala Thr Met Trp Glu Ser

130 135 140

Lys Gly Lys Ile Thr Tyr Leu Lys Gly Glu Ala Met Gln Tyr Asp Leu

145 150 155 160

Ser Thr Thr Gly Gly Asn Ser Gly Ser Pro Val Phe Asn Glu Lys Asn

165 170 175

Glu Val Ile Gly Ile His Trp Gly Gly Val Pro Asn Glu Phe Asn Gly

180 185 190

Ala Val Phe Ile Asn Glu Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Gln Asn Ile

195 200 205

Glu Asp Ile His Phe Ala Asn Asp Asp Gln Pro Asn Asn Pro Asp Asn

210 215 220

Pro Asp Asn Pro Asn Asn Pro Asp Asn Pro Asn Asn Pro Asp Glu Pro

225 230 235 240

Asn Asn Pro Asp Asn Pro Asn Asn Pro Asp Asn Pro Asp Asn Gly Asp

245 250 255

Asn Asn Asn Ser Asp Asn Pro Asp Ala Ala

260 265

<210> 2

<211> 798

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ctgccgaaca acgaccgtca ccagatcacc gacaccacca acggtcacta cgctccggtt 60

acctacatcc aggttgaagc tccgaccggt accttcatcg cttctggtgt tgttgttggt 120

aaagacaccc tgctgaccaa caaacacgtt gttgacgcta cccacggtga cccgcacgct 180

ctgaaagctt tcccgtctgc tatcaaccag gacaactacc cgaacggtgg tttcaccgct 240

gaacagatca ccaaatactc tggtgaaggt gacctggcta tcgttaaatt ctctccgaac 300

gaacagaaca aacacatcgg tgaagttgtt aaaccggcta ccatgtctaa caacgctgaa 360

acccaggtta accagaacat caccgttacc ggttacccgg gtgacaaacc ggttgctacc 420

atgtgggaat ctaaaggtaa aatcacctac ctgaaaggtg aagctatgca gtacgacctg 480

tctaccaccg gtggtaactc tggttctccg gttttcaacg aaaaaaacga agttatcggt 540

atccactggg gtggtgttcc gaacgaattc aacggtgctg ttttcatcaa cgaaaacgtt 600

cgtaacttcc tgaaacagaa catcgaagac atccacttcg ctaacgacga ccagccgaac 660

aacccggata atccagataa tccaaacaac ccagataacc ccaacaaccc cgacgaacca 720

aacaatcctg ataatcctaa taatcctgac aacccggaca acggtgacaa caacaactca 780

gataatcctg atgctgct 798

<210> 3

<211> 894

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

catatgaaag gtaaattcct gaaagtttct tctctgttcg ttgctaccct gaccaccgct 60

accctggttt cttctccggc tgctaacgct ctgccgaaca acgaccgtca ccagatcacc 120

gacaccacca acggtcacta cgctccggtt acctacatcc aggttgaagc tccgaccggt 180

accttcatcg cttctggtgt tgttgttggt aaagacaccc tgctgaccaa caaacacgtt 240

gttgacgcta cccacggtga cccgcacgct ctgaaagctt tcccgtctgc tatcaaccag 300

gacaactacc cgaacggtgg tttcaccgct gaacagatca ccaaatactc tggtgaaggt 360

gacctggcta tcgttaaatt ctctccgaac gaacagaaca aacacatcgg tgaagttgtt 420

aaaccggcta ccatgtctaa caacgctgaa acccaggtta accagaacat caccgttacc 480

ggttacccgg gtgacaaacc ggttgctacc atgtgggaat ctaaaggtaa aatcacctac 540

ctgaaaggtg aagctatgca gtacgacctg tctaccaccg gtggtaactc tggttctccg 600

gttttcaacg aaaaaaacga agttatcggt atccactggg gtggtgttcc gaacgaattc 660

aacggtgctg ttttcatcaa cgaaaacgtt cgtaacttcc tgaaacagaa catcgaagac 720

atccacttcg ctaacgacga ccagccgaac aacccggata atccagataa tccaaacaac 780

ccagataacc ccaacaaccc cgacgaacca aacaatcctg ataatcctaa taatcctgac 840

aacccggaca acggtgacaa caacaactca gataatcctg atgctgctct cgag 894

<210> 4

<211> 864

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

catatgaaaa agatttggct ggcgctggct ggtttagttt tagcgtttag cgcatcggcg 60

ctgccgaaca acgaccgtca ccagatcacc gacaccacca acggtcacta cgctccggtt 120

acctacatcc aggttgaagc tccgaccggt accttcatcg cttctggtgt tgttgttggt 180

aaagacaccc tgctgaccaa caaacacgtt gttgacgcta cccacggtga cccgcacgct 240

ctgaaagctt tcccgtctgc tatcaaccag gacaactacc cgaacggtgg tttcaccgct 300

gaacagatca ccaaatactc tggtgaaggt gacctggcta tcgttaaatt ctctccgaac 360

gaacagaaca aacacatcgg tgaagttgtt aaaccggcta ccatgtctaa caacgctgaa 420

acccaggtta accagaacat caccgttacc ggttacccgg gtgacaaacc ggttgctacc 480

atgtgggaat ctaaaggtaa aatcacctac ctgaaaggtg aagctatgca gtacgacctg 540

tctaccaccg gtggtaactc tggttctccg gttttcaacg aaaaaaacga agttatcggt 600

atccactggg gtggtgttcc gaacgaattc aacggtgctg ttttcatcaa cgaaaacgtt 660

cgtaacttcc tgaaacagaa catcgaagac atccacttcg ctaacgacga ccagccgaac 720

aacccggata atccagataa tccaaacaac ccagataacc ccaacaaccc cgacgaacca 780

aacaatcctg ataatcctaa taatcctgac aacccggaca acggtgacaa caacaactca 840

gataatcctg atgctgctct cgag 864

<210> 5

<211> 873

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

catatgaaat acctgctgcc gaccgctgct gctggtctgc tgctcctcgc tgcccagccg 60

gcgatggccc tgccgaacaa cgaccgtcac cagatcaccg acaccaccaa cggtcactac 120

gctccggtta cctacatcca ggttgaagct ccgaccggta ccttcatcgc ttctggtgtt 180

gttgttggta aagacaccct gctgaccaac aaacacgttg ttgacgctac ccacggtgac 240

ccgcacgctc tgaaagcttt cccgtctgct atcaaccagg acaactaccc gaacggtggt 300

ttcaccgctg aacagatcac caaatactct ggtgaaggtg acctggctat cgttaaattc 360

tctccgaacg aacagaacaa acacatcggt gaagttgtta aaccggctac catgtctaac 420

aacgctgaaa cccaggttaa ccagaacatc accgttaccg gttacccggg tgacaaaccg 480

gttgctacca tgtgggaatc taaaggtaaa atcacctacc tgaaaggtga agctatgcag 540

tacgacctgt ctaccaccgg tggtaactct ggttctccgg ttttcaacga aaaaaacgaa 600

gttatcggta tccactgggg tggtgttccg aacgaattca acggtgctgt tttcatcaac 660

gaaaacgttc gtaacttcct gaaacagaac atcgaagaca tccacttcgc taacgacgac 720

cagccgaaca acccggataa tccagataat ccaaacaacc cagataaccc caacaacccc 780

gacgaaccaa acaatcctga taatcctaat aatcctgaca acccggacaa cggtgacaac 840

aacaactcag ataatcctga tgctgctctc gag 873

<210> 6

<211> 876

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

catatgaaaa agaacatcgc attcctcctg gcatctatgt ttgttttctc tatcgctacc 60

aacgcttacg ctctgccgaa caacgaccgt caccagatca ccgacaccac caacggtcac 120

tacgctccgg ttacctacat ccaggttgaa gctccgaccg gtaccttcat cgcttctggt 180

gttgttgttg gtaaagacac cctgctgacc aacaaacacg ttgttgacgc tacccacggt 240

gacccgcacg ctctgaaagc tttcccgtct gctatcaacc aggacaacta cccgaacggt 300

ggtttcaccg ctgaacagat caccaaatac tctggtgaag gtgacctggc tatcgttaaa 360

ttctctccga acgaacagaa caaacacatc ggtgaagttg ttaaaccggc taccatgtct 420

aacaacgctg aaacccaggt taaccagaac atcaccgtta ccggttaccc gggtgacaaa 480

ccggttgcta ccatgtggga atctaaaggt aaaatcacct acctgaaagg tgaagctatg 540

cagtacgacc tgtctaccac cggtggtaac tctggttctc cggttttcaa cgaaaaaaac 600

gaagttatcg gtatccactg gggtggtgtt ccgaacgaat tcaacggtgc tgttttcatc 660

aacgaaaacg ttcgtaactt cctgaaacag aacatcgaag acatccactt cgctaacgac 720

gaccagccga acaacccgga taatccagat aatccaaaca acccagataa ccccaacaac 780

cccgacgaac caaacaatcc tgataatcct aataatcctg acaacccgga caacggtgac 840

aacaacaact cagataatcc tgatgctgct ctcgag 876

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala

1 5 10 15

Gln Pro Ala Met Ala

20

Claims

1.PelB信号肽在如下A1)-A3)中任一种中的应用：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品；

所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.与PelB信号肽相关的生物材料在如下A1)-A3)中任一种中的应用：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品；

所述与PelB信号肽相关的生物材料为所述PelB信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下(a1)-(a3)中任一种：

(a1)SEQ ID No.5第7-69位所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中所述PelB信号肽的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码权利要求1中所述PelB信号肽的DNA分子。

4.融合蛋白，为将权利要求1中所述PelB信号肽融合于V8蛋白酶的N端后所得。

5.与权利要求4所述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为权利要求4所述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：所述编码基因为如下(b1)-(b3)中任一种：

(b1)SEQ ID No.5第7-867位所示的DNA分子；

(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求4所述融合蛋白的DNA分子；

(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码权利要求4所述融合蛋白的DNA分子。

7.权利要求4所述的融合蛋白或权利要求5所述的生物材料在如下A1)-A3)中任一种中的应用：

A1)制备V8蛋白酶或其融合蛋白；

A2)提高V8蛋白酶或其融合蛋白表达量或产量；

A3)制备V8蛋白酶检测产品。

8.一种制备V8蛋白酶的方法，包括如下步骤：使权利要求4所述的融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到所述V8蛋白酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)将权利要求4所述融合蛋白的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；

2)将所述重组菌进行诱导培养，得到诱导菌液；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述诱导培养的方法包括如下步骤：培养所述重组菌至OD_600nm值为0.6-1.0时，向培养体系中添加0.8-1.2mM的IPTG进行诱导培养。