FR2631238A1 - Baculovirus recombinant, procede de production de la proteine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise a l'aide dudit virus, et cette proteine - Google Patents
Baculovirus recombinant, procede de production de la proteine d'enveloppe du virus de l'encephalite japonaise a l'aide dudit virus, et cette proteine Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne un procédé de production de la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, protéine que l'on peut utiliser dans des vaccins ou des trousses de diagnostic, à l'aide d'un Baculovirus recombinant dans lequel l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est intégré dans une région du génome non essentielle pour la prolifération du Baculovirus. Des cellules d'insecte sont infectées avec ce Baculovirus recombinant, puis cultivées, ce qui permet de récupérer la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, qui est exprimée dans les cellules.
Description
BACULOVIRUS RECONBINANT. PROCEDE DE PRODUCTION DE LA
PROTEINE D'ENVELOPPE DU VIRUS DE L'ENCEPHALITE JAPONAISE
A L'AIDE DUDIT VIRUS. ET CETTE PROTEINE
La présente invention concerne un Baculovirus recombinant, dans lequel est intégrée au moins une partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, dans une région du génome non essentielle à la prolifération du Baculovirus, un procédé pour produire efficacement la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise à l'aide dudit Baculovirus recombinant, et un vaccin contre le virus de
l'encéphalite japonaise.
Comme vaccin contre l'encéphalite japonaise, on a utilisé jusqu'à présent un vaccin contenant, à titre d'ingrédient efficace, un virus d'encéphalite japonaise inactive. On produit la solution mère du vaccin, contenant un virus d'encéphalite japonaise inactive, en inoculant la souche Nakayama du virus de l'encéphalite japonaise, que l'on trouve au National Institute of Health, dans le cerveau de souris nouveau-nés, en recueillant les cerveaux des souris infectées, et en purifiant le virus selon le procédé alcool-protamine et en l'inactivant ("Vaccin of Japan", seconde édition revue, éditée par National Institute of Health Alumini Association (publié le 20 janvier 1977 par Maruzen
Publishing Co., Ltd.)).
Dans un tel procédé de production de vaccin, il
faut manipuler le virus de l'encéphalite japonaise lui-
même en de grandes quantités, de sorte que la manipulation présente un danger extrêmement élevé pour ceux qui travaillent à la production des vaccins, et les
coûts de production sont eux aussi très élevés.
On peut également utiliser comme vaccin une protéine antigénique présentant l'antigénicité du virus, et non plus le virus lui-même. On a donc cherché à produire la protéine antigénique dans des cellules procaryotes ou dans des cellules eucaryotes, en utilisant la technique de l'ADN recombinant. On a également essayé d'exprimer la protéine d'enveloppe (désignée ici souvent par "protéine E") du virus de l'encéphalite japonaise, par manipulation génétique, en utilisant de la levure comme hôte (résumé préliminaire du 34*me Meeting of the Japanese Virus Society, tenu en octobre 1986, page 91). Cependant, on n'a pas réussi à exprimer la protéine
E naturelle.
Les co-demandeurs ont récemment réussi à exprimer la protéine E naturelle du virus de l'encéphalite japonaise, à partir d'un virus recombinant de la vaccine, dans lequel de l'ADNc codant pour la protéine E est intégré au génome du virus de la vaccine utilisé comme vaccin vivant. Bien que le virus recombinant soit prometteur en tant que vaccin vivant, il pose un problème en ce que son rendement est trop faible pour que l'on puisse récupérer les protéines exprimées et les utiliser
dans des buts de vaccination ou de diagnostic.
D'autre part, on a proposé des procédés pour exprimer un gène exogène dans des cellules d'insectes, à l'aide d'un vecteur constitué par un virus d'insecte (demandes de brevet japonais publiées, non examinées, n' 379887/1985 et 5787/1986). Il est dit que la quantité de protéine exprimée par ces procédés est nettement plus élevée que celle obtenue grâce à d'autres systèmes d'expression. Cependant, le virus de l'encéphalite japonaise, qui appartient au genre Flavivirus des Togaviridae, est caractérisé en ce qu'il possède un génome constitué d'un ARN simple brin, et en ce qu'un seul polypeptide long, traduit monocistroniquement à partir du génome dans les cellules infectées par le virus, subit une coupure (terme que l'on utilise pour signifier qu'un polypeptide unique est coupé par des protéases, dans les cellules, pour former les protéines respectives) en une protéine de capside, une protéine membranaire, la protéine E et 5 types de protéines non structurales; il est donc difficile, en manipulant ce virus, d'intégrer l'ADNc codant pour la protéine E dans le génome du Baculovirus et d'exprimer la protéine E. Jusqu'à présent, on n'a fait
aucune mention d'un exemple d'une telle expression.
Etant donné l'art antérieur décrit ci-dessus, les co-demandeurs ont fait des recherches poussées sur un procédé de production, en grande quantité, de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, et il en est résulté qu'ils ont trouvé qu'en sélectionnant la région codant pour la protéine E de l'ADNc préparé à partir de ARN du virus de l'encéphalite japonaise, en effectuant la ligature de ladite région codant pour la protéine E avec un promoteur du Baculovirus et en intégrant, le produit de cette ligature dans une région du génome non essentielle à la prolifération du Baculovirus, on peut exprimer, dans des cellules d'insecte infectées, de grande quantités de protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, utilisable comme vaccin ou pour des diagnostics. A partir de cette découverte, la présente
invention a été réalisée.
Selon la présente invention, on fournit un Baculovirus recombinant, abritant l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise dans une région du génome non essentielle à la prolifération du Baculovirus, ainsi qu'un procédé de production de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, lequel procédé comprend l'infection de cellules d'insecte avec ledit virus recombinant, la culture des cellules d'insecte et la récupération de la protéine E exprimée du virus de l'encéphalite japonaise, un Baculovirus recombinant utilisable pour ledit procédé, et un vaccin
contre le virus de l'encéphalite japonaise.
La figure i représente le procédé de la présente invention. La figure 2 représente le procédé de clonage de l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise. La figure 3 indique la position des sites d'action des enzymes de restriction dans l'ADNc. La figure 4 présente la séquence des bases de l'ADNc contenant une région codant pour la protéine E, ainsi que la séquence d'acides aminés correspondante. Les figures 5 à 7 représentent les procédés nécessaires pour construire le premier vecteur recombinant pAcYMS1. La figure 8 présente les procédés nécessaires pour la construction du second vecteur recombinant pAcYMJ3 contenant l'ADNc codant pour la protéine E. Dans la présente invention, on peut utiliser tout virus convenant à la production d'un virus recombinant, pourvu qu'il appartienne à la classe des Baculovirus. Des exemples englobent AutograDha californica, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou, Galleria mellonella, Bombyx mori, etc. Parmi ces virus, on préfère AutograDha californica (désigné ci-après simplement.rpar AcNPV). Ces virus ont été largement étudiés, et on peut en obtenir des échantillons auprès de nombreuses sources, y compris Texas Agricultural Experiment Station & Extension Service of Texas A & M University, U.S.A. En outre, on peut préparer l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, en utilisant la souche Nakayama décrite ci- dessus, que l'on trouve au National Institute, of Health, JaOAr Strain (Arboviruses Research Unit of Yale College, Connecticut,
U.S.A.), ou une souche Sagayama (même collection).
Par exemple, l'ADNc codant pour la protéine E, préparé à partir de la souche Sagayama décrite ci-dessus, est constitué de 1500 paires de bases au total, comme le montre la figure 4. Dans la présente invention, l'ADNc peut également être modifié (c'est-à-dire que sa séquence de bases peut avoir subi des substitutions, des insertions ou des suppressions), pourvu qu'il ait
pratiquement la même fonction que l'ADNc décrit ci-dessus.
Bien sûr, l'ADNc peut également être modifié de façon que la séquence d'acides aminés correspondante soit modifiée,
pourvu qu'elle garde pratiquement la même fonction.
Dans l'élaboration du virus recombinant, on construit tout d'abord un premier vecteur recombinant comporLant une région d'ADN qui n'est pas essentielle pour la prolifération du Baculovirus. Dans ce cas, il est nécessaire qu'un promoteur fonctionnant dans le
Baculovirus soit présent dans la région mentionnée ci-
dessus. Il est en outre préférable d'insérer, en aval du promoteur, un linker synthétique contenant une séquence
appropriée de coupure par une enzyme de restriction.
Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "région d'ADN non essentielle pour la prolifération" désigne une région, comme le gène de la polyhédrine du Baculovirus (L.K. Miller, et ai., Science, 219, 715-721 (1983)) ou similaire, qui n'affecte pratiquement pas la prolifération du virus, même si cette région subit une
mutation par insertion d'ADN exogène.
A titre de référence, on signale que la polyhédrine est une protéine possédant une masse moléculaire d'environ 29.000 daltons, et que son gène est présent sur le fragment EcoRI-1 du génome de AcNPV (G.E. Smith, et al. , J. Virol., 45, 215-225 (1983)). La séquence d'ADN du gène de la polyhédrine est représentée dans la monographie écrite par G.E. Smith et al. (Virology, 131, 561-565
(1983)).
En outre, on peut utiliser tout promoteur en tant que promoteur fonctionnant dans le Baculovirus, que ce soit un promoteur synthétique ou naturel, pourvu qu'il puisse efficacement fonctionner en tant que promoteur dans le système de transcription du Baculovirus. Des exemples particuliers de ce promoteur sont un promoteur du gène de la polyhédrine du Baculovirus, un promoteur du gène du polypeptide 10K du Baculovirus, etc. On peut préparer le premier vecteur recombinant d'une façon classique (voir par exemple les demandes de brevet japonais publiées, non examinées, n' 37988/1985 et 5787/1986, etc.). Par exemple, on opère comme suit. A partir du Baculovirus AcNPV, on isole un fragment d'ADN portant le gène de la polyhédrine, et on le purifie. Ensuite, une digestion par l'endonucléase de restriction EcoRI donne un fragment EcoRI-1 de 7,3 kilobases, qui contient le gène de la polyhédrine et d'autres fragments appropriés. Ce fragment EcoRI-1 est cloné dans un
plasmide de clonage convenable au niveau du site EcoRI.
Dans le cas de ce système, le promoteur du gène de
la polyhédrine est présent dans la région non essentielle.
Ce promoteur fonctionne effectivement aussi dans un
second vecteur recombinant.
Afin d'augmenter le taux d'expression, il est préférable d'utiliser un vecteur qui comporte un site d'enzyme de restriction immédiatement après le promoteur et la région 5' non traduite du gène de la polyhédrine suivie par la région 3' non traduite du gène de la polyhédrine, mais qui ne comporte pas la séquence codante du gène de la polyhédrine. On a signalé qu'un tel vecteur entraîne un taux d'expression extrêmement élevé d'un gène exogène (Matsuura et al., J. Gen. Virol., 68, 1233-1250
(1987)).
Comme on l'a indiqué ci-dessus, la protéine du virus de l'encéphalite japonaise est synthétisée de façon monocistronique, puis traitée pour être séparée en protéine d'enveloppe, etc.. En conséquence, quand on insère l'ADNc correspondant au génome entier du virus, il n'est pas nécessaire d'insérer artificiellement un codon
de début de traduction et un codon de fin de traduction.
Ceci s'applique également au cas dans lequel l'ADNc à insérer comporte, à son extrémité amont, une séquence (par exemple ATG) capable de jouer le rôle d'un codon de début de traduction, en plus de la région codant pour la protéine E. Quand seul l'ADNc codant pour la protéine E est intégré comme ci-dessus, il est nécessaire d'intégrer également un linker synthétique comportant un codon de début de traduction, un codon de fin de traduction et des sites d'enzymes de restriction entre les deux codons, au niveau du site d'enzyme de restriction situé en aval du
promoteur.
I1 est souhaitable que le codon de fin de traduction à insérer soit fourni en 3 positions, par déplacement du cadre de lecture, de façon à se trouver en accord avec le cadre de lecture de l'ADNc codant pour la
protéine E, quel que soit celui-ci.
L'ADNc à insérer peut également être un ADNc contenant une région codant pour une protéine supplémentaire quelconque, pourvu qu'il contienne la région codant pour la protéine E. Dans Flavivirus, il y a, en amont de la région codant pour la protéine E, des
régions codant pour une protéine membranaire (désignée ci-
après par protéine M), une protéine prémembranaire o10 (désignée ci-après par protéine préM) et une protéine de capside (désignée ci-après par protéine C). Dans la présente invention, on peut également utiliser un virus dans lequel tout ou partie des ADNc codant pour ces protéines peuvent être liés à l'ADNc codant pour la
protéine E en amont de celui-ci.
Des exemples particuliers du vecteur utilisé englobent des plasmides tels que pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC7, pUC8, pUC9, pUC19 et similaires; des phages comme le phage y, le phage M13 et similaires; des
cosmides comme pHC79 (Gene, 11, 291, 1980), etc..
Dans la présente invention, la région codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est ensuite insérée en aval du promoteur du premier vecteur recombinant, pour construire ainsi un second vecteur recombinant. Le procédé d'insertion peut également être effectué de façon classique (voir par exemple les publications de brevets indiquées cidessus); par exemple, un fragment d'ADNc dérivé du virus de l'encéphalite japonaise peut être inséré au niveau d'un site d'enzyme de restriction fourni artificiellement en
aval du premier vecteur.
A la suite de la construction de ces premier et second vecteurs recombindnts, on peut utiliser le système Escherichia coli dont la manipulation génétique est facile. Les plasmides vecteurs à utiliser ne sont pas particulièrement limités, pourvu qu'ils soient adaptés au il
but fixé.
Dans la présente invention, l'ADN du génome de Baculovirus est mélangé avec le second vecteur recombinant, et on effectue ensuite la transfection de cellules d'insecte avec le mélange pour provoquer une recombinaison par homologie entre l'ADN vecteur et l'ADN du génome du virus, et l'on construit ainsi un
Baculovirus recombinant.
Les cellules d'insectes en culture que l'on utilise ici peuvent être n'importe quelles cellules, pourvu que le Baculovirus puisse s'y développer. Un exemple particulier de telles cellules est la cellule Sf9,
dérivée de Spodoptera fruqiperda.
La-construction du Baculovirus recombinant peut être effectuée de façon classique. Les modes opératoires peuvent être réalisés, par exemple, de façon similaire à celle indiquée dans les exemples de la demande de brevet japonais n' 37988/1985. C'est-à-dire que l'on opère la transfection de cellules d'insecte avec le second vecteur recombinant et l'ADN du génome de Baculovirus, et l'on récupère les fluides *surnageants contenant des Baculovirus recombinants. Les fluides contenant ces Baculovirus recombinants sont soumis à l'essai normalisé,
sur plaque de polyhédrine d'AcNPV, décrit par L.E.
Borgman et al. (J. Virol., 19, 820-832, 1976). Les plaques ne formant pas d'occlusions virales sont choisies
comme plaques à virus candidats pour le virus recombinant.
A partir de ces plaques, on récupère les virus. En tant que procédé de sélection, parmi ces candidats, du virus abritant le fragment d'ADN codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, on peut utiliser l'hybridation sur plaque, à l'aide d'une sonde d'ADN, ou
bien, en variante, un immuno-essai utilisant un anti-
sérum ou un anticorps monoclonal.
Le Baculovirus recombinant ainsi purifié est inoculé dans des cellules d'insectes susceptibles d'être infectées. Les cellules d'insectes sont cultivées dans des conditions appropriées à leur croissance, de façon classique. Après une période convenable d'incubation, on recueille les cellules et on les soumet à une sonication pour préparer un extrait. On récupère la protéine d'expression à partir de l'extrait, d'une façon appropriée. Les cellules d'insectes utilisées pour l'incubation ne sont pas particulièrement limitées, pourvu que le Baculovirus puisse se développer dans ces cellules. La cellule Sf9 est celle que l'on préfère tout particulièrement. Les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans les conditions connues généralement de l'homme de l'art (voir J. Gen. Virol, 36,361-364 (1977)). On peut - facilement déterminer les conditions convenables de culture grâce à des expériences préliminaires, mais on préfère effectuer la culture dans un milieu contenant 10% de sérum foetal de veau, à 28'C. Les procédés de récupération de la protéine d'expression & partir des cellules ne sont pas particulièrement limités, pourvu qu'ils fassent appel à des méthodes classiques de purification biochimique, et un procédé souhaitable est la chromatographie d'affinité à l'aide d'anticorps du
virus de l'encéphalite japonaise.
La figure 1 explicite l'un des modes de réalisation
de la présente invention que l'on vient de décrire.
Selon la présente invention, on obtient donc un Baculovirus recombinant dans lequel l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est intégré dans une région du génome du Baculovirus, non essentielle à la prolifération de celui-ci, sous le contrôle d'un promoteur; des cellules d'insectes sont infectées avec le virus recombinant, et ces cellules infectées sont cultivées, grâce à quoi l'on peut obtenir la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise. Cette protéine E est utilisable dans des vaccins ou des trousses de diagnostic. Pour la préparation d'un vaccin, on peut diluer la protéine E avec l'un quelconque des diluants et/ou véhicules classiques, d'une façon classique. La- dose administrable d'un tel vaccin peut être déterminée de la façon classique; cependant, il serait suffisant de l'administrer en une quantité capable de produire un titre d'anticorps de 1,0 (en base
logarithmique décimale) dans le sang.
On va maintenant décrire la présente invention de
façon plus détaillée & l'aide des exemples ci-dessous.
Exemple 1
Production de l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise (1) Extraction de l'ARN génomique du virus de l'encéphalite japonaise:
Des cellules C6/36 dérivées de moustiques (J. Gen.
Virol., 40, 531-544 (1978)) sont infectées avec une
souche Sagayama du virus de l'encéphalite japonaise.
Après la prolifération du virus, le surnageant de la culture est mélangé avec du polyéthylène-glycol. On soumet le mélange à une centrifugation de façon à purifier les virus de l'encéphalite japonaise. Après extraction des virus purifiés avec du phénol, on ajoute de l'éthanol à l'extrait pour provoquer une précipitation, grâce à quoi on isole l'ARN génomique du virus (environ
11 kb).
(2) Clonage de l'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise (voir figure 2) : En utilisant de la poly(A)-polymérase (Takara Shuzo Co., Ltd.), on ajoute une séquence poly(A) à l'ARN génomique du virus, préparé dans l'étape (1), et on utilise celui-ci comme matrice: on fait réagir les 4 types (A, G, C, T) de désoxyribonucléoside-triphosphates et de la transcriptase inverse, en utilisant un oligo-dT
comme amorce, pour synthétiser un premier brin d'ADNc.
Ensuite, on construit un ADNc double brin en utilisant de 263123e la RNase-H de E. Coli, les 4 types (A, G, C, T) de désoxyribonucléosidetriphosphates et de l'ADN-polymérase d'E. Coli (Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Lab., (1982)), P. 211-246), puis on ajoute une chaîne dC à l'aide d'une terminal-transférase. D'autre part, après digestion du plasmide pUC9 (fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals) par l'enzyme de restriction PstI, on ajoute une chaîne dG au produit de digestion, à l'aide d'une terminal-transférase. On mélange ce produit d'addition de chaîne dG avec l'ADNc décrit ci-dessus. On soumet ce mélange à une cyclisation par ligature. On effectue une transfection en introduisant le plasmide recombinant obtenu dans des cellules compétentes HB101 d'E. Coli pour obtenir des transformants. On prélève des plasmides des transformants, et on compare les longueurs des chaînons drADNc insérés, sur gel d'agarose. Pour le plus long chaînon d'ADNc inséré, on analyse la séquence au niveau de l'extrémité 5' (Gene, 19, p. 269 (1982)). Sur la base des résultats de l'analyse de séquence, on construit à nouveau un ADNc par le procédé décrit ci-dessus, en
utilisant un oligonucléotide' synthétique 20-mer (5'-
dATTCCGTACCATGCAGTCCA-3') en tant qu'amorce, et l'ARN génomique du virus en tant que matrice. On ligature l'ADNc avec le plasmide pUC9 pour obtenir un certain nombre de transformants. Parmi les transformants obtenus, on sélectionne, par un procédé décrit ci-dessous, un transformant contenant un plasmide recombinant qui porte
l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe visée.
En ce qui concerne le procédé de construction d'un clone d'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise, un exemple de construction similaire de clone d'ADNc du virus de l'encéphalite japonaise à l'aide de la souche JaOArS 982 du virus de l'encéphalite japonaise est décrit
dans Gene, 48, p. 195-201 (1986).
(3) Criblage du plasmide recombinant pJE4118 contenant l'ADNc (4118) codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise (voir
figures 2 et 3).
On fait croître les transformants obtenus dans l'étape (2) sur des plaques d'agarose, et on les soumet à une réplication sur des filtres de nitrocellulose. Apres avoir doucement lavé les filtres ayant servi à la réplication avec du NP-40 à 0,2% (tensio-actif de Nakarai Kagaku), on soumet ces filtres à un immunocriblage à l'aide de sérum anti-encéphalite japonaise. On obtient un transformant capable de réagir positivement, bien que sa réactivité soit faible. Un plasmide que possède le transformant est appelé pJE4118. Puis on prépare le plasmide pJE4118 d'une façon classique (Molecular Cloning, p. 75-95, (supra)), et l'ADNc inséré dans le plasmide pUC9 est excisé à l'aide de l'enzyme de restriction Pst I. En utilisant cet ADNc comme sonde d'ADN, on soumet les divers transformants obtenus dans l'étape (2) à un criblage par la méthode d'hybridation de' colonies (Molecular Cloning, P. 382-387 (supra)) . On sélectionne un plasmide portant un ADNc en chevauchement avec l'ADNc (4118) inséré de pJE4118. L'ADNc ainsi choisi (2-20) est récupéré à partir du plasmide, et sa position est déterminée à l'aide d'enzymes de restriction (voir figure 3). On montre ainsi que l'ADNc (2-20) recouvre
partiellement la séquence N-terminale de l'ADNc (4118).
(4) Analyse de la séquence de bases de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe (voir figure 4): Les plasmides recombinants pJE4118 et pJE220 sont coupés par l'enzyme de restriction Pst I, et donnent des fragments d'ADN d'environ 2,2 kb et d'environ 1,0 kb, respectivement. On a analysé les séquences de ces fragments par le procédé de Messing et al. en utilisant le phage M13 (Gene, 19, P. 269 (1982); Science, 241, p. 1205 (1981)), depuis l'extrémité 5' dans le cas de l'ADNc
(4118) et depuis l'extrémité 3' dans le cas de l'ADNc (2-
). En résultat, on a remarqué que la séquence d'ADNc, aux endroits o les deux se chevauchent, comporte 334 bases, depuis le troisième élément du codon du 56-3 acide aminé jusqu'au cent-seizième acide aminé, comme cela est indiqué dans la figure 4. En se basant sur la comparaison de la séquence d'acides aminés attendue à partir de cette séquence de bases avec la séquence d'acides aminés de la protéine E du virus de la fièvre jaune (qui ressemble au virus de l'encéphalite japonaise et qui appartient au même genre que celui-ci) que l'on connait déjà (Science, 229, 726-733 (1985)), on déduit que la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise est constituée par les acides aminés, du 1er au 500*,0, indiqués dans la figure 4. De la même façon, on déduit que la protéine M du virus de l'encéphalite japonaise est constituée par les acides aminés allant du rang -75 au rang -1 et que la protéine
préM est constituée par les acides aminés allant du rang -
167 au rang -76, comme l'indique la figure 4. En outre, on déduit que la séquence en amont de ce qui correspond à la protéine préM code pour une partie de la protéine C du
virus de l'encéphalite japonaise.
(5) Construction de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise (voir figures 3 et 4): On supprime de l'ADNc (4118) les bases codant pour les 5 acides aminés situés à l'extrémité Nterminale de la protéine E. Ensuite, de l'ADNc (2-20) épissé est lié.à l'ADNc (4118) au niveau du site Aat II, ce qui donne l'ADNc (203) qui couvre toute la région correspondant à la protéine E. On traite ensuite l'ADNc (203) avec Hind III et EcoR V pour récupérer un fragment d'ADNc (J3) d'environ 2,7 kb. Ce fragment contient les régions codant pour la protéine M et pour la protéine préM, en plus de la région codant pour la protéine E.
Exemple 2
Production du premier vecteur recombinant pAcYNS1 dans lequel est intégrée la région d'ADN non essentielle à la prolifération de baculovirus (voir figures 5 à 7): (1) Production du plasmide pAcRP61 dans lequel l'extrémité 3' du gène de la polyhédrine est supprimée
(voir figure 5).
Afin de constituer le premier vecteur recombinant, le fragment d'ADN contenant le gène de la polyhédrine de AcNPV (souche sauvage) est cloné dans le plasmide pUC8 au niveau du site EcoR I. L'ADN de AcNPV est purifié par extraction du virus, suivi par une centrifugation équilibrée en gradient de densité de chlorure de césium, comme l'expliquent G.E. Smith et M.D. Summers (Virology, 89,517-527, 1978). On fait ensuite complètement digérer cet ADN par l'enzyme de restriction EcoR I. Apres récupération sur gel d'agarose du fragment EcoR I-I de 7,3 kb, on clone ce fragment dans pUC8 au niveau du site de EcoR I, pour préparer le plasmide pAcEcoR I-I. Ce plasmide recombinant possède 3 sites de reconnaissance pour BamH I (voir figure 5). L'un de ces 3 sites se trouve dans le gène de la polyhédrine, un autre se trouve loin en aval du gène de la polyhédrine et le dernier est situé dans le polylinker de pUC8. Les deux derniers sites de reconnaissance pour BamHI sont éliminés de pAcEcoR I-I, d'une façon semblable au procédé décrit par G.E. Smith et al. (Molecular and Cellular Biology, 3, p. 2156-2165,
1983) dans le but de produire pAclO1.
On coupe ensuite le plasmide pAclO1l au niveau du site Kpn I présent dans le gène de la polyhédrine, et on supprime séquentiellement son extrémité, à l'aide de 0,5 unité d'exonucléase Bal 31. Ensuite, on en répare les extrémités à l'aide d'ADN-polymérase d'E. coli (fragment Klenow). L'ADN de plasmide est purifié, et on ajoute 0,5 pg de linker BamH I phosphorylé (5'-pCGGATCCG-3') à 100 pl du mélange réactionnel, ainsi que 10 unités d'ADN ligase T4. Après incubation à la température ambiante pendant 2 heures, on purifie l'ADN. Puis on fait encore digérer l'ADN par BamH I dans 100 pl de solution réactionnelle. L'ADN digéré est soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7%, puis récupéré pour être purifié. Apres ligature de l'ADN à l'aide d.'ADN ligase T4, des cellules d'E. coli JM109 sont transformées par l'ADN ligaturé (résistance à l'ampicilline). On
prépare des plasmides à partir de plusieurs transformants.
Sur les fragments excisés des plasmides respectifs à l'aide de EcoR V etHinf I, on réalise une analyse de séquence par la méthode de Messing et al. (Gene, 19, p. 269, 1982>. On note que l'un de ces fragments est amputé des bases jusqu'à la 136ne en aval du codon de fin de traduction du gène de la polyhédrine, comme le montre la
figure 5. On nomme ce plasmide pAcRP61 (figure 5).
(2) Production du plasmide pAcE1 dans lequel le gène de la polyhédrine est supprimé (voir figure 6) On coupe le plasmide pAcEcoR I-I à l'aide de BamH I, pour l'amputer séquentiellement de son extrémité à l'aide de 0,5 unité d'exonucléase Bal 31. Ensuite, on en répare les extrémités à l'aide d'ADN polymérase d'E. coli (fragment de Klenow). L'ADN de plasmide est purifié, et l'on ajoute au mélange réactionnel le linker BamH I phosphorylé, mentionné ci-dessus, ainsi que de l'ADN ligase T4. Après incubation à la température ambiante pendant 2 heures, on purifie l'ADN. Puis on fait à nouveau digérer l'ADN par BamH I, dans 100 pl de solution réactionnelle. L'ADN digéré est soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7%, puis récupéré pour être purifié. Après ligature de l'ADN à l'aide de l'ADN ligase T4, on transforme des cellules d'E. coli JM109 à l'aide de l'ADN ligaturé (résistance à l'ampicilline). On prépare des plasmides à partir de plusieurs transformants.On réalise une analyse séquentielle des fragments excisés des plasmides respectifs avec EcoR V et BamH I. Parmi un certain nombre de plasmides, on sélectionne un plasmide contenant le fragment supprimé jusqu'au T du codon de début de traduction (ATG) du gène de la polyhédrine. On nomme ce
plasmide pAcEI (figure 6).
(3) Production du premier plasm.nide vecteur recombinant pAcYMS1 (voir figure 7) On coupe le plasmide pAcRP61 obtenu précédemment avec Xho I et BamH I. Le fragment le plus long, indiqué par des fléches sur la figure 7, est soumis à une
électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7%, puis récupéré.
D'autre part, on coupe le plasmide pAcEl avec Xho I et BamH I. Le fragment le plus court, indiqué avec des flèches sur la figure 7, est soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 0,7%, puis récupéré. Ces deux fragments sont ligaturés à l'aide de l'ADN ligase T4. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pAcYM1. On coupe ensuite ce plasmide pAcYM1 avec BamH I, site au niveau duquel est
inséré un linker synthétique (5'-pGATCCCCGGG-3') BamH I-
Sma I-BamH I. Le plasmide ainsi élaboré est appelé pAcYMSl (voir figure 7) . Dans le fragment EcoR I-I, le plasmide pAcYMS1 contient, dans l'ordre, le promoteur polyhédrine, la région 5' non traduite du gène de la
polyhédrine, le site pour enzyme de restriction BamH.I-
Sma I-BamH I, et la région 3' non traduite du gène de la polyhédrine.
Exemple 3
Production du second vecteur recombinant comportant l'ADNc codant pour la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise (voir figure 8) Apres réparation de ses extrémités à l'aide d'ADN polymérase d'E. coli (fragment de Klenow), l'ADNc (J3) obtenu dans l'exemple 1 (5) est ligaturé, & l'aide d'ADN ligase T4, avec pAcYMSl, coupé au préalable avec l'enzyme de restriction Sma I. On transforme ensuite des cellules JM109, et on purifie les plasmides obtenus à-partir de plusieurs transformants. Le plasmide dans lequel l'ADNc (J3) décrit ci-dessus a été intégré au niveau du site Sma I de pAcYMS1 dans la direction positive (le terme "direction positive" indique que la direction de traduction de l'ADNc est la même que la direction de transcription du promoteur polyhédrine) est sélectionné sur la base des résultats du schéma de restriction obtenus à l'aide d'enzymes de restriction convenables. Le second vecteur recombinant ainsi obtenu est appelé
pAcYMJ3.
Exemple 4
Construction d'un Baculovirus recombinant D'une façon semblable au procédé décrit dans la
monographie de F.L. Graham et al. (Virology, 52, p. 456-
467, 1973), on mélange 1 pg d'ADN génomique de AcNPV avec 1 à 10 pg de pAcYMJ3. On dilue le mélange avec une
solution tampon de 1-HEPES (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-
2-éthanesulfonate) (pH 7,0) contenant 15 mg/ml d'ADN de thymus de veau, jusqu'à 950 pl. Tout en agitant le mélange, on ajoute goutte à goutte 50 ml de CaCl2 2,5 M, à la température ambiante et pendant 30 minutes, pour former des précipités. On ajoute l'ADN précipité (1 ml) à des cellules Sf9, dans 2 ml de milieu placés sur une plaque de culture Je 60 ml. La monocouche de cellules est lavée avec le milieu 4 heures plus tard, et on y ajoute 2 ml de milieu contenant 10% de sérum de veau foetal, puis on laisse l'incubation s'effectuer pendant 3 jours. On recueille ensuite le milieu à l'aide d'une pipette stérile. Dans ce milieu, sont mélangés des virus AcNPV recombinants et non-recombinants. Afin d'isoler les AcNPV recombinants du mélange, on dilue le milieu recueilli de façon appropriée, et on inocule ce milieu dilué aux cellules Sf9 cultivées en monocouches, pour former des plaques. On sélectionne les plaques dans lesquelles ii ne se forme pas d'occlusion virale, et on récupère les virus à partir de ces plaques. On met les virus en suspension dans une solution de tampon phosphate. Une partie de cette suspension est répartie en taches sur une membrane en nylon ou en nitrocellulose, pour hydridation par points, et une autre partie de cette suspension est à nouveau inoculée dans des cellules Sf9, pour y faire
proliférer le virus.
Apres traitement à trois reprises avec NaOH 0,5N pendant 10 minutes et avec un tampon Tris-chlorhydrate 1M pendant 5 minutes, la membrane tachée est traitée avec NaCl 1,5M et un tampon Tris-chlorhydrate 0,5M pendant 5 minutes. La membrane traitée est saturée avec SSC double (SSC simple: 0, 15M de NaCl, 0,015M de citrate de sodium), puis traitée thermiquement à 80-C pendant 2 heures. On effectue ensuite un traitement avec SET quadruple (0,6M de NaCl, 0,08M de Tris-Cl, 4 mM d'EDTA (PH 7,8))-Denhardt décuple -0,1% de SDS à 68'C pendant 2 heures. On hybride par translation de coupure, à 68'C pendant 14 heures, de
l'ADN de sperme de saumon, modifié par SET quadruple-
Denhardt décuple-0,1i% de SDS-0,1% de Na4PzO7-50 pg/ml, et de l'ADNc de protéine E de virus de l'encéphalite japonaise, marqué au 32p. Après lavage, la membrane est placée sur un film pour rayons X, qui est soumis à une autoradiographie, et on sélectionne une-tache exposée sur le film. La solution de virus correspondant à la tache exposée est à nouveau diluée de façon convenable, et on inocule cette solution diluée à des cellules Sf9, pour le développement de plaques. Les plaques développées sont traitées comme ci-dessus, et le mode opératoire de purification est répété jusqu'à ce que les plaques développées soient toutes positives après hybridation par points. Le virus ainsi obtenu est le Baculovirus
recombinant visé, et on l'appelle AcJ3.
Exemple 5
Production de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise par le Baculovirus recombinant: On fait croître des cellules Sf9 en monocouche, de façon à atteindre une densité de 5.106/ml. Le milieu de culture est éliminé, et on fournit un milieu contenant 5 p.f.u./cellule de AcJ3, pour provoquer une infection à 23'C. Après l'inoculation, les cellules sont cultivées pendant 2 jours pour que la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise soit exprimée dans les cellules infectées. L'expression de cette protéine est confirmée
par le procédé au buvard Western (Bernet, W.N., Analyt.
Biochem., 112, p. 195-203, 1981), utilisant des anti-
263 1238
sérums de la protéine E. Les résultats révèlent que les cellules infectées par AcJ3 produisent une protéine ayant une masse moléculaire d'environ 53.000 daltons. Cette valeur de la masse moléculaire, 53.000 daltons, est égale à celle que l'on calcule à priori à partir de la séquence d'acides aminés de la protéine E du virus de
l'encéphalite japonaise (figure 4).
En dépit du fait que l'ADNc (J3) intégré dans le génome de AcJ3 contient, en plus de la région codant pour la protéine E, les régions codant pour les protéines préM, M et pour une partie de la protéine NS1 (protéine non structurale), c'est la protéine de 53.000 daltons qui est exprimée. De ce fait, on suppose facilement que la protéine exprimée dans les cellules infectées doit être soumise à un traitement semblable à celui subi par la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, pour devenir la protéine E de 53.000 daltons. La protéine E exprimée dans les cellules infectées de AcJ3 est réactive aux anti-sérums de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise, et il est donc évident que la
protéine E exprimée possède un caractère antigénique.
Elle peut donc être utilisée pour des vaccins ou des trousses de diagnostic. La quantité de protéine E produite dans les cellules infectées peut être détectée par le procédé au buvard Western, même s'il s'agit de l'extrait de seulement 200 cellules infectées. On voit donc que la protéine E est produite sur une échelle considérable. De la même manière, on a inoculé un Baculovirus sauvage, au lieu de AcJ3, à des cellules Sf9, pour examiner les protéines exprimées dans les cellules. On n'a cependant pas détecté de protéines réactives aux anti- sérums.
Exemple 6
Expérience d'immunité animale réalisée avec la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise exprimée
par un Baculovirus recombinant.
On cultive en monocouche 4.107 cellules Sf9. Apres avoir enlevé ie milieu de croissance, on fournit un milieu contenant 5 p.f.u. par cellule de AcJ3 pour provoquer l'infection à 23C. Apres l'infection, on cultive les cellules pendant 2 jours pour que la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise soit exprimée dans les cellules infectées. On récolte ensuite les cellules infectées par centrifugation à 3000 t/min pendant 20 minutes. Les cellules ainsi récoltées sont lavées avec 1 ml de tampon phosphate et soumises à une sonication. Le surnageant obtenu par centrifugation à 3000 t/min pendant minutes est utilisé comme échantillon de test pour
l'immunité animale.
On inocule, par voie intrapé-itonéale, 0,1 ml de l'échantillon de test mentionné ci-dessus, contenant la protéine E, à quatre souris mâles C3H/He, âgées de quatre
semaines (fourni par Shizuoka Experimental Animals Co-
operation). Deux semaines plus tard, on saigne deux d'entre elles. Les autres reçoivent une relance de 0,1 ml du même échantillon de test, et sont ensuite saignées une semaine plus tard. A partir du sang recueilli, on sépare un sérum de la façon classique, et l'on mesure le titre d'anticorps neutralisants contre le virus de l'encéphalite japonaise dans le sérum, de la manière décrite dans "Tissue Culture Technique for Virus Test",
Takashi KITAMURA, publié par KINDAI Inc., p. 250-255).
Les résultats des mesures sont indiqués dans le tableau 1.
Tableau 1
Titre d'anticorps neutralisants Souris N Relance dans le sang de la souris (logio) l - 1,2
2 - 1,1
3 + 1,5
4 + 1,8
témoin - < 0,6 Dans le tableau ci-dessus, les valeurs des titres d'anticorps neutralisants dans le sang des souris sont
transformées en leurs logarithmes ordinaires.
Comme le montrent les résultats, l'inoculation de la protéine E du virus de l'encéphalite japonaise produite par le Baculovirus recombinant AcJ3 fait augmenter le titre d'anticorps neutralisants contre le
virus de l'encéphalite japonaise dans le sang des animaux.
Ceci démontre l'efficacité de cette protéine en tant que vaccin. Bien que l'on ait décrit l'invention de façon détaillée en se référant & des modes de réalisation particuliers, il est évident pour le spécialiste que l'on peut y apporter diverses modifications sans sortir du
cadre de la présente invention.
Claims (10)
1. Procédé de production d'une protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, caractérisé en ce qu'il comporte l'infection de cellules d'insecte avec un Baculovirus recombinant, dans lequel est intégré, dans une région du génome non essentielle pour la prolifération du Baculovirus, au moins une partie de 1'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, la culture desdites cellules d'insecte et la récupération de la protéine d'enveloppe
exprimée du virus de l'encéphalite japonaise.
2. Procédé conforme à la revendication l, caractérisé en ce que tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe est intégré conjointement avec tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine de
membrane du virus de l'encéphalite japonaise.
3. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé en ce que tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe est intégré conjointement avec tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine de prémembrane et pour la protéine de membrane du virus de
l'encéphalite japonaise.
4. Procédé conforme à l'une quelconque des
revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'ADNc
codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise code pour la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 4 ou pour un polypeptide ayant pratiquement les mêmes fonctions que cette séquence
d'acides aminés.
5. Baculovirus recombinant, caractérisé en ce que tout ou partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise est intégré dans une région du génome non essentielle pour la
prolifération du Baculovirus.
6. Baculovirus recombinant conforme à la revendication 5, caractérisé en ce qu'au moins une partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe est intégrée conjointement avec au moins une partie de l'ADNc codant pour la protéine de membrane du virus de
l'encéphalite japonaise.
7. Baculovirus recombinant conforme à la revendication 5, caractérisé en ce qu'au moins une partie de l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe est intégrée conjointement avec une partie de l'ADNc codant pour la protéine de prémembrane et la protéine de
membrane du virus de l'encéphalite japonaise.
8. Baculovirus recombinant conforme à l'une
quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce
que l'ADNc codant pour la protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise code pour la séquence d'acides aminés représentée sur la figure 4 ou pour un polypeptide ayant pratiquement les mêmes fonctions que cette séquence
d'acides aminés.
9. Protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise, caractérisée en ce qu'elle est produite selon
un procédé conforme à l'une quelconque des revendications
1 à 4.
10. Préparation pour vaccin, caractérisée en ce qu'elle contient, en tant qu'ingrédient actif, une protéine d'enveloppe du virus de l'encéphalite japonaise
conforme à la revendication 9.
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| Title |
|---|
| TROP. MED. vol. 29, no. 4, 1987, pages 195 - 209; AIRA, Y.: "Expression of envelope glycoprotein E of Japanese Encephalitis Virus usingBombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus" * |
| VIROLOGY vol. 173, 1989, pages 674 - 682; MATSUURA, Y. et al.: "Characterization of Japanese Encephalitis Virus enveloppe protein expressed by recombinant baculoviruses" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5229293A (en) | 1993-07-20 |
| FR2631238B1 (fr) | 1994-10-28 |
| GB2218421A (en) | 1989-11-15 |
| GB2218421B (en) | 1992-12-02 |
| JP2511494B2 (ja) | 1996-06-26 |
| JPH01285198A (ja) | 1989-11-16 |
| GB8910381D0 (en) | 1989-06-21 |
| KR900018373A (ko) | 1990-12-21 |
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