JPH08505523A

JPH08505523A - Ｒｎａパッケージングシステム

Info

Publication number: JPH08505523A
Application number: JP6511342A
Authority: JP
Inventors: トーマス，エム．エー．ウィルソン; デュク−ジュワン−リー
Original assignee: ラットガースユニバーシティー
Priority date: 1992-10-29
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 1996-06-18
Also published as: AU693770B2; US5443969A; EP0683821A4; EP0683821A1; CA2147252A1; KR950704504A; AU5455494A; WO1994010329A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、組換えＲＮＡを形質発現させてシュードウイルス粒子内でパッケージさせるためのインビボシステムに関する。本発明は、植物性ウイルスコートタンパク（ＣＰｓ）を大腸菌内で効率的に形質発現させることができるという発見と、これらの組換えコートタンパク質が、インビボで隣接する組み立て原点配列（ＯＡＳ）を含む組換えキメラＲＮＡを集合・組み立てし、パッケージさせて、外来性ＲＮＡを含む成熟ウイルス粒子を形成する機能を有するという発見とに基づくものである。このように、本発明は、精製と貯蔵が容易である耐リボヌクレアーゼ性の形にＲＮＡをパッケージすることができ、これによってリボヌクレーアゼによるＲＮＡの劣化・分解に関連した従来技術の問題を克服するものである。有意なことに、本発明の方法は、ＲＮＡ配列と長さの双方から独立している。本発明の構成要素には、ウイルスコートタンパクの細菌宿主での供給源と、ＯＡＳを、エンコードするＤＮＡおよび外来性ＤＮＡを含むＤＮＡ分子の翻訳を指令する細菌宿主での供給源とが含まれるのであるが、なお、該ＤＮＡ分子は宿主細胞に転写させてＯＡＳを対象とするＲＮＡに結合させてなるＲＮＡ分子を産生させることが出来るのである。ＣＰｓおよびＯＡＳは、ロッド形状のラセン状粒子と一本鎖ＲＮＡゲノムとを有する植物ウイルスに由来し、最も好ましくは、タバコモザイクウイルスである。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＮＡパッケージングシステム１．緒言本発明は、長さまたは配列が無限である組換え一本鎖ＲＮＡを植物ウイルスコートタンパクから成るシュードウイルス粒子内に形質発現させかつパッケージンするためのインビボシステムに関する。本発明は、リボヌクレアーゼ抵抗性ウイルス様粒子中に存在する変化しやすいＲＮＡを効率的に産生し、かつ長期間に亙って取り扱うための手段を提供する。２．発明の背景トバモ、ポテクス、ポティおよびトブラウイルス群を含む数多くの伝染性植物ウイルスは、相互に共通する特性を幾つか共有している。このような特性としては、集合して一体と成って伸長した強固なロッド状または屈曲性の糸状構造体を形成するウイルスコートタンパクオリゴマーによってカプシドに包接されている一本鎖ＲＮＡゲノムが挙げられる。植物ウイルスの内で最も研究されたウイルスは、恐らくは、ゲノムサイズが６．４Ｋｂであるトバモウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）であろう。正鎖ゲノムＲＮＡは、多数のウイルスタンパク質をコードするもので、これには、例えば、ウイルスゲノムを複製するのに必要とされるタンパク質やコートタンパクなど構造タンパクをコードするタンパク質が含まれている。なお、このコートタンパクは、集合して２０Ｓの原ラセン形または円盤状構造物になり、次いでこの構造は、ウイルスゲノムＲＮＡ分子とともに伸長したラセン状構造体に配列されるものである（Goelet et al.，1982，Proc.Natl，Acad.Sci.79:5818-2 2）。ＴＭＶゲノムＲＮＡに近接したものは、組み立て原点配列（ＯＡＳ）と称される配列要素があり、これは、隣接ウイルスＲＮＡ配列をウイルス粒子に直接的に効率的にカプシドに包接するために必要でありかつ充分である。ＴＭＶＯＡＳは、一般的な菌株（およびcowpe strain（Cc;Sunnhempモザイクウイルス）のコートタンパク遺伝子それ自体）においてウイルスゲノムノ３’端末からほぼ１ｋｂに位置しており、かつ三つのヘアスピンステムーループ状の構造体を形成するものと予測される４４０ヌクレオチド配列から構成される（Tuｍer and Butle r，1986，Nucl.Acids Res.14:9229-42）。このウイルスコートタンパクの円盤状物は当初は、ウイルス組立ての過程においてループ１に結合し、また突然変異体組み立て原点の転写産生物を用いたインビトロパッケージングアッセイによって、ループ１を構成する７５のヌクレオチドが異種またはウイルスＲＮＡ配列をカプシドで包接するために必要かつ充分であうることが明らかになっている（Tuｍ er et al.，J.Mol.Biol.203:531-47）。インビトロ（in vitro）での再構成研究の結果、ＴＭＶの組み立てプロセスに関する詳細が得られている。感染した植物細胞から採取したビリオンに由来する精製コートタンパクの標本は、ｐＨ５におけるＲＮＡの不存在下でも、集合してラセン形の構造体とウイルス様ロッド状構造体を形成することができるので、その結果、このコートタンパクは、自己組み立てに必要な本質的な情報を含有していることが示唆される。精製したＴＭＶコートタンパク標本をＴＭＶＲＮＡとともにｐＨ７においてインビトロ培養すると、カプシドに包接されたＲＮＡを含有したＴＭＶ様ウイルス粒子が組み立てられるのである（Fraenkel-Conrat and 種のキメラＲＮＡ分子は、ＳＰ６またはＴ７（Jupin，I.et al.，1989，Nucl.Ac ids Res.17:815）転写プラスミドを用いてインビトロで転写すると、やはりインビトロでシュードウイルス粒子に組み立てることができる（Sleat et al.，1986 ，Virology155:299-308）。最近まで、インビトロでの再構成研究に使用するウイルスコートタンパクの供給源として、感染処理した植物組織から作成したウイルス標本が用いられてきた。しかしながら、このような供給源は、ウイルス感染、植物組織からウイルスの精製、次いでウイルスからコートタンパクの精製を行うことからなる煩雑な方法を用いなければならないので不利である。多数の植物ウイルスゲノムをクローニングし、次いで配列決定を行ったところ、ウイルスコートタンパクを暗号化する配列を決定することが出来た。これらの遺伝子を細菌の形質発現ベクターに挿入すると、例えば大腸菌内においてＴＭＶコートタンパクを形質発現させることが出来たという（Shire et al.，1990，Biochemistry 29:5119-26）。しかしながら、大腸菌内において産生された組換えＴＭＶコートタンパクがインビトロでＴＭＶＲＮＡと再構成する速度は、天然のコートタンパクとの再構成を基準とすると大幅に低い、ということが報告されている（同上）：著者らは、このような再構成が効率的でないことは、組み換えタンパク質のアミノ端末にアセチル基がないことに起因することを示唆している。Ｚｕｃｃｈｉｎｉ黄色モザイクウイルスおよびJohnsongrassモザイクウイルス（何れも、potyウイルスであり、tobamo virus，tobravirusまたはpotexvirusグループには属さない）のコートタンパクも、大腸菌で産生されている（Gal-On et al.，1990，Gene 87:273-277;Jagadis h et al.，1991，J.Gen.Virology 72:1543-1550）。分子生物学および組み換え核酸技術における現在の研究は、リボヌクレアーゼによるＲＮＡの分解劣化に関連した問題によって妨げられている。これまで行われた研究は、例えばヒト胎盤ＲＮＡアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）などの阻害剤、または例えば、リボヌクレアーゼの活性を阻害する発癌性が疑われている物質であるジエチルピロ炭酸塩（ＤＥＰＣ）などのアルキル化試薬の使用に依存するものであった；このような阻害剤は、ＲＮＡの修飾された成分として好ましくないものを生成させ得る可能性がある。３．発明の概要本発明は、組換え一本鎖ＲＮＡを形質発現させてシュードウイルス粒子内でパッケージさせるためのインビボシステムに関する。本発明は、ウイルスコートタンパク（ＣＰｓ）を大腸菌内で効率的に形質発現させることができるという発見と、これらの組換えコートタンパク質が、インビボで隣接する組み立て原点配列（ＯＡＳ）を含む組換えキメラＲＮＡを集合・組み立てし、パッケージさせて、外来性ＲＮＡを含む成熟ウイルス様粒子を形成する機能を有するという発見とに基づくものである。このように、本発明は、精製と貯蔵が容易である耐リボヌクレアーゼ性の形にＲＮＡをパッケージすることができ、これによってリボヌクレーアゼによるＲＮＡの劣化・分解に関連した従来技術の問題を克服するものである。本発明は、興味の対称となるＲＮＡは如何なるものでも好都合に効率よく産生し且つ実質的な劣化分解を伴うことなく長期間保存することを可能とするものである。有意なことに、本発明の方法は、ＲＮＡ配列と長さの双方から独立している。本明細書において規定する、組み換えＲＮＡを産生させ且つパッケージさせるためのインビボシステムは、広範な用途を有しており、これにはＲＮＡ操作を含めた分子生物学者によって目下用いられている技法の如何なる方法も包含される。これら用途としては、例えば、興味の対称となるタンパク質を産生させるためのインビトロ翻訳反応、細胞内に導入してタンパク機能を研究するためのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ分子の合成やノーザンまたはサザンブロット分析に使用する放射標識ＲＮＡの合成等が挙げられる。本発明の構成要素には、ウイルスコートタンパクの細菌宿主での供給源と、ＯＡＳを、エンコードするＤＮＡを外来性ＤＮＡ（以下”＊ＤＮＡ”と称する）に結合してなるＤＮＡ分子の翻訳を指令する細菌宿主での供給源とが含まれるのであるが、なお、該ＤＮＡ分子は宿主細胞に転写させてＯＡＳを対象とするＲＮＡに結合させてなる（以下”ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡ”と称する）ＲＮＡ分子を産生させることが出来るのである；これらの供給源は、双方とも和合性があり、且つ、タンパク質（ＣＰ）の形質発現および（ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡの）転写それぞれを同一の細菌宿主内において一緒に行う能力を有する。本発明によって提供されるＣＰｓおよびＯＡＳは、ロッド形状のラセン状粒子と一本鎖ＲＮＡゲノムとを有するあらゆる植物ウイルス由来のものであってもよく、たとえば、tobamovi rus，potexvirus，tobravirus，hordeivirus，potyvirus、およびfurovirusが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい一つの局面においては、ＣＰおよびＯＡＳ−結合＊ＤＮＡのこれらの供給源は、プラスミドベクターである。ある具体的な実施態様においては、単一プラスミドベクターがＣＰとＯＡＳ −結合＊ＲＮＡの双方の供給源である。もう一つの実施態様においては、異なる複数の供給源は異なる複数のプラスミドベクターである。ベクター、組換え細胞および本発明の方法を実施するためのキットも提供される。４．図面の説明第１図。大腸菌内で形質発現させたＴＭＶコートタンパクのCooｍassie染色（１５％）ポリアクリルアミドゲル。レーン：１，ｐＥＴＰｒｏ３０１（＋）ＩＰＴＧ；２，ｐＥＴ３０２（＋）ＩＰＴＧ；３，ｐＥＴＡ１ａ３０１（＋）ＩＰＴＧ；４，ｐＥＴ３０１（＋）ＩＰＴＧ；５，ｐＥＴ３ａ（＋）ＩＰＴＧ；６，ｐＥＴ３ａ（−）ＩＰＴＧ；７、タンパクサイズマーカー。第２図。大腸菌内で形質発現させたＴＭＶコートタンパクのウエスタンブロット分析。レーン：１、ｐＥＴＡ１ａ３０１（＋）ＩＰＴＧ；２、ｐＥＴ３０１（＋）ＩＰＴＧ；３、ｐＥＴ３０１（−）ＩＰＴＧ；４、ＥＴ３０２（＋）ＩＰＴＧ第３図。大腸菌で賛成させたＴＭＶコートタンパクおよびTＭＶ−様粒子の電子顕微鏡写真。ｐＥＴＡ１ａ３０１とｐＬｙｓＥ（ネガティブコントロールは、ＣＰ単独で形質発現）またはｐＥＴＡ１ａ３０１とｐＬｙｓ１０２（パネルＢ、Ｃ、Ｄ＝ＣＡＴ−ＯＡＳｍＲＮＡ）とで形質発現させた大腸菌のＩＰＴＧ−誘導培養液から得たＴＭＶコートタンパクを含む複合体のイムノソベント電子顕微鏡検査を実施した。ネガティブ染色は、１％酢酸ウラニル（パネルＡ、Ｂ、Ｃ））または１％モリブデン酸アンモニウム（パネルＤ）を用いて行った。パネルE は、ＴＭＶ−様粒子のヒストグラムを示す。第４図。ウイルス様粒子から抽出したＲＮＡのノーザンドットブロット。レーン：１、Ｈ２Ｏ−コントロール；２、ｐＥＴＡ１ａ３０１とｐＬｙｓ１０２（ＣＡＴ−ＯＡＳｍＲＮＡ）；３、ｐＥＴＡ１ａ３０１とｐＬｙｓ１０３２（ＧＵＳ−ＯＡＳｍＲＮＡ）；４、ｐＬｙｓＥとｐＥＴＡ１ａ３０１。第５図。ＴＭＶＯＡＳ配列から誘導した５’および３’プライマーを用いてシュードウイルス粒子から単離したＲＮＡ試料のＰＣＲ増幅。レーン：１、ＴＭＶＲＮＡ（ポジティブコントロール）；２、分子量”マーカー”；３、ｐＬｙｓＥＣＡＴ；４、ｐＬｙｓ１０２ＣＡＴ−ＯＡＳ；５、ｐＬｙｓ１０３２ＧＵＳ−ＯＡＳ．第６図。ＴＭＶＣＰをエンコードするｐＥＴ３ａベクター誘導体の一部分の概略ダイアグラム。幅の狭いレーンは、ｐＥＴ３ａベクター配列を表す。ＴＭＶＣＰをエンコードする遺伝子の５’末端のサイト配向突然変異誘導は、ＰＣＲ反応によって行った。ＴＭＶＣＰをエンコードする突然変異遺伝子は、最終形質発現ベクターであるｐＥＴ３ａにＮｄｅｌおよびＢａｍＨｌ部位を用いてクローン化させた。第７図。ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを提供生成するベクター。ＣＡＴＤＮＡからなる、大腸菌内にパッケージするべき転写産物を与えるｐＬｙｓ１０２ベクターの一部分について、その概略ダイアグラムが示されている。ＯＡＳは、ＴＭＶの組み立て配列の原点である。平行線を引いた領域は、ＯＡＳカセットをクローニングさせることによって生成させたＣＡＴ遺伝子の繰り返し配列を示す。第８図。ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを提供生成するベクター。ＯＡＳ−結合ＧＵＳＤＮＡからなる、大腸菌内にパッケージするべき転写産物を与えるｐＬｙｓ１０３２ベクターの一部分について、その概略ダイアグラムが示されている。ＯＡＳは、ＴＭＶの組み立て配列の原点を示す。平行線を引いた領域は、合成したｐｏｌｙ（ＣＡＡ）のリーダーを示す。第９図。ＯＡＳプローブの概略ダイアグラム。ＯＡＳハイブリッド化プローブが誘導された配列からなるｐＪｌｌ１０２（Gallie et al.，1987，Science 236 :1122-24）の一部について、その概略ダイアグラムを示す。Ω’は、ＴＭＶリーダー誘導体を示す（Gallie et al.，1987，Nucl.Acids Res.15:3127）。第１０図。組立のＴＭＶ原点。ウイルス配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５におけるヌクレオチド１７３−４１０）（Zimmern，D.，1983，EMBO J.2:1901-07）塩基５２９０から５５２７までから延長するＴＭＶＯＡＳを含有するＴＭＶゲノム（Goelst et al.，1982，Proc.Natl，Acad.Sci.USA79:5818-22）のヌクレオチド５１１８−５５５０（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）から得たヌクレオチド配列を示してある。第１１図。ＴＭＶＯＡＳのループ１。ＴＭＶコートタンパク円盤状物（Tur- グメントのカプシド包接を廃校させるに充分であると知られている、ＴＭＶＯＡＳのループ1について、そのヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。５．発明の詳細な説明本発明は、組換え一本鎖ＲＮＡをシュードウイルス（ウイルス様）粒子内に産生させかつパッケージするためのインビボシステムに関する。このインビボパッケージングシステムは、対象とするＲＮＡを容易に精製しかつリボヌクレアーゼの分解作用・効果から保護する形状において大量に産生させる手段として有用である。本発明は、インビボ（in vivo）においてウイルスコートタンパク（ＣＰｓ）を発現させかつＯＡＳ結合配列（以下”ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡ”と称する）をジュードウイルス粒子内にパッケージさせるに際して、該ＣＰｓがＯＳＡ−結合＊ＲＮＡを組み立てかつこれをシュードウイルス粒子内にパッケージさせるよう機能を果たすことができる能力に基くものである。明らかなように、”ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡ”とは、本明細書においては、ＯＡＳＲＮＡ配列に転写させることができる配列を対象とするＲＮＡに結合してなるＤＮＡ分子を言うものとし、また”ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡ”とは、かかる転写によって産生されたＲＮＡ配列を言うものとする。本発明の構成要素としては、ＣＰｓとＯＡＳ−結合＊ＲＮＡの双方を細菌宿主内において産生させるための供給源が含まれる。一つの局面において、組換えＣＰ遺伝子は、発現させるために細菌宿主染色体に組み込んでもよく（（例えば、相同組換えによって；例えば、KollerおよびSmithies．1989，Pr oc.Natl.Acad.Sci.86:8932-35;Zijlstra et al.，1989，Nature342;435-38）、また、ＯＡＳ−結ｋ合＊ＤＮＡ構造体を転写させるために細菌宿主染色体に組み込んでもよい（例えば、相同組換えによって）。また別の好ましい実施態様においては、このＣＰは、ベクターから、好ましくはプラスミド形質発現ベクターから形質発現させ、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡは、ベクターから、好ましくはＣＰをエンコードする形質発現ベクターとは同一または異なるベクターであってもよい、プラスミド形質発現ベクターから転写させる。本発明に従ったこのようなＣＰとＯＡＳ−結合＊ＲＮＡの供給源は、以下に詳述する。５．１．細菌宿主におけるウイルスコートタンパクの産生本発明の第一の構成要素は、植物ウイルスＣＰの細菌宿主内での組み換え産生を可能とする供給源である。好ましい局面において、ＣＰ核酸は、当該ＯＡＳの由来する元である同一ウイルス種であるウイルスのＣＰをエンコードするものである。この植物ウイルスＣｐは、ロッド状のラセン形粒子と一本鎖ＲＮＡゲノムを有する植物ウイルスノＣＰであって、そのウイルスとしては、例えばtobaｍovirus ，potexvirus，tobravirus，hordeivirus，potyvirusおよびfurovirusがあるが、これに限定されことはなく、tobamovirusが最も好ましい。これらのウイルスグループは、長さが含有するＲＮＡのサイズによってのみ決定されるロッド状のラセン形粒子を有する；即ち、パッケージングサイズに制約は全くないのである。ウイルス種としては、天然種および亜硝酸−やその他の薬品で誘導した変異種の双方が前記ウイルスグループに包含されるものと考えられる。Tobamovirus グループに属するウイルスとしては、ＴＭＶ、キューリ緑色斑点モザイクウイルス、トマトモザイクウイルス、Fragipaniモザイクウイルス、Odontoglossumリングスポットウイルス、Holmes'ヘラオオバコモザイクウイルス（cowpea Cc）、Ｕ２−タバコモザイクウイルスなど（例えば、植物ウイルスのＣＭＩ／ＡＡＢ説明、１９７７年９月、Ｎｏ．１８４）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。Tobravirus類には、エンド−早期褐色ウイルス、タバコラットルウイルスやペッパーリングスポットウイルス等が含まれるが、これらに限定されない。Potexvirusesには、ポテイトウイルスＸやパパイヤモザイクウイルスが含まれるが、これらに限定されない。Hordeivirusesには、オオムギストライプモザイクウイルスが含まれるが、これに限定されない。Potyvirusesには、ポテトウイルスＸが含まれるが、これに限定されない。Furovirusesには、土壌性小麦モザイクウイルスビート壊死性黄色葉脈ウイルスおよびポテトモップトップウイルスが含まれるが、これらに限定されない。このＣＰをエンコードする核酸は、当該技術分野において利用可能である如何なる手段によっても得られる。種々のＣＰ核酸配列が、これまでに開示されているが、これらも使用することが出来る。例えば、ＴＭＶＣＰは、クローン化されておりまた既に配列決定がされている（Goelet et al.，1982，Proc.Natl.Aca d.Sci.79:5818-22を参照のこと）。さらに、コドンを原核生物系内における翻訳のために最適化した時のＴＭＶＣＰの配列はすでに開示されている（Haynes et al. ，1986，Biotechnology 4;637-41）。所望のＣPの核酸クローンが入手可能でない場合は、かかるクローンは標準的組換えＤＮＡ方法論を使用することによって得ることが出来る。例えば、かかるＤＮＡは当該技術分野において公知の標準的な方法によってクローン化されたＤＮＡから、また化学的プロセスによってまたはウイルスＥＲＮＡまたはその精製断片を単離することによってウイルス粒子から得ることができる（例えば、Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring H arbor，New York;Glover，D.M.（ed.）），1985，DNA Cloning:A Practical App roach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，IIを参照）。所望の遺伝子を含む特異的・具体的なＤＮＡ断片の同定は、多くの方法で実施することが出来る。例えば、ＣＰＤＮＡｍａｔａｈａその特異的ＲＮＡまたはそれらの断片の一部分が一定量入手可能でありかつ精製し標識することができる場合は、生成したＤＮＡまたはＲＮＡは、標識済をプローブに核酸ハイブリッド化することによってスクリーンすればよい（Benton，W.and Davis R.，1977，scie nce 196:180;Grunstein，M and Hogness，D.，1975 Proc．Natl．Acad．Sci．U. S.A.72:3961）。このプローブに実質的な相同性を有するＤＮＡ断片はハイブリッドするであろう。制限酵素により消化し、次いで既知の制限地図があればこれに従って予期されるサイズと断片サイズを比較することによって、適切なＤＮＡを同定することも可能である。それ以上の選択は、かかる遺伝子の特性に基づいて行うことが出来る。その代わりに、かかる遺伝子の存在は、その形質発現による生成物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づいた種々の分析によって検知することが出来る。例えば、電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、セルフアッセンブリー活性または抗原性などの特性が、生成ＣＰについて公知の特性と類似したまたは同一であるＣＰを産生するｃＤＮＡクローンを選択することが出来る。適切なＣＰのＲＮＡも、インビトロ翻訳によって同定することができる。単離したＲＮＡのインビトロ翻訳生成物について免疫沈降分析または機能分析（例えば、ビトロでのセルフアッセンブリ能力など）を行うことによって、当該ＲＮＡが所望の配列を含有するＲＮＡとして同定される。ＣＰ遺伝子を単離する代わりになる方法としては、例えば既知の配列から遺伝子配列そのものを化学的に合成すること、または当該ＣＰをエンコードするＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成することなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の方法も適用可能であり、本発明の範囲に含まれる。所望ならば、同定されかつ単離された遺伝遺伝子は次に、本発明の細菌形質発現ベクターに伝達するに先立って適切なクローニングベクターに最適に挿入すればよい。天然のＣＰｓの誘導体（断片をも含む）および類縁体をエンコードする核酸類も、かかる誘導体や類縁体が集合してウイルス粒子に組み立てられかつＯＡＳ含有ＲＮＡをその粒子内にパッケージする能力を保持している限り本発明において用いることができる。具体的には、ＣＰ誘導体は、機能的に活性な分子を作成できるＣＰを置換、付加または欠失によって変えることによって作成することができる。更には、ヌクレオチドをコードする配列が持つ固有の同義性・縮重性によって、そのたのＤＮＡでも、実質的に同一または機能的に均等であるウイルスＣＰアミノ酸配列をエンコードするものは、本発明の方法を実施するのに使用してもよい。例えば、ＤＮＡ配列を変えて、大腸菌または他の細菌コドン用途に最適化させることも有用であり得るし、またはアミノ酸配列に変更を加えて、細菌宿主系においてウイルス粒子組立を促進することも可能であろう。このようなコートヌクレオチドを変更する方法としては、異なるヌクレオチドについて欠失、付加または置換を行って同一または機能的に均等同等である遺伝子産物をエンコードする配列が得られる方法が挙げられる。このような遺伝子産物は、サイレンな変化が生じて生理活性な産物を生成するようなかかる配列内においてアミノ酸の欠失、付加または置換を含有していてもよい。かかるアミノ酸置換は、残基の持つ極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行えばよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、例えばアスパラギン酸やグルタミン酸が挙げられる；正に荷電したアミノ酸としては、リシンやアルギニンが挙げられる；疎水性値が類似している、荷電していない極性頭頂基または非極性頭頂基を有するアミノ酸としては、以下が挙げられる：即ち、ロイシン、イソロイシン、バリニン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロシンである。ある一つの具体的な実施態様においては、ＣＰ融合タンパク質誘導体をエンコードし、ペプチド結合を介して該ＣＰに融合した表面リガンドからなり、該表面リガンドの存在がＯＡＳ−依存性ＲＮＡアッセンブリと干渉しないようにした核酸類を作成することができる。本明細書に於いて使用する”表面リガンド”なる用語は、細胞の表面に存在するレセプターに結合するペプチドまたはタンパク質を言う。即ち、このような表面リガンド−ＣＰ融合タンパク質は、かかる表面リガンドのレセプターを形質発現する特定の細胞種類を標的としてインビトロでシュードウイルス粒子を送り込むことが出来るのである；その後のレセプターによって媒介された細胞な取り込みによって、該粒子とそれに含まれるＲＮＡとが細胞内に送り込まれるのである。使用することができる表面リガンドは、Ａｒｇ− Ｇｌｙ−Ａｓｐアミノ酸モチーフ（ポリオレセプターのリガンド）を含有するペプチド、アシアロゴグリコプロテイン等を含むが、これらに限定されるのではない。ＣＰｓの誘導体または類縁体は、ＣＰまたはその断片に実質的に相同であるペプチド類またはエンコードする核酸がＣＰ核酸配列にハイブリッド化させる能力を有しており、組立とパッケージングにおいて機能的に活性を有するペプチド類を含むが、これらに限定されるものではない。かかるＣＰの誘導体および類縁体をエンコードする核酸は、当該技術分野において公知である種々の方法によって産生させることができる。たとえばクローン化したＣＰ遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である種々の方法の如何なるものによっても修飾することができる（Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，New York）。この配列は、制限エンドヌクレアーゼ（類）を用いて適切な部位において解裂・切断させ、次いで所望ならば、更に酵素修飾を行い、単離しかつインビトロでつなぐことができる。あるＣＰの誘導体または類縁体をエンコードする遺伝子を産生させるに際しては、かかる修飾処理された遺伝子が、ＣＰの機能的活性がエンコードされている遺伝子領域において翻訳停止信号で中断されることなく、当該ＣＰと同じ翻訳読み取り枠内に留まっていることが確保されるように、配慮するべきである。更には、ＣＰをエンコードする核酸配列は、インビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開始および／または終止配列を作成するおよび／または破壊するか、またはクローニング領域において変異を起こさせるかまたは新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、若しくは以前に存在する部位を破壊する課して、インビトロでの更なる修飾を容易にすることができる。当該技術分野で公知である、突然変異誘起に係る如何なる方法も使用することができるが、例えば、部位配向突然変異誘起が含まれるが、これに限定されるものではない（Hutc hison，C.et al.，1978，J.Biol.Chem.253:6551）。次いで、所望のＣＰをエンコードする核酸は、適当な細菌形質発現ベクター、即ち、細菌宿主内において挿入したタンパク質をエンコードする内に挿入する。配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターの中に挿入して、当該細菌内においてＯＡＳ−結合＊ＲＮＡをその後において組み立てしかつカプシドに包摂することになるＣＰの合成を指揮する機能を発揮するベクターを作成するのである。このようなＣＰをエンコードする配列を形質発現させるために種々のベクター系を用いることができるが、かかるベクターは、細菌宿主において機能しかつ存在する他の如何なるベクターとも共存できるものでなくてはならない（たとえば、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを含有するベクター）。かかるベクターとしては、たとえばバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドガアゲラレルガ、これらには限定されるのではない。好ましい局面においては、プラスミド形質発現ベクターを使用する。ベクターの形質発現要素は、その強度および特異性において異なる。適当な転写および翻訳要素は多数あるが、これらの何れも、細菌宿主内部において機能する限り使用してもよい。標準的な組換えＤＮＡ方法は、適切な転写／翻訳制御信号とＣＰをコードする配列とからなるキメラ遺伝子を含有する形質発現ベクターを構築するために使用してもよい（たとえば、Sambrook et al.，1989、上記を参照）。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡおよび合成方法やインビボ組換え体（遺伝子組み換え）が挙げられる。クローニングベクター内への挿入は、たとえばかかるＤＮＡ断片を相補的な付着末端を有するクローニングベクター内につなぐことによって行うことができる。しかしながら、該ＤＮＡを断片化するために使用した相補的制限部位が、クローニングベクター内に存在しない場合は、当該ＤＮＡ分子の端部を酵素によって修飾してもよい。その代わりに、所望の部位は何れでも、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ端末に繋げることによって作成することが出来る；これらの繋げたリンカーは、特異的な、化学的に合成したオリゴヌクレオチドをエンコードする制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有して成っていてもよい。また別の方法においては、切断したベクターおよびＣＰ遺伝子を、ホモポリマーテイリングによって修飾してもよい。かかるＣＰをエンコードする核酸配列の形質発現は、第二の核酸配列によって調節してもよい。たとえば、あるＣＰの形質発現は、当該技術分野で公知である細菌プロモーター／エンハンサー要素によって制御してもよい。ＣＰ遺伝子形質発現を制御する為に使用してもよいプロモーターは、構成性でもまた誘導性であってもよく、β−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Komaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Scl.75:3727-3 1）、ｔａｃプロモーター（DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.80:21- 25）、ｌａｃＵＶ５、λＰｌ、Ｔ７やｔｒｐプロモーターが含まれるが、これらに限定されるのではない。ＣＰ遺伝子を単離する別の方法としては、公知の配列から当該遺伝子配列それ自体を化学的に合成することまたは当該ＣＰ遺伝子をエンコードするＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成することが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。その他の方法も使用可能であって、本発明の範囲に含まれる。プロモーター配列以外に、当該ＣＰ形質発現ベクターは好ましくは、挿入されたコートタンパク質配列を効率的に翻訳するために特異的である開始信号を含有する。かかる信号の一つは、シャイン−ダルガノ配列と称されるが、ＲＮＡの効率的な翻訳を行うために必要とされるリボソーム結合部位として機能する。大腸菌においては、かかるリボソーム結合部位は、開始コドン（ＡＴＧ）および当該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流域に位置する、長さが３〜９ヌクレオチド（たとえば、ＣＰ遺伝子の）である配列が包含される；平均して、ｍＲＮＡの八つのヌクレオチドのうち六つがこのような配列にマッチする：即ち、５’− ＵＡＡＧＧＡＧＧ−３’である。転写終了信号（当該ＣＰ遺伝子の下流域）、たとえば抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子等の選択可能なマーカーやリソチームの形質発現をさせる遺伝子（中でも、細菌の細胞壁を破断し易くすることによってシュードウイルス粒子を後刻精製する上で役立つ）も好ましくは、かかるプラスミド形質発現ベクターに含まれる。ＢＨ２１（ＤＥ３）系においては、Ｔ７リゾチームは、Ｔ７ポリメラーゼに結合する機能を有しているので、当該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対する溶原遺伝子から形質発現させた”漏出性”Ｔ７ポリメラーゼに対する緊縮制御の一つでもあるようである。一つの具体的な実施態様においては、本発明によって提供される組み換え形質発現ベクターは、植物ウイルスＣＰまたはその機能的な誘導体をエンコードするものであり、下記する抗生成分を機能的に結合したものから構成される：即ち、当該ＣＰまたはその機能的誘導体の形質発現を制御するプロモーター、翻訳開始信号、当該ＣＰまたはその機能的誘導体をエンコードするＤＮＡ配列、および転写停止信号である。好ましい局面においては、上記した構成成分は、上記した５ ’から３’のオーダーに位置する。また別の具体的な実施態様においては、本明細書の実施例の部において記載したように、ＴＭＶＣＰをエンコードする遺伝子を、ファージＴ７遺伝子１０から得たＴ７プロモーターおよびこのファージの遺伝子１０からの翻訳開始信号（シャイン−ダルガルノ部位）の双方の下流域に挿入する。下記するように、野生型ＣＰ遺伝子配列（プラスミドｐＥＴ３０１）、および大腸菌コドン使用に最適化したＣＰ配列の双方とも、Ａｌａ，ＰｒｏまたはＡｓｐの何れかについてペナルチメートのアミノ−端末Ｓｅｒ（Ｎ−ホルミルメチオニンを翻訳後プロセシングによって除去する）が幾つか変化したＣＰｓと同様に使用した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーターおよびｃｏｌＥ１レプリコンも、この形質発現ベクターに包含させた。この実施態様においては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＣＰ配列を転写するものであるが、このＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、誘導可能なプロモーター、ｌａｃＵＶ５の制御下において染色体組み込み配列（λ誘導体溶原菌）から作成する。即ち、ｌａｃＵＶ５転写をＩＰＴＧによって誘導した場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが産生されるが、これが次にはこのＣＰ、遺伝子を転写させて、ＣＰを産生するのである。このＴ７プロモーターを含有する形質発現ベクターを使用することが好ましいが、その理由は、このＴ７プロモーターに隣接してクローン化した遺伝子を効率的に転写するのに寄与する数多くの利点を有しているからである。かかる利点としては、同種プロモーター配列に対するＴ７ポリメラーゼの特異性が厳密であること、伸長が進行する差異の速度が早いこと、および転写の早期の終了が生起する頻度が少ないことな度が挙げられる。５．２．細菌宿主におけるＯＡＳ−結合＊ＲＮＡの産生本発明の第二の構成要素は、当該ＣＰが形質発現される同一細菌宿主においてＯＡＳ−結合＊ＤＮＡの転写を可能ならしめ、かくして当該形質発現されたＣＰが集合してウイルス粒子に組み立てられ、かつ該粒子内に転写から生じるＯＡＳ −結合＊ＤＮＡをパッケージさせるような供給源である。ウイルスの組み立て原点配列（ＯＡＳ）が、当該ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡベクターの本質的な特徴の一つである。その理由は、異種ＲＮＡ分子（ＯＡＳ結合＊ＤＮＡ）をシュードウイルス粒子内ヘカプシドで包接することを支配・管理する役割を持っているからである。本明細書で使用するＯＡＳなる用語は、植物ウイルスＣＰ類によって特異的に認識されることができるＲＮＡ配列（またはかかるＲＮＡ配列をエンコードするＤＮＡ）であって、当該ＯＡＳを含有するＲＮＡをかかるＣＰ類によってカプシドに包接することを支配・管理するに充分であるものを言う。明らかなように、当該ＯＡＳは、＊ＤＮＡの５’または３’端末で直接的に結合している必要はない；たとえば、何らかの介在配列がある可能性がある；必要とされることは、当該ＯＡＳが＊ＤＮＡに関しては、転写されるとリボ核酸が生成され（ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡ）、かくして当該ＲＮＡが、ＣＰによる当該ＲＮＡ分子をウイルス様粒子にカプシドに包接することを可能ならしめるために対象とするＲＮＡ配列に機能的に結合するように位置することである。たとえば、転写終止信号は、ＯＡＳ-結合＊ＤＮＡの下流域において生起するにすぎないものとする（転写は、上流から下流域に向かう方向で進行する）。ＯＡＳ結合＊ＤＮＡは好ましくは、ＯＡＳ結合＊ＲＮＡを形成するため、ＯＡＳ結合＊ＤＮＡの細菌内でのでの転写を支配することができる適切なベクター、好ましくはプラスミドベクター内に挿入される。ベクターの選択およびその構成成分（たとえば、プロモーター、選択可能なマーカー等）は、上記５．１項において記載した通りであってよいのであるが、ベクターは、細菌宿主内部において機能し、かつこの宿主と共存し得る、かつ宿主内に共存するＣＰＫＨベクターと共存可能である調節要素を有していなければならない。このようなＯＡＳ −結合＊ＤＮＡベクターは好ましくは、下記する機能的に結合した成分要素から成る：即ち、プロモーター、ＯＡＳ、＊ＤＮＡ、および転写終止信号。ある一つの実施態様においては、前記した成分要素は、５’から３’への順序で存在し、その順序で列挙記載される。また別の実施態様においては、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡベクターは、５’から３’への順序で以下から構成される：即ち、＊ＤＮＡ、ＯＡＳ、および転写終止信号である。この後者の実施態様は、ＯＡＳ（たとえば、ＴＭＶＯＡＳ）は、当該ＲＮＡの５’端末または３’端末に位置した場合は、双方向に機能しかつカプシド内包接を支配することができるという事実を利用したものである；しかしながら、このＯＡＳを＊ＤＮＡの５’端末に配置・位置させることは、細胞内での転写ＲＮＡの分解を阻害するためには好ましいのである。即ち、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡ形質発現ベクターを設計するに際しては、このＯＡＳ配列を当該＊ＤＮＡの５’端末に配置し、かくして新たに転写されたＲＮＡを急速かつ効率的に集合・組み立てさせてウイルス粒子にすることが最も効果的である。このようにして、同時転写的カプシド内包接は、ＲＮＡの合成が進行するに応じてコートタンパクでＲＮＡを保護するべきであり、かくしてインビボでの急速なＲＮＡ分解に関連した種々の問題が回避されることになる。しかしながら、＊ＲＮＡがタンパク質内に翻訳されるべきｍＲＮＡである実施態様においては、ＩＲＥＳ即ちシャイン−ダルガルノ４０Ｓ／３０Ｓリボソーム結合部位をＯＡＳと＊ＤＮＡとの間において設けない限り、５’−ＯＡＳ配列がこのｍＲＮＡの翻訳に干渉する可能性がある。その代わりに、自己切断リボザイム部位は、ＯＡＳとＤＮＡとの間において挿入されても構わない。ある一つの具体的な実施態様においては、このＯＡＳ−結合＊ＤＮＡベクターは、更に、種々の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含んで成るポリリンカー領域が＊ＤＮＡに対して５’または３’に位置して成る。一つの好ましい局面においては、ＯＡＳ-結合＊ＤＮＡ形質発現ベクターは、また、たとえば抗生物質（テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン等）耐性をエンコードする遺伝子など選択可能なマーカー遺伝子を含有する。好ましい一つの局面において、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡのＲＮＡ成分は、対象とするタンパクをエンコードするｍＲＮＡであり、かくして好ましくは、その最終的な翻訳を容易にするために（第５．４部を参照）、シャイン−ダルガルノ配列は、コードする配列の前でＤＮＡに取り込まれる。ベクターは、任意にかつ好ましくはリソチームの形質発現を可能ならしめてもよい。ある具体的な局面において、Ｔ７プロモーター系を用いた場合は、Ｔ７リソチームタンパク質を形質発現させることも有用であり得る。その理由は、Ｔ７ポリメラーゼを結合しかつＴ７ポリメラーゼによる低レベルの構成性形質発現を阻害するよう機能するからである。Ｔ７リソチームを形質発現させることも好ましい。その理由は、その結果細菌壁が生成するが、その細菌壁はリソチームによって大腸菌ペプチドグリカン壁が分解するために一層脆くなるからである。この特徴は、後刻細菌壁がウイルス粒子の精製におけるある段階として溶解せしめられる段階において有用となる。このＴ７リソチーム遺伝子は染色体またはエピソームの何れかによって細菌宿主細胞内において形質発現させてもよい。ＣＰ形質発現ベクターについて上記にて議諭したように、具合技術分野に通暁した人に公知である方法を用いて、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡと適切な転写制御配列を含有する細菌ベクターを構築することが出来る（例えば、Sambrook et al.，1 989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd.Ed.，Cold Spring harbor Laboratory，N.Y.）。ある具体的な実施態様においては、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡの転写を支配するプロモーターは誘導性であり、異なるプラスミド上に存在して、ＣＰ遺伝子形質発現を支配するプロモーターと同一のプロモーターである。その代わりに、このＣ P遺伝子プロモーターは、異なる誘導性プロモーターであってもよいか、または構成性プロモーターであってもよく、またはＯＡＳ−結合＊ＤＮＡプロモーターは構成性であってもよい。明らかなように、複数のプロモーター種類の組合せの如何なるものでも使用してもよい。本発明によって提供された産生とパッケージング系の持つ利点の一つは、形質発現とパッケージングがＯＡＳ−結合＊ＲＮＡの＊ＲＮＡ構成成分に関して配列と長さとの双方に依存していることであるようである。その結果、対象とする如何なるＤＮＡ配列も、ＯＡＳに結合させ次いで転写させてもよく、そのＲＮＡを集合組立てして、本発明に従ったウイルス様粒子としてもよい。即ち、本発明の一つの具体的な実施態様においては、下記する機能的に結合された要素からなるプラスミドベクターが提供される：即ち、細菌プロモーター、ポリリンカー、ＯＡＳ、転写終止信号である。ある実施態様においては、前記する要素は、５’から３’への順序で現れ、これらはその順序で列挙記載される。もう一つの実施態様では、ベクターは、下記する、５’から３’への順序で列挙するものから構成される：即ち、細菌プロモーター、ＯＡＳ，ポリリンカー、転写終止信号である。このようなベクターは、対象とするＤＮＡ配列は如何なるものでもその挿入を容易にさせるのであるが、その原因は、該ポリリンカー領域が、異種＊ＤＮＡを挿入されるかもしれない制限エンドヌクレアーゼ切断部位を種々含有するからである。使用する目的で特異的な植物ウイルスＯＡＳ配列を選択することは、如何なる植物ウイルスＣＰｓが細菌宿主細胞で形質発現されるつあるかに依存して異なってくる。ウイルスＯＡＳ配列およびウイルスＣＰｓが相互に機能的に和合性を有して、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡを効率的に組み立てしてウイルス粒子に出来ねばならないこと、即ち形質発現したＣＰは、粒子組立を受けかつ粒子へのカプシド包接のためＯＡＳを認識することができるものでなくてはならないこと、に留意することが重要である。用いることができるＯＡＳ配列は、例えば、のＯＡＳ配列を包含するが、これに制限されない。但し、ＴＭＶＯＡＳが最も好ましい。好ましい局面においては、ＯＡＳおよびＣＰ配列は、同一ウイルス種から誘導される。恐らくは、組み立て原点配列の内で最もよく定義されるものは、ＴＭＶＯＡＳから成る配列であろう（例えば、Turner et al.，1988，J.Mol . 参照）。ＴＭを用いた実験の結果、ＯＡＳ配列から成るウイルスゲノムＲＮＡの３’端末から１ｋｂに位置する、ほぼ４４０のヌクレオチド配列が明らかにされている（第１０図；ＳＥＱＩＤＮｏ：５）。この領域は、三つの安定したヘアーピン形の軸−ループを形成すると予測される三つの領域を包含していることが見出されており（Zimmern，D.，1983，EMBO J.2:1901-07）、かつコートタンパク２０Ｓ”ｄｉｓｋｓ”は当初はウイルス組立の過程においてループ１（３ ’ｍｏｓｔ）に結合することが明らかにされている。また、インビトロパッケージング試験および変異株組み立て原点転写物（Turner，DF.R.，et al.，1988，J .Mol.Biol.203:531-47）を用いて、迅速かつ特異的な組立の開始がループ２、および３の不存在下で生起する可能性があること、またループ1の配列はほぼ７５のヌクレオチド（第１１図；ＳＥＱＩＤＮＯ：６）から成るが、異種ＲＮＡ配列をカプシドに包接するために必要かつ充分であることの二点も証明されている。ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを構築するのに使用する最も好ましいＯＡＳ配列は、この７５個のヌクレオチドである。本発明の他の実施態様においては、上記において議論したＴＭＶＯＡＳ以外のＯＡＳも使用することが出来る。たとえば、ｃｏｗｐｅａ種ＴＭＶは、そのＣＰ遺伝子の中央部に、使用することができる一個のＯＡＳを有している（Meshi et al.，1981，Mol.Gen.Genet.184:20-25）；このＣＰ遺伝子（ＯＡＳを含有する）を＊ＤＮＡにつなげて、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを形成することができる。この実施態様おいては、かかるＯＡＳ-結合＊ＤＮＡは、ＣＰの供給源としても機能するはずで、かくして別のＣＰの供給源を捜す必要性を回避することができる。もう一つの別の実施態様においては、potexvirusパパイヤモザイクウイルスＲＮＡ（Lok and Abou-Haidar，1986，Virology 153:289-96）の５’端末に位置するＯＡＳを使用することができる。本発明の好ましい局面において、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡおよびCＰは、細菌宿主の内部において異なる形質発現ベクターから産生される。しかしながら、また別の実施態様においては、ＣＰ遺伝子をＯＡＳ−結合＊ＲＮＡを産生するベクターに組み込まれかつこのベクターから形質発現させられる。実施例の部において、詳述している本発明の具体的な実施態様において、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡを生成させるために、二つのパートから成る問題解決法が用いられている：先ず第一に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、ｌａｃＵＶ５等の誘導性プロモーターの制御下で形質発現せしめられる；第二には、プラスミドベクターが、Ｔ７ＲＮＡプロモーターの制御下でＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを形質発現させる。即ち、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、たとえばＩＰＴＧによって誘導されると形質発現する場合は、かかる形質発現されたＴ７ＲＮＡポリイメラーゼは、Ｔ７プロモーターを認識しかつＯＡＳ−結合＊ＤＮＡを転写することになろう。実施例の部において詳述する具体的な実施態様において、ＯＡＳ− 結合＊ＤＮＡベクターは、Ｔ７プロモーターを含有しており、その後にはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子カセットが続いていた。このＴＭＶＯＡＳ配列およびＴ７ターミネーターは、ＵＳコード配列の３’側に位置していた。以下において詳述するように、三番目の形質発現ベクターが、カプシド包接のためのＣＰを供給し、またＴ７プロモーターの制御下で形質発現していた。以下の実施例において詳述する本発明のもう一つ別の実施態様において、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡが、ＴＭＶＯＡＳが後に続くクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴまたはＣｍ’）遺伝子を含有するプラスミドから産生されている。低レベルの構成性転写が、Ｃｍ’遺伝子の大腸菌プロモーターから行われていた。５．２．１．細菌宿主大腸菌が好ましい宿主生物であるが、例えばSalmonella spp.，B.subtilisおよび形質転換可能なCyanobacteria（Synecococcus，Anabena，Anacystis nidula ns）を含むがこれらに限定されない他の菌株の細菌も、ＯＡＳ−結合＊ＲＮＡおよびＣＰを形質発現させるために使用することもできる。細菌株の選択は、ウイルスＣＰを形質発現させるために滑ＯＡＳ−ｋｅｔｕｇｏｕ＊ＤＮＡの転写を支配するために如何なる形質発現ベクター（エピソームまたは染色体の何れをを用いて取り込むかは問わず）を用いるかに依存することになるのである。その理由は、かかるベクターの調節要素が、細菌宿主や同時に存在する他の全てのベクター内で機能し、且つかかる細菌宿主やその他のベクターと和合性を有するものでなくてはならないからである。例えば、プロモーター、転写終止信号および複製の原点（プラスミドのための）は、選択した細菌宿主内で機能するものを、当該技術分野で一般的でまたは当該技術に通暁した技術者に容易に入手可能である知識に基づいて選択するべきである。また別の実施例として、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡの形質発現がλＰＬプロモーターの制御下において行われる場合は、ｃｌｔｓ８５７リプレッサータンパク質は宿主生物（または組み換えプラスミドを形質発現させることによって）供給させるべきである。同様に、形質発現がＴ７プロモーターによって制御される場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの供給源は宿主細胞において利用可能であるべきである。上記したように、宿主細菌は、ＣＰＤＮＡ配列とＯＡＳ−結合＊ＤＮA構造物を含んでいてもよいが、これらは二つともエピソームでまたは二つとも染色体で組み込まれるか、または一方がエピソームでまた他方が染色体で組み込まれたものである。組み換え分子は、宿主細菌細胞内に形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、または当該技術分野において公知の方法の如何なるものによっても導入することができる。本明細書の実施例の部において詳述した本発明の具体的な実態様においては、ＴＭＶＣＰＷＰエンコードし且つこれを形質発現させることができまたＯＡＳ −結合＊ＤＮＡ配列を転写する能力を有するプラスミドを、E．coli BL21（DE3 ）pLysEとも称される宿主細菌株内に形質転換させるのであるが、この菌株は、インデューサＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を媒体に添加した場合バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を発現させるλ溶原菌を含有しているのである（Studieret al.，1990，Met.Enzym ol.185:62-89）。この特殊な菌株の細菌も、ｐ１５Ａレプリコンと（ｐＬｙｓＥとして）Ｔ７リソチーム構造遺伝子を有するプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４を含有している。このＴ７リソチームは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに結合し、その活性を基本量において阻害するが、この活性は、ＩＰＴＧインデューサの不存在下でもｌａｃＵＶ５プロモーターからの転写に因って生じたものである。上記したように、リソチームも、細菌細胞のペプチドグリカン壁を分解するので、細胞を一層脆くするのである。この独特な系においては、ＩＰＴＧを添加することによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導の結果、Ｔ７プロモーターの制御下でのＯＡＳ−結合＊ＤＮＡの形質発現が活性化されるのである。二番目の形質発現プラスミドは、Ｔ７プロモータの制御下でＣＰを形質発現させるもので、やはり形質発現を開始する；即ち、ＯＡＳ−結合ＲＮＡ分子をウイルス粒子に組み立てることが、引き続いて生起するのである。５．３．ウイルス粒子およびＯＡＳ−結合＊ＲＮＡの産生と精製細菌細胞は、使用する特定の宿主細胞に依存して、当該技術分野で公知である種々の相異なる培養培地において増殖させることができる。抗生物質抵抗性遺伝子を含有するプラスミドベクターを用いた、ある一つの具体的な実施態様においては、ウイルスＣＰとＯＡＳ−結合＊ＤＮＡベクターのぞれぞれが保有する当該抗生物質抵抗性遺伝子に依存して、適当な抗生物質を添加する。ある一つの実施態様においては、誘導性ブロモーター、プロモーター活性のインデュサー、例えばｌａｃＵＶ５プロモーターのＩＰＴＧ、とからなる本発明のベクターを、所望ならば増殖培地に添加して、かかるベクターからの転写を活性化するのである。細菌細胞から得た組み立て済みウイルス粒子の精製は、多くの相異なる方法を用いて実施することができる。ウイルス様粒子を生成過程において変化させないように保持するために、全ての方法は剪断力と洗剤を回避するべきものとしている。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の中における透明にした溶菌液の標準実験計画は、これを回避するべきである。溶液は好ましくは、例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチン、Ｎ−トシル−１−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはプロテアーゼを阻害するよう機能する他の二価のカチオンキレート化剤などのプロテアーゼ阻害剤をも含有しておくべきである。特別の実施態様においては、下記する方法の一つを用いてもよい：（ａ）スクロース存在下での浸透圧ショック（好ましい）；（ｂ）透明化した細胞の溶菌液のスクロースパッド遠心分離; または（ｃ）抗−ＣＰ後退を用いたイムノアフィニティ。また別の実施態様においては、凍結−解凍方法が、細菌細胞を溶菌するのに有用であり得よう。例として、但しこれに限定されないが、組み立てたジュードウイルス粒子を精製するために、この細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、次いでリソチームを含む緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｍＥＤＴＡ）等の緩衝溶液中に再度懸濁させればよい。細胞溶菌したあとで、二番目の遠心分離の工程を実施して、細胞残滓を除去する。シュードウイルス粒子は更に、多くの相異なる方法を用いて透明化した細胞溶菌液から精製してもよい。例えば、抗−ＣＰ後退を用いたイムノアフィニティカラムを使用して、更に濃縮してウイルス粒子を得てもよい。またはその代わりに、この細胞溶菌液をスクロースクッションまたは勾配を介し遠心分離してもよく、このように精製したウイルス粒子をＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）に再度懸濁させればよい。好ましい局面においては、第６．１．２項において記載した浸透圧ショック方法を用いる。シュードウイルス粒子からキメラＯＡＳ−結合＊ＲＮＡを精製するために、当該技術に通暁した技術者に公知である如何なる方法をも用いても構わない。好ましくは、ＳＤＳ／フェノール抽出法を行ってタンパク質を除去し、次いでＲＮＡをエタノール沈殿させる。対象とするＲＮＡの配列が、本発明に従ったウイルスＣＰｓ内において正しく形質発現させ、かつカプシドに包接されていることを確認するために、当該技術分野において公知である種々の分析方法を実施すればよいが、かかる分析方法には例えば、ＯＡＳ−結合ＤＮＡ配列を代表するＤＮＡフラグメントまたは異種＊ＤＮＡをプローブ／プライマーとして用い、逆転写酵素を用いた放射標識ノーザン（ドット）ブロットまたはＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）を包含するが、但しこれらには限定されない。場合によっては、使用前にＯＡＳ−結合配列をキメラＲＮＡから切断することが望ましい可能性がある。例えば、ＲＮＡの５’端末に位置するあるＯＡＳ配列が、＊ＲＮＡにおける正当な翻訳開始を妨害しまたはＯＡＳ内においてＡＵＧ配列から翻訳を開始し、かくして融合タンパク質が生じるが、この融合タンパク質は、正当な読み取り枠で開始が始まっていないため所望のタンパク質を含有していない可能性がある。ＯＡＳの翻訳開始配列をパッケージング機能に影響を与えることなく除去することが出来たとしても、ＯＡＳの存在がＲＮＡを翻訳して対象とするタンパク質を合成する効率を妨げる可能性がある。ＯＡＳ配列を除去することに到る標的とした切断は、例えば以下のようにリボヌクレアーゼを用いて行うことができる：ＯＡＳ結合＊ＲＮＡをＤＮＡオリゴマーと共に培養するが、このオリゴマーは、配列相補性のお陰でＯＡＳ配列と対象とするＲＮＡ配列との間に位置するＲＮＡ分子の領域に結合するのである。生じる二重ラセンのＤＮＡ／ＲＮＡの短い領域は、ＤＮＡ／ＲＮＡに特異的なヌクレアーゼであるリボヌクレアーゼＨによる切断のための基質として働く。またはその代わりに、組換えＲＮＡ分子は、リボチーム領域とＯＡＳ配列と対象とするＤＮＡ配列との間の切断を行う認識配列を組み込むことによって自己切断するように設計される。また異なる具体的な実施態様においては、配列に特異的な切断部位を、ＯＡＳと＊ＲＮＡとの間にあるＯＡＳ−結合＊ＲＮＡ内に組み込まれてもよいし、または真核生物のリボソームランディング部位（ＩＲＥＳ）をＯＡＳと＊ＤＮＡとの間に挿入してもよい。５．４．カプシド包接したＲＮＡの使用方法一本鎖ＲＮＡパッケージングシステムは、対象とする特定のＲＮＡを大量に産生させかつ貯蔵するための好都合でかつ効率的な方法である。このシステムは、ＲＮＡ配列とＲＮＡ長さとに依存し、ＲＮＡ分子をウイルス様粒子内にカプシド包接することによって、当該ＲＮＡ分子がリボヌクレアーゼによって実質的に分解されるのから保護される。このシュードウイルス粒子は、細菌細胞溶菌液から容易に精製され、一旦精製されると、緩衝液中においては室温で無限の期間貯蔵することが可能である。所望の時間に、このＲＮＡをシュードウイルスから抽出して使用することができる。一本鎖ＲＮAパッケージングシステムの用途は広範であり、ＲＮＡの操作を含む分子生物学において使用される技法の殆ど全てを包含する。例えば、ＯＡＳ結合＊ＲＮＡの＊ＲＮＡが対象とするタンパク質をエンコードするｍＲＮＡである実施態様においては、本発明に従った組換えＲＮＡ分子パッケージングシステムは、粒子からリリースされ、エンコードされた対象とするタンパク質を産生させるためのインビトロ翻訳反応において使用することができる。その代わりに、パッケージされた組換えＲＮＡは、例えばエンコードされたタンパク質の可能性ある機能を研究するなどの多数の用途や治療作用のために用いるセンスまたはアンチセンスＲＮＡを含んでなる。本発明のパッケージングシステムはまた、増殖培地に放射標識したヌクレオチドを添加することによって、例えば、ノーザンまたはサザンブロット分析様のハイブリッド形成プローブとして使用され得る、ＯＡＳ結合＊ＲＮＡに応じた放射標識したＲＮＡ断片を合成する為に使用してもよい。また別の実施態様においては、本発明に従って産生されたシュードウイルス粒子は、カプシド包接されたＲＮＡを直接供与する手段として動物、書物、菌または原核細胞内に直接導入して、これらの細胞とともに脱コート化や随伴翻訳を行うことができる。細胞内への導入は、当該技術分において公知である方法によって、例えばエレクトロポレーションまたは植物内のスフェロプラストまたはプロトプラストにＰＬＯ／ＰＥＧ（ポリ−Ｌ−オルニチン／ポリエチレングリコール）接種することなどによって行うことが出来る。また別の実施態様においては、表面リガンドを含有するＣＰ誘導体は、レセプターを経由した細胞内取り込みによって動物細胞内に供給することが出来る。５．５．キット本発明を実施するための構成成分の一つまたはそれ以上を含有するキットも提供される。このようなキットは、一つまたはそれ以上の容器内に本発明を実施する構成成分を含有してなる。例えば、かかるキットは、５．１および５．２項におい手記載したようにＣＰを賛成させまたＯＡＳ結合＊ＲＮＡをP産生させるためのプラスミドまたはベクター、前記ベクターを一つ以上含むかまたはＣＰ遺伝子またはＯＡＳ−結合＊ＲＮＡを染色体中に含有する細菌を有する容器からなる。ある具体的な実施態様においては、キットは、第一の容器内に入れた、好ましくは誘導性プロモーターの制御下染色体により組み込んだかまたはエピソームのＣＰ遺伝子を有する細菌；および第二の容器内に入れた、ＯＡＳ−結合＊ＤＮＡをＯＡＳ結合＊ＲＮＡ内に翻訳することを支配することができる細菌宿主で機能するプラスミドベクターとから構成される。好ましい局面においては、かかる第二の容器は、以下に記す、機能的に結合した成分からなるプラスミドベクターを含有する：プロモーター、ポリリンカー、ＯＡＳ、転写終止信号。ある実施態様においては、前記成分は、５’から３’への順序で存在し、これらはこの順序で列挙記載される。また別の実施態様においては、当該プラスミドベクターは、５’から３’への順序で下記を含有してなる：プロモーター、ＯＡＳ、ポリリンカー、転写終止信号。６．実施例６．１．材料および方法６．１．１．プラスミドと細菌株宿主細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）である。Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１は、Ｆ＊、ｏｍｐＴ、γβ−、ｍβ−である。ＤＥ３は、ｌａｃｌ遺伝子、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃＺ遺伝子の開始部、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有するλ誘導体である。この菌株は、元来ブルックヘブン国立研究所から提供されたものであり、λ溶原菌の一つで、その内部では、インデューサＩＰＴＧを培地に添加した場合、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの構造性遺伝子がｌａｃＵＶ５プロモー 62-89）。この溶原菌宿主株も、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４（Pouwels et al.，1985，in Cloning Vectors，Elsevier Science Publishers，Amsterda m，p.I-A-iv-9）を含んでおり−このプラスミドベクターは、ｐ１５Ａレプリコンである、ｐＬｙｓＥとして（Studier et al.，1990，Meth.Enzymol.185:60-89 ）、ｔｅt遺伝子から形質発現されたＴ７リソチームの構造性遺伝子を有する。このリソチームは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに結合しかつ、ＩＰＴＧインデューサの不存在下でもｌａｃＵＶ５プロモーターから生起する低レベルの構成性転写を阻害するよう機能する。このリソチームもまた、かかる大腸菌のペプチドグリカン壁を分解するので、細胞を一層脆くする。形質発現システムの一部として、ＴＭＶＣＰの供給源が提供されねばならない。種々のＴＭＶＣＰの構造性遺伝子（その誘導体を含む）がすでにプラスミドベクターｐＥＴ３ａ内へクローン化されている（第６図）。ｐＥＴ３ａは、ファージＴ７遺伝子１０からのｔ’プロモーターおよびこのファージの遺伝子１０からの翻訳開始信号（原核シャイン−ダルガルノ部位）を含有している。このｐＥＲＴ３プラスミドシリーズは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーターを含有し、上記したｐＡＣＹＣ１８４／ｐ１５Ａレプリコンと和合性を有するｃｏｌＥ１レプリコンである。Ｔ７プロモーターとターミネーターとの間に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるべき配列を挿入しかつクローニングするためのＮｄｅｌおよびＮｈｅｌ部位がある。真核ウイルスの固有コドンを用いて天然のＴＭＶコートタンパク質を産生させるための形質発現プラスミドは、ＮｓｉｌとともにプラスミドｐＴＭＶ２１０（フロリダのレークアルフレッド大学、Ｗ．Ｏ．ドーソンからの寄贈）中でＴＭＶの全長を消化し、次いでＴ４ＤＮＡと処理して３’突出端末を”ｃｈｅｗｂａｃｋ”させ、さらにＤｒａｌと消化することによって作成した。生じた断片をＳｍａｌで消化したｐＧＥＭ３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）に挿入し、生じたＫｐｎｌ−ＢａｍＨｌＣＰを含有する断片をｐＥＴ３ａに挿入した（Ｋｐｎｌ部位をトリミングして平滑末端を作成した後）。生じたプラスミド、ｐＥＴ３０１が、ＩＰＴＧを添加してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＤＥ３から）の甲レベルの形質発現を誘導させた場合、Ｔ’プロモーターから天然のＴＭＶＣＰ（ＴＭＶのＵ１株のＮ−ｍａｔｔａｎｎＭｅｔ−Ｓｅｒをエンコードする）を産生するのである。もう一つのプラスミド（JｏｅｌＨａｙｎｅｓから提供されたもの）は、Ｕ１株の天然のＴＭＶＣＰを産生する（Haynes et al .，1986，Biotechnology4:637-641）。この後者のプラスミドは、コドンが大腸菌の形質発現に対して最適化されている限り完全合成ＴＭＶＣＰを含有している。もう一度、この遺伝子のＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨｌカセットをトリムダウンし、ｐＥＴ３ａにクローン化させて、ｐＥＴ３ａ０２を産生させたのである。二番目のアミノ酸位置におけるセリンがアラニン、アスパラギン酸またはプロリンで置換されているコートタンパク質をコードするプラスミドも幾つか構築した。得られたプラスミドは、ｐＥＴＡｌａ３０１、ｐＥＴＡｓｐ３０１およびｐＥＲＴｐｒｏ３０１とそれぞれ命名した。ＴＭＶコートタンパク質をエンコードする遺伝子の５’端末を部位配向突然変異誘発を以下のプライマーを用いてＰＣＲ反応によって行った：１．Ｓｅｒ（２）をＡｌａに変えるため；５’プライマー５’−ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）；３’プライマー５’−ＧＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡ− ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）。２．Ｓｅｒ（２）をＡｓｐに変えるために；５’プライマー５’−ＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）；３’プライマは、ＳＥＱＩＤＮｏ：２のそれであった。３．Ｓｅｒ（２）をＰｒｏに変えるため；５’プライマー５’−ＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）；３’プライマーは、ＳＥＱＩＤＮｏ：２のそれであった。インシテュにおいてＴＭＶコートタンパク質をカプシド包接するためのＴＭＶ組み立て原点（ＯＡＳ）配列を含有する基質転写産物を作成するために、二つの方法を用いた。最位置の系は、Ｔ７リソチーム遺伝子を有するプラスミドｐＬｙｓＥ中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを用いるものであった。Ｃｍ’遺伝子中の独自ＥｃｏＲ１部位を切断し、プラスミドｐＪｌｌ１０２（Gallie et al.，1987，Science236:1122-24）から得た、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｍ’）遺伝子３’半分とＴＭＶ組み立て原点（ＯＡＳ）（ウイルスＲＮＡ配列の塩基５１１８−５５５０から得た−４４０ヌクレオチド；Zimmern，1983，EMBO J.2:1901-07；第１０図、ＳＥＱＩＤＮＯ：５））とを含有するＥｃｏＲ１断片をｐＬｙｓＥの開いたＥｃｏＲ１部位に挿入し、ｐＬｙｓ１０２を生成させた（第７図）。即ち、プラスミドｐＬｙｓＥの選択可能なマーカーとして使用した、Ｃｍ’遺伝子の大腸菌プロモーターからの低レベルの構成性転写によって、機能性のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡが得られたが、これはその後にＴＭＶＯＡＳが続き、さらに原初のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ選択可能マーカー遺伝子の繰り返しレムナント３’末端断片が続くものであった。転写産物は、長さが１．７ｋｂで内部ＯＡＳを有するものと予測された。インシテュにおいてＴＭＶコートタンパク質でカプシド包接を行うためのＯＡＳ＊ＲＮＡを製造するための第二の問題解決法は、プラスミドｐＪｌｌ１０３２から誘導したＴ７プロモーターポリ（ＣＡＡ）リーダーＧＵＳ遺伝子カセット（大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を含有するｐＵＣ１９誘導体；Wil-son ，T.M.A.，et al.，1990，Post-Transcriptional Control of Gene Expression ，いるものであったが、これには、ＴＭＶＯＡＳウイルスＲＮＡ配列の塩基５１ 1901-07；第１０図、ＳＥＱＩＤＮＯ：５）およびこのＧＵＳ遺伝子の３’ 部位におけるＴ７ターミネーターを含むＳａ１ｌ−ｉｎｄｌｌｌカセットが結合されていた。次いで、このＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片の全体を修飾し、次いでプラスミドｐＬｙｓＥ内の独自Ｈｉｎｄｌｌｌ部位にクローン化した（第８図）。このＴ７プロモーターから誘導された転写産物は、長さがほぼ２．５ｋｂでありかつ３’端末ＴＭＶ組み立て原点配列をが入するものと予測される。６．１．２．大腸菌からのシュードウイルスの精製細菌を１００ｍｌの培地中で３７℃において４時間培養した。細胞を０．４ｍＭＩＰＴＧによって室温で６時間誘導された。細菌を４℃にて１５分間８Ｋｒｐｍで遠心分離することによって採取した。この細菌菌体のペレットを１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再度懸濁させ、次いでリソチーム溶液を１ｍｇ／ｍｌで添加した。この懸濁液を室温で５乃至１０分間培養し、次いで４容量部のＴＥ（ｐＨ７．５）を添加した。デオキシリボヌクレアーゼＩを添加し、懸濁液を粘性を示さなくなるまで培養した。懸濁液は、４℃にて２０分間１０ｋｒｐｍで遠心分離して、菌体残滓を除去し、上澄液をスクロースグラジエント（１０−４０％）に負荷し、ベックマン４５Ｔｉロータの中で４℃にて４時間４０Ｋｒｐｍで回転させた。このスクローズグラジエントの底から得たペレットを１ｍｌのＴＥに溶解させ、この使用を電子顕微鏡検査に用いた。６．１．３．ＲＮＡの抽出およびノーザンドットブロットＯＡＳ配列を含有する３２Ｐで標識したＤＮＡ断片を、ノーザンドットブロットハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。このプローブは、その一部を第９図において示してあるｐＪｌｌ１０２（Gallie et al.，1987，Science 2 36:1122-24）から誘導した。ｐＪｌｌ１０２は、ＢａｍＨｌで消化し、ゲルにかけ、ＯＡＳを含む小さい、ほぼ４４０ｂｐ断片を溶離した。この断片を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとＤＮａＳｅとを用いて３２Ｐ−ｄＡＴＰでニックトランスレーションさせた（Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.を参照）。この標識したプローブをハイブリダイゼーション溶液に添加した。ドットブロットハイブリダイゼーションのために、ＲＮＡはフェノール抽出法によって精製したウイルス粒子から抽出し、エタノールと適当な塩例えば、酢酸ナトリウムを添加して沈殿させた。このＲＮＡ試料をニトロセルロース紙でドットさせ、次いでこの紙を室温で乾燥させた。編成させ次いで中和した後、フィルターを８０℃で２時間ベークさせ、４２℃で２時間予備ハイブリッド化させ、次いでニックトランスレーションさせたプローブを用いて４２℃で２時間ハイブリッド化させ、洗浄し、フィルムに露光させた。６．１．４．シュードウイルス粒子から単離したＲＮＡのポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）による増幅ＲＮＡ試料を６．１．３．項において記載したように精製したＴＭＶ−様粒子から抽出した。このＲＮＡ試料を逆転写酵素の基質として使用し、得られたｃＤＮＡｓを下記のプライマーペアーを用いてＰＣＲ反応に使用した：ＴＭＶＯＡＳの３’プライマー（５’から３’へ）、５’ＣＣＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）；およびＴＭＶＯＡＳの５’プライマー（５７から３’へ）、５７ＧＴＴＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）。６．１．５．大腸菌産生ＴＭＶコートタンパクのＳＤＳＰＡＧＥ分析これらの特定の実験において使用したＴＭＶＣＰは、Ｕ１菌株配列（ｐＥＴ３０２）の大腸菌で最適化したコドンバージョン、天然のＴＭＶＵ１コトタンパク質配列（ｐＥＴ３０１）またはｐＴＭＶ２１０からＰＣＲでクローン化した天然のＴＭＶコートタンパク質配列（但し、二番目のアミノ酸（セリン）をアラニンに変更したもの（ｐＥＴＡｌａ３０１））の何れかであった。菌体密度がほぼ０．６ｎｉなった時に、ＩＰＴＧを１０ｍｌの培養液に添加した。示した事例においては、ＩＰＴＧによる誘導時間は２時間であった。当初の大腸菌培養液の９３マイクロリットルに等しい容量を、改造ゲルが１５％のポリアクリルアミドである標準の非連続Ｌａｅｍｍｌｉゲル系（Laemmli U.K.，1970，Nature 227 :680）に負荷し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気透析（ＳＤＳＰＡＧＥ）にかけた。これらのタンパク質を可視化するために、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅで染色した。タンパクバンドの同一性は、正当なＴＭＶＣＰ（マーカーライン２に添加）との同時泳動のみならず、ウサギで培養した天然Ｕ１ＴＭＶＣＰに対するポリクローナル抗血清によるウエスタンブロッティングによっても確認した。６．２．結果６．２．１．大腸菌内におけるＴＭＶウイルスコートタンパク質の形質発現と組換えＲＮＡ分子のパッケージング透明化した菌体溶菌液のＳＤＳＰＡＧＥ分析結果を第１図に示す。これらの特殊な実験において用いたＴＭＶコートタンパク質は、Ｕ１菌株配列（ｐＥＴ３０２）の大腸菌で最適化したコドンバージョン、天然のＴＭＶＵ１コトタンパク質配列（ｐＥＴ３０１）またはｐＴＭＶ２１０からＰＣＲでクローン化した天然のＴＭＶコートタンパク質配列−但し、二番目のアミノ酸（セリン）をアラニンに変更したもの（ｐＥＴＡｌａ３０１）−の何れかであった。Ｃｏｏｍｓｉｅｂｌｕｅによる染色の結果、ｐＥＴ３０１およびＰＥＴＡら３０１は、当初の菌体培養液９３μｌ当たり２−３μｇのＴＭＶコートタンパク質の合成を誘導したことが明らかに示されている。ｐＥＴ３０２は、Ｃｏｏｍｓｉｅｂｌｕｅ染色に基づいて判断すると、上記の何れよりもほぼ２または３倍のＣＰを誘導した。タンパクバンドの同一性は、正当なＴＭＶＣＰ（マーカーライン２に添加）との同時泳動のみならず、ウサギで培養したＴＭＶコートタンパク質に対するポリクローナル抗血清によるウエスタンブロッティングによっても確認した（第２図）。レーン２におけるウエスタンブロット上における低レベルの信号は、ＩＰＴＧなしでも、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの低レベルのバックグランド構成性形質発現が、酵素活性を阻害するＴ７リソチームが形質発現するにも拘らず生起する、という事実に原因する。粒子のインビボ組立と比較するために、インビトロ組み立ても試みた。あらゆるＣｐｓは、ＯＡＳ＋メッセンジャーＲＮＡｓの不存在下で誘導した大腸菌培養液から強力に精製し、Ｄｕｒｈａｍの方法に従って（1972，J.Mol.Biol.67:289- 305）、フェノールで抽出した精製ＴＭＶＲＮＡとともに培養した。ウイルスで精製したＣＰも、ポジティブコントロールとして使用した。このポジティブコントロールは、主合資かつ濁度（Ａ３１０ｎｍ）を増大させたが、一方大腸菌が精製したＣＰはいずれもインビトロではＴＭＶＲＮＡとは集合する機能を示さなかった。各々のＣＰ構築物がＯＡＳ＋ＲＮＡの不存在下で形質発現させられていた大腸菌の電子顕微鏡写真から、ウイルス様構造を持つ何らかの組立て体が存在することが判ったが、これは詳細に検査してみると、圧倒的に円盤上のロッドが積み重なったもの（通常はタンパク質分解産物と見なされている）であるように見えた。尚、このロッドはおそらくはＲＮＡを一切含んでいないようである。このような非ラセン形の組立て体に関する観察結果は、天然のラセン形ＴＭＶ構造に特異的なモノクローナル抗体での、イムノゴールド標識が存在しないことによって確認されている。ＯＡＳ＋ｍＲＮＡの存在下、または不存在下で得られた大腸菌内におけるインビボ粒子組立て体に関しては、ｐＴＥＰｒｏ３０２から合成したＴＭＶコートタンパク質のプロリンバージョンは、電子顕微鏡写真で可視化されているように、明らかに円盤上ロッドが積み重なったものを形成していた。我々は、これらのロッドがＲＮＡを含有しているか否かをまだ決定していないが、これらの明瞭な縞状の外観から、タンパク質だけの構造であることが示唆される。透明化された菌体溶菌液を電子顕微鏡で調べてみたが、その得られた写真を第３Ａ−Ｄ図に示してある。プラスミドｐＥＴ３０１から生成させたＴＭＶＣＰの天然型のものは、ＯＡＳ＋ＲＮＡなしで形質発現させると、完全にきれいな背景を与え、明らかにウイルス様粒子への組み立てはなかった。ｐＥＴＡｌａ３０１、ｐＥＴ３０１およびｐＥＴ３０２に就いては、コートタンパク質はＯＡＳ＋ｍＲＮＡの存在下で形質発現させたが、ＣＡＴまたはＧＵＳについては、電子顕微鏡写真検査の結果から、ｐＥＴＡｌａ３０１について第３図に示すように短いロッドの数が実質的に増加していることが明らかとなった。いくつかの標本の長さは、他のものよりは均一であり、特定の遺伝子の転写から得られたロッドの推定長さ（ＣＡＴ−ＯＡＳについてはほぼ７５ｎｍ）と合致していた。ＲＮＡをこれらの精製した粒子からスクローズ密度勾配、硫酸セシウム平衡勾配またはクルロースパッド遠心分離に従って抽出した、ノーザンブドットロットをＴＭＶＯＡＳに特異的なプローブを用いて行った。ＴＭＶ組み立て原点配列を含むＣＡＴおよび/またはＧＵＳＲＮＡをｐＥＴＡｌａ３０１コートタンパク質をともに形質発現させた誘導の場合は、得られたロッドは、ＲＮＡを生成し、このＲＮＡはＯＡＳに特異的なプローブで強力でかつ明確な信号を与えた（第４図）。ＴＭＶＯＡＳ配列から得た５’および３’プライマーを用いてシュードウイルス粒子から誘導させたＲＮＡ試料をＰＣＲ増幅させると、やはり、かかる場合においてもＣＡＴ−ＯＡＳおよびＧＵＳ−ＯＡＳの検出が可能であった（第５図）。即ち、ｐＥＴＡｌａ３０１をエンコードしたＴＭＶＣＰは、大腸菌内においてインビボでＣＡＴ−ＯＡＳＲＮＡまたはＣＡＡ−ＧＵＳ−ＯＡＳＲＮＡを集合・組み立てし、かつパッケージさせてＴＭＶ様シュードウイルス粒子を与えたのである。７．微生物の寄託プラスミドｐＥＴＡｌａ３０１（Ｓｅｒ２をＡｌａ２で置換したＴＭＶコートタンパク質をエンコードする形質発現プラスミド）およびプラスミドｐＬｙｓ１０２（パッケージ可能なＣＡＴ−ＯＡＳ転写産物を与える）を含有する細菌株E. coli BL21（DE3）は、特許手続きを目的とする微生物の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って１９９２年９月１０日、メリーランド州２０６５２、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１に所在するAmerican Type Cultur e Collectionに寄託した。本発明の範囲は、寄託した微生物によってまたは本明細書において記載した具体的な実施態様によって制限されるものではない。実際、本明細書において記載した他に、本発明の種々の修正が、前記記載および添付した図面から当該技術分野に通暁した技術者には明らかであろう。かかる修正も、添付クレームの範囲に含まれるものと解される。種々の刊行物が本明細書において引用されたが、これらの開示はその全体が文献に含まれる。配列記載（１）一般的情報（ｉ）特許申請認：Wilson，Thomas H.A.他（ｉｉ）発明の名称：ＲＮＡパッケージングシステム（ｉｉｉ）配列の数：８（ｉｖ）相当する住所：（Ａ）宛て先：Ｐｅｎｎｉｅ＆Ｅｄｍｏｎｄｓ（Ｂ）Ｓｔｒｅｅｔ：１１５５アヴェニュオブアメリカ（Ｃ）Ｃｉｔｙ：ニューヨーク（Ｄ）Ｓｔａｔｅ；ニューヨーク（Ｅ）Ｃｏｕｎｔｒｙ：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：１００３６−２７１１（ｖ）コンピュータ読み取り書式（Ａ）媒体のタイプ：フロッピディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）ＯＳ：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフト：Patentln Release＃1.0，Version1.25 （ｖｉ）現行出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：同一日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人の情報（Ａ）氏名：Ｃｏｒｕｚｚｉ、ＬａｕｒａＡ．（Ｂ）登録番号：３０、７４２（Ｃ）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ＤｏｃｋｅｔＮｏ．：７１０８−００６（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話：２１２７９０−９０９０（Ｂ）ファックス：２１２８６９−９７４１（Ｃ）テレックス：６６１４１ＰＥＮＮＩＥ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ；１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：１ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：２ＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧ λＣＣＡ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：３ＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２４ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：４ＧＧＣＡＴＧＣＣＧＴＡＣＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４３３ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＲＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：５ＣＧＵＣＧＵＣＡＣＧＣＧＣＧＡＧＵＧＧＡＡＣＵＵＧＣＣＵＧＡＣＡＡＵＵＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＵＧ−ＵＧＡＧＣＧＵＧＵＧＵＣＵＧＧＵＧＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＵＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＧＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＵＣＵＣ（以下略）（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６の情報（i）配列の特徴：（Ａ）長さ：７５ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＲＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：６ＵＧＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＵＧＧＡＡＣＵＵＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＵＧＣＵＵＧＡＵＧＡＧ−ＵＵＣＡＵＧＧＡＡＧＡＵＣＵＣＣＣＵＡＵＧＵＣＧＡＵＣＡ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７の情報（i）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：３ＣＣＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１４ヌクレオチド（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖型式；一本鎖（Ｄ）トポロジ：不明（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱＩＤＮＯ：８ＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＧ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ワン−リーデュク−ジュアメリカ合衆国，ニュージャージー 08854，ピスカタウェイ，デビッドソンロード，ニコルスアパートメント 107

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）植物ウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１組替え核酸および（ｂ）転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合した植物ウイルス集合起点配列からなるＲＮＡ分子を産生することのできる第２組替え核酸よりなる細菌を培養することからなり（ただし問題のＲＮＡ配列は植物ウイルスＲＮＡではないものとする）、これにより、植物ウイルスコートタンパク質が発現され、第２組替え核酸が細菌に転写され、コートタンパク質がＲＮＡ分子を包膜する粒子の中に集合し、その中で植物ウイルスが桿状の螺旋状粒子および一本鎖ＲＮＡゲノムを有するものである植物プソイドウイルス粒子中に組替えＲＮＡ分子を産生し包膜する方法。２．植物ウイルスがトバモウイルス、ポテックスウイルス、トブラウイルス、ホルデイウイルス、ポティウイルス及びウロウイルスからなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。３．植物ウイルスがトバモウイルスである請求項２に記載の方法。４．植物ウイルスがタバコモザイクウイルスである請求項３に記載の方法。５．第１組替え核酸が、植物ウイルスコートタンパク質の細菌内での発現を制御するプロモーター配列を含み、第２組替え核酸が、ＲＮＡの細菌内での発現を制御するプロモーター配列を含む、請求項１に記載の方法。６．第１組替え核酸が、作用的に結合した下記の成分：（ａ）コートタンパク質またはその官能誘導体の発現を制御するプロモーター；（ｂ）翻訳開始シグナル；（ｃ）コートタンパク質またはその官能誘導体をコード化するＤＮＡ配列；および（ｄ）転写終結シグナルを含むプラスミドベクターである請求項１に記載の方法。７．第１組替え核酸が、作用的に結合した下記の成分：（ａ）コートタンパク質またはその官能誘導体の発現を制御するプロモーター、（ｂ）翻訳開始シグナル、（ｃ）コートタンパク質またはその官能誘導体をコード化するＤＮＡ配列、および、（ｄ）転写終結シグナルを含むプラスミドベクターである請求項４に記載の方法。８．第２組替え核酸が、作用的に結合した下記の成分：（ａ）プロモーター、（ｂ）細菌内でのプロモーターの制御下で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合した集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生することのできるＤＮＡ配列、および（ｃ）転写終結シグナルを含むプラスミドベクターである請求項１に記載の方法。９．第２組替え核酸が、作用的に結合した下記の成分：（ａ）プロモーター、（ｂ）細菌内でのプロモーターの制御下で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合した集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生することのできるＤＮＡ配列、および（ｃ）転写終結シグナルを含むプラスミドベクターである請求項６に記載の方法。１０．第１組替え核酸および第２組替え核酸が、それぞれ更に選択可能マーカーを含む請求項１に記載の方法。１１．選択可能マーカーが耐微生物質遺伝子である請求項１０に記載の方法。１２．細菌が、更に細菌の培養、特に発現してリゾチームを産生する組替えＤＮＡ配列を含有する請求項１０に記載の方法。１３．第１組替え核酸がタバコモザイクウイルスの天然コートタンパク質遺伝子を含む請求項４に記載の方法。１４．第１組替え核酸がタバコモザイクウイルスの天然コートタンパク質をコード化する配列を含み、該配列がエシェリキア・コリ（Esherichia coli）内の翻訳の為に最適化されている請求項４に記載の方法。１５．第１組替え核酸がタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化する配列を含み、アミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンに変えられている請求項４に記載の方法。１６．集合配列起点が図１１に示した配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項４に記載の方法。１７．集合配列起点が図１１に示した配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項１５に記載の方法。１８．集合配列起点が図１０に示した配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:５）を含む請求項４に記載の方法。１９．（ａ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）タバコモザイクウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列の発現を制御する第１プロモーター、（ｉｉ）翻訳開始シグナル、（ｉｉｉ）コートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列および（ｉｖ）第１転写終結シグナル；および（ｂ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）第２プロモーター、（ｉｉ）細菌内での第２プロモーターの制御下で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合したタバコモザイクウイルス集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生することの出来る第２ＤＮＡ配列（ただしこのＲＮＡ配列はタバコモザイクウイルスＲＮＡではない）および（ｉｉｉ）第２転写終結シグナル、を含む細菌を培養し、これにより、コートタンパク質またはその誘導体を発現させ、第２ＤＮＡ配列を細菌内に転写し、コートタンパク質またはその誘導体をＲＮＡ分子を包膜する粒子内に集合させることからなる、組替えＲＮＡ分子を植物プソイドウイルス粒子内に包膜する方法。２０．第１ＮＡ配列が、アミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンに変えられているタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化し、集合配列起点が図１１に示された配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項１９に記載の方法。２１．細菌がエシェリキア・コリ（Esherichia coli）である請求項２０に記載の方法。２２．第１プロモーターおよび第２プロモーターが誘導プロモーターである請求項１９に記載の方法。２３．第１プロモーターおよび第２プロモーターがT7 RNAプロモーターであり、細菌が更に配列をコード化するＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を制御する誘導プロモーターである請求項１９に記載の方法。２４．誘導プロモーターがlac ＵＶ５プロモーターである請求項２３に記載の方法。２５．第３ＤＮＡ配列が染色体に組み込まれる請求項２４に記載の方法。２６．問題のＲＮＡ配列が問題のタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ配列である請求項１に記載の方法。２７．問題のＲＮＡ配列が問題のタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ配列である請求項１９に記載の方法。２８．（ａ）植物ウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１組替え核酸と、（ｂ）適当な細菌中で転写して、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合した植物ウイルス集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生する事の出来る第２組替え核酸（ただしここで問題のＲＮＡ配位は植物ウイルスＲＮＡではない）と、からなり、植物ウイルスが桿状の螺旋粒子および一本鎖ＲＮＡゲノムを有する細菌。２９．植物ウイルスがトバモウイルス、ポテックスウイルス、トブラウイルス、ホルディウイルス、ポティウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される請求項２８に記載の細菌。３０．植物ウイルスがタバコモザイクウイルスである請求項２９に記載の細菌。３１．第１組替え核酸が、細菌内での植物ウイルスコートタンパク質の発現を制御するプロモーター配列を含み、第２組替え核酸が、細菌内でのＲＮＡ分子の発現を制御するプロモーター配列を含む請求項２８に記載の細菌。３２．第１組替え核酸がタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化し、アミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンに変えられており、集合配列起点が図１１に示された（ＳＥＱＩＤＮO:６）を有する請求項２８に記載の細菌。３３．（ａ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）タバコモザイクウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列の発現を制御する第１プロモーター、（ｉｉ）翻訳開始シグナル、（ｉｉｉ）コートタンパク質、叉はその誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列および（ｉｖ）第１転写終結シグナルを含む第１プラスミドベクターと、（ｂ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）第２プロモーター、（ｉｉ）細菌内での第２プロモーターの制御下で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合したタバコモザイクウイルス集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生する事の出来る第２ＤＮＡ配列（ただし、このＲＮＡ配列はタバコモザイクウイルスＲＮＡではない）、および、（ｉｉｉ）第２転写終結シグナルを含む第２プラスミドベクターと、を含有し、これにより、コートタンパク質またはその誘導体が発現され、第２ＤＮＡ配列が細菌内で転写され、コートタンパク質またはその誘導体が、ＲＮＡ分子を包膜する粒子内に集合する組替え細菌。３４．第１ＤＮＡ配列がタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化し、ここでアミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンに変えられており、集合配列起点が図１１に示した配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項３３に記載の細菌。３５．細菌がエシャリキア・コリ（Esherichia coli）である請求項３４に記載の細菌。３６．第１プロモーター、および第２プロモーターが、Ｔ７ＲＮＡプロモーターであり、細菌が更に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ解読配列を含む第３ＤＮＡ配列およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を制御する誘導プロモーターを含有する請求項３３に記載の細菌。３７．ＡＴＣＣに寄託し受理番号Ｎｏ．69070を与えられた、プラスミドpET Ala301およびpLys102を含有するエシェリキア・コリ（Esherlchia coli）。３８．一つの容器内に、（ａ）植物ウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体を解読するＤＮＡ配列および適当な細菌内での植物ウイルスの発現を制御するプロモータ配列を含む第１組替え核酸と、（ｂ）適当な細菌内で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合した植物ウイルス集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生することの出来る第２組替え核酸（ただし、このＲＮＡ配列は植物ウイルスＲＮＡではない）と、を含むキットであって、植物ウイルスが桿状の螺旋状粒子、および一本鎖ＲＮＡゲノムを有しているキット。３９．植物ウイルスがトバモウイルス、ポテックスウイルス、トブラウイルス、ホルディウイルス、ポティウイルスおよびフロウイルスからなる群から選択される請求項３８に記載のキット。４０．植物ウイルスがタバコモザイクウイルスである請求項３９に記載のキット。４１．第１組替え核酸がタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化し、アミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンに変えられており、集合配列起点が図１１に示された配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項４０に記載のキット。４２．一つの容器内に、（ａ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）タバコモザイクウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列の発現を制御する第１プロモーター、（ｉｉ）翻訳開始シグナル、（ｉｉｉ）コートタンパク質またはその誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列および（ｉｖ）第１転写終結シグナルを含む第１プラスミドベクターと、（ｂ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）第２プロモーター、（ｉｉ）細菌内での第２プロモーターの制御下で転写されて、問題のＲＮＡ配列に作用的に結合したタバコウイルス集合配列起点を含むＲＮＡ分子を産生することの出来る第２ＤＮＡ配列（ただし、このＲＮＡ配列はタバコモザイクウイルスＲＮＡではない）および第２転写終結シグナルを含む第２プラスミドベクターと、を含むキットであって、コートタンパク質またはその誘導体が発現され、第２ＤＮＡ配列が細菌内で転写され、コートタンパク質、またはその誘導体がＲＮＡ分子を包膜する粒子内に集合するキット。４３．第１ＤＮＡ配列がタバコモザイクウイルスのＵ１株のコートタンパク質をコード化し、ここでアミノ基末端からの第２アミノ酸がアラニンにかえられており、集合配列起点が図１１に示した配列（ＳＥＱＩＤＮＯ:６）を含む請求項４２に記載のキット。４４．細菌がエシェリキア・コリ（Esherichia coli）である請求項４２に記載のキット。４５．第１プロモーターおよび第２プロモーターがＴ７ＲＮＡプロモーターであり、細菌が更に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ解読配列を含む第３ＤＮＡ配列およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を制御する誘導プロモーターを含有する請求項４２に記載の細菌。４６．一つの容器内に、（ａ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）タバコモザイクウイルスコートタンパク質またはその官能誘導体をコード化する、第１ＤＮＡ配列の発現を制御する第１プロモーター、（ｉｉ）翻訳開始シグナル、（ｉｉｉ）コートタンパク質またはその誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列および（ｉｖ）第１転写終結シグナルを含む第１プラスミドベクターと、（ｂ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）第２ＤＮＡ配列の発現を制御する、第２プロモーター、（ｉｉ）ポリリンカーおよびタバコモザイクウイルス集合配列起点をコード化する配列を含む第２ＤＮＡ配列および（ｉｉｉ）第２転写終結シグナルを含む第２プラスミドベクターと、を含むキット。４７．ポリリンカーがタバコモザイクウイルス集合配列起点をコード化する配列に対して５’位にある請求項４６に記載のキット。４８．ポリリンカーがタバコモザイクウイルス集合配列起点をコード化する配列に対して３’位にある請求項４６に記載のキット。４９．一つの容器内に、（ａ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）植物ウイルスコートタンパク質またはその官能誘導をコード化する第１ＤＮＡ配列の発現を制御する第１プロモーター、（ｉｉ）翻訳開始シグナル、（ｉｉｉ）コートタンパク質またはその誘導体をコード化する第１ＤＮＡ配列、および（ｉｖ）第１転写終結シグナルを含む第１プラスミドベクターと、（ｂ）次の作用的に結合した成分：（ｉ）第２ＤＮＡ配列の発現を制御する第２プロモーター、（ｉｉ）ポリリンカー、および植物ウイルス集合配列起点をコード化する配列を含む第２ＤＮＡ配列、および（ｉｉｉ）第２転写終結シグナルと、を含むキットであって、植物ウイルスが桿状の螺旋状粒子および単鎖ＲＮＡゲノムを有しているキット。５０．１個またはそれ以上の容器の中に請求項２８に記載の細菌を含むキット。５１．１個またはそれ以上の容器の中に請求項３３に記載の細菌を含むキット。５２．１個またはそれ以上の容器の中に請求項３６に記載の細菌を含むキット。