JP6041896B2 - 加水分解酵素に対して耐性があるカプシドを有するvlpを用いるプロセス - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮特許出願第61/578,706号(2011年12月21日出願)、米国仮特許出願第61/607,900号(2012年3月7日出願)、米国仮特許出願第61/661,688号(2012年6月19日出願)(その開示全部が、本発明において参考として含まれる)に対する優先権を主張し、そのすべての開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ファイル名450061_配列表_ST25.txt(容量77キロバイト)を含み2012年12月20日に作成された、「配列表」の紙のコピー及びフロッピー(登録商標)ディスクで配列表のコンピューターに読み込み可能な形式の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
−(Gly)x(x=0〜6)である。リンカーセグメントは、−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Ser及び−Gly−Ser−Gly−から選ばれたGly−Serリンカーであってもよい。
によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。例えば、カプシ
ドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly)
x−(x=1)であり、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3.4によって触媒された加
水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含
んでもよく、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly)x−(x=2)であり、ペプチ
ド結合加水分解酵素分類EC3.4によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプ
シドに組み立てる。カプシドは、カプシドタンパク質を含んでもよく、一方又は両方のリ
ンカー配列が−(Gly)x−(x=3)であり、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3
.4によって触媒された加水分解に対して耐性があるカプシドに組み立てる。カプシドは
、1〜3残基によって切り捨てられたN末端である1つ以上の外皮タンパク質配列を含ん
でもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は、除去された残基の数によ
って延長され、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3.4によって触媒された加水分解に
対して耐性がある。カプシドは、1残基によって切り捨てられたC末端である1つ以上の
外皮タンパク質配列を含んでもよく、本明細書中に記載されているようなリンカー配列は
、1つの残基によって延長され、そのカプシドは、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3
.4によって触媒された加水分解に対して耐性がある。カプシドは、1残基及び1つの残
基によって延長されたリンカー配列によって切り捨てられたC末端である連結された二量
体の第1の外皮タンパク質配列を含んでもよく、又は連結された三量体の第1の及び/又
は第2の外皮タンパク質配列が1残基によって切り捨てられたC末端であり、カプシドは
、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3.4によって触媒された加水分解に対して耐性が
ある。カプシドは、N末端切り捨て及びC末端切り捨てを有するカプシドタンパク質を含
んでもよく、ペプチド結合加水分解酵素分類EC3.4によって触媒された加水分解に対
して耐性がある。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
少なくとも1つの異種カーゴ分子及びパッキング配列を封入するカプシドを含む、ウイ
ルス様粒子(VLP)。
(項目2)
カプシドに封入された少なくとも1つのリボザイムを更に含む、項目1に記載のVL
P。
(項目3)
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目2に記載のVLP。
(項目4)
異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、項目3に記載のVLP。
(項目5)
リボザイムが、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核
酸構築物を形成する、項目4に記載のVLP。
(項目6)
複数の核酸構築物を含む、項目5に記載のVLP。
(項目7)
オリゴリボヌクレオチドが、siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA及
びmiRNAから選択される短RNAである、項目4に記載のVLP。
(項目8)
少なくとも2つのリボザイムを含み、それぞれのリボザイムが短RNAの一端を切断す
るために選択される、項目7に記載のVLP。
(項目9)
少なくとも1〜100個のヌクレオチドからなるリンカーを更に含み、リンカーが少な
くとも40%のA又は少なくとも40%のUを含み、リンカーが、オリゴリボヌクレオチ
ドとパッキング配列又はオリゴリボヌクレオチドとリボザイムを結合させる、項目4に
記載のVLP。
(項目10)
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタVリボザイムから選択される
、項目2に記載のVLP。
(項目11)
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも6個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目2に
記載のVLP。
(項目12)
リボザイムが、野生型肝炎デルタVリボザイムの速度の最大で約50%の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタVリボザイムであ
る、項目2に記載のVLP。
(項目13)
リボザイムが、配列番号10〜18から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デル
タV(HDV)リボザイムである、項目2に記載のVLP。
(項目14)
カプシドが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性がある野生型ウイルスカプシドを含む、項目1に記載のVLP。
(項目15)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも40%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目16)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも41%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目17)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも45%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目18)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも52%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目19)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも53%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目20)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも56%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目21)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも59%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目22)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも86%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載
のVLP。
(項目23)
カプシドが、配列番号3のアミノ酸配列を有する野生型腸内細菌ファージMS2カプシ
ドタンパク質を含む、項目1に記載のVLP。
(項目24)
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
MS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と少なくとも15%の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
(項目25)
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
MS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と少なくとも16%の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
(項目26)
カプシドが、有効構造アンカードアラインメントに基づいて、野生型腸内細菌ファージ
MS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と少なくとも21%の配列同一性を有する
カプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触
媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
(項目27)
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目1に記載のVLP。
(項目28)
異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む
、項目27に記載のVLP。
(項目29)
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目28に記載のVLP。
(項目30)
異種カーゴ分子が、約1,500Da以下の分子量を有する生体活性小分子に特異的に
結合する第1アパタマー(apatamer)配列及びカプシドのパッキング配列に結合する第2
アパタマー配列を含む二官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含む、項目
1に記載のVLP。
(項目31)
第1アプタマー配列に結合している生体活性小分子を更に含む、項目30に記載のV
LP。
(項目32)
生体活性小分子が、及び除草剤又は殺虫剤を含む、項目31に記載のVLP。
(項目33)
生体活性小分子が、アトラジン、アセタミプリドホレート(acetamipridphorate)、
プロフェノホス(profenofos)、イソカルボホス(isocarbophos)及びオメトエートアス
(omethoateas)からなる群から選択される、項目32に記載のVLP。
(項目34)
短RNA、リボザイム及びパッキング配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸
構築物。
(項目35)
短RNAが、siRNA又はshRNAである、項目34に記載の核酸構築物。
(項目36)
少なくとも40%がAであるか、少なくとも40%がTであるか又は少なくとも40%
がUである、4〜100個のヌクレオチドの結合ヌクレオチド配列を更に含み、結合ヌク
レオチド配列が、パッキングコード配列により及びsiRNAコード配列によりフランク
されている、項目34に記載の核酸構築物。
(項目37)
リボザイムが、短RNA及びパッキング配列によりフランクされている、項目34に
記載の核酸構築物。
(項目38)
短RNAが、siRNA又はshRNAである、項目37に記載の核酸構築物。
(項目39)
項目34に記載の核酸構築物を含むベクター。
(項目40)
項目39に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目41)
宿主細胞がベクターにより安定して形質移入されている、項目40に記載の宿主細胞
。
(項目42)
細菌細胞である、項目40に記載の宿主細胞。
(項目43)
Escherichia coli(エシェリキア・コリ)細胞である、項目40に
記載の宿主細胞。
(項目44)
植物細胞である、項目40に記載の宿主細胞。
(項目45)
哺乳類細胞である、項目40に記載の宿主細胞。
(項目46)
真菌細胞である、項目40に記載の宿主細胞。
(項目47)
酵母細胞である、項目40に記載の宿主細胞。
(項目48)
宿主細胞が、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるウイルスカプシドをコードする第2核酸配列を含む第2ベクターにより
安定して更に形質移入されている、項目40に記載の宿主細胞。
(項目49)
第2核酸配列が、野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)の
アミノ酸配列と少なくとも40%の配列同一性を有するウイルスカプシドをコードするウ
イルスタンパク質をコードし、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより
触媒される加水分解に耐性がある、項目40に記載の宿主細胞。
(項目50)
核酸配列が、野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)をコー
ドする、項目40に記載の宿主細胞。
(項目51)
リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、項目34に記載の核酸構築物。
(項目52)
リボザイムが、短RNAの少なくとも6個の隣接ヌクレオチドに相補的な核酸の隣接セ
ットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目34に記載の核酸構築物。
(項目53)
リボザイムが肝炎デルタVリボザイムである、項目34に記載の核酸構築物。
(項目54)
リボザイムが、野生型肝炎デルタVリボザイムの速度の最大で50%の速度で短RNA
との連結を切断することができる突然変異肝炎デルタVリボザイム又は配列番号10〜1
8から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタV(HDV)リボザイムである、
項目34に記載の核酸構築物。
(項目55)
項目34に記載の核酸構築物を含有するように形質転換された、植物又は植物組織。
(項目56)
種又は子孫が核酸構築物を含む、項目55に記載の植物又は植物組織の種又は子孫。
(項目57)
a)少なくとも1つの異種カーゴ分子を封入するウイルスカプシドをそれぞれ含む複数
のウイルス様粒子と、b)組成物に存在するカプシド100グラムあたり4グラム未満の
量で存在する1つ以上の細胞溶解産物とを含み、細胞溶解産物が、タンパク質、ポリペプ
チド、ペプチド及びこれらの任意の組み合わせから選択される、組成物。
(項目58)
カプシドが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性がある、項目57に記載の組成物。
(項目59)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と
少なくとも40%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目57に記
載の組成物。
(項目60)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)を含む
、項目57に記載の組成物。
(項目61)
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目57に記載の組成物。
(項目62)
異種カーゴ分子が、siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA及びmiR
NAから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目57に記載の組成物。
(項目63)
それぞれのウイルス様粒子が、少なくとも1つのリボザイムを更に含み、リボザイムが
、パッキング配列およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成
する、項目62に記載の組成物。
(項目64)
それぞれのウイルス様粒子が複数の核酸構築物を含む、項目63に記載の組成物。
(項目65)
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタVリボザイムから選択される
、項目63に記載の組成物。
(項目66)
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも6個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目63
に記載の組成物。
(項目67)
リボザイムが、野生型肝炎デルタVリボザイムの速度の最大で約50%の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタVリボザイム又は
配列番号10〜18から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デルタV(HDV)リ
ボザイムである、項目63に記載の組成物。
(項目68)
オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、長さが1〜100個のヌクレオチドの
ヌクレオチド配列により結合されており、そのような結合配列が、40%を超えるA又は
40%超えるUを含む、項目63に記載の組成物。
(項目69)
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目57に記載の組成物。
(項目70)
異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを更に含む
、項目69に記載の組成物。
(項目71)
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目70に記載の組成物。
(項目72)
細胞溶解産物が0.5グラム未満の量で存在する、項目57に記載の組成物。
(項目73)
細胞溶解産物が0.2グラム未満の量で存在する、項目57に記載の組成物。
(項目74)
細胞溶解産物が0.1グラム未満の量で存在する、項目57に記載の組成物。
(項目75)
標的カーゴ分子を単離及び精製する方法であって、(a)少なくとも1つの標的カーゴ
分子を封入するカプシドをそれぞれ含む複数のウイルス様粒子(VLP)を含む全細胞溶
解物を得ることであり、カプシドが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼ
により触媒される加水分解に耐性があること、(b)VLPを、カテゴリーEC3.4の
ペプチド結合ヒドロラーゼを使用する加水分解に、全細胞溶解物に存在するが、カプシド
により封入されていない個別のポリペプチド100個あたり、少なくとも60個、少なく
とも70個、少なくとも80個又は少なくとも90個が切断されるが、そのような加水分
解の前の全細胞溶解物に存在するカプシド100個あたり少なくとも60個、少なくとも
70個、少なくとも80個又は少なくとも90個が、加水分解の後に無傷のまま残るのに
十分な時間及び条件下で付すことを含む、方法。
(項目76)
カプシドが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)のアミ
ノ酸配列と少なくとも40%の配列同一性を有するウイルスカプシドタンパク質をそれぞ
れ含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に
耐性がある、項目75に記載の方法。
(項目77)
カプシドが、それぞれ野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3
)を含む、項目75に記載の方法。
(項目78)
標的カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目75に記載の方法。
(項目79)
標的カーゴ分子が、siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA及びmiR
NAから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、項目75に記載の方法。
(項目80)
それぞれのウイルス様粒子が、リボザイムを更に含み、リボザイムが、パッキング配列
およびオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築物を形成する、項目75
に記載の方法。
(項目81)
加水分解の後にカプシドの精製を更に含む、項目75に記載の方法。
(項目82)
精製が、液−液抽出工程、結晶化工程、分別沈殿工程及び限外濾過工程の少なくとも1
つを含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
標的カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目75に記載の方法。
(項目84)
項目75に記載の方法により生成される組成物。
(項目85)
宿主細胞における標的細胞の細胞内産生の後で、全細胞溶解物における加水分解から標
的分子を保護する方法であって、(a)カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラー
ゼにより触媒される加水分解に耐性があるウイルスカプシドを選択すること、(b)ウイ
ルスカプシドを形成するウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含む第1ベクターと
、パッキング配列及びsiRNA配列によりフランクされているリボザイムを含む核酸配
列を含む第2ベクターにより、宿主細胞を安定的に形質移入すること、並びに(c)パッ
キング配列及びsiRNA配列によりフランクされているリボザイムを包むカプシドを発
現及び組み立てるために、形質転換された細胞にとって十分な時間及び条件下で細胞を維
持することを含む、方法。
(項目86)
少なくとも1つの異種カーゴ分子を封入するVLPを精製するプロセスであって、(a
)複数のVLPを含む細胞溶解物を得ること、(b)細胞溶解物を、VLP以外の細胞溶
解産物を加水分解するのに十分な時間及び条件下でプロテアーゼと接触させて、加水分解
物を形成すること、並びに(c)加水分解物からVLPを単離することを含む、プロセス
。
(項目87)
工程(c)が、(i)硫酸アンモニウムによる第1沈殿、続いて第1遠心分離を実施し
て、第1沈殿物及び第1上澄みを得ること、並びに(ii)硫酸アンモニウムによる第1
上澄みに対する第2沈殿、続いて第2遠心分離を実施して、第2沈殿物を得ることを含み
、第2沈殿物が少なくとも約90重量%のVLPを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目88)
工程(c)が、(i)エタノールによる第1沈殿、続いて第1遠心分離を実施して、第
1沈殿物及び第1上澄みを得ること、並びに(ii)硫酸アンモニウムによる第1上澄み
に対する第2沈殿、続いて第2遠心分離を実施して、第2沈殿物を得ることを含み、第2
沈殿物が少なくとも約90重量%のVLPを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目89)
工程(c)が、加水分解物を超遠心分離して、少なくとも約90重量%のVLPを含む
沈殿物を得ることを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目90)
VLPが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分
解に耐性があるカプシドをそれぞれ含む、項目86に記載のプロセス。
(項目91)
VLPが、野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列と少
なくとも40%の配列同一性を有するカプシドタンパク質を含む及びカテゴリーEC3.
4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシドをそれぞ
れ含む、項目86に記載のプロセス。
(項目92)
VLPが、それぞれ野生型腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)
を含む、項目86に記載のプロセス。
(項目93)
工程(b)が、約37℃で少なくとも約30分間実施される、項目86に記載のプロ
セス。
(項目94)
工程(b)の前に、細胞溶解物をヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼの少なくとも
1つと約37℃で少なくとも約30分間接触させることを更に含む、項目86に記載の
プロセス。
(項目95)
プロテアーゼが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼである、項目8
6に記載のプロセス。
(項目96)
プロテアーゼが、プロテイナーゼK、Streptomyces griseus(ス
トレプトマイセス・グリセウス)のプロテアーゼ、Bacillus lichenfo
rmis(バチルス・リケンフォルミス)のプロテアーゼ、ペプシン及びパパインから選
択される、項目86に記載のプロセス。
(項目97)
異種カーゴ分子がオリゴヌクレオチドを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目98)
異種カーゴ分子がオリゴリボヌクレオチドを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目99)
オリゴリボヌクレオチドが、siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA及
びmiRNAから選択される短RNAである、項目98に記載のプロセス。
(項目100)
VLPが、パッキング配列及びオリゴリボヌクレオチドによりフランクされて核酸構築
物を形成するリボザイムをそれぞれ更に含む、項目86に記載のプロセス。
(項目101)
リボザイムが、ハンマーヘッドリボザイム及び肝炎デルタVリボザイムから選択される
、項目100に記載のプロセス。
(項目102)
リボザイムが、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも6個の隣接ヌクレオチドに相補的
なヌクレオチドの隣接セットを有するハンマーヘッドリボザイム変種である、項目10
0に記載のプロセス。
(項目103)
リボザイムが、野生型肝炎デルタVリボザイムの速度の最大で約50%の速度でオリゴ
リボヌクレオチドとの連結を切断することができる突然変異肝炎デルタVリボザイムであ
る、項目100に記載のプロセス。
(項目104)
リボザイムが、配列番号10〜18から選択される核酸配列を有する突然変異肝炎デル
タV(HDV)リボザイムである、項目100に記載のプロセス。
(項目105)
オリゴリボヌクレオチド及びパッキング配列が、少なくとも1〜100個のヌクレオチ
ドの、40%を超えるA又は40%超えるUを含むリンカー配列により結合されている、
項目100に記載のプロセス。
(項目106)
異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、項目86に記載のプロセス。
(項目107)
VLPが、異種カーゴ分子とウイルスカプシドを結合するオリゴヌクレオチドリンカー
をそれぞれ更に含む、項目106に記載のプロセス。
(項目108)
オリゴヌクレオチドリンカーが、リボザイム配列を含むオリゴリボヌクレオチドである
、項目107に記載のプロセス。
(項目109)
工程(a)の前に、細胞におけるVLPの発現に続いて細胞を遠心分離すること、細胞
を再懸濁すること、細胞を溶解し、細胞溶解物を遠心分離して、上澄みを得ることによる
細胞溶解物の調製を更に含み、上澄みが工程(a)に細胞溶解物として使用される、請求
項86に記載のプロセス。
(項目110)
カプシドが、1位のA残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージMS2
カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリー
EC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目
1に記載のVLP。
(項目111)
カプシドが、1位のA残基が欠失している及び2位のS残基が欠失していることを除い
て野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシ
ドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒され
る加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
(項目112)
カプシドが、1位のA残基が欠失している、2位のS残基が欠失している及び3位のN
残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージMS2カプシド(配列番号3)
のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴリーEC3.4のペプチド結
合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
(項目113)
カプシドが、129位のY残基が欠失していることを除いて野生型腸内細菌ファージM
S2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテゴ
リーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、請
求項1に記載のVLP。
(項目114)
カプシドが、112〜117セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌
ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含
み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性
がある、項目1に記載のVLP。
(項目115)
カプシドが、112〜117セグメントに単一のアミノ酸欠失を有する野生型腸内細菌
ファージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含
み、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性
がある、項目1に記載のVLP。
(項目116)
カプシドが、65〜83セグメントに1〜2つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目1に記載のVLP。
(項目117)
カプシドが、44〜55セグメントに1〜2つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目1に記載のVLP。
(項目118)
カプシドが、33〜43セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージ
MS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテ
ゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、
項目1に記載のVLP。
(項目119)
カプシドが、24〜30セグメントに1〜2つの残基挿入を有する野生型腸内細菌ファ
ージMS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、
カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があ
る、項目1に記載のVLP。
(項目120)
カプシドが、10〜18セグメントに単一の残基挿入を有する野生型腸内細菌ファージ
MS2カプシド(配列番号3)のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質を含み、カテ
ゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性がある、
項目1に記載のVLP。
(項目121)
カプシドが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第2カプシドモノマー配列と連鎖してい
るカプシドタンパク質モノマー配列を含む、項目1に記載のVLP。
(項目122)
カプシドが、C末端が第2カプシドモノマー配列と連鎖している0〜6個の残基リンカ
ーセグメントによりC末端が延長されているカプシドタンパク質モノマー配列を含み、全
てが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐
性があるカプシドの中に組み立てられる、項目1に記載のVLP。
(項目123)
リンカー配列が、−(Gly) x −であり、ここでx=0〜6であるか又は−Gly−
Gly−Ser−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Ser及び−Gly−Ser−
Gly−から選択されるGly−Serリンカーである、項目122に記載のVLP。
(項目124)
カプシドが、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水
分解に耐性があるカプシドの中に組み立てられる第3カプシドモノマー配列と連鎖してい
るカプシドタンパク質を含む、項目122に記載のVLP。
(項目125)
カプシドが、C末端が第3カプシドモノマー配列と連鎖している0〜6個の残基リンカ
ーセグメントによりC末端が延長されているカプシドタンパクを含み、全てが、カテゴリ
ーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプシ
ドの中に組み立てられる、項目122に記載のVLP。
(項目126)
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly) x −であり、ここでx=0〜
6であるか又は−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Se
r及び−Gly−Ser−Gly−から選択されるGly−Serリンカーであり、カテ
ゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカ
プシドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目125に記載のVLP。
(項目127)
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly)x−、x=1であり、カテゴ
リーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目125に記載のVLP。
(項目128)
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly)x−、x=2であり、カテゴ
リーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目125に記載のVLP。
(項目129)
カプシドが、一方又は両方のリンカー配列が−(Gly)x−、x=3であり、カテゴ
リーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があるカプ
シドの中に組み立てられるカプシドタンパク質を含む、項目134に記載のVLP。
(項目130)
1つ以上のコートタンパク質配列が、1〜3つの残基によりN末端切断されており、リ
ンカー配列が、欠失された残基の数により延長され、カテゴリーEC3.4のペプチド結
合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−(Gly) x
−であり、ここでx=0〜6である、項目1に記載のVLP。
(項目131)
1つ以上のコートタンパク質配列が、1つの残基によりC末端切断されており、リンカ
ー配列が、1つの残基により延長され、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラー
ゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リンカー配列が−(Gly) x −であり、こ
こでx=0〜6である、項目1に記載のVLP。
(項目132)
連鎖二量体における第1コートタンパク質配列が、1つの残基によりC末端切断されて
おり、リンカー配列が、1つの残基により延長されている、或いは連鎖三量体における第
1及び/又は第2コートタンパク質配列が、1つの残基によりC末端切断され、カテゴリ
ーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより触媒される加水分解に耐性があり、リン
カー配列が−(Gly) x −であり、ここでx=0〜6である、項目1に記載のVLP
。
(項目133)
N及びC末端切断を含有し、カテゴリーEC3.4のペプチド結合ヒドロラーゼにより
触媒される加水分解に耐性がある、項目1に記載のVLP。
出願書類にはカラーで作成された少なくとも1枚の写真が含まれている。カラー写真を有するこの特許出願のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて特許庁より提供されるであろう。
A.定義
本明細書に記載の方法及び組成物は、ある種のウイルスカプシドが、核酸に対する商業化手続きを改善するための新たな製造方法及び精製方法で調製され及び/又は使用され得る賞賛の一部をもたらす。本明細書に記載の方法は、核酸、ペプチド、又はタンパク質を含むポリペプチドなどの異種カーゴ分子を含むために、すぐに利用可能なヒドロラーゼに対して耐性がある組み換え型ウイルスカプシドを使用する。
(配列番号1)全MS2ゲノム、野生型、太字で外皮タンパク質配列
ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG
(配列番号3)MS2外皮タンパク質、アミノ酸配列:
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
(i)全ての一本鎖RNAスペーサーが4〜40ヌクレオチド(配列番号30)を有する場合、1つの一本鎖(非ハイブリダイズ)RNAスペーサーに隣接した少なくとも1つのパッキング配列及び1〜100の同一の又は異なるsiRNAs、
(ii)全ての一本鎖RNA配列が4〜40ヌクレオチド(配列番号28、HDVリボザイム)を有する場合、1つの(1)リボザイム及びsiRNAにつき1つの一本鎖(非ハイブリダイズ)RNA配列、
(iii)siRNAにつき2つの(2)リボザイム、
(iv)1つの(1)T7開始部位、1つの(1)リボザイム、1つの(1)パッキング部位及び1つの(1)転写終結部位、又は
(v)1つの(1)T7開始部位、1つの(1)パッキング部位、及び1つの(1)転写終結部位
(vi)siRNAにつき4つの(4)リボザイム(配列番号29)
CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTG(配列番号4)
又は
TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG (配列番号5)
以下の非限定的な実施例は、本開示の様々な態様を例示するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するために本出願人によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい方法を構成するために考慮され得ることは当業者に理解されるであろう。しかしながら、本開示を考慮すると、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、又は同様の結果のように得ながら、記載された具体例で多くの変化が起こることを理解すべきである。したがって、実施例は例示のためだけのものであり、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明を有効にし、記述するために必要な程度まで、引用された全ての文献は、本明細書に参考として組み込まれる。
MS2バクテリオファージ(ATTC No.15597−B1,from American Type Culture Collection,Rockville,MD)及び大腸菌(ATCC No.15669)は、ATCCから得られ、Strauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54 J.Mol.Biol 7:43−54によって記載された方法を使用して増殖させた。600nmの光学濃度(OD)及びpHは、反応の間ずっと追跡した。ODiは、宿主との接種後すぐのODを表している。感染は2.3時間で行われた。Ln(OD/ODi)は、左軸(全菱形)で表し、pHは右軸(白四角)で表した。この実験は宿主の接種後5.3時間で終了した。得られた溶解物を、2,000gで遠心分離し、残りの細菌及び細菌の破片を除去するために0.2umの膜を通して濾過した。
MS2バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図2に示す。
MS2バクテリアファージの処理は次の通り行われた。処理中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図3に示す。実施例Aの終わりに得られた4mLの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。レロン11での抽出後の水溶液の試料は、採取され、分析された(レーン1のサンプル、図3)。20mMのCaCl2の水溶液370μLを部分的に精製されたファージ溶液(130μL)に添加した。混合物を37℃でインキュベートし、1時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン2の試料、図3。インキュベーション生成物を脱イオン(DI)水で2mLに希釈し、100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(150μL)をDI水で2mLに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン3の試料、図3。ファージの完全分解を示している、10kDa以下の弱いバンドのみ観測した。
MS2バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図3に示す。実施例4の終わりに得られた4mLの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。部分的に精製されたファージを含有する水溶液を、脱イオン水で2mLに希釈し、300kDaの膜を通して濾過し、濾液を100kDaの膜を通して濾過し、そこから150μLの濃縮水が得られた。次いで、濃縮水を脱イオン(DI)水で2mLに希釈し、同じ100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(150μL)の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン4の試料、図3。混合物を37℃でインキュベートし、1時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン5の試料、図3。次いで、生成物を脱イオン(DI)水で2mLに希釈し、100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(150μL)をDI水で2mLに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の試料を採取し、分析した。レーン6の試料、図3。100kDa以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された14kDaのMS2’s外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のMS2カプシドの存在を示している。99%より高い純度のファージを含有する生成物を得た。
MS2バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図4に示す。
MS2バクテリアファージの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図5に示す。実施例50の終わりに得られた4mLの溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。フレロン11での抽出後の水溶液の試料は、採取され、分析された(レーン1のサンプル、図5)。20mMのCaCl2の水溶液1.24mLに溶解された0.9mgのプロテイナーゼKを部分的に精製されたファージ溶液(1.2mL)に添加した。混合物を37℃でインキュベートし、1時間後にプロテイナーゼKを不活性化するためにエタノールに0.2Mのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)溶液60μLを添加した。次いで、混合物を氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン2の試料、図5。0.1%のリン酸水溶液の0.68mLを、液体のpHを4までもたらすために氷水浴に激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで30分間遠心分離した。上清を室温に到達させ、1%のNaOH130μLを液体のpHを8までもたらすために添加した。上清を氷水浴に15分間入れ、1%の酢酸1.3mLを液体のpHを4までもたらすために0℃で激しい撹拌でゆっくり添加した。0℃で1.5mLのエタノールを、液体中のエタノール濃度を34%までもたらすために激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで30分間遠心分離した。ペレットを200μLの脱イオン水に再懸濁し、20μLの試料を採取し、分析した。レーン3、図5。残り(180μL)を脱イオン(DI)水で2mLに希釈し、100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(150μL)をDI水で2mLに希釈し、同じ膜を通して再び濾過した。濃縮水の希釈及び限外濾過をもう一回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン4の試料、図5。100kDa以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された14kDaのMS2’s外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のMS2カプシドの存在と一致する。同じ濃縮水でUVスペクトルは、図6に示され、それはG.F.Rohrmann and R.G.Krueger,(1970)J.Viro.,6(3):26により発行された結果と一致する。Superdex 200(GE Healthcare,Piscataway,NJ)サイズ排除クロマトグラフィーを、pH7.4及び150mMのNaClでトリス緩衝食塩水を使用して同じ濃縮水上で実行した。それはカラムの空隙容量でのみ280nmの吸光度を示した。600kD〜2kDのタンパク質に対する溶出量に吸光度はなかった。この試験は無傷のファージ粒子と一致する。RNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)及びDNA−free kit(Life Technologies,Grand Island,NY)を使用して同じ濃縮水の別の試料から単離し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies)を使用して逆転写した。次いで、MS2ゲノムの3つの異なる部分の有無をPCR実験で識別した。次の一対のプライマーを使用し、各プライマーはMS2ゲノムの最初及び最後のベースの位置を指定し、それぞれforward(F)及びreverse(R):F1001_1021−R2180_2201,F1201_1223−R1979_2001,F1401_1426−R1680_1705。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies)を増幅に用いた。Ethidium Bromideで染色した1.5%のアガロースゲルにクロマトグラフィーで分析された、図9に示すようなPCR生成物(レーン1のプライマーF1201_1223−R1979_2001に対して1.2kbp、レーン2のプライマーF1201_1223−R1979_2001に対して800bp、及びレーン3のプライマーF1401_1426−R1680_1705に対して304bp)は、無傷のMS2バクテリアファージゲノムと一致した。また、感染性試験を以下のように同じ濃縮水上で実行した。濃縮水5μLを用いて、それがOD(600nm)=0.22に達した時点で、実施例Aに記載されたような細菌培養物の1mLを感染させた。図7に示すように、感染後1時間はOD(600nm)は0.62であり及び更に2時間後は0.21に下がったが、同じ時間中対照試料は、感染後1時間はOD(600nm)の0.82及び更に2時間後は1.2に達した。この試験は濃縮水の高い感染性のファージを示し、したがって精製工程は単離するために使用し、その安全性に妥協しなかったことを証明した。結論として、99%より高い純度のMS2バクテリアファージを含有する生成物を得た。
異なる外因性プロテイナーゼを使用したMS2バクテリアファージの精製は、実施例Eに記載されるようにプロテイナーゼK以外のプロテイナーゼを使用したことを除いて実質的に試みられた。Bacillus lichenformis(P5380,Sigma Aldrich)からのプロテアーゼによって進められたタンパク質分解後に、MS2バクテリアファージを正常に精製した。しかしながら、pH1.6でporcine gastric mucosa(P6887,Sigma Aldrich)からのペプシンを用いたタンパク質分解反応は、MS2バクテリアファージを有意に分解するために見出された。一方、pH6でpapaya latex(P3125,Sigma Aldrich)からのパパインを用いたタンパク質分解反応は、MS2バクテリアファージを広範囲にわたって分解しなかった。実施例H:特定の19−mer RNAヘアピンに付属のその外皮タンパク質をコード化するRNAをカプシドで包むMS2カプシドの産出MS2カプシドの産出は次の通り行われた。得られた結果を図8に示す。次のDNA配列、コード化MS2外皮タンパク質及びその特別のRNA19−merパック部位は、pDEST14_A252 Plamsmid(Life Technologies)にクローン化された。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTACCCAGCT
(配列番号6)
MS2カプシドの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図8に示す。培養物の115mLと同等である実施例Hからのベレットの画分は、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、16,000gで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。20mMのCaCl2の水溶液1.05mLに溶解された0.3mgのプロテイナーゼKを部分的に精製されたMS2カプシド溶液(1.05mL)に添加した。混合物を37℃でインキュベートし、2.5時間後にそれを氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、分析した。レーン3の試料、図8。15分後、0.1%のリン酸水溶液の0.14mLを、4.1まで液体のpHをもたらすために氷水浴に激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで20分間遠心分離した。1%のNaOHの100μLを0℃で保つ上清に7.9まで液体のpHをもたらすために添加した。次いで、0℃で0.5mLのエタノールを、液体中のエタノール濃度を20%までもたらすために激しい撹拌でゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで20分間遠心分離した。7まで溶液のpHを調節するために1%の酢酸を添加した後、上清をVivaspin2(Sartorius)300kDa膜を通して濾過し、そこから150μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水をリン酸緩衝生理食塩水で2mLに希釈し、同じ100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(150μL)の希釈及び限外濾過を4回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン4の試料、図8。100kDa以下の分子量でタンパク質を透過する膜によって維持された14kDaのMS2’s外皮タンパク質は、明確に視認でき、無傷のMS2カプシドの存在と一致する。RNAをQIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)及びDNA−free kit(Life Technologies,Grand Island,NY)を使用して同じ濃縮水の別の試料から単離し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies)を使用して逆転写した。次いで、MS2カプシドの部分の有無をPCR実験で識別した。F1401_1426−R1680_1705。次の一対のプライマーを使用し、各プライマーはMS2ゲノムの最初及び最後のベースの位置を指定し、それぞれforward(F)及びreverse(R):F1401_1426−R1680_1705。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies)を増幅に用いた。図10に示すような(レーン1の304bp、Life Technologiesからの1kb plus ladderに相当する最左のレーン)、Ethidium Bromideで染色した2%のアガロースゲルにクロマトグラフィーで分析された、PCR生成物は、無傷のMS2被膜遺伝子と一致した。結論として、99%より高い純度のMS2カプシドを含有する生成物を得た。
MS2 VLPの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図11に示す。実施例Hと同一の実験から得たベレットの6分の1を、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、16,000gで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。次いで、試料を採取し、分析した。レーン1の試料、図11。MS2ファージの外皮タンパク質と一致する約14kDaの強いバンドを見出した。他のバンド−不純物−高分子量の大部分は、試料重量の約27%を示す。20mMのCaCl2水溶液の1.36mLを部分的に精製されたMS2 VLP溶液(1.35mL)に添加し、氷水浴に入れた。15分後、10%の酢酸水溶液の50mLを、4.1まで液体のpHをもたらすために添加した。次いで、同じ温度及び激しい撹拌で、1.44mLのエタノールをゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで20分間遠心分離した。ペレットを20mMのTris−HCl及びpH7.5まで調製した10mMのMgCl2から成る水性緩衝液の2mLに懸濁させた。次いで、試料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン2の試料、図11。この試料の不純物は試料重量の約24%を示した。希釈した試料はVivaspin2(Sartorius)100kDa膜を通して濾過し、そこから200μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水を同じバッファで2mLに希釈し、同じ100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(200μL)の希釈及び限外濾過を4回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン3の試料、図11。この試料の不純物は試料重量の約9,7%を示した。結論として、99%より高い純度のMS2 VLPを含有する生成物を得た。
MS2 VLPの精製は次の通り行われた。精製中に試料を採取し、SDS PAGE分析を試料上で実行した。得られた結果を図12に示す。実施例Hと同一の実験から得たベレットの6分の1を、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、細胞を溶解させるため超音波で分解した。細胞残屑は、16,000gで遠心分離によって除去される。得られた細胞溶解物は、硫酸アンモニウムを用いた沈殿及びStrauss and Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54によって記載されるようなトリクロロフルオロメタン(フレロン11)を用いた抽出によって部分的に精製された。次いで、試料を採取し、分析した。レーン1の試料、図12。MS2ファージの外皮タンパク質と一致する約14kDaの強いバンドを見出した。他のバンド−不純物−高分子量の大部分は、試料重量の約26%を示す。20mMのCaCl2の水溶液1.36mLに溶解された0.6mgのプロテイナーゼKを部分的に精製されたMS2 VLP溶液(1.35mL)に添加した。混合物を37℃でインキュベートし、2.5時間後に氷水浴に入れた。次いで、試料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン2の試料、図12。この試料の不純物は試料重量の約14%を示した。15分後、10%の酢酸水溶液の約50mLを、4.1まで液体のpHをもたらすため氷水浴に添加した。次いで、同じ温度及び激しい撹拌で、1.54mLのエタノールをゆっくり添加した。液体は30分間0℃に保ち、4℃で16,000gで20分間遠心分離した。ペレットを20mMのTris−HCl及びpH7.5まで調製した10mMのMgCl2から成る水性緩衝液の2mLに懸濁させた。次いで、試料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン3の試料、図12。この試料の不純物は試料重量の約10%を示した。希釈した試料はVivaspin2(Sartorius)100kDa膜を通して濾過し、そこから200μLの濃縮水を得た。次いで、濃縮水を同じバッファで2mLに希釈し、同じ100kDaの膜を通して濾過した。濃縮水(200μL)の希釈及び限外濾過を4回繰り返した。次いで、濃縮水の資料を採取し、SDS PAGEによって分析した。レーン4の試料、図12。この試料の不純物は試料重量の約5.1%を示した。結論として、約95%の純度のMS2 VLPを含有する生成物を得た。
MS2 VLPの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、SDS PAGE分析を試料に行った。得られた結果を図13に示す。実施例Hと同様の実験により得られたペレットの6分の1を、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を16,000gでの遠心分離により除去した。得られた細胞溶解物を、Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54に記載されているように、硫酸アンモニウムの使用による沈殿及びトリクロロフルオロメタン(Freon 11)の使用による抽出によって部分的に精製した。部分的に精製されたMS2 VLP溶液(1.35mL)に、1.36mLの20mM CaCl2水溶液を加えた。混合物を、(構成的ヒドロラーゼが作用することを可能にするため)37℃で2.5時間インキュベートし、その後、氷水浴の中に入れた。試料を取り出し、SDS PAGEにより分析した:図13のレーン1が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約12%を表した。15分後、約120μLの1%水酸化ナトリウム水溶液を氷/水浴に加えて、液体のpHを7.86にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、0.81mLのエタノールをゆっくりと加えた。液体を0℃で30分間保持し、16,000gにより4℃で20分間遠心分離した。約100μLの10%酢酸水溶液を、氷/水浴中で激しく撹拌しながら上澄みにゆっくりと加え、液体のpHを4.01にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、1.3mLのエタノールをゆっくりと加えた。液体を0℃で30分間保持し、16,000gにより4℃で20分間遠心分離した。ペレットを、20mMのTris−HCl及び10mMのMgCl2を含有し、pH7.5に調整された2mLの緩衝水溶液に懸濁した。希釈された試料をVivaspin 2(Sartorius)100kDa膜で濾過し、200μLの濃縮液(retentate)を得た。次に濃縮水を同じ緩衝液で2mLに希釈し、同じ100kDa膜で濾過した。濃縮液(200μL)の希釈及び限外濾過を更に4回繰り返した。濃縮水の試料を取り出し、SDS PAGEにより分析した:図13のレーン3が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約4.7%を表した。結論として、得られた生成物は、MS2 VLPを約95%より高い純度で含有した。
MS2 VLPの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、SDS PAGE分析を試料に行った。得られた結果を図13に示す。実施例Hと同様の実験により得られたペレットの6分の1を、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を16,000gでの遠心分離により除去した。得られた細胞溶解物を、Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol 7:43−54に記載されているように、硫酸アンモニウムの使用による沈殿及びトリクロロフルオロメタン(Freon 11)の使用による抽出によって部分的に精製した。部分的に精製されたMS2 VLP溶液(1.35mL)に、1.36mLの20mM CaCl2水溶液に溶解した0.3mgのプロテイナーゼKを加えた。混合物を、37℃で2.5時間インキュベートし、その後、氷水浴の中に入れた。試料を取り出し、SDS PAGEにより分析した:図13のレーン2が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約8.1%を表した。15分後、約120μLの1%水酸化ナトリウム水溶液を氷/水浴に加えて、液体のpHを7.86にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、0.81mLのエタノールをゆっくりと加えた。液体を0℃で30分間保持し、16,000gにより4℃で20分間遠心分離した。約100μLの10%酢酸水溶液を、氷/水浴中の上澄みに加え、液体のpHを4.01にした。次に、同じ温度で激しく撹拌しながら、1.3mLのエタノールをゆっくりと加えた。液体を0℃で30分間保持し、16,000gにより4℃で20分間遠心分離した。ペレットを、20mMのTris−HCl及び10mMのMgCl2を含有し、pH7.5に調整された2mLの緩衝水溶液に懸濁した。希釈された試料をVivaspin 2(Sartorius)100kDa膜で濾過し、200μLの濃縮液を得た。次に濃縮水を同じ緩衝液で2mLに希釈し、同じ100kDa膜で濾過した。濃縮液(200μL)の希釈及び限外濾過を更に4回繰り返した。濃縮水の試料を取り出し、SDS PAGEにより分析した:図13のレーン4が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約0.9%を表した。結論として、得られた生成物は、MS2 VLPを約99%より高い純度で含有した。
MS2 VLPの精製を以下のように実施した。試料を、精製の際に取り出し、SDS PAGE分析を試料に行った。得られた結果を図14に示す。実施例Hと同様の実験により得られたペレットの6分の1を、10mMのMgCl2を含有する20mMのTris−HCl、pH7.5に再懸濁し、超音波処理して細胞を溶解した。細胞片を16,000gでの遠心分離により除去した。上澄みの試料を取り出し、SDS PAGEにより分析した:図14のレーン1が試料である。この試料中の不純物は、試料重量の約70%を表した。実施例Hと同様の実験から得られたペレットの他の4つの同様の画分を、同じ方法で処理した。
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列の配列A(配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 配列A(配列番号7)
配列T7−Rz6
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTCAAGAGGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCAAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGACCATGG(配列番号8)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列の配列A(配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 配列A(配列番号7)
配列T7−Rz12
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGATAAATAAATAAATTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATTTATTTATTTAATTATTATTATTATTATTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAAAATAATAATAATAATAATCCATGG(配列番号9)
それぞれ異なるカーゴを包むMS2カプシドを産生する幾つかの実験を、実施例Oに記載されているように実施する。しかし、配列B(配列番号8)に含まれるHDVリボザイム配列の代わりに、遅い反応速度定数を有するsiRNAの3’末端を切断する突然変異体を、それぞれの実験において使用する。遅発性HDVリボザイムを含有する以下の配列を、それぞれの実験において配列Bの代わりに使用する。
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCGGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号12)
配列G39U:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGTGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号13)
配列A78G:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAGTGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号14)
配列C21U:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTTCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号15)
配列G25A:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCACTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号16)
配列A78U:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGATTGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号17)
配列G74C:
TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGCCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号18)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列の配列A(配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG
配列T7−Rz15:
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGTTCACGTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCGTGAACGACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATATATATATATAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAATATATATATATACCATGG(配列番号19)
それぞれ異なるカーゴを包むMS2カプシドを産生する幾つかの実験を、実施例Oに記載されているように実施する。しかし、配列B(配列番号8)に含まれるHDVリボザイム配列の代わりに、siRNAの3’末端をハイブリダイズし、切断するように設計された長ハンマーヘッドリボザイム配を、それぞれの実験において使用する。長ハンマーヘッドリボザイムを含有する以下の配列を、それぞれの実験において配列B(配列番号8)の代わりに使用する。
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG (配列番号7)
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGATCTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGGGATCATATCTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGTTAATTAA(配列番号26)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(配列番号7)
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATTATATCTTGGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTGATGAGACTCTTCGGAGTCGAAACACCCAGTGGTGTCCTGACCCTGAAGTTCATCTGCCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGACCCTGAAGTTCATCTGCTATATCTTGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGCTGATGAGGCTCTTCGGAGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCCCTGAAGTTCATCTGCACCACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCCTGAAGTTCATCTGCACCATACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGTTAATTAA(配列番号27)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG (配列番号7)
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATATATATACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCAATTAATTACTGACCCTGAAGTTCATCTGCCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCAATAATAATCCCTGAAGTTCATCTGCACCACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGTTAATTAA(配列番号928)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンする。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(配列番号7)
配列T7−Rz8
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATTAGCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGATGAGACTCCGAATTCGGAGTCGAAACACGGTAACCGTGTCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGGCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCCATGG(配列番号29)
MS2カプシドの産生を以下のように実施する。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンした。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG (配列番号7)
実施例O〜Xにより得られたMS2カプシドを、実施例Nに概説された手順の使用により精製する。
実施例Nに記載されているように精製されたMS2カプシドに包まれているRNAを、製造会社(Life Technologies,Grand Island,NY)から供給されたプロトコールに従って、TRIzol(登録商標)試薬の使用によりそれぞれの実験において抽出した。得られたRNAを、ホルムアミドにおいて95℃で5分間加熱して変性させ、8%のポリアクリルアミド、8モルの尿素、1.08%のTris塩基、0.55%のホウ酸及び0.093%のEDTAから構成される17.6cm×38cm×0.04cm(幅、長さ、高さ)のゲルにおける電気泳動により分析した。処理緩衝液は、ゲルと同じ濃度のTris塩基、ホウ酸及びEDTAを有した。電力は約40Wで送った。ゲルを、25%のホルムアミド、19%のイソプロパノール及び15mMのTrisをpH8で含有する水性混合物中のStains−All染料(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)の0.025%溶液の使用により染色した。得られた結果を図15に示す。図15のRNA電気泳動のレーン番号は、図14のタンパク質電気泳動と同じレーン番号を参照する。単一RNAバンドを各レーンにおいて観察することができ、それぞれの場合に回収された高純度RNAと一致しうる。
作成物T7−Rz2をインビトロ転写に使用した。この作成物をpACYC184プラスミド(New England Biolabs)にクローンした。One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli(Life Technologies)の細胞を、このプラスミドの使用により形質転換した。プラスミドを含有するBL21(DE3)を、アンピシリンを含有するLB培地において37℃で増殖させ、OD(600nm)を0.8に等しくした。プラスミドを、製造会社の使用説明書に従ってQIAprep(登録商標)Spin Miniprep Kit(Qiagen)の使用により単離した。NcoI(New England Biolabs)を使用し、単離したプラスミドをこの作成物に導入した制限部位で切断した。消化の後、テンプレートを、1.5%アガロースゲルにおける電気泳動により精製し、製造会社の使用説明書に従ってPureLink(商標)Quick Gel Extraction Kit(Life Technologies)の使用により単離した。逆転写を、製造会社の使用説明書に従ってMAXIscript(登録商標)T7 Kitの使用により行った。RNA産物を、Novex(登録商標)変性15%ポリアクリルアミドTBE−尿素ゲル(Life Technologies)を70℃で作動して電気泳動した。RNAバンドを、臭化エチジウム(Sigma−Aldrich)の使用により可視化した。ゲル画像化を、Image Lab 4.0.1ソフトウエア(Bio−Rad)の使用により行った。
TAATACGACTCACTATAGGCTTGTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号31)
作成物T7−Rz1及びT7−Rz4をインビトロ転写に使用した。T7−Rz1は、共通リボザイムを含み、すなわち、6対未満のハイブリダイズヌクレオチドに切断されるRNAとハイブリダイズする幹を有するものを含む。T7−Rz4は、切断されるsiRNAとハイブリダイズする長い幹を有する、すなわち、6対を超えるハイブリダイズヌクレオチドを有する幹を有するフランキングリボザイムを含む。
TAATACGACTCACTATAGGCTCGAGCAAGCCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCGCTTGTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGCTTGCCATGG(配列番号32)
TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号33)
MS2カプシドの産生を以下のように実施した。MS2のコートタンパク質をコードする以下のDNA配列(配列A;配列番号7)を、pDEST14(Life Technologies)プラスミドにクローンした。
ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(配列番号7)
TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(配列番号33)
実施例CCにおいて産生されたウイルス様粒子の精製を、実施例Nに記載されたとおりに実施した。
実施例DDに記載されているように精製されたウイルス様粒子に包まれているRNAを、製造会社(Life Technologies,Grand Island,NY)から供給されたプロトコールに従って、TRIzol(登録商標)試薬の使用により抽出した。得られたRNAを、ホルムアミドにおいて95℃で5分間加熱して変性させ、Novex(登録商標)変性15%ポリアクリルアミドTBE−尿素ゲル(Life Technologies)を70℃で作動して電気泳動することにより分析した。RNAバンドを、水溶液1mLあたり0.5μgの臭化エチジウム(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)の使用により可視化した。得られた結果を図18のレーン3に示す。レーン1は、分子基準のセットを示す。レーン2は、49個のヌクレオチド長さの化学的に合成されたshRNAを示す。
250mLの培養物から得られ、実施例DDに記載されたように精製された、MS2カプシドを含むウイルス様粒子を、400μLの20mM CaCl2水溶液にpH=7.5で懸濁した。
MS2ウイルスカプシドタンパク質(配列番号3)は、単一の折り畳みドメインを有し、レビウイルス科及びアロレビウイルス科カプシドタンパク質を含む、スーパーファミリーd.85の折り畳みファミリーd.85.1(RNAバクテリオファージカプシドタンパク質に属する。このファミリーのそれぞれのカプシドモノマーは、6本鎖ベータシート、続く2つのへリックスから構成される(時々、ねじれを有する長へリックスとして記載される)。180個のモノマーが非共有的に組み立てられて、カプシド内面を向いている連続ベータ−シート層及びカプシド外面にアルファ−へリックスを有する二十面体(ほぼ球状)のウイルスカプシドを形成する。X線結晶構造が、腸内細菌ファージMS2、GA(UniProt配列アイデンティファイアーP07234)及びFR(UniProt配列アイデンティファイアーP03614)ウイルスカプシド、並びに1つのMS2の1つのC末端が別の全てのd.81.1ファミリーレビウイルス科コートタンパク質のN末端と縮合しているMS2二量体から形成されるMS2のカプシドのために解明され、パブリックドメインに配置された。これらの構造のProtein Data Bankアンデンティファイアーは、それぞれ1AQ3(配列番号34)、1GAV(配列番号35)、1FRS(配列番号36)及び2VTU(配列番号37)であり、これらのアラインメントを図20に示す。この本明細書に記載されている全てのアラインメントにおいて、残基の番号付けは、連続した残基番号付けであり、例えば配列番号3は、大部分のPDB構造に使用されているように、細胞により除去されるリードMet(M)残基の0から開始している。
配列番号34 1AQ3 腸内細菌ファージMS2コートタンパク質 T59S
ASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYSI
KVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPS
AIAANSGIY
配列番号35 1GAV 腸内細菌ファージGAコートタンパク質 A59T G79V
ATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIK
LEVPKIVTQVVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEA
ISSQSGFYA
配列番号36 1FRS 腸内細菌ファージFRコートタンパク質
>sp|P03614|COAT_BPFR コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ fr PE=1 SV=4
ASNFEEFVLVDNGGTGDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTV
KVEVPKVATQVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIAT
AIAANSGIY
配列番号37 2VTU 腸内細菌ファージMS2コートタンパク質共有二量体
sp|P03612|COAT_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=1 SV=2
ASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTI
KVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPS
AIAANSGIYANFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSS
AQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLL
KDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号38(配列番号38) G4WZU0 G4WZU0_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 329852
>sp|P03612|COAT_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=1 SV=2
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYT
IKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIP
SAIAANSGIY
配列番号39
D0U1D6 D0U1D6_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022
>tr|D0U1D6|D0U1D6_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージMS2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号40
C0M2U4 C0M2U4_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2>tr|C0M2U4|C0M2U4_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVELPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号41
C0M2S8 C0M2S8_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M2S8|C0M2S8_BPMS2 コートタンパク質OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号42
C0M212 C0M212_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
tr|C0M212|C0M212_BPMS2 コートタンパク質OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号43
C0M1M2 C0M1M2_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M1M2|C0M1M2_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVAVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号44
C0M2L4 C0M2L4_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022遺伝子ms2g2
>tr|C0M2L4|C0M2L4_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVXQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号45
C0M220 C0M220_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M220|C0M220_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTXFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号46
Q2V0S8 Q2V0S8_BPBO1116 腸内細菌ファージbo1 12014
>tr|Q2V0S8|Q2V0S8_BPBO1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ BO1 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGPLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号47
C0M216 C0M216_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M216|C0M216_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNDGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号48
C0M1Y0 C0M1Y0_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M1Y0|C0M1Y0_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGXVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号49
D0U1E4 D0U1E4_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|D0U1E4|D0U1E4_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号50
C0M309 C0M309_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M309|C0M309_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPISSAIAANSGIY
配列番号51
C0M325 C0M325_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M325|C0M325_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCEXIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号52
Q9T1C7 Q9T1C7_BPMS2116 腸内細菌ファージms12 110679
>tr|Q9T1C7|Q9T1C7_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ M12 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVXPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号53
C0M2Z1 C0M2Z1_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M2Z1|C0M2Z1_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
配列番号54
C0M1N8 C0M1N8_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M2Z1|C0M2Z1_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
配列番号55
J9QBW2 J9QBW2_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|J9QBW2|J9QBW2_BPMS2 カプシドタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号56
C8XPC9 C8XPC9_BPMS2113 腸内細菌ファージms2 329852
>tr|C8XPC9|C8XPC9_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号57
C0M2Y4 C0M2Y4_BPMS2115 腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M2Y4|C0M2Y4_BPMS2 コートタンパク質(フラグメント) OS=腸内細菌ファージMS2 GN=MS2g2 PE=4 SV=1
NFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号58P69171 COAT_BPZR115 腸内細菌ファージzr 332942
>sp|P69171|COAT_BPZR コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ ZR PE=1 SV=1
ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号59
P69170 COAT_BPR17116 腸内細菌ファージr17 12026
>sp|P69170|COAT_BPR17 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ R17 PE=1 SV=1
ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号60
P03612 COAT_BPMS2 腸内細菌ファージms2 329852
>sp|P03612|COAT_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 PE=1 SV=2
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号61
C0M1L4 C0M1L4_BPMS2116腸内細菌ファージms2 12022 遺伝子ms2g2
>tr|C0M1L4|C0M1L4_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=MS2g2 PE=2 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号62
C8XPD7 C8XPD7_BPMS2116 腸内細菌ファージms2 329852 遺伝子cp
>tr|C8XPD7|C8XPD7_BPMS2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ MS2 GN=cp PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号63
Q2V0T1 Q2V0T1_BPZR116 腸内細菌ファージzr 332942
>tr|Q2V0T1|Q2V0T1_BPZR コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ ZR PE=4 SV=1
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号64
Q9MCD7 Q9MCD7_BPJP5115 腸内細菌ファージjp501 12020
>tr|Q9MCD7|Q9MCD7_BPJP5 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ JP501 PE=4 SV=1
MASNFTEFVLVDNGETGNVTVAPSNFANGVAEWISSDSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVAVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号65
P03611 COAT_BPF2115 腸内細菌ファージf2 12016
>sp|P03611|COAT_BPF2 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ f2 PE=1 SV=1
ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号66
P34700 COAT_BPJP3115 腸内細菌ファージjp34 12019
>sp|P34700|COAT_BPJP3 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ JP34 PE=3 SV=2
MATLRSFVLVDNGGTGDVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
配列番号67
Q2V0U0 Q2V0U0_BPBZ1115 腸内細菌ファージjp500 332939
>tr|Q2V0U0|Q2V0U0_BPBZ1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ JP500 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGDVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
配列番号68
Q2V0T7 Q2V0T7_BPBZ1115 腸内細菌ファージsd 332940
>tr|Q2V0T7|Q2V0T7_BPBZ1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ SD PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPISAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTTISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
配列番号69
Q9MBL2 Q9MBL2_BPKU1115 腸内細菌ファージku1 12021
>tr|Q9MBL2|Q9MBL2_BPKU1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ KU1 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQSVNGVELPVSAWKAFASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
配列番号70
P07234 COAT_BPGA115 腸内細菌ファージga 12018
>sp|P07234|COAT_BPGA コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ GA PE=1 SV=3
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYAIKLEVPKIVTQVVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
配列番号71
C8YJG7 C8YJG7_BPBZ1115 腸内細菌ファージbz13 329853
>tr|C8YJG7|C8YJG7_BPBZ1 カプシドタンパク質 OS=腸内細菌ファージ BZ13 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
配列番号72
C8YJH1 C8YJH1_BPBZ1115 腸内細菌ファージbz13 329853
>tr|C8YJH1|C8YJH1_BPBZ1 カプシドタンパク質 OS=腸内細菌ファージ BZ13 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQTVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
配列番号73
C8YJH5 C8YJH5_BPBZ1115 腸内細菌ファージbz13 329853
>tr|C8YJH5|C8YJH5_BPBZ1 カプシドタンパク質 OS=腸内細菌ファージBZ13 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGDPIADAISSQSGFYA
配列番号74
Q2V0T4 Q2V0T4_BPTH1115 腸内細菌ファージth1 12029
>tr|Q2V0T4|Q2V0T4_BPTH1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ TH1 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
配列番号75
Q2V0U3 Q2V0U3_BPBZ1116 腸内細菌ファージtl2 332938
>tr|Q2V0U3|Q2V0U3_BPBZ1 コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ TL2 PE=4 SV=1
MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
配列番号76
P03614 COAT_BPFR116 腸内細菌ファージfr 12017
>sp|P03614|COAT_BPFR コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ fr PE=1 SV=4
MASNFEEFVLVDNGGTGDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTVKVEVPKVATQVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIATAIAANSGIY
配列番号77
ef108465 腸内細菌ファージr17 329852
gi|132424616|gb|ABO33465.1| コートタンパク質 [腸内細菌ファージMS2]
MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
配列番号78 1QBE
>sp|P03615|COAT_BPQBE コートタンパク質 OS=腸内細菌ファージ Qbeta PE=1 SV=2
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKN
YKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLI
DAIDQLNPAY
Claims (22)
- 少なくとも1つの異種カーゴ分子を封入する、腸内細菌ファージMS2カプシドタンパク質(配列番号3)からなるVLPを精製するプロセスであって、(a)複数のVLPを含む細胞溶解物を得ること、(b)細胞溶解物を、VLP以外の細胞溶解産物を加水分解するのに十分な時間及び条件下で、プロテイナーゼK、Streptomyces griseus(ストレプトマイセス・グリセウス)のプロテアーゼ、Bacillus lichenformis(バチルス・リケンフォルミス)のプロテアーゼ、ペプシン及びパパインからなる群から選択されるプロテアーゼと接触させて、加水分解物を形成すること、並びに(c)加水分解物からVLPを単離することを含む、プロセス。
- 工程(b)が、少なくとも30分間実施される、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(b)が、37℃で実施される、請求項1に記載のプロセス。
- 加水分解のための時間および条件が、全細胞溶解物に存在するが、カプシドにより封入されていない個別のポリペプチド100個あたり、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個又は少なくとも90個が切断されるが、そのような加水分解の前の全細胞溶解物に存在するカプシド100個あたり少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個又は少なくとも90個が、加水分解の後に無傷のまま残るのに十分なものである、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(b)が、細胞溶解物をヌクレアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼからなる群のうちの少なくとも1つと接触させることを更に含む、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(c)が、加水分解物を遠心分離して、少なくとも90重量%のVLPを含む沈殿物を得ることを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(c)が、(i)硫酸アンモニウムによる加水分解物の第1沈殿、続いて第1遠心分離を実施して、第1沈殿物及び第1上澄みを得ること、並びに(ii)硫酸アンモニウムによる第1上澄みに対する第2沈殿、続いて第2遠心分離を実施して、第2沈殿物を得ることを含み、第2沈殿物が少なくとも90重量%のVLPを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(c)が、(i)エタノールによる加水分解物の第1沈殿、続いて第1遠心分離を実施して、第1沈殿物及び第1上澄みを得ること、並びに(ii)硫酸アンモニウムによる第1上澄みに対する第2沈殿、続いて第2遠心分離を実施して、第2沈殿物を得ることを含み、第2沈殿物が少なくとも90重量%のVLPを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、異種カーゴ分子とVLPとを結合するオリゴヌクレオチドリンカーを含む、請求項1に記載のプロセス。
- オリゴヌクレオチドリンカーがオリゴリボヌクレオチドである、請求項9に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA及びmiRNAから選択されるオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、リボザイムを含むオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 加水分解物から単離されたVLPが、組成物に存在するカプシド100グラムあたり4グラム未満の1つ以上の細胞溶解産物を含み、細胞溶解産物が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、短RNA、リボザイム及びパッキング配列を含むオリゴリボヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 異種カーゴ分子が、生体活性分子に特異的に結合する第1アプタマー配列及びカプシドのパッキング配列に結合するための第2アプタマー配列を少なくとも含む多官能性ポリヌクレオチドを含む二分子カーゴ分子を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 生体活性分子が、除草剤又は殺虫剤を含む、請求項16に記載の生体活性分子。
- 細胞溶解物が、プロテアーゼ耐性カプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む第1ベクター、及び異種カーゴ分子をコードする核酸配列を含む第2ベクターを含む細胞から得られたものである、請求項1に記載のプロセス。
- 細胞溶解物が、プロテアーゼ耐性カプシドタンパク質をコードする核酸配列、及び異種カーゴ分子をコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞から得られたものである、請求項1に記載のプロセス。
- 細胞溶解物が、原核宿主細胞から得られたものである、請求項1に記載のプロセス。
- 細胞溶解物が、真核宿主細胞から得られたものである、請求項1に記載のプロセス。
- 加水分解から標的分子を保護する方法であって、(a)配列番号3をコードする核酸配列を含むベクター、及び標的分子をコードする核酸配列を含むベクターにより、宿主細胞を安定的に形質移入すること、(b)形質転換された細胞にとって十分な時間及び条件下で宿主細胞を維持して、標的分子を包むカプシドを発現及び組み立てること、(c)請求項1に記載のプロセスによって、標的分子を包むVLPを精製することを含む、方法。
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