JP2873002B2 - アスベルギルスのプロモーターを含有するｄｎａ構築物ならびに該構築物で形質転換されたアスペルギルス - Google Patents

アスベルギルスのプロモーターを含有するｄｎａ構築物ならびに該構築物で形質転換されたアスペルギルス

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、糸状菌類におけるタンパク質の発現およ
び分泌を伴なうタンパク質の発現に関するものである。 発明の背景 組換えDNA技術のひとつの目標は、容易にしかも経済
的に入手できる宿主細胞に、商業的にあるいは科学的に
価値のあるタンパク質をコードしているDNAセグメント
を挿入することである。一般に、挿入のために選ばれる
遺伝子は、それら本来の宿主で限られた量しか産生され
ないタンパク質をコードしているもの、あるいは高価す
ぎて維持することのできない宿主に固有のものである。
より多くの収量で、あるいは同様の収量でより経済的に
タンパク質を産生することが可能な宿主に、制御された
方法で遺伝情報を転移することにより、タンパク質産生
のためのより望ましいビヒクルが得られる。 タンパク質をコードしている遺伝子は、本質的に、タ
ンパク質コード（暗号）領域の５′末端に接しているDN
Aのプロモーター領域を含んでいる。プロモーター領域
は、RANポリメラーゼIIとの結合部位を含んでいる。RNA
ポリメラーゼIIは、コード領域の適当なDNA鎖と相補的
なメツセンジヤーRNAの組立てを効果的に触媒する。ほ
とんどのプロモーター領域には、“TATAボツクス”とし
て一般に知られている配列に関係するヌクレオチド塩基
配列が存在し、そして、該配列は通常、コード領域の始
まりから幾分離れた上流に位置していて、正確な転写開
始反応には必要なものである。コード領域を正しく機能
させ、制御するのに重要な、あるいは必須であるそれ以
外の特徴も、コード領域の始まりの上流にあるプロモー
ター領域中に含まれている。 糸状菌類、特に、アスペルギルス属（Aspergillu
s）、たとえばアスペルギルス・ニーガー（A.niger）の
ような糸状嚢子菌類は、有用なタンパク質をコードして
いる外来遺伝子の受容体として適している微生物群の一
種である。現在、A.ニーガーとその関連（近縁）種は、
たとえば食品業界において使用するような酵素の工業生
産に係る業界で広範に用いられている。それらの用途
は、微生物の分泌能力に基づくものである。微生物は十
分に特徴づけられていて、広範に利用され、受け入れら
れているので、有用なタンパク質を得るために、A.ニー
ガーの細胞やA.ニデユランス（A.nidulans）を含むその
関連種の細胞を遺伝子的に修飾し増強するような工業的
でかつ科学的な誘因（動機）が存在する。 糸状菌類由来の外来タンパク質を発現、分泌させる方
法は、いまだ完成されていない。酵母において成功した
試みが、アスペルギルス属のような糸状菌類において成
功するかどうかは決して自明のことでない。酵母は、糸
状菌類の遺伝子を発現させるのに適した組織ではなく
〔ペンチラ（Pentilla）らのモレキユラー・ジーン・ジ
エネテイック（Molec.Gen.Genet.）（1984）194:494−4
99〕、また酵母遺伝子は糸状菌類中で発現しないことが
明らかにされた。最近になつて、A.ニデユランスおよび
A.ニーガーにおける遺伝子工学技術が発達してきた。こ
れらの技術は、外来的に加えられる遺伝子が、発現する
ことのできる形態でアスペルギルス・ゲノムに組込まれ
ることと関連している。 現在までのところ、これらの技術を用いても、外来タ
ンパク質は糸状菌類中で発現されず、該菌類から分泌さ
れなかつた。これは、適当な発現ベクターやその組立て
構成要素がないことによつていた。これらの構成要素に
は、上述したアスペルギルス・プロモーター配列、所望
の生産物をコードしている領域、および所望の生産物を
細胞外媒質に導びくために加えられる関連配列が含まれ
る。 上記のように、宿主細胞によつて外来遺伝子が発現す
るには、タンパク質をコードしている領域の上流に位置
するプロモーター領域が存在することが必要である。こ
のプロモーター領域は、それと関連するコード領域が、
最後には所望のタンパク質生産物に翻訳されるメツセン
ジヤーRNAに転写されることの制御において活性であ
る。このようにして産生されるタンパク質は、宿主に関
する運命に基づいて２つの種類の分類される。 第一の種類のタンパク質は、細胞内に残る。細胞内に
ある場合、所望のタンパク質を抽出するには、生産物を
放出させて、最終的に精製するために、遺伝子的に操作
された宿主を破壊あるいは溶解する必要がある。細胞内
生産物は、いくつかの点で都合がよい。このタンパク質
生産物は、濃縮することができ、すなわち細胞塊ととも
にペレツトにすることができ、もし、生産物が細胞外状
況で不安定、あるいは構造的に分泌することができない
場合には、これは、産生および精製の望ましい方法であ
る。 ２番目の種類のタンパク質は、細胞から分泌されるも
のである。この場合、精製は、細胞自身よりも細胞外媒
質上で行われる。生産物は、アフイニテイ−クロマトグ
ラフイーのような方法で抽出することができ、連続液中
発酵が可能である。また、特定の生産物は、細胞外でよ
り安定であり、細胞外精製が有利である。真核生物にお
けるタンパク質の分泌は、通常、タンパク質のアミノ基
末端に位置している分泌シグナルペプチド（以下、シグ
ナルペプチドと呼ぶ）によつて、ほとんど常に指令を受
けていることが実験的に明らかとなつている。シグナル
ペプチドは、ジー．ボン ヘイジン（G.Von Heijne）の
ヨーロピアン・ジヤーナル・バイオケム（Eur.J.Bioche
m）17−21（1983）によつて記述されているように、特
徴的な分布を有していて、当業者によりそのことは理解
されている。シグナルペプチドは、細胞に認識された時
点で、タンパク質を分泌経路へと導びく。分泌の間に、
シグナルペプチドは開裂して除かれ、タンパク質は、細
胞外媒質から成熟した形で収穫することができるように
なる。 細胞内および細胞外の両種のタンパク質はともに、コ
ード領域と連結しているプロモーター領域を含む遺伝子
によつてコードされている。細胞外へ導かれるタンパク
質をコードしている遺伝子は、細胞内のタンパク質をコ
ードしている遺伝子と、細胞外タンパク質をコードして
いる遺伝子では、シグナルペプチドをコードしているプ
ロモーター（それは、RNAポリメラーゼによつて最初に
転写される部分である）に最も近いコード領域部分がシ
グナルペプチドをコードしているという点で異なつてい
る。シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配
列は、以下ではシグナルペプチドのコード領域あるいは
シグナル配列と表わされるが、それ自体コード領域の機
能的な部分である。 発明の概要 所望のタンパク質を発現するために糸状菌類を形質転
換する方法（システム）が、ここに開発された。この方
法によれば、形質転換によつて、そのタンパク質が天然
に分泌されるものであるかどうかに関係なく、該タンパ
ク質を発現するばかりでなく、そのタンパク質を分泌す
ることのできる糸状菌類を得ることができる。その上、
本発明のある面においては、発現されるタンパク質の濃
度レベルを、コントロールすることができる。当業者に
は、本明細書で示される方法によつて、糸状菌類がタン
パク質の貴重な産生源として機能し、多くの適用例で、
細菌や酵母による方法（系）よりも秀れている代替系が
もたらされることを理解できるであろう。 このように一般的な態様では、本発明は、糸状菌類細
胞の遺伝子構成を改良し、これらの細胞によつて発現さ
れるタンパク質の性質または量を変えるための糸状菌類
の系質転換方法（系）を提供するものである。本発明の
より具達的な態様を以下に記述する。 本発明におけるひとつの態様では、A.ニーガー、A.ニ
デユランスあるいはその関連（近縁）種のような糸状菌
類におけるコード領域と関連するプロモーター領域を、
同定、分離し、細胞外で２番目の異なるコード領域と機
能的な関係の下で適当に結合させ、そして、適当なベク
ターを用いて、宿主糸状菌類に再び導入する。形質転換
された宿主細胞は、導入されたプロモーター領域のコン
トロールの下で、２番目のコード領域のタンパク質を発
現する。特定の宿主が天然では発現しないタンパク質を
発現する場合、および該タンパク質を分泌するいくつか
の場合に、この２番目のコード領域は、宿主種にとつて
外来のものであるかもしれない。他方、２番目のコード
領域がタンパク質発現を改良または増強するために特定
の宿主内でそのタンパク質が自然の状態で関連している
プロモーター領域とは異なるプロモーター領域と関連し
ている場合には、第２の暗号領域は宿主本来のものであ
るかもしれない。 第２のコード領域が、通常分泌されるタンパク質をコ
ードしているものである場合にはその配列は、転写およ
び翻訳後、タンパク質生産物のアミノ基末端にシグナル
ペプチドを存在せしめるようなヌクレオチド配列を、
５′末端、すなわちシグナルペプチドのコード領域に含
んでいるだろう。そのシグナルペプチドは、菌類宿主に
よつて認識され得、そして、タンパク質生産物は、細胞
の分泌経路へと導びかれ、分泌され得る。 もうひとつの態様では、本発明は、シグナルペプチ
ド、すなわちシグナルペプチドのコード領域をコードし
ているDNA配列であつて、コード領域内でコードされて
いるタンパク質の分泌を促するように、糸状菌類、好ま
しくは嚢子菌類種、たとえばA.ニーガーやA.ニデユラン
スによつて、認識されるDNA配列を提供するものであ
る。これらのシグナルペプチドのコード領域は、天然状
態では細胞内に保持されるタンパク質の分泌を誘導する
ために該タンパク質をコードしているコード領域と連結
することができる。一方、通常分泌されるタンパク質
は、普通、これらのシグナルペプチドのコード領域を天
然に含んでいるので、シグナルペプチドをコードしてい
る領域を挿入することは通常必要としないが、それで
も、所望により、本発明のシグナルペプチドのコード領
域で、天然に存在するこのような配列を置換してもよ
い。従つて、シグナルペプチドのコード領域が、非分泌
性のタンパク質をコードしている領域と連係されている
場合には、そのものは上記コード領域にとつて、外来性
であるだろう。 本発明は、菌類宿主が異種タンパク質を発現するよう
に配列されたプロモーターを伴つた外来性のコード領域
を糸状菌類中に導入し得る方法（性能）を提供するもの
である。また、本発明は、そこに、天然に存在する個々
の遺伝子、あるいはそこに導入された外来遺伝子の転写
は、その遺伝子と共に宿主に導入されたプロモーター領
域を介して調節することのできる方法をも提供する。た
とえば、A.ニデユランスのアルコール・デヒドロゲナー
ゼＩ（alc A）遺伝子やアルデヒド・デヒドロゲナーゼ
（ald A）遺伝子と天然で連なつているプロモーター領
域は、細胞外媒質のエタノール、スレオニン、あるいは
他の誘導物質によつて調節できる。この効果は、alcRと
して知られる遺伝子の保全に依存している。alcAあるい
はaldAプロモーター領域が、アスペルギルスなどにおい
て、外来タンパク質をコードしている領域と連なつてい
る時には、本発明に従つて、エタノールあるいはその他
の誘導物質によつて、異なる遺伝子の発現を同様に調節
することができる。 さらなる例として、A.ニーガーにおいてグルコアミラ
ーゼ遺伝子と天然で連なつていて、本発明の態様におい
て使用されるプロモーター領域は、でんぷんおよび他の
糖類によつて正に誘導される。 本明細書で用いる「誘導性プロモーター」は、例え
ば、エタノール、トレオニン、デンブンならびに他の
糖、および他の誘導物質のような誘導因子に反応して転
写を誘導することができるプロモーターを意味する。 もうひとつの態様では、本発明は、シグナルペプチド
をコードしている領域と機能的に連なるプロモーター領
域であつて、その３′側に位置し、シグナル配列と同じ
解読枠内に所望のタンパク質をコードしている領域を導
入させ得る領域を含むDNA構築物を提供するものであ
る。プロモーター／シグナル構築物は、タンパク質コー
ド領域をシグナルペプチドのコード領域に正確に連結さ
せ得る制限部位をその側面に有している。 他の態様では、本発明は、プロモーターやシグナルペ
プチドのコード領域を含むセグメントを、完全なタンパ
ク質のコード領域と共に、糸状菌類宿主のゲノムに導入
することのできる遺伝子ベクターを提供するものであ
る。そのタンパク質をコードしている領域は、宿主の糸
状菌類にとつて、固有のものであつても、外来のもので
あつてもよい。 このように、本発明は、アスペルギルス・ニーガー、
アスペルギルス・ニデユランスなどの糸状菌類細胞にお
いて、プロモーター領域として活性なDNA配列、および
シグナルペプチドのコード領域として活性なDNA配列を
提供するものである。 更に、本発明は、糸状菌類細胞においてプロモーター
領域として活性なDNA配列、および該DNA配列と機能的な
関連性を持つて化学的に結合しているコード領域（つま
り、該コード領域は糸状菌類宿主において、前記DNA配
列の影響下で発現することができる）からなる新規な構
築物を提供するものでもある。 更に、本発明は、形質転換されたアスペルギルス宿主
細胞において発現することのできるコード領域、および
形質転換されたアスペルギルス宿主細胞において活性で
あるプロモーター領域（コード領域とプロモーターとは
化学的に結合し、互いに機能的に関連している）を、適
当なベクターによつて宿主細胞に導入することからな
る、糸状菌類宿主細胞を遺伝子的に修飾する方法を提供
する。 この方法は、遺伝子発現の水準を上げるために、選択
された構築物の多数のコピーを宿主に導入することを包
含している。要すれば、あるいは所望ならば複数の構築
物のコピーの導入に伴なつて、構築物に対して調節作用
を有する生産物をコードしている遺伝子の多数のコピー
を導入する。 本発明は、本発明の構築物によつて形質転換された糸
状菌類細胞をも含むものである。 好ましい態様の説明 本発明において好ましい宿主は、子嚢菌種の糸状菌類
で、最も好ましくは、A.ニーガー、A.ニデユランスなど
を含むアスペルギルス属である。 発明の好ましい態様においては、A.ニーガー・グルコ
アミラーゼ遺伝子、あるいは、A.ニデユランスのアルコ
ール・デヒドロゲナーゼＩ遺伝子またはアルデヒド・デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子と関連しているプロモーター領
域、のいずれかと関連しているプロモーター領域を、適
当なベクター・プラスミドを製造する上で使用する。 これらプロモーター領域のうちいずれか、あるいは全
ては、適当な誘導物質を加えることで宿主細胞内で調節
することができる。alcAとaldAにおいては、この誘導
は、第３の遺伝子のタンパク質生産物である、プロモー
ターを介してコントロールされるalcRによつて調節され
る。alcAプロモーターあるいはaldAプロモーターを含む
構築物の多数のコピーを、対応するalcR遺伝子の多数の
コピーの導入を伴なわずに宿主に導入した場合、alcR生
産物の利用可能性によつて、alcAおよびaldAプロモータ
ーのプロモーター機能を制限し得ることが明らかにされ
ている。このような場合、宿主が産生することのできる
alcR生産物の量は、alcR生産物による誘導を必要とする
いくつかのプロモーターの要求量に応ずるのに不十分で
あることがある。従つて、alcAあるいはaldAプロモータ
ーを含む構築物の多数のコピーによる糸状菌類の形質転
換には、本発明の好ましい態様に従がつてalcR遺伝子の
多数のコピーの導入を併わせて行う。他方、たとえば、
高濃度のグルコース（および、いくつかの他の炭素源）
を、宿主の増殖に用いる培地中に使用することによつ
て、転写を抑制することができる。そして、コード領域
によりコードされていて、プロモーターによつて制御さ
れている生産物の発現は、細胞生育相の終了の後、つま
り、グルコースの全てが消費され、その遺伝子の抑制が
解除される時まで遅延する。この時に、プロモーターの
活性を増強するために誘導物質を添加する。 上述したプロモーターの制御のもとで、発現するよう
に選択されたコード領域のタンパク質生産物の運命は、
該コード領域のヌクレオチド配列によつて決定される。
既述したように、もし、タンパク質生産物が天然で細胞
外環境に導びかれるものならば、生来、分泌性のシグナ
ルペプチドのコード領域を含んでいるであろう。通常、
細胞内に存在するタンパク質生産物には、このシグナル
ペプチドが欠如している。 このように本明細書の目的においては、“コード領
域”は、細胞内に残つているか、分泌されるかのいずれ
かのタンパク質をコードしていると解すべきである。
（この“コード領域”とは、当業界では、時に構造遺伝
子すなわち遺伝子の、タンパク質をコードしている部分
を指して呼ばれることがある。）タンパク質が、それを
産生する細胞内に残つている場合には、通常、コード領
域は、シグナルペプチドのコード領域を欠如しているだ
ろう。コード領域が本来、分泌タンパク質をコードして
いるコード領域のセグメントと翻訳解読フレームにおい
て天然で連結しているシグナルペプチドのコード領域を
含んでいる場合には、コード領域内でコードされている
タンパク質は、細胞代謝における当然の結果として分泌
され得る。この場合、シグナルペプチドのコード領域を
挿入する必要はない。一方、分泌タンパク質をコードし
ているコード領域部分にとつて外来のシグナルペプチド
のコード領域を導入するように操作することもある。コ
ード領域が、シグナルペプチドのコード領域を天然で含
んでいない場合、あるいは天然のシグナルペプチドと通
常連結している所望のタンパク質の分泌を増強するため
に天然のシグナルペプチドのコード領域と単に置換する
場合には、この外来性シグナルペプチドのコード領域が
必要となる。 従つて、本発明の他の好ましい態様においては、要す
れば、すなわち、上述したプロモーターの制御のもとで
発現するために選択されたコード領域が、それ自身シグ
ナルペプチドのコード領域を含んでいない時には、シグ
ナルペプチドのコード領域を供給する。使用されるシグ
ナルペプチドのコード領域は、A.ニーガーのグルコアミ
ラーゼ遺伝子に伴なつているもの、あるいはin vitro
で作られる合成シグナルペプチドのコード領域であるこ
とが好ましく、適当なベクター・プラスミドの作成に使
用する。他のベクターの他の成分とライゲイトできるよ
うに、これらシグナルペプチドのコード領域の片方ある
いは両方の末端が修飾されていることが最も好ましい。
シグナルペプチドのコード領域が、コード領域の、成熟
した機能的タンパク質をコードしているセグメントと同
一フレーム中にあるように、シグナルペプチドのコード
領域をプロモーター領域とコード領域のタンパク質をコ
ードしているセグメントの間に挿入するような方法で行
うと、このライゲイシヨンは効果的である。 図面の簡単な説明 第1A図は、アスペルギルス・ニデユランスのアルコー
ルデヒドロゲナーゼＩ（alcA）遺伝子におけるコード領
域およびプロモーター領域を構成しているDNAの塩基配
列の模式図である。 第1B図は、A.ニデユランスのアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ（aldA）遺伝子におけるコード領域およびプロモー
ター領域を構成しているDNAの塩基配列の模式図であ
る。 第２図は、糸状菌類細胞を形質転換するのに有効なプ
ラスミドpDG6を組立てる方法の概略的模式図である。 第３図は、第２図のプラスミドpDG6の一部分の線状表
示図である。 第４図は、pGL1およびpGL2のプラスミド地図の概略的
模式図である。 第５図は、プラスミドpGL2への挿入のための合成リン
カー配列の選択性の模式図である。 第６図は、pGL2のフラグメントのヌクレオチド配列の
模式図である、 第７図は、pGL2BおよびpGL2BIFNのプラスミド地図の
模式図である。 第８図は、pGL2BIFNのフラグメントのヌクレオチド配
列の模式図である。 第９図は、プラスミドpALCA1Sおよびその作成方法の
模式図である。 第10図は、pALCA1SIFNのプラスミド地図およびその作
成方法の模式図である。 第11図は、pALCA1SIFNのフラグメントのヌクレオチド
配列の模式図である。 第12図は、pGL2CENDOのプラスミド地図の模式図であ
る。 第13図は、pGL2CENDOのフラグメントのヌクレオチド
配列の模式図である。 第14図は、pALCA1SENDOのプラスミド地図である。 第15図は、pALCA1SENDOのフラグメントのヌクレオチ
ド配列の模式図である。 第16図は、プラスミドpALCA1AMYおよびその作製方法
の模式図である。 第17図は、第16図に示すpALCA1AMYのセグメントのヌ
クレオチド配列の模式図である。 好ましい態様の詳細な説明 本発明において、A.ニーガーあるいはA.ニデユランス
などにおいて機能的な遺伝子のプロモーター領域が同定
された、所望のプロモーター領域を含む各々の遺伝子を
同定する方法は同様であるため、alcA遺伝子およびそれ
に含まれているプロモーターの位置を決め、同定する方
法について概説する。この目的のために、選択したタン
パク質、たとえばalcAを発現するように、選択種の細胞
を誘導し、これらの細胞から、メツセンジヤーRNAを分
離する。それらの一部は、未だ同定されていないが、al
cAをコードしている。フラグメントの相補的DNAを、mRN
Aフラグメントより作成し、ベクターにクローン化す
る。誘導されたA.ニデユランスより分離されたメツセン
ジヤーRNAをサイズ分画してalcA配列を豊富化し、末端
を標識して、alcA+ 菌株より調製されたcDNAクローンと
ハイブリダイズする。alcA+ mRNAとハイブリダイズするc
DNAを含むクローンは、alcA mRNAのDNAコピーを含んで
いる。この切片を、選択したアスペルギルス菌株由来の
全DNA遺伝子バンクとハイブリダイズし、選択したコー
ド領域たとえばalcAおよびその非翻訳領域を分離する。
aldAコード領域も同様の方法を用いて分離した。 そのコード領域は、他のコード領域およびタンパク質
と同様に、メチオニンをコードしているコヂンATGを伴
つた５′末端より始まる。発現されるタンパク質のアミ
ノ酸配列が知られている場合には、コード領域のDAN配
列は、容易にわかる。ATGコドのすぐ“上流”は、プロ
モーター領域に先行されるメツセンジヤーRNAのリーダ
ー部分である。 第1Aおよび1Bでは、A.ニデユランス由来の全DNA配列
を、従来からの塩基表示法によつて図示している。第1A
図に示した部分は、プロモーター領域およびアルコール
デヒドロゲナーゼＩ酵素をコードしているalcA遺伝子の
コード領域を含んでいる。第1B図に示した部分は、プロ
モーター領域およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素、
すなわちaldAをコードしている領域を含んでいる。（両
方ともに、“IVS"の用語は、介在配列を表わす。）これ
ら２つの酵素のアミノ酸配列は、他の種において公知で
ある。これらより、領域10および10′がコード領域であ
ると認められる。コード領域は各々、12位のメチオニン
・コドンATGを有する５′（“上流”）末端より開始す
る。タンパク質のコード領域によつてコードされる相応
のアミノ酸配列を、第1Aおよび1B図のそれぞれの列の下
に、従来からの省略法によつて付記する。コドン12のす
ぐ上流は、メツセンジヤーRNAのリーダー領域およびプ
ロモーター領域をコードしている領域で、長さは、プロ
モーターとして機能する上で必須の構造的特徴を全て含
ませるために決定するか、あるいは少なくとも概算して
おく必要がある。第1Aおよび1B図の各々には、ATGコド
ン12より上流の約800塩基の配列をそれぞれ示す。 機能するのに必須なものは全て、約1000塩基の長さの
配列中に、おそらくは図示した800塩基配列中含まれて
いるだろうし、さらには、最初の200〜300塩基配列、す
なわち第1Aおよび1B図における約14の位置よりも後にあ
るだろうことは、他の既知のプロモーターとの類似性に
よつて予測できる。プロモーター領域の本質的な機能
は、転写の正確な開始のための部位を提供することで、
それはTATAボツクス配列として知られている。このよう
な配列は、第1A図のalcAプロモーター配列上の16、およ
び第1B図のaldAプロモーター配列上の16′部に見出され
る。プロモーター領域のもうひとつの機能は、たとえば
遺伝子の転写を増強する調節分子のためのあるいは遺伝
子を活性または不活性にするための結合部位のような遺
伝子転写の調節において活性な、適当なDNA配列を提供
することである。このような調節領域は、第1Aおよび1B
図に、それぞれalcAおよびaldA遺伝子として図示したプ
ロモーター領域中にある。 本発明でプロモーター領域として使用されるDNA配列
の正確な上流５′末端は、それが本明細書で記述するよ
うな必須の機能的な配列を含んでいるならば、決定的な
ものではない。５′末端の上流にある余分なDNA配列
は、必要なものではないが、本発明において有害なもの
ではないようである。 本明細書記載の操作によつて、ある遺伝子のプロモー
ター領域を組立てるのに必須の機能的特徴全てを含む配
列の大きさを決定したなら、次の工程では、プロモータ
ー領域の末端の下流の都合よい位置でDNA鎖を切断し、
タンパク質のコード領域を取り除き、基本的に、プロモ
ーター領域および、時にメツセンジヤーRNAのリーダー
領域をコードしている領域部分を含む配列を残す。この
目的のためには、適当な位置に制限部位が存在していな
ければならず、次いで、適当な制限酵素でDNAを処理し
て有効に切断する。制限部位は、第1A図に図示されるal
cA配列によつてわかる。上流の切断に、プロモーター領
域にとつて必須の機能部位の全てを保持される部分に含
めるように、十分な距離をもつて上流に部位を選択す
る。下流の開裂部位に関しては、alcCの場合、正確にAT
Gコドン12の位置にある、制限部位は存在していない。
該部分に最も近い下流の制限部位は、13における配列GG
GCCCで、そこでは、その鎖を制限酵素Apa Iによつて切
断することができる。もし所望ならば、このような開裂
の後、位置13から位置12までの残つたヌクレオチドは、
エキソヌクレアーゼを用いて段階的に取り除くことがで
きる。このような取り除かれるヌクレオチドの数がわか
つているなら、エキソヌクレアーゼの作用を、位置12を
過ぎる時に適当に停止させることができる。第1B図に示
すaldAコード領域のメチオニン・コドン12の下流に同様
の制限部位を位置決めすることによつて、このプロモー
ター領域をもその後の使用のために同様に切り出す。多
くの場合、プロモーター領域の５′末端上に残つたヌク
レオチドは、塩基トリプレツトの解読フレームが維持さ
れる限りは、プロモーター領域の機能に害を与えること
はなく、該機能を有意に妨げることもない。 添付の第２図は、本発明に従つてアスペルギルス形質
転換体を形成するのに使用できるプラスミドpDG6を作成
する方法の工程を概略的に示したものである。第２図に
おいては、18は、細菌セルロモナス・フイミ（Cellulom
onas fimi）由来のエンドグルコナーゼ（セルラーゼ）
のコード領域30すなわち既知のベクターM13MP8における
C.フイミ由来のBamH Iエンドグルカナーゼ・フルグメン
トを含む組換えプラスミドである。それは、図示した適
切なEcoR I、Hind IIIおよびBamH I制限部位、並びに、
図示されていない、本発明にとつて問題外の他の制限部
位を含んでいる。項目20は、p5と名付けられた組換えプ
ラスミドで、既知の大腸菌（E.coli）プラスミドpBR322
より組立てられ、開始コドンATGをも含む、alcAコード
領域の一部分とともに、上述のようにして作成されたal
cAプロモーター領域を含むA.ニデユランスのEcoR Iフラ
グメントを含有している。それは、図示した制限部位、
並びに本発明では使用されないために図示されていない
他の制限部位を有している。プラスミドp5は、EcoR I部
位（３′）からHind III（５′）に至るDNA配列22を有
しており、該部分は事実上、第1A図で示している配列の
一部で、それは配列の上部に位置15（EcoR I制限部位の
構成部位である配列GAATTC）から位置17と表わされてい
る部分に相当るう。プラスミド20における配列22は、約
2kbの長さである。 次に、プラスミド18と20を制限酵素EcoR IおよびHind
IIIで切断して、alcAプロモーター領域と、エンドグル
カナーゼのコード領域30とを切り取り、Hind III切断プ
ルスミドpUC12とライゲイトして、pUC12上にこれらの配
列を含む、第２図に示すような新規な構築物pDG5Aを作
成する。プラスミドpUC12は公知で、市販されている大
腸菌プラスミドであり、該プラスミドは大腸菌内におい
て効率的に複製するので、所望ならば、pDG5Aのコピー
を豊富に産することができる。新規な構築物pDG5Aを、
構築物調製における他の生産物より分離する。次いで、
構築物pDC5Aに選択マーカーを付ければ、続いて得られ
る首尾よく構築物を導入されたアスペルギルスの形質転
換体を選別、分離することができる。ArgB- アスペルギ
ルス宿主の場合、この目的のために、一般にA.ニデユラ
ンス由来のArg B遺伝子を適当に使用することができ
る。ArgB遺伝子は、酵素オルニチン・トランスカルバミ
ラーゼをコードしていて、この遺伝子を含む菌株は、通
常の平板培養法および培養技術によつて、ArgB- 菌株よ
り容易に選別、分離することができる。ArgB- 菌株は、
アルギニン欠損の培地で生育できない。 第２図に示すように本発明のこの態様において、選択
マーカーを組込むには、Xba Iを使用して、A.ニデユラ
ンス由来のArgB+ 遺伝子を含むプラスミドpDG ATCC53006
のXba Iフラグメント32（ブクストン（Buxton）らの米
国特許出願、通し番号06/678,578、1984年12月５日出願
を参照）と構築物pDG5Aをライゲイトし、エンドグルカ
ナーゼのコード領域とalcAプロモーター配列およびArgB
遺伝子を含有する新規な構築物pDG6を形成する。そし
て、実施例１において、より詳細に記述するが、プラス
ミドpDG6を形質転換に使用し、alcAプロモーターの制御
下にあるエンドグルカナーゼのコード領域を含む新規な
アスペルギルス突然変異体菌株を作成する。 第３図には、Hind III部位24からHind III部位26まで
の構築物pDG6の機能部である配列の概略を、線状で示
す。それは、第１図で示したようにalcAプロモーター領
域22とATGコドン12およびATGコドンの下流にあるalcAコ
ード領域の残余部分の一部を含んでいて、それに続いて
プラスミド18由来のセルラーゼのコード領域30を含んで
いる。 プラスミドpDG6は、糸状菌類にとつて外来のタンパク
質のコード領域と結合した糸状菌類プロモーターを含む
ベクターの１例にすぎない。第16図に示した本明細書中
でpALCA1AMYと呼ぶもうひとつのベクターにおいては、a
lcA遺伝子の糸状菌類プロモーターと、天然に存在する
α−アミラーゼ酵素、つまり形質転換された菌類宿主に
とつて外来の生産物をコードしている配列とが連結され
ている。ベクターpDG6およびpALCA1AMYのタンパク質生
産物は、両方とも、それぞれの形質転換された宿主によ
つて発現する。さらに、α−アミラーゼのコード領域
は、天然でシグナルペプチドのコード領域を含んでいる
ので、この生産物は、宿主にとつては外来性であるにも
かかわらず、宿主の分泌機序を用いて、形質転換される
宿主によつて分泌され得る。 このように、糸状菌類のプロモーター領域を同定、分
離することによつて、所望の暗号領域と連結したこれら
のプロモーター領域を含むベクターで、形質転換するこ
とによつて宿主を操作し得る。 もし、ベクターのコード領域がシグナルペプチドのコ
ード領域を必要とするか、あるいは存在するシグナル配
列を、別の、好ましい、より効率的なシグナルペプチド
のコード領域によつて置き換えられるなら、このような
シグナルペプチドのコード領域は、プロモーターと、分
泌タンパク質をコードしているセグメントとの間に挿入
することができる。プラスミドpGL2（第４図）およびpA
LCA1S（第９図）は、特にこの目的に適した中間体クロ
ーニングベクターを例示している。各々は、カセツトと
して機能することができ、プロモーター、シグナル配列
および、シグナル配列と一緒に、正しい転写解読フレー
ムに、タンパク質のコード領域を挿入することを可能な
らしめる、シグナル配列下流の制限部位を提供するもの
である。 第４図において示すプラスミドpGL2は、グルコアミラ
ーゼ遺伝子のプロモーター40、シグナル配列42および開
始部分46を含むpGL1より作成することができ、それらす
べては本明細書で示す方法に従い、A.ニーガーDNA由来
の１つのセグメントから導かれる。このセグメントにお
いては、以下のチヤート１に再現するヌクレオチド配列
の末端（しかし、グルコアミラーゼのシグナル配列42の
内部にある）に向けて、BssH II制限部位が得られる。 シグナル配列42をもつた解読フレームに、タンパク質
のコード領域を受け入れることのできるセグメント、す
なわちリンカー44を該シグナル配列の下流に供給するた
めには、シグナル配列中に存在するBssH II部位および
その下流のSst I部位を利用する。この特別な態様にお
いては、セグメント46をpGL1から取り出し、第５図に示
すＡ、ＢあるいはＣと表示した３つのリンカーのうちひ
とつを選んでそれにより置き換える。各々のリンカー
は、BssH II末端およびSst I末端とライゲイトすること
ができる。BssH IIによるセグメント46の開裂に際して
欠損されたシグナル配列の末端コドンを修復するために
もリンカーを操作できる。さらに、所望のコード領域を
ベクターpGL2に挿入できるようにするために、各々のリ
ンカーを、そのヌクレオチド配列中のEcoRVおよびBgl I
I/Xho II部位を唯一つに限定する。 適当なリンカーの選択は、リンカーに挿入されるタン
パク質のコード領域の少なくとも最初の２、３のコドン
についての知見に基づいて行われる。有意に翻訳される
べきタンパク質のコード領域のためには、タンパク質の
コード領域の開始部位は、シグナル配列の開始点の直接
結合しているか、開始点から特定の数のヌクレオチド
（即ち、トリプレツト）をもつて結合しているべきであ
る。従つて、もし、挿入されるタンパク質のコード領域
が一つあるいは二つの不必要なヌクレオチド（あるい
は、それらの非トリプレツト因子）をその５′領域に通
常の開裂により生じるように有していれば、第５図に示
す三つのリンカーのうちのひとつで、余分で不必要なヌ
クレオチドの存在に対処することができ、シグナル配列
をもつ転写解読フレームに、タンパク質のコード領域の
始まりを位置せしめることができる。 リンカーＡ、ＢおよびＣによつてコードされるアミノ
酸残基は、第５図で示すようにヌクレオチド配列の下に
示されており、このことから、リンカーの解読フレーム
に及ぼす、さらに最終的には、挿入されるタンパク質の
コード領域に及ぼす、余分なヌクレオチドのリンカー配
列への付加の影響がわかるであろう。制限部位が常に解
読フレームの修飾部より下流にあるようにリンカーを設
計し（つまり、リンカーＡ、Ｂ、あるいはＣにおけるそ
れぞれ一つ、二つあるいは三つのアデニン残基）そうす
ることによつて、制限部位に挿入されるコード領域の解
読フレームを、適当なリンカーを選択することで維持す
ることができる。 プラスミドpGL2や、特定のリンカーセグメントＡ、Ｂ
あるいはＣを使用するプラスミドには、例えば、Ｂリン
カーを用いたpGL2BIFNがあり、これを用いて糸状菌類た
とえばアスペルギルス菌種を形質転換するとインターフ
エロンα−２が分泌され、さらには、Ｃリンカーを用い
たpGL2CENDOがあり、これを用いてこのような糸状菌類
を形質転換すると、エンドグルカナーゼが分泌される。 プラスミドpGL2は天然に依存するシグナル配列を利用
しているが、合成シグナル配列を含むベクターを利用す
ることも、本発明の範囲内に属する。このようなベクタ
ーの１例は、pALCA1Sで、それは糸状菌類を形質転換す
ることのできるベクターを形成するためにタンパク質の
コード領域を挿入できるプラスミドpGL2と同様の中間型
ベクターである。しかし、pGL2と異なり、pALCA1Sは、a
lcAプロモーターを利用し、プロモーターと連結した合
成シグナル配列を利用している。pALCA1Sを第９図に示
し、その組立て模式図を表わし、さらに実施例を参考な
挙げる。pALCA1Sから作られるプラスミドには、例え
ば、形質転換された糸状菌類にインターフエロンα−２
を分泌させるpALCA1SIFN、および糸状菌類宿主にエンド
グルカナーゼを分泌させるpALCA1SENDOがある。両方の
場合とも、宿主にとつて分泌タンパク質が外来性であつ
ても分泌できる。 さらに、以下の実施例によつて、本発明をさらに詳細
に説明、例示する。しかし、それは本発明を限定するも
のではない。 以下に挙げる実施例１および２の各々によつて、天然
で存在するが非菌類のコード領域と連結された糸状菌類
から導かれたプロモーターを有するベクターを用いて、
糸状菌類宿主を首尾よく形質転換できることを示す。 実施例１ pDG6 ATCC 53169を使用するA.ニデユランス
の形質転換 まず、第２図に示すベクター構築物pDG6を、標準的な
通常なライゲイシヨンおよび制限技術を用いて第２図に
示した設計方法に従つて製造した。次いて、以下のよう
に構築物pDG6をアスペルギルス・ニデユランスのArgB-
異変体細胞に導入した： ２の円錐形フラスコ中に0.02％アルギニンと10-5％
ビオチンを含有する完全培地（Cove 1966）500mlを入
れ、A.ニデユランスArg B- 菌株の分生胞子105個/mlを受
け付け、20時間250rpmで撹拌しながらインキユベートし
た。ワツトマンNo.54紙を通して菌糸を収穫し、無菌
脱イオン水で洗浄して、吸引乾燥した。菌糸1g当たり20
mgのノボザイム234（ノボ・エンザイム・インダストリ
ーズ（Novo Enzyme Industries））、0.1ml（＝15000単
位）のβ−グルクロニダーゼ（シグマ（Sigma））およ
び3mgの牛血清アルブミンを添加した、250ml（フラスコ
中の過滅菌した1.2M MgSO4・10mMリン酸カリウム（pH
5.8）に菌糸を加えた。光学顕微鏡によつてスフエロプ
ラストの生成を周期的に確認しながら、ゆつくりと撹拌
して、50−70分間、37℃で消化を行なつた。50mlの無菌
イオン交換水を加え、30umのナイロンメツシユに通して
過することでスフエロプラストを末消化のフラグメン
トから分離し、室温で50mlの円錐底管に入れ、振盪ロー
ター（swing out rotor）で５分間2500gで遠心分離して
収穫した。0.6M KCl 10ml中で再懸濁と遠心分陸を行な
い、スフエロプラストを２回洗浄した。スフエロプラス
トの数を血球計算器を用いて計測し、最終濃度が108個/
mlとなるように、pH7.5の1.2Mソルビトール、10mMトリ
ス/HCl、10mMCaCl2に再懸濁した。DNApDG6（pH8の、10m
Mトリス/HCl・1mMEDTA中、全量40μ）を加えたプラス
チツク管に、0.4mlの部分標本を入れ、室温で25分間、
インキユベートした。pH7.5の60％PEG4000、10mMトリス
/HCl、10mMCaCl2の部分標本0.4ml、0.4ml、そして1.6ml
を、添加の都度おだやかに、しかし完全に混合しなが
ら、各々のチユーブに順次加え、次いで20分間室温でイ
ンキユベートした。そして、形質転換されたスフエロプ
ラストを、適当に補充した最小培地１％寒天上層（over
lay）に加え、45℃で0.6M KClを加えるか減じるかし
て、直ちに、プレート内の同一の（冷えてはいるが）培
地上に注ぎ入れた。37℃で３〜５日培養し、増殖してい
るコロニーの数を計測した（エフ・ブクストン（F.Buxt
on）らのジーン（Gene）37、207−204（1985））。エン
トン（Yelton）らの方法〔プロナス（Proc.Nat′l Aca
d.Sci.）アメリカ（U.S.A）81;1370−1374（1980）〕も
使用した。 コロニーを２つの群に分けた。組み込まれたセルラー
ゼ遺伝子を誘導するために、ひとつの群のインキユベー
ト培地に、スレオニン（11.9g/リツトン）とフルクトー
ス（1g/リツトル）を加えた。他の群には、誘導物質を
加えないで、炭素源としてグルコースだけを使用した最
小培地上で発育させることで抑制した。培養した後に、
菌糸を過して分離し、凍結乾燥して、すりつぶし、pH
7の20mMトリス/HClでタンパク質を抽出し、両群ともに
バイオラド分析（BioRadAssay）によつて全タンパク質
生産を検定した。 セルラーゼの生産を調べるために、セルラーゼ（9g/
リツトル、カルボキシメチルセルロース）含有の寒天培
地のプレートを作成し、ガラス繊維の過物質の小片を
用意し、お互いを分離して、相同対接合体（トランスコ
ンジユガント）のひとつからの全タンパク質75μｇを各
々過器に加えた。プレートを一晩37℃でインキユベー
トした。そして、過器を取り除き、下の寒天培地にお
けるセルラーゼの破壊で明らかになるように、プレート
をコンゴーレツドで着色して、過器上の全タンパク質
にどこにセルラーゼが存在しているかを確認した。プレ
ートを5MNaCl水溶液で洗浄してよごれを取り除き、肉眼
で様相の違いを検定した。 スレオニンとフルクトースによつて誘導された４つの
形質転換体のうち３つが、全タンパク質生産物中のセル
ラーゼの存在を明らかに示した。誘導されなかつた、グ
ルコース抑制形質転換体は、セルラーゼ産生を示さなか
つた。 同じベクター系および菌株より３つのコントロール
（対照）系質転換体を作成したが、この場合はプロモー
ター配列を除いた。それらはどれも、誘導物質があろう
となかろうとセルラーゼを産生しなかつた。スレオニン
誘導された、系質転換菌株由来の培地が、C.フイミのエ
ンドグルカナーゼに対して惹起したモノクローナル抗体
と反応を示す事実によつて、C.フイミ・エンドグルカナ
ーゼのコード領域の存在を確認した。このモノクローナ
ル抗体は、コントロール菌株の細胞内A.ニデユランスタ
ンパク質とは交差反応を示さなかつた。 実施例２ pALCA1AMY ATCC53380を使用したA.ニデユラ
ンスの系質転換 ベクター構築物pALCA1AMYを第16図に示すように、標
準的な通常のライゲイシヨンおよび制限技術を用いて調
製した。第16図を参照しながら具体的に説明すると、プ
ラスミドp501〔S.J.ロスステイン（S.J.Rothstein）
ら、ネイチヤー（Nature）、308、662−655（1984）を
参照〕上に規定されたEcoR I−EcoR Iフラグメント中に
含まれている小麦α−アミラーゼ遺伝子72のコード領域
を挿入するために、A.ニデユランス・アルコールデヒド
ロゲナーゼ１のプロモーター22が位置している（上述）
Hind III−EcoR Iセグメントを含有するベクターpALCA1
を、そのEcoR I部位で切断した。小麦α−アミラーゼ
は、自然に分泌されるタンパク質であるのでそのコード
領域72は、シグナルペプチドのコード領域76と、成熟型
の分泌されたα−アミラーゼをコードしているセグメン
ト78を含有している。p501のEcoR I−EcoR Iセグメント
中に含有されているコード領域72を、pALCA1のEcoR I切
断部位とライゲイトすることでAlcAプロモーター22がα
−アミラーゼのコード領域と機能的に連結しているプラ
スミドpALCA1AMYが得られる。pALCA1AMY中でのp501起源
のα−アミラーゼコード領域の正しい方向性は、常法に
よりライゲイシヨン部位の配列を決定することで確認す
る。プロモーター／コード領域の結合部のヌクレオチド
配列を第17図に示す。 A.ニデユランスを実施例１に記載の方法で形質転換
し、細胞外媒質の試料を取り出して、１％溶解性でんぷ
ん寒天上に置かれたガラス繊維紙に適用する。そし
て、37℃で８時間後、過後を取り出し、固体ヨードの
入つたビーカー（50℃の水浴中）上で裏返す。きれいな
はん点は、でんぷんの減成を表わしていて、一方残つた
でんぷんは、深い紫色に変わり、これにより、分泌され
たα−アミラーゼの存在を確認する。 以下に挙げる３−12においては、完全なベクターによ
つて形質転換された糸状菌類から、外来性タンパク質を
分泌させるために、分泌シグナルペプチドのコード領域
を導入したベクターを提供する。 実施例３ 中間型ベクター、プラスミドpGL2の産生 Ａ） プロモーターおよびシグナルペプチド配列の供給
源 ATCCにカタログ番号22343で寄託されているA.ニーガ
ー株から得られるDNAから誘導された遺伝子バンクをプ
ローブして、A.ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子を分
離した。このプローブは、バイオサーチ・オリゴヌクレ
オチド合成装置とグルコアミラーゼ・タンパク質の公開
されているアミノ酸配列の情報を用いて調製したオリゴ
ヌクレオチド・プローブを用いて行つた。アミノ酸配列
のデータをヌクレオチド配列データに“逆翻訳”して、
プローブを合成した。プローブされた特定の遺伝子バン
クは、大腸菌内で生存でき、複製し得る市販のプラスミ
ドpUC12のBamH I部位にクローンされた、上述のA.ニー
ガーDNAのSav3A部分消化物であつた。 グルコアミラーゼ遺伝子を含むHind III−Bgl IIのDN
A断片を、pUC12にサブクローンした。次いで、所望のプ
ロモーター領域、シグナルペプチドのコード領域および
グルコアミラーゼタンパク質のコード領域の位置を、サ
ブクローンしたフラグメントを含有するpUC12中に確認
した。 EcoR I/EcoR Iフラグメント（第４図参照）の配列を
決定し、その配列データをウイスコンシン（Wisconsi
n）大学の配列分析プログラムを用いて分析した結果、
該フラグメントは長く、オープン翻訳解読フレームを含
んでいることがわかつた。 Hind III−Bgl IIフラグメント内の５′EcoR I部位と
BssH II3′部位の間のグルコアミラーゼ遺伝子の領域部
分であるヌクレオチド配列の分析結果を第６図に示す。
この領域には、グルコアミラーゼプロモーターおよびシ
グナルペプチドのコード領域を含んでいる。 このフラグメント内、すなわちヌクレオチド97−102
はタータボツクス（TATA box）48であり、これは正確な
転写開始のために、多くの真核生物のプロモーター領域
に必要とされる部位（多分RNAポリメラーゼII結合部
位）である。従つて、プロモーター領域の少なくとも一
部分が存在することが確認される。さらに、機能的必須
部の全てが約1000塩基の長さの配列内に含まれているら
しく、特にコード領域の開始コドン、すなわちヌクレオ
チド206−208、即ちメチオニンに対応するコドン“ATG"
49の上流の最初の200塩基内にあるらしいことを他の既
知のプロモーター領域との類似性から予言できる。この
ように、プロモーターと転写リーダー配列は、ヌクレオ
チド205で終了する。プロモーター領域は、RNAポリメラ
ーゼII結合部位およびその機能に必要な他の全ての特徴
を含んでいるにちがいないが、プロモーター領域の始ま
りを確認することは、それ程重要なことではない。この
ような、EcoR I−EcoR I配列は、グルコアミラーゼ遺伝
子の完全なプロモーター領域を表わしていると考えられ
るがプラスミドpGL2に使用するフラグメントは、完全な
プロモーター領域が、得られたプラスミド中に適切に含
まれることを確実にするために、もつと大きいHind III
−Bam I/Bgl IIセグメント中にこのフラグメントをまぜ
たものである。 成熟グルコアミラーゼのアミノ酸配列が既知であるこ
とに基いて（スベンソン（Svensson）らの“アスペルギ
ルス・ニーガー由来の２形態のグルコアミラーゼの特徴
付け”、カールスベルグ・リサーチ・コミユン（Carlsb
erg Res.Commun）、47、55−69（1982）を参照）、シグ
ナルペプチドのヌクレオチド配列を正確に決定すること
ができる。分泌タンパク質をコードしている遺伝子のシ
グナルペプチドのコード領域は、ATGコドン49によつて
コードされているメチオニン残基によつて開始すること
で知られている。ヌクレオチド配列の開始部分以外、す
なわちATGコドン３′側を確認することにより、該部分
のアミノ酸配列を決定することのできる情報が得られ
る。このアミノ酸配列を発表されているアミノ酸配列と
比較することによつて、その比較した、発表されている
配列に対応する部分が存在しないグルコアミラーゼの部
分的遺伝子として、シグナルペプチドを同定することが
できる。本明細書で定義されているグルコアミラーゼの
シグナルペプチド・コード領域は、先にこの方法によつ
て確認された。 上記の方法により、Sau3A部分消化により生成され、p
UC12に組込まれたHind III−BamH I/Bgl IIフラグメン
トが、グルコアミラーゼ遺伝子の以下の特徴を含むこと
を確認した：開始部、たぶん無関係な部分、プロモータ
ー領域、シグナルペプチドのコード領域、およびコード
領域の残りの部分。Hind IIIとBamH I/Bgl IIによる開
裂およびライゲイシヨンで、pUC12プラスミドに挿入さ
れたこのフラグメントは、第４図にプラスミドpGL1とし
て模式的に示されている。このプラスミドは、大腸菌中
でも依然として選択でき、複製できるような、複製など
に必要な全ての特徴を含んでいる。 Ｂ） プラスミドpGL2の組立て 前駆体としてpGL1を使用して、プラスミドベクターpG
L2を第４図に示すように形成することができる。本明細
書第５図に示した合成リンカー配列Ａ、ＢあるいはＣを
挿入するために、シグナル配列42の３′末端近くの制限
部位BssH IIを、唯一の下流のSst I部位とともに利用す
る。このように、pGL1をBssH IIとSst Iのふたつで開裂
し、それによつて、そこに含まれているグルコアミラー
ゼのコード領域46の開始部分を取り除く。その後、BssH
II/Sst Iに適合した末端を持つ様に設計した合成リー
ダー配列ＡからＣまでのうちのひとつを選んで挿入し、
ライゲイトし、プラスミドpGL2を作成する。３つのリン
カー配列、即ちＡ、ＢあるいはＣのいずれを使用するか
により、得られたプラスミドを、以下、それぞれpGL2
A、pGL2BあるいはpGL2Cと呼ぶ。 本明細書に示した合成リンカー配列は、第５図に示す
様に単一のEcoRVおよびBgl II制限部位を備えており、
そこへ所望のタンパク質のコード領域を挿入する。挿入
すれば、得られたプラスミドは、宿主、たとえばA.ニー
ガー、A.ニデユランスなどを形質転換するのに使用でき
る。宿主に認識されるプロモーター領域およびシグナル
ペプチドのコード領域が存在することによつて、タンパ
ク質のコード領域を発現させ、その発現されたタンパク
質を分泌させることができる。 実施例４ pGL2BIFN作成時のプラスミドpGL2の使用 プラスミドpGL2の使用例を以下に第７図を参照して述
べる。第７図では、pGLB由来のプラスミドpGL2BIFNの組
立てを図示している。 第５図に示される合成リンカー配列“B"を挿入するこ
とを除いて、pGL2に関して一般的に述べた方法に従つて
プラスミドpGL2Bを作成する。従つて、第７図において
は、参照番号44を“44B"と置き換えた。ベクターpGL2B
に開裂部を設けるために、プラスミドをリンカー44Bの
内部のEcoRV部位で切断する。開裂によつて平滑末端が
生じるが、これは、この目的のために有用であると知ら
れているリガーゼを使用して、平滑末端を両端に持つフ
ラグメントとライゲイトできる。 第７図に記載する態様においては、ヒトインターフエ
ロンα−２のコード領域を含有するフラグメント60を挿
入してpGL2BIFNを作成する。具体的には、ヒトインター
フエロンα−２をコードしているコード領域を含むDde
I−BamH Iフラグメント60を、既知であるこの遺伝子の
配列および制限地図に基づいて、プラスミドpN5H8（表
示していない）より取り出した。 プラスミドpN5H8は、既知のプラスミドpAT153をBamH
I部位でインターフエロン遺伝子と結合させたものであ
る。そのインターフエロン遺伝子は、スロコンブ（Sloc
omb）らによるプロナス（Proceedings of the National
Academy of Sciences）、USA、79巻、5455−5459頁（1
982）の“フアージM13mp7におけるクローンされたイン
ターフエロンα−２遺伝子の高レベルの発現およびモノ
クローナル抗体によるその精製”において開示されてい
る。 インターフエロン・フラグメントの粘着末端をpGL2B
のEcoRV切断部位にアニールするために、逆転写酵素を
用いてDde IおよびBamH I粘着末端を充填し、常法に従
つて適当なリガーゼでライゲイトする。 インターフエロンα−２のコード領域の解読フレーム
および、そのヌクレオチド配列、および適当な場合には
アミノ酸配列についての再生されたシグナルペプチド配
列との関係を示している第８図により、pGL2の挿入のた
めにリンカー配列Ｂを選ぶのが都合よいことは明らかで
あろう。 第８図は、49におけるメチオニンコドンATGから始ま
り、50におけるリジンコドンAAGで終わるグルコアミラ
ーゼのシグナルペプチド配列42部分に連結した、シグナ
ル配列の５′部にあるプロモーター領域40の部分を表わ
している。実際には、シグナルペプチドのコード領域
は、さらにひとつの残基、つまり52におけるアルギニン
に対応するCGCコドンまで延びているが、この残基は、
リンカー配列を挿入するために開裂およびライゲイシヨ
ンの間に欠損したアルギニン残基を補うように操作され
た合成リンカー配列44Bによつて構成されている。この
様によれば、シグナルの遺伝子配列は、もとのままであ
る。 同様にリンカー配列は、解読フレームを変更すること
なく、インターフエロンα−２のコード領域の挿入を可
能にする。第７、および第８図は、EcoRVによるリンカ
ー配列44Bの開裂により、平滑末端を有するリンカー・
フラグメント44B′および44B″が得られることを示して
いる。インターフエロンα−２コード領域をDde I部位
で切り取り、その酵素によつて形成した粘着末端を充填
すると、コード領域の配列をきずつけずに所望のヌクレ
オチド配列がつくられる。Dde I部位を充填したインタ
ーフエロン配列をEcoRVで開裂したリンカー配列内にラ
イゲイシヨンしたものは、リンカーの44B′とインター
フエロンのコード領域60の間のトリプレツト・コドン状
態で明らかのように、インターフエロンコード領域の本
来の解読フレームを維持している。万一、リンカーＢよ
りもヌクレオチドがひとつ少ない第５図に示すリンカー
Ａを選ぶと、ひとつのヌクレオチドによつて全解読フレ
ームがシフトし、ナンセンス配列となつてしまうだろ
う。合成リンカーＢを選ぶことによつて、平滑末端にし
たIFα−２フラグメントを正しく方向づける時に、コー
ド領域の解読フレームを変えないシグナルペプチド配列
とインターフエロンのコード領域の間のコドンを使用す
ることができる。正しい方向性は、ライゲイシヨン結合
部にまたがる挿入体をもつたクローンの塩基配列を決め
ることによつて選択する。 実施例５ pGL2BIFN ATCC 53371で形質転換されたA.
ニデユランスからの発現および分泌 プラスミドpGL2BIFNを同時形質転換した。すなわち、
米国特許出願通し番号678,578（1984年12月５日出願）
により詳しく記載されているArgB+ 遺伝子を含有するプ
ラスミドでA.ニデユランスのArgB- 菌株をarg選択マーカ
ーを含有する別のプラスミドといつしよに同時形質転換
した。ArgB+ 形質転換体を選択すると、その20個のうち1
8個が１−100のコピー数のヒトインターフエロンα−２
のコード領域を含有していた。 いくつかの形質転換体をでんぷん培地上で培養し、グ
ルコアミラーゼ・プロモーターを誘導して、セルテツク
（Cell Tech）IFα−２分析キツトを用いて、細胞外媒
質を定量してヒトIFα−２を分析した。 全ての形質転換体が、あるレベルの合成と、定量可能
なタンパク質の分泌を示した。２つのコントロール（対
照）、つまり宿主菌株（形質転換されていないもの）お
よび検出可能なヒトIFα−2DNAを持たないひとつのargB
+形質転換体については、IFα−２タンパク質の合成を
検出できなかつた。別の実験では、必要な変更を加えた
上記と同様の方法で、pGL2BIFNを用いて、A.ニデユラン
スの代りにA.ニーガーを形質転換すると、IFα−２分泌
能力を有するA.ニーガーが観察された。 プロモーターとpGL2BIFNのシグナル領域は、A.ニーガ
ー由来であるけれど、それらはA.ニデユランスおよびA.
ニーガーの両方において機能し得ることがわかる。 本発明においては、グルコアミラーゼのプロモーター
領域以外のプロモーター領域も使用できる。第1A図およ
び第1B図に示したアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子
およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータ
ー領域を使用するのが適当である。 実施例６ プラスミドpALCAIS、ATCC53368中間型ベクタ
ーの組立て 本実施例では、受託番号53169の下、宿主、E.Coli
（大腸菌）JM83に入れてATCCに保管されている10.3kbプ
ラスミドpDG6中に含まれているalcAプロモーターを使用
した。pDG6のプラスミド地図を第２図に示す。尚、alcA
プロモーターを使用するもうひとつの態様の例示を用意
にするために、ここで参照する第９図にもこのプラスミ
ドを示す。 pDG6は、このHind III−EcoR I（最初のもの）セグメ
ント中に、alcA遺伝子のプロモーター領域22および開始
コドンの３′側にあるalcAコード領域の５′部分も一部
含んでいる（エンドグルカナーゼのコード領域30と結合
している）。さらにpDG6は、C.フイミのエンドグルカナ
ーゼのコード領域20の下流に多数のクローン部位62を含
んでいる。 alcAプロモーター領域22を得るため、pDG6をPst Iお
よびXho Iで切断し、エンドグルカナーゼのコード領域
の大部分を除去した。第２の工程では、この直線化した
プラスミド64を、エキソヌクレアーゼIII（これはXho I
−切断DNA末端から切除して行くが、Pst I末端からは切
除しない）を用いる制御された方法で１方向から切除
し、次いでS1ヌクレアーゼで仕上げた。酵素がalcAATG
コドンの５′側50塩基の位置までヌクレオチドを除去
し、TATAボツクスを残し、メツセンジヤーRNAの開始部
位を無傷のまま残す様に切断を調節した。 切除した後、ベクター66を再ライゲート（再環状化）
し、プロモーター領域22のすぐ下流にSal I−Xba I制限
部位を有するベクター68を創製した。Sal I/Xba Iによ
るベクター68の切断により、ベクター内の適切な位置に
シグナルペプチドのコード領域を導入することが可能に
なる。 本実施例で用いる特定のシグナルペプチドのコード領
域を合成してヘイジン〔G.Von Heijne,Eur.J.Biochem.,
17−21（1983）〕が開示している常法に従つて同定され
る特徴あるシグナルペプチドのコード領域を作成した。
Sal I切断部位に相補的な５′側配列、およびXba I制限
配列とライゲーシヨンしうる３′側配列を供するように
この合成シグナルを設計した。 この合成分泌シグナル68の配列は以下の式で示され
る。 この分泌シグナル自身はMetで始まり、矢印で示した
４回目のAlaで終わる。 シグナルとして作用するこの合成配列68が得られたな
ら、これをベクター70のSal I−Xba I部位にクローニン
グし、alcAプロモーター領域22および合成ペプチドシグ
ナルのコード領域68を含有するプラスミドpALCA1Sを得
る。このシグナルペプチドのコード領域が多重クローニ
ング部位62の上流に挿入されているということは、この
部位62が、種々のタンパク質のコード化セグメントをこ
のプラスミド内にクローニングすることを可能にしてい
る部位であるという点で重要である。 従つて、pALCA1Sは本発明の重要な具体例である。 実施例７ プラスミドpALCA1SIFNの構築 pALCA1Sの有用性の例として、pALCA1SIFNの創製を示
す第10図について言及する。このプラスミドは、alcA遺
伝子のプロモーター領域22および合成シグナルペプチド
のコード領域68〔この両者はpALCA1S（第９図）由来で
ある〕を含有する。さらに、このプラスミドはpGL2BIFN
由来のヒトインターフエロンα−２をコードしているコ
ード領域60を含有している。 タンパク質のコード化セグメントを得るために、pGL2
BIFNをEcoR I切断し、そしてBal IIで部分的に切断する
（内部にBgl II部位が存在するので）。このタンパク質
のコード領域の挿入は、pALCA1SをBamH IおよびEcoR I
で切断し（この両者は、多重クローニング部位62中に存
在する）、そこへ該コード領域をライゲートすることに
よつて行なわれ、こうしてpALCA1SIFNが創製される。 得られたプラスミドのヌクレオチド配列、すなわちHi
nd IIIの1170ヌクレオチド下流の部位からEcoR Iまで
を、制限エンドヌクレアーゼ消化の関連部位を表示する
第11図に示す。第11図の３から、このIFα−２コード領
域60が合成シグナルペプチドのコード領域68の適切な解
読フレーム内に存在することがわかるであろう。 実施例８ プラスミドALCA1SIFNで形質転換したA.ニデ
ユランスからの発現および分泌 上記のようにして調製したプラスミドpALCA1SIFNをA.
ニデユランスといつしよにして同時形質転換してargB選
択マーカーを付与し、このargB＋形質転換体を選別し、
ヒトインターフエロンα−２のコード領域の存在につい
てチエツクし、次いでスレオニン含有培地で増殖させて
alcAプロモーターを誘起した（すべて前記実施例３と記
載と同様にして）。セル・テク（Cell Tech）IFα−２
検定キツトを用いて、この細胞外培地をヒトIF−２につ
いて検定した。形質転換体20個のうち11個が、スレオニ
ンの存在下で誘起され、そしてグルコースの存在化で抑
制されるインターフエロンの分泌を示した。 実施例９ pGL2CENDO ATCC 53372 リンカー配列“B"のかわりに合成リンカー配列“C"
（第５図）を用い、第７図で示されるpGL2BIFNに類似し
ているが、インターフエロン２コード領域のかわりにエ
ンドグルカナーゼコード領域を含有する、pGL2CENDOと
命名したベクタープラスミドを、プラスミドpGL2C ATCC
53367から、前記実施例に記載の方法に従つて構築し
た。C.フイミ（C.fimi）エンドグルカナーゼコード領域
30を含有するBamH IフラグメントをpGL2CのBgl II部位
に挿入した。A.ニデユランス形質転換体はこのベクター
プラスミドから調製され、この形質転換体はデンプン調
節性のセルラーゼ分泌を示した（実施例１の記載のよう
にして検定して）。ベクタープラスミドpGL2CENDOの地
図を添付の第12図に示すが、ここで30はエンドグルカナ
ーゼコード領域（第２図および実施例１に関連して記載
した、セルロモナス・フイミのエンドグルカナーゼコー
ド領域）を、42はグルコアミラーゼ遺伝子のシグナルペ
プチドのコード領域を、そして40はグルコアミラーゼ遺
伝子のプロモーター領域を示す。このヌクレオチド配列
を第13図に示すが、これは、リンカー配列Ｃ（第５図）
の使用によつてシグナルペプチドコード化領域42および
エンドグルカナーゼコード化領域30の解読フレームが保
持されていることを例証している。 実施例10 プラスミドpALCA1SENDO ATCC 53370の構築 前記実施例の記載の方法に従い、実施例５（第９図）
に記載したようにしてEcoR Iで直線化したプラスミドpA
LCA1Sを、プラスミドpDG5B（pUC12が逆向きであるHind
IIIフラグメントの配向を有するpDG5;第２図参照）由来
であり、かつエンドグルカナーゼコード化領域30を含有
するEcoR Iフラグメントと結合させることによつて、pA
LCA1SENDOと命名したベクタープラスミドを構築した。p
ALCA1SENDOの地図を第14図に示し、その関連領域のヌク
レオチド配列を第15図に示す。これらの図において、al
cA由来のプロモーター領域は数字22で、合成シグナルペ
プチドコード化領域は68で、そしてエンドグルカナーゼ
コード化領域は30で表示する。 実施例11 pALCA1SENDOおよびpGL2CENDOで形質転換した
A.ニデユランスからの発現および分泌 前記のようにして調製したプラスミドpALCA1SENDOま
たはpGL2CENDOおよびargB＋選別可能マーカーで、A.ニ
デユランスを同時形質転換した。得られた同時形質転換
体のうち数個が、実施例１に記載したものと同じモノク
ローナル抗体試験系およびカルボキシメルセルロースプ
レートで検定したとき、レベルの異なるセルラーゼ（す
なわちエンドグルカナーゼ）の分泌を示した。両プラス
ミドの系質転換体は、結合させたプロモーターによつて
制御される分泌を示した。プラスミドpGL2CENDOはデン
プンで誘起し、pALCA1SENDOはスレオニンで誘起した。 実施例12 pGL2CENDOで形質転換したA.ニーガーからの
発現および分泌 A.ニーガーをargB＋選別マーカーおよびプラスミドpG
L2CENDOで同時形質転換した。形質転換体のいくつかが
レベルの異なるエンドグルカナーゼの分泌を示した（実
施例１に記載のように検定して）。この分泌は培地中に
デンプンを存在させることによつて誘起した。 実施例13 増加させたコピー数の調節遺伝子 アスペルギルス・ヒデユランスにおいて適切な誘導物
質（たとえばエタノール）の存在下、alcR（alcAのため
の陽性調節遺伝子）の遺伝子産物の作用によつて、alcA
モーターを作動させる。 多重コピー形質転換体（多数のalcAプロモーターを含
有する）を有する証拠は、alcR遺伝子産物が、数個のal
cAプロモーター（刺激を必要とする）のプロモーター機
能を制限していることを示唆する。 alcR遺伝子のコピー数の増加はalcRの発現を増加さ
せ、このような状況を改善する。この証拠は以下のよう
である。 多重のalcRという状況下（alcRメツセンジヤーRNAを
過剰生産することがわかつている）では、それ自身のコ
ード領域（ADH I）と融合した多重コピーalcAプロモー
ターを有する形質転換体は、エタノール上では十分に増
殖しないい。これは、おそらくエタノールのADH分解の
産物であるアルデヒドの急速な蓄積によるものであろ
う。これらの菌株中のADH活性は高い。コピー数の増加
によりADH活性が増加したというのが、おそらくこれら
の観察結果の説明となろう。 多重alcRという状況下では、インターフエロンα−２
と融合した多重コピーalcAプロモーターを有する形質転
換体は、かなり高レベルの分泌インターフエロンを産生
する。これらの菌株においては、単一コピーalcRを有す
る菌株と異なり、より多数のalcAプロモーターがalcR調
節タンパク質を利用することができる。 すなわち、本発明の好ましい態様は、形質転換された
ときには所望のタンパク質を分泌するであろう糸状菌類
宿主に、コード領域を導入するための手段を提供するも
のである。この目的のための特に有用な中間型プラスミ
ドはpALCA1SおよびpGL2（Ａ、ＢまたはＣ）である。 これらのプラスミドから創製された有用な形質転換ベ
クターには、pALCA1SIFN、pGL2BIFN、pALCA1SENDOおよ
びpGL2CENDOが含まれる。これらのプラスミドおよび本
明細書に挙げたその他のプラスミドそれぞれの培養物
は、現在永久生存しうる状態でアレリツクス社（Alleli
x Inc.,6850 Goreway Drive,Mississauga,Ontario,Cana
da）の研究室に保管されている。これらのプラスミド
は、本特許出願が継続している間じゆうこの状態で保管
し、許可を与えられた者が利用できるようにする。本出
願について特許が付与された後は、ブダペスト条約に基
づいて認められたATCC寄託機関から制限されることなく
利用することができるようにする。寄託物およびそれぞ
れの受託番号を以下の表に挙げる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:66） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３３６９ (72)発明者 バクストン，フランシス・ポール カナダ国オンタリオ、トロント、インデ ィアン・ロード727番 (72)発明者 ピケット，マーク・ハドソン カナダ国オンタリオ、ブランプトン、ア プト 1105、ナイツブリッジ・ロード３ 番 (72)発明者 デイビス，ロジャー・ウェイン カナダ国オンタリオ、ライムハウス、ア ール・アール ナンバー１番 (72)発明者 スカゾキオ，クロディオ フランス国ビュール・シュール・イベッ ト 91440、リュ・ドゥ・ロワヨーム 14、パルク・ドゥ・ビュール６番 (56)参考文献 特表 昭59−501694（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ．Ｊ．，1984［３］ Ｐ. 1581−1586 Ｇｅｎｅ，1985［33］ Ｐ．137−149

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．アスペルギルス遺伝子由来の、アスペルギルスの構
    造遺伝子の上流に位置する少なくとも約800ヌクレオチ
    ドからなる誘導性プロモーター及び、そのプロモーター
    にとって外来性であるポリペプチドをコードする、その
    プロモーターと作動可能に連結されたDNAフラグメント
    を含有するDNA構築物。 ２．該プロモーターがアスペルギルス・ニデュランスの
    遺伝子由来のものである、請求項１に記載のDNA構築
    物。 ３．該プロモーターが、以下に示すアスペルギルス・ニ
    デュランスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子； 由来のものであるか又は以下に示すアルデヒドデヒドロ
    ゲナーゼ遺伝子； 由来のものである、請求項２に記載のDNA構築物。 ４．該プロモーターがアスペルギルス・ニーガーの遺伝
    子由来のものである、請求項１に記載のDNA構築物。 ５．該プロモーターが、以下に示す配列を含む、アスペ
    ルギルス・ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子由来のも
    のである、請求項４に記載のDNA構築物。 ６．該ポリペプチドがアスペルギルスにとって外来性で
    ある、請求項１から請求項５までのいずれかに記載のDN
    A構築物。 ７．さらにシグナルペプチドをコードするDNAフラグメ
    ントを有し、該シグナルペプチドをコードするDNAフラ
    グメントが該プロモーターとポリペプチドをコードする
    該DNAフラグメントとの間に存在することを特徴とする
    請求項１に記載のDNA構築物。 ８．該シグナルペプチドが該ポリペプチドに本来のもの
    である請求項７に記載のDNA構築物。 ９．該シグナルペプチドが該プロモーターに本来のもの
    である請求項７に記載のDNA構築物。 １０．該シグナルペプチドが該プロモーター及び該ポリ
    ペプチドにとって外来性である請求項７に記載のDNA構
    築物。 １１．アスペルギルス遺伝子由来の、アスペルギルスの
    構造遺伝子の上流に位置する少なくとも約800ヌクレオ
    チドからなる誘導性プロモーター及び、そのプロモータ
    ーにとって外来性であるポリペプチドをコードする、そ
    のプロモーターと作動可能に連結されたDNAフラグメン
    トを含有するDNA構築物を含有する形質転換されたアス
    ペルギルス株。 １２．DNA構築物の多重コピーを含有する請求項11に記
    載の形質転換されたアスペルギルス株。 １３．請求項11又は請求項12に記載の形質転換されたア
    スペルギルス・ニデュランス株。 １４．請求項11又は請求項12に記載の形質転換されたア
    スペルギルス・ニーガー株。
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