CN114989268A - 一种植物病毒移动蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病毒疫苗构建的技术领域，尤其涉及一种植物病毒移动蛋白及其应用，该移动蛋白为P3a蛋白，来源于MaYMV，用于编码MaYMV的一个蛋白，该移动蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1。本发明首次研究得出P3a具有影响病毒细胞间移动的功能，将P3a构建到病毒内，替换病毒本身的运动蛋白，可以促进病毒在细胞间移动，利用此功能将其应用在植物病毒疫苗，有利于促进疫苗在植物细胞间有效扩散，增强疫苗的保护作用，达到更好的免疫的目的。

Description

一种植物病毒移动蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及植物病毒疫苗构建的技术领域，具体涉及一种植物病毒移动蛋白及其应用。

背景技术

植物病毒病是由植物病毒寄生引起的病害，植物病毒必须在寄主细胞内营寄生生活，专化性强，它们大多数是由单一种外壳蛋白组成形态大小相同的亚基，多个亚基组成外壳，外壳内含有携带其全部基因的病毒核酸。植物病毒的种类很多，例如常见的烟草花叶病毒、郁金香碎色花病毒、大蒜E病毒等。

植物不仅具有免疫系统，而且和动物的免疫系统非常类似，同时具有内源性免疫和系统获得性免疫。既可以产生对植物病毒或其他致病源的本底抗性，也可以根据入侵者的形态添加新的免疫物质来应对未知的刺激。因此，通过生物诱抗激发植物自身防御体系的抗病、抗虫的植物免疫诱抗药物已成为生物源农药开发的新热点，它们的功能类似医用和兽用疫苗，因此也称之为植物疫苗。

目前，关于植物疫苗方面的研究，大多应用病毒的弱毒株系接种植物，利用交叉保护作用，弱毒株系侵染寄主后，寄主启动免疫反应，防止同属致病病毒对寄主造成侵染危害，抵御病毒侵染。但病毒的弱毒株系不够稳定，安全性不够，易使弱毒株系变成具有致病作用的毒株。

ShaChen等人于2016年在Viruses杂志上发表的一篇题为“CharacterizationofaNovelPolerovirusInfectingMaizeinChina”的文章，披露了一种新型病毒——玉米黄花叶病毒MaYMV，该MaYMV病毒侵染玉米导致玉米产生矮化、黄化症状，严重影响了玉米的产量和品质。目前，在我国的云南、贵州、安徽等地均检测到了MaYMV危害玉米，MaYMV在东非等国家也有发生危害。

P3a基因是已经研究过的源于玉米黄花叶病毒(MaYMV)，用于编码MaYMV的一个蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。目前，关于P3a基因的功能开发较少，其在疫苗领域的开发目前尚处空白，本发明正是基于该基因开发了一种能够将P3a应用在植物病毒疫苗开发中，以提供一种P3a基因在构建植物病毒疫苗中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物病毒移动蛋白及其应用，以利用P3a蛋白具有携带病毒在寄主细胞间移动的功能，通过它改造病毒，使得病毒具有增强在植物细胞间扩散的功能，构建病毒的疫苗。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种植物病毒移动蛋白，该移动蛋白为P3a蛋白，来源于玉米黄花叶病毒(MaYMV)，用于编码MaYMV的一个蛋白，该移动蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示，全长135bp。

本发明还提供了上述植物病毒移动蛋白在用于携带植物病毒在寄主细胞间移动中的应用。

本发明还提供了上述植物病毒移动蛋白在构建植物病毒疫苗中的应用，P3a具有影响病毒移动的功能，将P3a替换病毒弱毒株系的运动蛋白，可以促进病毒弱毒株系在寄主细胞间扩散，起到增强疫苗的保护作用。

本发明还提供了一种植物疫苗，所述植物疫苗为由P3a蛋白与含有运动缺陷型载体的疫苗病毒进行互补构建获得，利用P3a蛋白代替疫苗病毒株系中的运动蛋白，通过P3a蛋白携带疫苗病毒在寄主细胞间扩散。

作为本发明的进一步优化方案，所述疫苗病毒为烟草花叶病毒疫苗、郁金香碎色花病毒疫苗、大蒜E病毒疫苗，但不限于此。

本发明的有益效果在于：

本发明研究得出P3a具有影响病毒细胞间移动的功能，将P3a构建到病毒内，替换病毒本身的运动蛋白，可以促进病毒在细胞间移动，利用此功能将其应用在植物病毒疫苗，有利于促进疫苗在植物细胞间有效扩散，增强疫苗的保护作用，达到更好的免疫的目的。

附图说明

图1为P3a与TVCV运动缺陷载体互补试验，图中PMMoV MP是阳性对照，GUS是阴性对照；

图2为共聚焦荧光显微镜观察P3a在细胞间的扩散情况，图中DIC表示明场、Merge表示叠加。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1P3a基因序列的获得

取感染玉米黄花叶病毒的活体玉米植株，利用RNA提取试剂盒提取感病植株的叶片总RNA，并将RNA反转录成cDNA，利用引物F：CATACCATTTACGAACGATAGGTCGACATACAGAAGCTTCGAAGATAGC和R：GTCGTGGTCCTTATAGTCGTCGACCCTCCCGTATTCATTCACAAT，以cDNA为模板扩增P3a基因，将扩增获得的P3a基因连接到带有Flag标签的pUC19-2X35S-3XFLAG载体上，构建获得带有Flag标签的植物表达载体，送去上海生工生物工程技术服务有限公司，测序P3a基因序列如SEQ ID NO.1所示。

利用引物GUS-F:CGCCATGGACGACAAGACCGTCACC ATGTTACGTCCTGTAGAAAC，GUS-R:GAGGTCACCGGAGAAGAGCCGTCGCGCGTGGTTACAGTCTTGCG，以本氏烟草cDNA为模板扩增GUS基因，上述扩增反应程序如下：第一步预变性94℃3min；第二步变性94℃30s，打开双链；第三步退火58℃30s使特异性引物结合至双链；第四步延伸温度为72℃，按照1kb/min设置延伸时间；根据扩增量的需要从第二步到第四步设置30个循环数，最后72℃稳定10min获得稳定的PCR产物。

2.2构建表达载体

利用带有酶切位点的引物P3a-F’：CATGCCATGGATACAGAAGCTTCGAAGATAGC，P3a-R’：CTGGTCACCCTTATCGTCATCGTCTTTG，以P3a基因片段为模板进行扩增，获得带有酶切位点的P3a片段，利用NcoI和BstEII双酶切P3a片段和植物表达载体pCambia3301，并将P3a片段连接到pCambia3301载体的35S启动子后，构建35S-P3a植物表达载体。

利用带酶切位点的引物GUS-F’：CGCCATGGACGACAAGACCGTCACCATGTTACGTCCTGTAGAAAC，GUS-R’：GAGGTCACCGGAGAAGAGCCGTCGCGCGTGGTTACAGTCTTGCG，以GUS基因片段为模板进行扩增，获得带有酶切位点的GUS片段，利用NcoI和BstEII双酶切GUS片段和植物表达载体pCambia3301，并将GUS片段连接到pCambia3301载体的35S启动子后，构建35S-GUS植物表达载体。

利用引物P19-F：CCCATGGGATGGAACGAGCTATACAAGG，P19-R：GGGTAACCCTTACTCGCTTTCTTTTTCGA，以番茄丛矮病毒的cDNA为模板扩增P19序列，P19序列具体如SEQ ID NO.3所示。利用NcoI和BstEII双酶切P19序列和植物表达载体pCambia3301，并将P19序列连接到pCambia3301载体的35S启动子后，构建35S-P19植物表达载体。P19序列是沉默抑制子，可以与35S-P3a，35S-GUS瞬时共浸润，用于增强P3a和GUS的表达强度和持续时间。

2.3构建携带GFP的运动缺陷型载体芜菁脉明病毒(TVCV-ΔMP-GFP)

按照Krin S.et al.Cytorhabdovirus P3genes encode 30K-like cell-to-cellmovement proteins，Virology，489(2016)20-33.2.4文献中的方法构建TVCV-ΔMP-GFP。

2.4转化

将35S-P3a，35S-GUS，35S-P19和TVCV-ΔMP-GFP分别电击转化至农杆菌感受态GV3101，涂布平板，28度培养2-3天；挑取单克隆至含利福平和庆大霉素抗性的培养基，28度摇床培养12-16小时，收集菌体，并用瞬时转染液(10mM MgCl2、10mM MES，pH5.6和200μM乙酰丁香酮)重悬，分光光度计测定OD值使其终浓度为35S-P3a(OD600＝0.5)，35S-GUS(OD600＝0.5)，35S-P19(OD600＝0.3)和携带GFP的运动缺陷型载体芜菁脉明病毒(OD600＝0.005)。

2.5荧光共聚焦观察

将35S-P3a+35S-P19+TVCV-ΔMP-GFP组合浸润本氏烟草，以35S-GUS+35S-P19+TVCV-ΔMP-GFP作为阴性对照，以辣椒轻斑驳病毒移动蛋白PMMoV MP代替P3a蛋白作为阳性对照，5-6d荧光共聚焦下观察GFP的在细胞间的扩散情况。辣椒轻斑驳病毒移动蛋白PMMoVMP的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。结果如图1、2所示，发现P3a组的绿色荧光能够携带TVCV病毒从一个细胞扩散到另一个细胞，而GUS绿色荧光只局限在一个细胞内，说明P3a具有携带病毒在细胞间扩散的功能。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种植物病毒移动蛋白及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> 玉米黄花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus)

<400> 1

atagattgga aactcttttg cggggttctc atagggatcc tcgttgctgt ccctgtaacc 60

atctttggct tgtacaagat ctacctatct atctcctcga acgtgcgttc aattgtgaat 120

gaatacggga ggtag 135

<210> 2

<211> 1792

<212> DNA

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 2

cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca ttcagtctgg atcgcgaaaa 60

ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa gaaagccggg caattgctgt 120

gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt cgtaattatg cgggcaacgt 180

ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca ggccagcgta tcgtgctgcg 240

tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat aatcaggaag tgatggagca 300

tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg tatgttattg ccgggaaaag 360

tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg cagactatcc cgccgggaat 420

ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac ttccatgatt tctttaacta 480

tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg aacacctggg tggacgatat 540

caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg tctgttgact ggcaggtggt 600

ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat caacaggtgg ttgcaactgg 660

acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac ctctggcaac cgggtgaagg 720

ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca gagtgtgata tctacccgct 780

tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag ttcctgatta accacaaacc 840

gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac ttgcgtggca aaggattcga 900

taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg attggggcca actcctaccg 960

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ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct ttaggcattg gtttcgaagc 1080

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ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa 1440

agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt 1500

ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg 1560

tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca 1620

ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa 1680

gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg 1740

ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaat ga 1792

<210> 3

<211> 519

<212> DNA

<213> 番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus)

<400> 3

atggaacgag ctatacaagg aaacgacgct agggaacaag ctaacagtga acgttgggat 60

ggaggatcag gaggtaccac ttctcccttc aaacttcctg acgaaagtcc gagttggact 120

gagtggcggc tacataacga tgagacgaat tcgaatcaag ataatcccct tggtttcaag 180

gaaagctggg gtttcgggaa agttgtattt aagagatatc tcagatacga caggacggaa 240

gcttcactgc acagagtcct tggatcttgg acgggagatt cggttaacta tgcagcatct 300

cgatttttcg gtttcgacca gatcggatgt acctatagta ttcggtttcg aggagttagt 360

atcaccgttt ctggagggtc gcgaactctt cagcatctct gtgagatggc aattcggtct 420

aagcaagaac tgctacagct tgccccaatc gaagtggaaa gtaatgtatc aagaggatgc 480

cctgaaggta ctgagacctt cgaaaaagaa agcgagtaa 519

<210> 4

<211> 774

<212> DNA

<213> 辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus)

<400> 4

atggcgttag tagtcaagga tgacgttaag atttctgagt tcatcaattt gtctaccgct 60

gagaaattct tacctgctgt tatgacttcg gtcaagacgg tacgaatttc gaaagttgac 120

aaagtgattg caatggaaaa cgattcgtta tccgatgtag atttgcttaa aggtgttaag 180

cttgttaaag atggttatgt gtgtttggca gggttagttg tgtccgggga gtggaaccta 240

ccggacaact gcagaggtgg agtaagcgtt tgtttggttg acaagagaat gcaaagagat 300

gacgaagcaa cacttggatc ttatagaacc agtgcggcta agaaacgatt tgccttcaaa 360

ttgatcccga attatagcat tactaccgcc gatgctgaga gaaatgtttg gcaagtttta 420

gttaatatta gaggtgttgc catggaaaag ggtttctgtc ctttatcttt ggagtttgtc 480

tcagtttgta ttgtacacaa atccaatata aaattaggct tgagagagaa aattactagt 540

gtgtcggaag gaggacccgt tgaacttaca gaagcagttg ttgatgagtt catcgaatca 600

gttccaatgg ctgacagatt acgtaaattt cgcaatcaat ccaagaaaag aagtaataag 660

tatgtaggta agagaaatga taataagggt gtgaataagg aaaggaagct gtttgataag 720

gttagaattg ggcagaactc ggagtcatcg gacgccgagt cttcttcgtt ttaa 774

Claims (5)

1.一种植物病毒移动蛋白，其特征在于，该移动蛋白为P3a蛋白，来源于MaYMV，用于编码MaYMV的一个蛋白，该移动蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的植物病毒移动蛋白的应用，其特征在于，所述P3a蛋白作为植物病毒移动蛋白，用于携带植物病毒在寄主细胞间移动。

3.根据权利要求2所述的植物病毒移动蛋白的应用，其特征在于，P3a具有影响病毒移动的功能，将P3a替换病毒弱毒株系的运动蛋白，构建植物病毒疫苗，可促进病毒弱毒株系在寄主细胞间扩散，起到增强疫苗的保护作用。

4.一种植物疫苗，其特征在于，所述植物疫苗为由如权利要求1所述的植物病毒移动蛋白与含有运动缺陷型载体的疫苗病毒进行互补构建获得，利用P3a蛋白代替疫苗病毒株系中的运动蛋白，通过P3a蛋白携带疫苗病毒在寄主细胞间扩散。

5.根据权利要求4所述的一种植物疫苗，其特征在于，所述疫苗病毒为烟草花叶病毒疫苗、郁金香碎色花病毒疫苗、大蒜E病毒疫苗。

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