JP5913434B2 - 植物における異種タンパク質の改善された発現のための、5’(5’−utr)における最適化されたリーダー機能を有する人工dna配列 - Google Patents
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Description
(1)効率的なmRNAキャッピングのための、CaMV35Sプロモーターの転写開始部位(Inr);
(2)TMVリーダーΩに存在する翻訳エンハンサーと同様のpoly(CAA)領域;
(3)多くの植物リーダーと同様のCTエレメントリッチ配列。
a)人工合成;
b)自然又は人工の配列内における、自然又は誘導される組み換え又は突然変異;
により得ることができる。
− 組織特異的プロモーター、特に種子特異的プロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞;
− 誘導可能なプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞;
− フェーズ依存的転写活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞;
− 葉緑体で活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞;
− ミトコンドリアで活性を有するプロモーターの制御下にある、本発明に係る配列を含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
− バイオテクノロジーによる分子の生産;
− 組み換えタンパク質の合成;
− ウイルス性、細菌性又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成;
− 除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質の合成;
− 原料とそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成;
− 原料とそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質の合成;
− 燃料、ゴム及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質の合成;
− 工業用酵素と商業用タンパク質の合成;
− 医薬用タンパク質の合成;
− ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチンの合成;
− ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンの合成;
− 好ましくはイディオタイプ特異的でリンパ系腫瘍の治療に用いられる、患者特異的で注射可能なワクチンの合成;
− 二次代謝産物の生成に関わるタンパク質の合成;及び
− 形質転換細胞を同定及び/又は選抜する因子として、直接的又は間接的に用いられるタンパク質の合成。
本発明のこれら及び他の特徴は、以下、添付図面を参照しつつ、数例の好ましい実施形態の説明により明らかとなるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
10×Pfuバッファー(15mM Mg2+含有):10μL
配列番号2 プライマー[10μM]:2μL
配列番号3 プライマー[0.1μM]:2μL
配列番号4 プライマー[0.1μM]:2μL
配列番号5 プライマー[0.1μM]:2μL
配列番号6 プライマー[0.1μM]:2μL
配列番号7 プライマー[10μM]:2μL
Pfu DNAポリメラーゼ[3U/μL]:0.8μL
dNTP[各2.5mM]:4μL
最終量100μLになるよう水を加える。
LL−TCK配列又は同様に構成された5’−UTRに、可能なフランキング領域又は分子フックを付加することにより、異なる種類の発現ベクターにおける広範囲のクローニングの解決法を提供する。本実施例においては、pBI121(GenBank受託番号AF485783)中の[EcoRV−XbaI]断片の代わりに、実施例1の[EcoRV−XbaI]断片をクローニングするのに用いる方法を説明する。pBI121はCaMV35Sプロモーター内部の外に複数のEcoRV部位を有するため、HindIIIとXbaIの制限酵素の使用によって後者のプロモーターをpBI121(クロンテック)から切り出した(非特許文献15)。
LL−TCK又は同様に構成された5’−UTRを含むトランスジェニック植物は、Agrobacterium spp.人工株による重感染、フィトウイルス人工株による感染又はトランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子を用いた導入、DNAマイクロインジェクションを含む一連の方法によって作出できる。
フォワード 5’−ACAATTACGTATTTCTCTCTCTAGA−3’
リバース 5’−CGATCGGGGAAATTCGAGCTC−3’
サイクル:1×(94℃、5分間);40×(94℃、1分間15秒間;60℃、45秒間;72℃、2分間);1×(72℃、5分間)。
前記の通り、pBI121プラスミドとpSTARTプラスミドのそれぞれを、アグロバクテリウムを介したタバコリーフディスクの形質転換に用いた。いずれの場合にも、制御される遺伝子はuidA(gusAとしても知られる)であるため、LL−TCKと広く普及したpBI121リーダーとで得られる導入遺伝子の発現レベルは、uidAがコードするβ−グルクロニダーゼ(EC3.2.1.31)酵素活性の測定により直接的に比較することができる。各個体群から約20個体の第一の形質転換体(第一世代T1に属するトランスジェニック植物体)についてPCRにより導入遺伝子の有無をアッセイし、続いてβ−グルクロニダーゼ活性を解析した(図2)。ロゼット後期に達したら(硬化30日)各植物体から最も若い葉3枚を採取し、押しつぶすことにより粗サップを得た(エリッヒ・ポレーネ);粗サップ(100μL)を、高分子ポリビニルピロリドン(PVP)(12mg)を含む2容量の抽出液(Jefferson 1989(非特許文献20))と混合した。11,500×gで15分間遠心分離した後、上清を集め、4−メチルウンベリフェリル−β−D−グルクロニド(MUG;シグマアルドリッチ(Sigma−Aldrich))を基質に用いて2回蛍光定量的に解析した(Dyna Quant200フルオロメーター;GEヘルスケア(GE Healthcare))。サンプルの内因性蛍光、消光及び組み換え酵素以外の要因による基質の分解によるバックグラウンドノイズを測定するための試行を行った。導入遺伝子発現レベルを、粗サップ1mL当たりのβ−グルクロニダーゼユニットとして測定した。1ユニットは前記(非特許文献20)と同じアッセイ条件を用いた際、1分間当たり1nMの4−メチルウンベリフェロン(4−MU)を放出する酵素量によって定義された。分散と平均との間の相互関連を避けるため、データをログ変換して提供した。コロモゴロフ−スミルノフテストによってログデータ分散の正規性を、バートレット検定式によって分散の均一性をチェックした後、分散分析を行った。ダンカンの多重範囲検定法により確率水準P=0.05で平均を比較した。
LL−TCK又は同様に構成された5’−UTRにおける、異なるエレメントの組合せは、得られた導入遺伝子の翻訳効率だけでなく、転写における測定可能な改善として反映される。本実施例においてこの様な改善は、前述の通りpBI121とpSTARTで得られたT2タバコトランスジェニック植物体において観察される。その証拠を集めるため、pBI121群又はpSTART群に属する植物体(それぞれ10個体と13個体のT2)を中間uidA発現レベルによって特徴付け、次のことを決定するため解析した。
i.uidAの平均転写レベル;
ii.18S RNAの平均転写レベル;及び
iii.実際に生産されたβ−グルクロニダーゼの量。
プログラム:1×(95℃、10分間);50×(95℃、15秒間;62℃、30秒間;72℃、30秒)。
uidA転写産物を増幅するため、次のプライマーを用いた:
フォワード 5’−TTACGCTGAAGAGATGCTCGAC−3’
リバース 5’−CCTAAAGAGAGGTTAAAGCCGACAG−3’
フォワード 5’−ACATCCAAGGAAGGCAGCAG−3’
リバース 5’−GACTCATAGAGCCCGGTATTGTTATT−3’
Claims (17)
- 植物における異種タンパク質の発現を改良するのに適した5’−UTRリーダー領域の人工DNAであって、少なくとも一つのpoly(CAA)領域及び単一コピーのACAATTACオクタマーを含み、該poly(CAA)領域は、該オクタマーに対して5’位置に配されたCAAの9回繰返しを含み、前記ACAATTACオクタマーは、該オクタマーとpoly(CAA)領域との結合によって得られる調節エレメントの3’末端に付加された(CT)4エレメントを含む少なくとも一つのpoly(CT)領域と組合せられており、
前記5’−UTRリーダー領域が、43ヌクレオチド以上200ヌクレオチド以下の長さを有する、5’−UTRリーダー領域の人工DNA。 - 前記5’−UTRリーダー領域が、前記人工DNAと、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの転写開始部位であるCaMV35SのInr部位との組合せを含む、請求項1に記載の人工DNA。
- 配列番号1に示される配列を含む、請求項1又は2に記載の人工DNA。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の配列に相補的な配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の人工DNA。
- 前記5’−UTRリーダー領域が、43ヌクレオチド以上150ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の人工DNA。
- 前記5’−UTRリーダー領域が、60%未満のG+C含量を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の人工DNA。
- 前記5’−UTRリーダー領域が、50%未満のG+C含量を有する、請求項6に記載の人工DNA。
- 5’−UTR領域に存在する請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含む、5’−UTRの植物発現ベクター中の構築物。
- Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens、又はAgrobacterium rhizogenesの種に属する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含むプラスミドを有する細胞株。
- 宿主生物に関係なく、請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含む人工ウイルス株。
- 構成プロモーター若しくは組織特異的プロモーターの制御下にある請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含む発現ベクターで形質転換した植物細胞。
- 前記組織特異的プロモーターが、種子特異的プロモーター、誘導可能なプロモーター、フェーズ依存的転写活性を有するプロモーター、葉緑体において活性を有するプロモーター、ミトコンドリアにおいて活性を有するプロモーターからなる群より選択される、請求項11に記載の植物細胞。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含む発現ベクターで安定的に形質転換した植物であって、メッセンジャーRNAが前記5’−UTRリーダー領域を含むいずれかのタンパク質を一過的に発現することを特徴とし、一過的な発現がウイルスベクター、アグロ浸潤法、粒子を用いた導入法、エレクトロポレーションにより該タンパク質の生産を発現する、植物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAを含む発現ベクターで安定的に形質転換した植物若しくはその後代。
- バイオテクノロジー上の分子生産のため、若しくは
−組み換えタンパク質、
−ウイルス性、細菌性、又は真菌性の病原体に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質、
−除草剤に対する抵抗性を誘導することを目的とする組み換えタンパク質、
−原料及びそれに由来する製品において脂肪酸の組成を変えることを目的とする組み換えタンパク質、
−原料及びそれに由来する製品において栄養価を変えることを目的とする組み換えタンパク質、
−燃料、ゴム、及びバイオプラスチックの生産を目的とする組み換えタンパク質、
−工業用酵素及びタンパク質商品、
−医薬用タンパク質、
−ヒト又は動物を対象とする経口投与ワクチン、
−ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチン
の合成のための、請求項1〜7のいずれか1項に記載の人工DNAの使用。 - 前記ヒト又は動物を対象とする注射可能なワクチンが、患者特異的、イディオタイプ特異的で、リンパ系腫瘍の治療に用いられる、請求項15に記載の人工DNAの使用。
- 前記タンパク質が、二次代謝産物の生成に関わるタンパク質、若しくは形質転換細胞を同定及び/又は選択する因子として直接的又は間接的に使用可能なタンパク質である、請求項15に記載の人工DNAの使用。
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