CN101270367A - 家蚕丝腺生物工厂的建立方法及其制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，以转座子piggyBAC因子为基础载体，通过基因工程操作构建带有家蚕丝蛋白特异性启动子控制外源基因表达盒、增强子活性的元件、抗生素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体，与辅助质粒作混合，导入初产卵，孵化后的蚁蚕连续添食特定抗生素至4龄眠，获得抗特定抗生素、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。利用该转基因家蚕的丝腺组织可获得药用蛋白药物。本发明方法实现转基因家蚕丝腺工厂制备药用蛋白药物，生产成本低，不涉及具有潜在危害的杆状病毒，安全性高，具有重要的实施价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种家蚕丝腺工厂的建立方法及其在多肽类药物制备领域的用途。
背景技术
生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。转基因动物生产的蛋白经过后加工而类似人体天然蛋白的结构，有完全相似的生物活性，用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。
转基因动物生物反应器生产药用蛋白的一种技术路线是，将目的基因构建成载体，通过不同方法获得转基因动物，通过转基因动物的特定器官收集并提纯药用蛋白，目前以乳腺生物反应器较为多见，已成功地在转基因动物的乳腺生物反应器中表达了多种蛋白基因。
家蚕是一个理想的生物反应器，具有表达水平高、翻译后加工与修饰、安全性高、成本低廉等优势，已经成为某些真核生物所不可替代的表达系统。家蚕丝腺是典型的外分泌腺体。它是由功能高度特化为合成、分泌丝蛋白的巨核细胞所构成的单层细胞管壁的管状器官。丝腺合成并分泌到丝腺腔里的蛋白共两类，即丝素蛋白与丝胶蛋白。丝素蛋白在后部丝腺合成，有重链、轻链和P25三种蛋白分子以6∶6∶1的比例构成，难溶于水(Cong-Zhao Zhou，et al.NucleicAcids Reasearch，2000，28(12)：2413-2419；Inoue S，et al.J Biol Chem，2000，275(51)：40517-28)。由于丝腺具有强大的生产蛋白质和分泌蛋白质的能力，而且丝腺腔中只含有丝素蛋白和丝胶蛋白，其性质比较特殊，很容易与其他目的蛋白质分开，将对后分离纯化带来极大方便，这一优点将是已有的表达系统所不及的。因此，利用家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源高价值蛋白具有实用经济效益和广阔的发展前景。
公开号为CN1786176的中国专利《家蚕丝腺生物反应器及其构建方法》公开了一种家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，通过构建由含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目的基因、含有丝胶-1基因polyA信号位点序列的表达框构成的丝腺特异分泌表达质粒，再将表达框架亚克隆进病毒表达系统的供体质粒，然后转化DH10BacΔEGT感受态细胞，抽提重组病毒DNA，导入载体细胞包装成重组病毒质粒，大量扩增病毒，最后注射家蚕，当病毒在蚕体大量繁殖，复制的时候，外源基因在启动子的控制下得到表达和后加工。
上述现有技术的特点是利用昆虫病毒表达系统表达外源基因，该系统的缺点是存在病毒的潜在危害。
公开号为CN1912116的中国专利，利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法公开了一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法，以piggyBac的衍生载体pBac[3xp3-DsRedaf]为转座子，构建携带IGF-I基因且可进行表达的重组注射载体pBac[3XP3-DsRedaf]-R3，经QIAGEN Plasmid Midikit(Qiagen)试剂盒纯化，与pHA3PIG(Tamura et al.，2000)辅助质粒一起，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显微注射。注射后的蚕卵用无毒胶封口，催青孵化，将当代的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体。
该专利所公开的方法中没有使用病毒表达系统，所以不存在杆状病毒可能带来的问题。
piggyBAC因子又称IFP2，是目前应用比较广泛的昆虫转座子，已被证实在多种昆虫中可以发挥转座作用，可以通过转座而将外源基因重组整合到昆虫基因组中。
通常情况下，通过抗生素压力筛选可以获得稳定表达外源基因的转基因个体。运用G418筛选哺乳动物转化细胞已有较多的报道，而通过稳定转化的昆虫细胞表达外源基因的报道还不多见，而通过G418筛选转基因家蚕个体研究更少。最近，Invitrogen公司开发了一种能在昆虫sf细胞稳定表达外源基因的载体pIZT/V5-His，该载体通过Zeocin的抗性标记筛选可获得稳定表达外源基因的细胞系，而通过Zeocin抗生素对转基因家蚕的筛选方法也未见报道。
鉴于家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源高价值蛋白具有实用经济效益和广阔的发展前景，研发一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法具有重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，在丝腺组织特异性表达外源蛋白，以避免采用杆状病毒载体可能带来的问题。
本发明进一步的目的是提供含有表达的外源蛋白的药物的制备方法，以简化工艺，降低制备成本。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法，包括以下步骤：
(1)构建带有家蚕丝腺特异性表达基因的启动子X控制外源蛋白基因表达盒；
(2)构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有荧光蛋白报告基因的载体pigA3-en；
(3)双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的pigA3-en，得带有增强子en和启动子控制外源基因的载体；
(4)构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制抗生素抗性基因的重组载体；
(5)酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制抗生素抗性基因的片段，克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有启动子X控制外源基因表达盒、增强子元件、抗生素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体；
(6)步骤(5)所得重组转基因载体，在辅助质粒的作用下，利用精子介导法导入初产卵，孵化，筛选获得带有抗生素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。
上述技术方案中，所述家蚕丝腺特异性表达基因启动子X选自丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白轻链基因启动子、丝胶蛋白-1基因启动子或P25基因启动子中的一种。所述外源蛋白基因可以是药用蛋白基因，如人胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因；也可以是抗原蛋白基因。所述的增强子en选自家蚕丝素蛋白轻链基因第一内含子序列、杆状病毒的同源区(homologous region)增强子序列中的一种。所述昆虫细胞内具有活性的启动子Y为家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子。所述的荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因中的一种。所述的抗性基因可以为新霉素抗性基因neo。
上述技术方案中的步骤(6)中所述的精子介导法是一种常用的向蚕卵导入外源基因的方法，本发明中的家蚕品种为菁松品种，正常饲养至化蛾，将步骤(5)所得的转基因载体与辅助质粒混合，用毛细管注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵。步骤(6)中所述的筛选方法是抗生素筛选与荧光检测结合，具体步骤为：孵化步骤(6)所得的初产卵，孵化后的蚁蚕(G0)连续添食特定抗生素，G418或者Zeocin至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出具有抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕。抗生素G418的作用不仅仅是筛选，还可以防止所导入家蚕基因组的外源基因在继代过程中丢失。
上述技术方案中，增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。增强子的作用同增强子的取向无关，甚至远离靶基因达几千kb也仍有增强作用，本发明的技术方案中构建的转基因载体带有增强子，提高了外源基因表达的水平。
为实现本发明进一步的目的，采用的技术方案是，一种含有外源蛋白的药物制备方法，采用上述技术方案获得的转基因家蚕的丝腺经冷冻干燥后制成药物。
或者，一种含有人类药用蛋白的药物制备方法，采用上述技术方案获获得的转基因家蚕进行蚕种繁殖，将获得的家蚕的丝腺经冷冻干燥后制成药物。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明通过采用piggyBAC转座子可以获得丝蛋白基因启动子控制外源基因，并在丝腺组织特异性表达的转基因家蚕，用转基因家蚕丝腺生产的外源蛋白制备成口服制剂有明确的药效。
2.本发明由于采用转基因家蚕制备药物，获得的药物中不会有杆状病毒残留，生物安全性高。
3.本发明获得的转基因家蚕可以进行育种繁殖，与普通家蚕一样饲养，用于制药时，制备工艺简单，成本低。
4.本发明所获的转基因家蚕带抗生素抗性基因，可以防止所导入家蚕基因组的外源基因在继代过程中丢失问题。
5.本发明在所构建的重组转基因载体中导入了增强子元件，可提高外源基因的表达水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：丝胶蛋白基因启动子-1控制人胰岛素样生长因子-I基因的转基因家蚕的制备
技术操作过程如下：
1.人胰岛素样生长因子-I基因的制备
根据业已公开的人胰岛素样生长因子-I基因的cDNA序列(GenBank登录号M11568)，按常规人工合成人胰岛素样生长因子-I活性肽对应的DNA序列：
TGGATATCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcagttcgtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaagcctgccaagtcagctTAAGCTTCTCGAGAT
为了便于克隆表达，在5′端引入起始密码子ATG和EcoR V的酶切位点，3′端引入终止密码子TAA和Xho I的酶切位点。
2.构建带有人胰岛素样生长因子-I基因的pBluescriptII SK(+)重组质粒
将人工合成的DNA序列用EcoR V和Xho I双酶切，常规法回收酶切片段，与用EcoR V和Xho I双酶切的pBluescriptIISK(+)质粒(Stratagene公司产品)连接。T4DNA连接酶为GIBCO BRL公司产品，连接条件为16℃，12小时。连接产物转化大肠杆菌TG1菌株，通过蓝白斑筛选获得重组转化子，小批量提取质粒DNA(参见《分子克隆》，1989，科学出版社)，用EcoR V和Xho I酶切鉴定，有一条约230bp的片段被克隆，经测序证明已成功克隆了IGF-I基因，所获得的重组质粒称之为pSK-IGF。
3.丝胶蛋白启动子控制IGF-I基因的构建
以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPser-1(ccg aat tcg cac aca cactac ata cc)和TPser-2(ccg ata tcg ttg gcg gtc ttt gga tcg c)为引物，通过常规PCR扩增获得约570bp左右的片段，经序列测定证实为丝胶蛋白启动子-1；该PCR产物经EcoR I和EcoR V双酶切后，克隆进同样双酶的pSK-IGF载体，获重组pSK-Ser-IGF载体。以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-3(ggc tcg agc aaa ttg tgt ttg cgt tag g)，TPFib-L-4(gcg gta ccc actgtc caa tcc acc gtc)为引物，扩增出约290bp的片段，测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经Xho I和Kpn I双酶切后，与同样酶切的pSK-Ser-IGF载体连接，获得重组载体pSK-Ser-IGF-polyA。
4.带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建
以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-5(cgg ata tct atg ggctcc agt aac c)和TPFib-L-6(gcg tcg acg gtc agg tta gat taa cgg g)为引物，常规PCR扩增，获得丝素轻链基因第1内含子中具有增强子功能的约400bp左右的序列，Sal I和EcoR V双酶切后，克隆进经Sal I和Sma I双酶切的PigA3GFP质粒(参见Cary，L.C.et al.Transposon mutagenesis ofbaculoviruses：analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions withinthe FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.Virology，1989，172：156-69)获带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体，命名为pigA3-en。
5.带有增强子元件和丝胶蛋白启动子1控制IGF-I外源基因的转基因载体的构建
pSK-Ser-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I双酶切，回收丝胶蛋白启动子1控制IGF-I基因的片段(约1.1kb)，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-en载体，获得的新载体命名为pigA3-Ser-IGF-en
6.构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体
以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，用IE-1基因启动子的特异性引物对(5′ttc gaa ttc gat ttg cag ttc ggg ac3′，5′gcg gat ate agt cgt ttg gtt gtt ca3′)进行PCR扩增，PCR产物用EcoR I、EcoR V双酶切后，克隆在pBluescript II SK(+)载体，获得带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的载体pSK-IE
以pcDNA3.1载体(Invitron公司产品)为模板，以Neo1(5′ctg ata tca tgattg aac aag atg g3′)和Neo3(5′agc tcg aga att cta gct aga ggt cga c3′)为引物，PCR扩增出neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列(约1.1kb)，经Xho I、EcoR V酶切消化后，克隆进经过同样处理的pSK-IE载体中，获得pSK-IE-Neo载体。
7.构建带有家蚕丝胶蛋白启动子控制IGF-I表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo)和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体
pSK-IE-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3-Ser-IGF-en质粒，获的重质粒命名为pigA3-Ser-IGF-en-neo.
8.精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和新霉素抗性的转基因家蚕家蚕品种为菁松品种，正常饲养至化蛾。
将pigA3-Ser-IGF-en-neo及辅助质粒(参见Tamura Toshiki.et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBactransposon-derived vector.Nature Biotechnology，2000，18：81-84)按1∶1混合(混合浓度2μg/μL)，用毛细管玻璃针以1.5～2.0μL/只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕(G0)连续添食10000μg/mL的G418至4龄眠，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出抗G418、带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕(转基因家蚕)，进行IGF-I基因检测和常规家蚕育种。
9.转基因家蚕的IGF-I基因PCR检测
针刺取少量荧光家蚕的血淋巴(约20μL血淋巴/每头)，加500μL TE缓冲液(pH8.0)，加500μL过饱和苯酚(pH8.0)作用10min，12000r/min离心10min，取上清，再用过饱和酚提取一次，加氯仿∶异戊醇(24∶1)作用10min，12000r/min离心10min，取上清加2倍体积无水冷乙醇，混合均匀，置-20℃，2小时后再用12000r/min离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，12000r/min离心1min，弃上清，自然干燥，沉淀用10μL TE缓冲液溶解，获家蚕基因组总DNA。
以提取蚕血淋巴总DNA作为模板，用IGF-I基因的特异性引物T-IGF1(tgg ata tca tgg gac cgg aga cgc tct gc)和T-IGF2(atc tcg aga agc tta agc tgactt ggc agg ctt g)进行PCR检测，同时设正常家蚕为阴性对照，pigA3-Ser-IGF-en-neo质粒DNA为阳性对照。PCR检测显示，在G0、G1、G2、G3等代均可扩增出230bp左右的IGF-I特异片段，阴性对照无该片段产生，表明IGF-I基因已进入家蚕基因组，并稳定遗传。
10.转基因家蚕丝腺IGF-I表达产物检测
解剖取转基因家蚕，取中部丝腺组织，用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)充分研磨破碎细胞，12000r/min，4℃离心10min，取上清，用ELISA法，按检测试剂盒(博士德，武汉博士德生物工程有限公司)说明书测定IGF-I的表达水平，同设正常家蚕中部丝腺对照，结果表明，转基因家蚕中部丝腺组织IGF-I的表达水平达25000-40000pg/g。
实施例二：丝蛋白基因P25启动子控制人胰岛素样生长因子-I基因的转基因家蚕的制备
具体实施方案与实施例一基本相同，不同之处是将实施例一中的步骤3改为“p25基因启动子控制IGF-I基因的构建”，具体步骤是：
1.同实施例一中的步骤1
2.同实施例一中的步骤2
3.p25基因启动子控制IGF-I基因的构建
以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPP25-1(gcg aat tca aca gaaatc ccg ag)和TPP25-2(ccg ata tcc gcg cca gga tgt tgc gcg)为引物，通过常规PCR扩增获得470bp左右的片段，经序列测定证实为p25基因启动子；该PCR产物经EcoR I和EcoR V双酶切后，克隆进同样双酶的pSK-IGF载体，获重组pSK-P25-IGF载体。以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，以TPFib-L-3(ggc tcg agc aaa ttg tgt ttg cgt tag g)，TPFib-L-4(gcg gta ccc actgtc caa tcc acc gtc)为引物，扩增出290bp的片段，测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经Xho I和Kpn I双酶切后，与同样酶切的pSK-Ser-IGF载体连接，获得重组载体pSK-p25-IGF-polyA。
4.同实施例一中的步骤4
5.带有增强子元件和p25启动子控制IGF-I外源基因的转基因载体的构建
pSK-p25-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I双酶切，回收p25启动子控制IGF-I基因的片段(990bp)，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-en载体，获得的新载体命名为pigA3-p25-IGF-en
6.同实施例一中的步骤6
7.构建带有p25启动子控制IGF-I表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo)和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体
pSK-IE-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3-p25-IGF-en质粒，获的重质粒命名为pigA3-p25-IGF-en-neo.
8.同实施例一中的步骤8，但所用的质粒为pigA3-p25-IGF-en-neo。
9.同实施例一中的步骤9
10.同实施例一中的步骤10，但测定的组织为后部丝腺。结果表明，转基因家蚕后部丝腺组织IGF-I的表达水平超过25000pg/g。
实施例三：带有BmNPV hr3增强子、丝素蛋白轻链基因(Fib-L)启动子控制人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的转基因家蚕的制备
具体实施方案与实施例一和实施例二基本相同，不同之处是将实施例一和实施例二中的人胰岛素样生长因子-I基因改为人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因，启动子改为丝素蛋白轻链基因(Fib-L)启动子，增强子改为家蚕核多角体病毒(BmNPV)同源区序列(homologous region)的hr3增强子。
具体步骤是：
1.人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的制备
根据业已公开的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的cDNA序列(GenBank登录号M11220)，按常规人工合成人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的DNA序列：
TGGATATCatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctctgcacccgcccgctcgcccagccccagcacgcagccctgggagcatgtgaatgccatccaggaggcccggcgtctcctgaacctgagtagagacactgctgctgagatgaatgaaacagtagaagtcatctcagaaatgtttgacctccaggagccgacctgcctacagacccgcctggagctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcaccaagctcaagggccccttgaccatgatggccagccactacaagcagcactgccctccaaccccggaaacttcctgtgcaacccagattatcacctttgaaagtttcaaagagaacctgaaggactttctgcttgtcatcccctttgactgctgggagccagtccaggagtgaCTCGAGAT
为了便于克隆表达，在5′端引入EcoR V的酶切位点，3′端引入Xho I的酶切位点。
2.构建带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的pBluescript II SK(+)重组质粒
同实施例一中的步骤2，不同的是，用EcoR V和Xho I酶切鉴定，有一条约450bp的片段被克隆，经测序证明已成功克隆了hGM-CSF基因，所获得的重组质粒称之为pSK-GMCSF。
3.丝素蛋白轻链基因启动子控制hGM-CSF基因的构建
同实施例一中的步骤3，不同的是，所用引物为TPFib-L-1(cgg aat tcc gactcg cca agt tac gtc)和TPFib-L-2(gcg ata tcg tgg tct gtt atg tga cc)，PCR扩增获得约600bp左右的片段，经序列测定证实为丝素蛋白轻链基因启动子，获重组pSK-FibL-GMCSF载体和重组载体pSK-FibL-GMCSF-polyA。
4.带有丝素蛋白轻链基因启动子控制hGM-CSF外源基因的基于piggyBAC转座子转基因载体的构建
pSK-FibL-GMCSF-polyA用EcoR I和Kpn I双酶切，回收丝素蛋白轻链基因启动子控制hGM-CSF基因的片段(约1.3kb)，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的PigA3GFP载体，获得的新载体命名为pigA3-FibL-GMCSF
5.构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因neo的重组载体
同实施例一中的步骤6。
6.构建带有家蚕丝素蛋白轻链基因启动子控制hGM-CSF表达盒、新霉素抗性基因(neo)和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体
pSK-IE-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3-FibL-GMCSF质粒，获的重质粒命名为pigA3-FibL-GMCSF-neo
7.构建带有家蚕丝素蛋白轻链基因启动子控制hGM-CSF表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo)和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体
以BmNPV的基因组DNA为模板，以TPhr3-1(ctg gta ccg ccg tgc cca gtcacg tgt acg cc)和TPhr3-2(ctc ccg ggg tga aca gcc cat tcg agg c)为引物，常规PCR扩增，获得家蚕核多角体病毒(BmNPV)同源区序列(homologousregion)的hr3中具有增强子功能的约740bp左右的序列，Kpn I和Sma I双酶切后，克隆进经Kpn I和Sma I双酶切的pigA3-FibL-GMCSF-neo质粒，获带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体，命名为pigA3-FibL-GMCSF-en-neo。
8.精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和新霉素抗性的转基因家蚕
同实施例一中的步骤8，不同的是，所用转基因载体为pigA3-FibL-GMCSF-en-neo，进行hGM-CSF基因的检测。
9.转基因家蚕的hGM-CSF基因PCR检测
同实施例一中的步骤9提取蚕血淋巴总DNA。
以提取蚕血淋巴总DNA作为模板，用hGM-CSF基因的特异性引物T-GMCSF1(tgg ata tca tgt ggc tgc aga gcc tgc)和T-GMCSF2(atc tcg agt cactcc tgg act ggc tcc c)进行PCR检测，同时设正常家蚕为阴性对照，pigA3-FibL-GMCSF-en-neo质粒DNA为阳性对照。PCR检测显示，在G0、G1、G2、G3等代均可扩增出450bp左右的hGM-CSF特异片段，阴性对照无该片段产生，表明hGM-CSF基因已进入家蚕基因组，并稳定遗传。
10.转基因家蚕丝腺hGM-CSF表达产物检测
解剖取转基因家蚕，取后部丝腺组织，用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)充分研磨破碎细胞，12000r/min，4℃离心10min，取上清，用ELISA法，按检测试剂盒(Beckman coulter EIA GM-CSF)说明书测定hGM-CSF的表达水平，同设正常家蚕后部丝腺对照，结果表明，转基因家蚕后部丝腺组织hGM-CSF的表达水平超过25000pg/g。
实施例四：带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)的转基因家蚕的育种
G0代荧光蚕与正常蚕(菁松)交配后代为G1代，G1代同一蛾圈孵化后单独饲养(下同)，用便携式荧光灯结合荧光倒置显微镜检测G1代家蚕幼虫，结合PCR检测(采用实施例一第9步，下同)，将既有明显荧光显示，又能PCR检测到hGM-CSF基因的同一蛾圈孵化后饲养的G1代转基因家蚕进行杂交育种，获得G2代，用以上从G1代获得G2代的方法，将G2代育种制备为G3代，对G2、G3代同样进行荧光检测和PCR检测，保留从G2代到G3代不发生性状分离的G3代。对保留的G3代的同一蛾圈蚕种分为两组，一组备用，一组正常饲养，并与正常蚕(菁松)进行单对杂交，同一蛾圈蚕种的杂交后代如果均不发生性状分离时，认定该蛾圈蚕种为转基因家蚕。常规饲养该蛾圈蚕种的备用组，从而获得不发生性状分离的转hGM-CSF基因的家蚕品种。
实施例五：口服型囊胶制备及生物活性试验
收集实施例一中转IGF-I基因的家蚕的中部丝腺或实施例二中转IGF-I基因家蚕的后部丝腺，经匀浆后，用纱布过滤去除粗杂质，冷冻干燥成粉剂原料，将原料粉按每kg加水1L的比例溶解，经18000r/min离心1小时，取上清，再经冷冻干燥后成精原料粉，原料粉装入胶囊，制成口服型胶囊。口服型胶囊经小鼠动物实验证明，有明显降血糖作用。
Claims (7)
1.一种构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建带有家蚕丝腺特异性表达基因的启动子X控制外源蛋白基因表达盒；
(2)构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有荧光蛋白报告基因的载体pigA3-en；
(3)双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的pigA3-en，得带有增强子en和启动子X控制外源基因的载体；
(4)构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制抗生素抗性基因的重组载体；
(5)酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制抗性基因的片段，克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有荧光蛋白报告基因和启动子X控制外源基因表达盒、增强子元件、启动子Y控制抗生素抗性基因的重组转基因载体；
(6)步骤(5)所得重组转基因载体，在辅助质粒的作用下，利用精子介导法导入初产卵，孵化，筛选获得带有抗生素抗性基因、荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到目的基因，育种制成转基因家蚕。
2.根据权利要求1所述的构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于：所述家蚕丝腺特异性表达基因启动子X选自丝素蛋白重链基因启动子、丝素蛋白轻链基因启动子、丝胶蛋白-1基因启动子或P25基因启动子中的一种；昆虫细胞内具有活性的启动子Y为家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子。
3.根据权利要求1所述的构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于：所述外源蛋白基因是药用蛋白基因，选自人胰岛素样生长因子-I基因、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因中的一种。
4.根据权利要求1所述的构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于：所述的增强子en选自家蚕丝素蛋白轻链基因第一内含子序列、杆状病毒的同源区增强子序列中的一种。
5.根据权利要求1所述的构建家蚕丝腺生物工厂的方法，其特征在于：所述的抗性基因选自新霉素抗性基因neo抗性基因。
6.一种含有外源蛋白的药物制备方法，其特征在于：采用权利要求1获得的转基因家蚕的丝腺经冷冻干燥后制成药物。
7.一种含有外源蛋白的药物制备方法，其特征在于：采用权利要求1获得的转基因家蚕进行蚕种繁殖，将获得的家蚕的丝腺经冷冻干燥后制成药物。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845442A (zh) * | 2010-04-23 | 2010-09-29 | 苏州大学 | 一种家蚕生物反应器制备人白介素28a的方法及其制药用途 |
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| CN102226202A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-10-26 | 浙江大学 | 家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法 |
| CN102250935A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 苏州大学 | 一种载有人胰岛素样生长因子-ⅰ基因的重组转基因载体及其应用 |
| CN104542507A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-29 | 苏州大学 | 一种高蛋白血症的家蚕模型的制备方法与应用 |
| WO2017123242A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Ding Enyu | A universal nucleic acid drug vector enhancing mrna stability and translatability |
| CN108642059A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-10-12 | 西南大学 | 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用 |
| CN111793643A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-10-20 | 重庆西蚕生物技术研究院有限公司 | 表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重链表达系统及制备方法和应用 |
-
2008
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Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102187845B (zh) * | 2010-03-05 | 2013-06-05 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| CN102187845A (zh) * | 2010-03-05 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高蚕丝产量的转基因方法 |
| CN101845442A (zh) * | 2010-04-23 | 2010-09-29 | 苏州大学 | 一种家蚕生物反应器制备人白介素28a的方法及其制药用途 |
| CN101845442B (zh) * | 2010-04-23 | 2012-04-04 | 苏州大学 | 一种家蚕生物反应器制备人白介素28a的方法及其制药用途 |
| CN102226202A (zh) * | 2011-05-13 | 2011-10-26 | 浙江大学 | 家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法 |
| CN102250935B (zh) * | 2011-05-30 | 2013-09-04 | 苏州大学 | 一种载有人胰岛素样生长因子-ⅰ基因的重组转基因载体及其应用 |
| CN102250935A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-11-23 | 苏州大学 | 一种载有人胰岛素样生长因子-ⅰ基因的重组转基因载体及其应用 |
| CN104542507A (zh) * | 2014-12-25 | 2015-04-29 | 苏州大学 | 一种高蛋白血症的家蚕模型的制备方法与应用 |
| WO2017123242A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Ding Enyu | A universal nucleic acid drug vector enhancing mrna stability and translatability |
| CN109104870A (zh) * | 2016-01-15 | 2018-12-28 | 丁恩雨 | 一种能够增强mRNA稳定性和可译性的通用核酸药物载体 |
| US10626413B2 (en) | 2016-01-15 | 2020-04-21 | Enyu Ding | Nucleic acid vector |
| CN108642059A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-10-12 | 西南大学 | 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用 |
| CN108642059B (zh) * | 2018-05-04 | 2020-07-28 | 西南大学 | 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用 |
| CN111793643A (zh) * | 2020-07-17 | 2020-10-20 | 重庆西蚕生物技术研究院有限公司 | 表达目的蛋白分布于丝素和丝胶的家蚕丝心蛋白重链表达系统及制备方法和应用 |
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