CN103243121B

CN103243121B - 一种提高家蚕原种产卵量的方法

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Publication number: CN103243121B
Application number: CN201310184009.8A
Authority: CN
Inventors: 贡成良; 曹广力; 薛仁宇; 潘中华; 郑小坚
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-05-17
Also published as: CN103243121A

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高家蚕原种产卵量的方法：以含有荧光蛋白报告基因的piggyBAC转座子载体为基础载体，通过基因工程操作构建vasa-like基因启动子或nanos-like基因启动子控制GAL4基因表达的转基因家蚕vlg-GAL4系统或nanos-GAL4系统；通过基因工程操作构建UAS启动子控制家蚕ovo-1基因表达的转基因家蚕UAS-ovo-1系统；转基因家蚕vlg-GAL4系统或nanos-GAL4系统与UAS-ovo-1系统杂交，获得杂交一代家蚕，所得家蚕自交、产卵，即完成对家蚕原种产卵量的提高。本发明方法通过GAL4/UAS双元系统实现了在生殖腺过表达家蚕ovo-1基因，提高单蛾产卵水平，产卵量增加10%以上，同时降低张种生产成本，具有重要的应用价值。

Description

一种提高家蚕原种产卵量的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种提高家蚕原种产卵量的方法。

背景技术

家蚕丝蛋白质高效合成、产卵量、发育与变态、免疫与抗性以及性别决定是家蚕最重要的五大性状。提高家蚕原种的产卵量是蚕种生产的重要内容，对降低张种生产成本、提高劳动生产力有重大影响。单蛾造卵数、产卵数是家蚕品种的固有性状。生产中，通过加强饲养管理、良桑饱食可在一定程度提高家蚕单蛾造卵数、产卵数，但这种常规方法难以明显提高单蛾的卵量。因此，有必要从根本上探索增加单蛾造卵数、产卵数新方法。

在果蝇中，ovo基因的产物控制卵巢发育和生殖细胞的分化，OVO-A和OVO-B亚型是具有相反调节活性的转录因子，OVO亚型在纯合的雌性生殖细胞发育过程中具有相反的活性：OVO-B正调控卵巢肿瘤基因（otu）启动子，然而OVO-A下调靶启动子；在卵子形成的过程，OVO-B是雌性生殖细胞发育所必需且充分的条件，而OVO-A在这个过程中并没有作用。但是母性的OVO-A是子代生殖细胞形成和维持所必需的，缺乏OVO-A将导致母性不育，母本缺乏OVO-A表达而导致不育的子代没有明显的生殖细胞，卵巢小且萎缩，精巢萎缩且松散。过早或过度的表达OVO-A导致的母性致死能够通过转基因增加编码额外的OVO-B来挽救。因此，调节ovo基因不同亚型的表达可以控制卵巢的发育和生殖细胞的形成、维持。

家蚕属鳞翅目，卵巢的正常发育是家蚕造卵的前体，家蚕基因组中存在与果蝇性腺发育基因高度同源的序列，暗示家蚕的性腺发育与果蝇有类似性。但家蚕在分类上与果蝇不同，卵巢发育、生殖细胞的分化、形成和维持具有其特殊的规律，如何在基因水平对卵巢发育、生殖细胞分化等关键基因进行调节，提高单蛾产卵水平，降低张种生产成本，是一个亟待解决的问题。到目前为止，尚无用通过内源性基因表达提高家蚕产卵量的报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种提高家蚕原种产卵量的方法，基本思路是通过遗传操作技术，利用GAL4/UAS双元系统，在家蚕原种生殖腺过表达家蚕ovo-1基因，调节卵巢发育、生殖细胞分化，从而提高单蛾产卵水平。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种提高家蚕原种产卵量的方法，包括以下步骤：

(1) 通过基因工程操作将家蚕生殖腺特异性启动子控制下的GAL4基因克隆进含有荧光蛋白报告基因的piggyBAC转座子载体，构建重组转基因载体A，与辅助质粒混合，导入原种初产卵，孵化后的蚁蚕通过常规筛选获得带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到荧光蛋白报告基因和GAL4基因，育种制成转基因家蚕GAL4系统；通过基因工程操作将UAS启动子控制下的家蚕ovo-1基因克隆进含有荧光蛋白报告基因的piggyBAC转座子载体，构建重组转基因载体B，与辅助质粒混合，导入原种初产卵，孵化后的蚁蚕通过常规筛选获得带有荧光蛋白报告基因的家蚕，检测到外源基因，育种制成转基因家蚕UAS-ovo-1系统；

(2) 将育种制成的转基因家蚕GAL4系统与转基因家蚕UAS-ovo-1系统交配，获得杂交一代家蚕，所得家蚕自交、产卵，即完成家蚕原种产卵量的提高。

上述技术方案中所述荧光蛋白报告基因可以是绿色荧光蛋白基因GFP、增强型绿色荧光蛋白基因EGFP、红色荧光蛋白基因DsRed或黄色荧光蛋白基因YFP；本发明优选为绿色荧光蛋白基因GFP。

所述的家蚕生殖腺特异性启动子选用vasa-like基因启动子或nanos-like基因启动子。

所述的重组转基因载体A为带有vasa-like基因启动子驱动GAL4基因表达元件的重组piggyBAC转座子载体pigvlg-Gal4或带有nanos-like基因启动子驱动GAL4基因表达元件的重组piggyBAC转座子载体pignanos-Gal4，所对应的家蚕系统为vlg-Gal4或nanos-Gal4系统；所述的重组转基因载体B为pigUAS-Bmovo-1。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明采用Gal4/UAS双元系统，实现了在生殖腺过表达卵巢发育调节关键基因，较大幅度提高了单蛾产卵水平，避免了常规单元转基因系统的潜在危害；同时节约蚕种生产成本。

附图说明

图1是实施例一步骤1中Bmovo-1基因部分序列的测序图；

图2是实施例一步骤4中UAS-ovo-1系统发绿色荧光转基因家蚕图；

图3是实施例一步骤5中vlg-GAL4系统发绿色荧光的转基因家蚕图；

图4是实施例一步骤5中vlg-GAL4系统转基因家蚕PCR鉴定GFP图

图5是实施例二步骤2中nanos-GAL4系统发绿色荧光的转基因家蚕图；

图6是实施例二步骤2中nanos-GAL4系统转基因家蚕PCR鉴定GFP图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：家蚕vasa-like基因启动子控制GAL4、UAS控制Bmovo-1转基因双元系统的构建

1. Bmovo-1基因cDNA的克隆

解剖家蚕幼虫卵巢，提取总RNA，以总RNA为模板，oligo(dT)为引物反转录合成cDNA，以SEQ ID No.1（gat atc atg ccg aaa atc ttc tgg att aag，下划线示EcoRⅤ位点）和SEQ ID No.2（gtc gac tta att gtg tac tgg cat ggg c，下划线示SalⅠ位点）为引物，常规PCR扩增cDNA，回收2.42 kb的特异性产物；将产物克隆进pMD^TM19-T（大连宝生物有限公司），获pMD-Bmovo，测序，附图1为测序结果，可以证实与GenBank已公开的序列（登录号：GU477588）一致。

2. 效应转基因载体pigUAS-Bmovo-1的构建

（1）pSKUAS质粒构建：以pUAST质粒DNA（参见Brand and Perimon，Development，1993，118：401-415）为模板，以SEQ ID No.3（ctg gat ccg cat gcc tgc agg tcg，下划线为BamHⅠ位点）和SEQ ID No.4（ttg ata tcc aat tcc cta ttc aga g，下划线为EcoRⅤ位点）为引物，PCR扩增出UAS片段（约350 bp）。BamHⅠ/EcoRⅤ双酶切后克隆进pBluescriptⅡSK(+)质粒（Stratagene公司产品）的BamHⅠ/EcoRⅤ位点，获pSK-UAS质粒；

（2）pSK-UAS-Bmovo-PA质粒的构建：pMD-Bmovo质粒EcoRⅤ/SalⅠ双酶切，回收2.42 kb片段，克隆进pSK-UAS的相同酶切位点，获pSK-UAS-Bmovo；以SEQ ID No.5（gcg tcg aca aat tgt gtt tgc gtt agg，下划线为SalⅠ位点）和SEQ ID No.6（gcc tcg agc act gtc caa tcc acc gtc，下划线为XhoⅠ位点）为引物，从家蚕基因组中扩增得到家蚕丝素轻链基因poly(A)加尾信号序列，SalⅠ和XhoⅠ酶切后克隆到pSK-UAS-Bmovo的SalⅠ和XhoⅠ位点，得到pSK-UAS-Bmovo-PA质粒；

（3）pigUAS-Bmovo-1的构建：pSK-UAS-Bmovo-PA质粒用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切切出UAS-Bmovo-PA片段后，克隆进BglⅡ/XhoⅠ双酶切的piggyA3GFP载体（参见Cary LC et al.，Virology，1989，172:156–69）获pigUAS-Bmovo-1效应转基因载体。

3. 激活转基因载体pigvlg-Gal4的构建

（1）pigvlg质粒的构建：以家蚕基因组为模板，SEQ ID No.7（tat ccc gggccg cgc cgt aat cct tcc acc c，下划线为SmaⅠ位点）和SEQ ID No.8（cgc aga tct att acc tgc aaa gta att t下划线为BglⅡ位点）为引物，PCR扩增，回收0.9 kb的特异性片段，克隆进pMD^TM19-T，获pMD-vlg，测序证实与GenBank上公开的vasa-like基因启动子序列（登录号：EU360451）一致，pMD-vlg质粒用SmaⅠ/BglⅡ双酶切，回收启动子片段，克隆进同样酶切的piggyA3GFP载体获pigvlg质粒；

（2）pigvlg-Gal4载体的构建：以pBGT1（参照Lukacsovich T et al.，Arch Insect Biochem Physiol，2008，69 (4): 168-175）为模板，SEQ ID No.9（tag gat cca tga agc tac tgt ctt cta tcg，下划线为BamHⅠ酶切位点）和SEQ ID No.10（ttc tcg agc ggc gcg cct tct agt gga t，下划线为XhoⅠ酶切位点）为引物，PCR扩增出的GAL4基因片段（3.4 kb）用BamHI/XhoⅠ双酶切后，克隆进pigvlg的BglⅡ和XhoⅠ位点，获pigvlg-Gal4载体。

4．转基因家蚕UAS-ovo-1系统的构建与鉴定

（1）UAS-ovo-1系统的构建：转基因载体pigUAS-Bmovo-1及辅助质粒（参见Tamura T et al.，Nature Biotechnology，2000,18: 81-84）按1:1混合（混合浓度2 μg/μL），用毛细管玻璃针以1.5~2.0 μL/只注入处女蛾（家蚕品种：皓月）交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕（G₀）正常桑叶育饲养，通过荧光倒置显微镜检测，筛选出带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕（转基因家蚕，参见附图2，转基因家蚕幼虫），进行分子检测和常规家蚕育种；

（2）UAS-ovo-1系统的鉴定：提取转基因家蚕蛾（带荧光）基因组DNA，以SEQ ID No.11（tgg aat tca tgg tga gca agg gcg agg，下划线示BamHⅠ位点）和SEQ ID No.12（ttg gat cct tac ttg tac agc tcg tcc atg，下划线分别示EcoRⅠ位点）为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出GFP的特异性条带；以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，也可从转基因家蚕基因组中扩增出Bmovo-1基因，表明为转基因家蚕。

5．转基因家蚕vlg-Gal4系统的构建与鉴定

（1）vlg-Gal4系统的构建：pigvlg-Gal4及辅助质粒按1:1混合（混合浓度2 μg/μL），用毛细管玻璃针以1.5~2.0 μL/只注入处女蛾（家蚕品种：皓月)交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕（G₀），正常桑叶饲养，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕（转基因家蚕，参见图3，转基因家蚕蚕蛹），进行分子检测和常规家蚕育种。

（2）vlg-Gal4系统的鉴定：提取转基因家蚕基因组DNA，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出GFP的特异性条带；以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物也可从转基因家蚕基因组中扩增出GAL4基因，表明确为转基因家蚕。

附图4为步骤（2）中的GFP鉴定结果，其中：泳道1，转基因载体为模板的PCR产物；泳道2-4：转基因家蚕基因组为模板的PCR产物；泳道5，标准分子量DNA；结果表明确为转基因家蚕。

6．vlg-Gal4系统与UAS-ovo-1系统杂交后代单蛾产卵量：vlg-Gal4系统与UAS-ovo-1系统相互杂交，获得杂交一代家蚕，该家蚕正常饲养、保护至化蛾，相互交配，单蛾的产卵量提高10.4-15.3%。

实施例二：家蚕nanos-like基因动子控制GAL4、UAS控制Bmovo-1转基因双元系统的构建

1．激活转基因载体pignanos-Gal4的构建

(1) pignanos质粒的构建：以家蚕基因组为模板，SEQ ID No.13（tat ccc ggg tgc ctt aca tca aag aca ta，下划线为SmaⅠ位点）和SEQ ID No.14（cgc aga tct ttc aat tac gaa gat gtt gct下划线为BglⅡ位点）为引物，PCR扩增，回收0.6 kb的特异性片段，克隆进pMD^TM19-T，获pMD-nanos，测序证实与GenBank上公开的nanos-like基因启动子序列（BABH01013628.1的8401-9001区域）一致，pMD-nanos质粒用SmaⅠ/BglⅡ双酶切，回收启动子片段，克隆进同样酶切的piggyA3GFP载体获pignanos质粒；

(2) pignanos-Gal4载体的构建：以pBGT1（参照Lukacsovich T et al.，Arch Insect Biochem Physiol，2008，69 (4): 168-175）为模板，SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物，PCR扩增出的GAL4基因片段（3.4 kb）用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后，克隆进pignanos的BglⅡ和XhoⅠ位点，获载体pignanos-Gal4载体。

2．转基因家蚕nanos-GAL4系统的构建与鉴定

（1）nanos-GAL4系统的构建：pignanos-Gal4及辅助质粒按1:1混合（混合浓度2 μg/μL），用毛细管玻璃针以1.5~2.0 μL/只注入处女蛾（家蚕品种：皓月）交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕（G₀），正常桑叶饲养，结合荧光倒置显微镜检测，筛选出带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕（转基因家蚕，参见图5，转基因家蚕蚕蛾），进行分子检测和常规家蚕育种；

（2）nanos-GAL4系统的鉴定：提取转基因家蚕基因组DNA，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12为引物进行PCR扩增，可特异性扩增出GFP的特异性条带；以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物也可从转基因家蚕基因组中扩增出GAL4基因，表明确为转基因家蚕。

附图6为步骤（2）中的GFP鉴定结果，其中：M，DNA标准分子量；泳道1-2，正常家蚕基因组为模板的PCR产物；泳道3，转基因家蚕为模板的PCR产物；泳道4，转基因载体为模板的PCR产物；结果表明确为转基因家蚕。

3．nanos-GAL4系统与UAS-ovo-1系统杂交后代单蛾产卵量：nanos-GAL4系统与实施例一中的UAS-ovo-1系统相互杂交，获得杂交一代家蚕，该家蚕正常饲养、保护至化蛾，相互交配，单蛾的产卵量提高10.7-15.8%。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学

<120> 一种提高家蚕原种产卵量的方法

<160> 12

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gat atc atg ccg aaa atc ttc tgg att aag 30

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtc gac tta att gtg tac tgg cat ggg c 28

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctg gat ccg cat gcc tgc agg tcg 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttg ata tcc aat tcc cta ttc aga g 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcg tcg aca aat tgt gtt tgc gtt agg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcc tcg agc act gtc caa tcc acc gtc 27

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tat ccc ggg ccg cgc cgt aat cct tcc acc c 31

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cgc aga tct att acc tgc aaa gta att t 28

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tag gat cca tga agc tac tgt ctt cta tcg 30

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttc tcg agc ggc gcg cct tct agt gga t 28

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tgg aat tca tgg tga gca agg gcg agg 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ttg gat cct tac ttg tac agc tcg tcc atg 30

Claims

1.一种提高家蚕原种产卵量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2) 将育种制成的转基因家蚕GAL4系统与转基因家蚕UAS-ovo-1系统交配，获得杂交一代家蚕，所得家蚕自交、产卵，即完成家蚕原种产卵量的提高；

所述家蚕ovo-1基因的GenBank登录号为GU477588。

2.根据权利要求1所述一种提高家蚕原种产卵量的方法，其特征在于，所述的家蚕生殖腺特异性启动子选用vasa-like基因启动子或nanos-like基因启动子。