CN101016556A - 一种用于家蚕转基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于家蚕转基因的方法。包括家蚕产卵、注射胚胎时期、排卵方法、注射和封口、催青等，可以提高显微注射的效率和转基因效率。方案中使用强生粉配制糨糊将蚕卵固定，用70％酒精消毒处理蚕卵，用细毛笔将蚕卵逐颗排列，将外源基因克隆到转座子载体上构建成重组转座子，将纯化的重组转座子与Helper质粒按1∶1的重量比例用注射缓冲液调整浓度为0.4μg/μl，在实体显微镜下实施显微注射，注射量为15－20ng DNA，注射后蚕卵用皮革用胶封口；将注射后的蚕卵连同载玻片移入催青容器，25℃催青，孵化饲养、挑选继代、检测。

Description

一种用于家蚕转基因的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于家蚕转基因的方法。具体为虫卵注射方法导入外源基因，包括家蚕产卵、注射胚胎时期、排卵方法、注射和封口、催青等，较大地提高了转基因效率。

背景技术

所谓转基因是指基因的转移，即用各种工方法插入生物体自身不具有的基因，由于染色体遗传物质的交换而使其表现形态得以改变。通过获得的生物称为转基因生物，即转基因植物和转基因动物。进而所谓转基因昆虫是指昆虫染色体上插入了别的生物的基因的重组昆虫。利用病毒导入外源遗传物质时，被重组的基因存在于病毒染色体上，于是病毒仅只感染生物体(也称宿主)，而不将重组基因传递给他的下一代。但是转基因昆虫则在染色体上进行了遗传物质的重组，一旦外源基因导入后则可在后代中传递，与昆虫自身所具有的基因在后代中的表达完全相同。因此，一旦作成转基因昆虫，可以轻易地进行饲育、繁殖、传代。即是所说的彻底改变生物自身性状的生物技术。

目前研究现状，家蚕转基因主要通过以下三种途径进行：

1、提取外源DNA并用技术手段导入另一昆虫体内，主要在胚胎早期进行。

早期应用此方法也曾获得多一些变异个体，但通常这些外源DNA仅仅进入细胞质而非整合到染色体上，因此往往不能稳定地遗传；同时外源DNA进入另一个体，往往由于降解酶的作用而迅速分解，其表达的频率很低。

2、利用转座子将外源基因插入到宿主染色体上。

利用转座子进行转基因的研究表明其转基因效率高，一般可达2-5％，高的可达20-30％(通常为果蝇)。对大多数昆虫而言，其影响转座效率的因素尚需研究，包括质粒大小、报告基因、极细胞形成的时间等。外源基因在宿主染色体上的转座位置受核苷酸排列决定，这种转座通常是不定向的。另外基因转座往往伴随着宿主基因的改变或突变。

3、利用同缘重组特性，通过构建基因打靶载体将外源基因导入宿主染色体

利用转座子产生转基因昆虫有其转化率高的优点，但其转座的位点通常是随机的。利用同缘重组特性，通过构建基因打靶载体将外源基因导入宿主染色体则具有人为的定向性。这一方法为丝腺生物反应器研究，生产特定蛋白质及改进蚕丝特性提供了可能。

昆虫转基因无论通过何种途径，虫卵注射方法导入外源基因是其关键步骤，直接关系到转基因成功与否和效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于家蚕转基因的方法。包括家蚕产卵、注射胚胎时期、排卵方法、注射和封口、催青等，可以较大地提高显微注射的效率和转基因效率。

本发明用于家蚕转基因的方法包括以下步骤：

a)将强生粉配制成60％重量比的水剂，蒸成糨糊状，均匀涂抹于蚕连纸上，自然晾干，取刚羽化交配雌蛾，按1小时间隔分批在蚕连纸上产卵，每隔1小时将雌蛾移至另一蚕连纸上继续产卵，直至产卵完毕；

b)用70％酒精喷洒卵面，进行消毒处理，然后用清水水洗蚕卵到容器中，用细毛笔将蚕卵逐颗整齐排列于载玻片上，蚕卵卵孔部位朝上，卵窝部位朝右，自然晾干，利用蚕连纸上的糨糊将蚕卵粘于载玻片上，自然晾干；

c)将外源基因克隆到转座子载体上构建成重组转座子piggy Bac-DsRed-FigH-外源基因-LBS，将纯化的重组转座子与Helper质粒按1∶1的重量比例用注射缓冲液调整浓度为0.4μg/μl，在实体显微镜下实施显微注射，注射卵龄为产卵后2-4小时，注射量为15-20ng DNA，注射后蚕卵用皮革用胶封口；

d)将注射后的蚕卵连同载玻片移入催青容器，25℃催青，孵化饲养GO代幼虫；

e)荧光双筒解剖镜下观察G1代蚁蚕单眼色，挑选单眼显红色幼虫继续饲养、制种，G2世代后以同样方法以单眼红色为标记挑选饲养并继代，同时以Northern，Southern和Western blot方法检测外源基因转座及表达情况。

本发明以虫卵注射方法导入蜘蛛丝基因为例将上述方法进一步叙述如下：

将市售优质强生粉配制成60％水剂，蒸熟成糨糊，均匀涂抹于蚕连质上，自然晾干备用。取刚羽化交配雌蛾，按1小时间隔分批产卵，每隔1小时将雌蛾移至另一蚕连纸上继续产卵，直至产卵完毕。

为便于蚕卵注射，提高注射效率和转基因效率，产于蚕连纸上的蚕卵需进行重排。方法是：将蚕卵用70％酒精喷洒卵面，进行消毒处理。然后用清水水洗蚕卵到容器中，用细毛笔将蚕卵逐颗整齐排列于载玻片上，蚕卵卵孔部位(稍尖)朝上，卵窝(浅的凹陷)部位朝右，8排每排6颗。自然晾干，利用蚕连纸上的糨糊将蚕卵粘于载玻片上。

将蜘蛛丝基因flag克隆到转座子载体上构建成重组转座子piggyBac-DsRed-FigH-flag-LBS，将纯化的重组转座子与Helper质粒(提供转座酶)按1∶1的重量比例用注射缓冲液(5mMKCl、0.5mMPBS、pH7.0)调整浓度为0.4μg/μl。在实体显微镜下实施显微注射，注射卵龄为产卵后2-4小时，注射量为15-20ng DNA。注射后蚕卵用皮革用胶(无毒)封口。

将注射后的蚕卵连同载玻片移入催青容器，25℃催青。孵化饲养GO代幼虫。荧光双筒解剖镜下观察G1代蚁蚕单眼色。挑选单眼显红色幼虫继续饲养、制种。G2世代后以同样方法以单眼红色为标记挑选饲养并继代，同时以Northern，Southern和Western blot方法检测蜘蛛丝基因转座及表达情况。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步阐述。

实施例1

解剖蜘蛛(Nephila clavata)雌性成虫丝腺，以0.8％生理盐水洗净，采用Sambrook等方法抽提基因组DNA。设计横丝基因扩增引物，引物1：5’-AATGAAAAAAGAGGGTT GGTACCTCCTGG-3’(下划线为KpnI酶切位点)，引物2：5’-TTCGAATTTTCTTGGGT CTGCAGGTGT-3’(下划线为PstI酶切位点)；按以下条件PCR扩增获得横丝基因：94℃1分、56℃1分、72℃1分30秒，30个循环。将扩增的蜘蛛丝横丝基因克隆入pFastBacHT B(Invitrogen)并测序。再将横丝基因切出，克隆入转座子载体pBac3×P3DsRed，构建成重组转座子载体，该载体含有家蚕丝素重链启动子，红色荧光标记基因，转座子和蜘蛛丝横丝基因等部分。

实施例2

转基因注射用蚕卵为多化性N4品种，将纯化的重组转座子与Helper质粒(提供转座酶)按1∶1的重量比例用注射缓冲液(5mMKCl、0.5mMPBS、pH7.0)调整浓度为0.4μg/μl。在实体显微镜下实施显微注射，注射卵龄为产卵后2-4小时，注射量为15-20ng DNA。注射后蚕卵用皮革用胶(无毒)封口。共注射蚕卵380粒，孵化165头蚁蚕(GO)，饲养后结茧125个，获雌蛾48头，经交配后产卵获卵圈45个。45个卵圈分别催青孵化(G1)，荧光双筒解剖镜下观察G1代蚁蚕单眼色。挑选单眼显示红色的蚁蚕2区，幼虫继续饲养、制种。转座率大约为4％。

实施例3

G2世代后以同样方法以单眼红色为标记挑选饲养并继代。以红色荧光阳性的G1蛾和G2第5龄第3天幼虫后部丝腺为材料，抽提基因组DNA，并用ISOGENE(日本)提供的RNA抽提试剂盒抽提总RNA，分别以Northern，Southern方法检测蜘蛛丝基因转座情况。实施结果表明：蜘蛛丝横丝基因已正确导入家蚕丝素基因中，其导入位点为1-2个。将转蜘蛛丝基因家蚕丝与对照N4茧丝作丝质检定，其强度和弹性分别增加6-8％。

本发明方案的优点是：蚕卵注射方法简便，注射成功率高，较大地提高了转基因效率。

Claims (1)

1、一种用于家蚕转基因的方法，其特征在于以下步骤：

(1)将强生粉配制成60％重量比的水剂，蒸成糨糊状，均匀涂抹于蚕连纸上，自然晾干，取刚羽化交配雌蛾，按1小时间隔分批在蚕连纸上产卵，每隔1小时将雌蛾移至另一蚕连纸上继续产卵，直至产卵完毕；

(2)用70％酒精喷洒卵面，进行消毒处理，然后用清水水洗蚕卵到容器中，用细毛笔将蚕卵逐颗整齐排列于载玻片上，蚕卵卵孔部位朝上，卵窝部位朝右，自然晾干，利用蚕连纸上的糨糊将蚕卵粘于载玻片上，自然晾干；

(3)将外源基因克隆到转座子载体上构建成重组转座子piggy Bac-DsRed-FigH-外源基因-LBS，将纯化的重组转座子与Helper质粒按1∶1的重量比例用注射缓冲液调整浓度为0.4μg/μl，在实体显微镜下实施显微注射，注射卵龄为产卵后2-4小时，注射量为15-20ng DNA，注射后蚕卵用皮革用胶封口；

(4)将注射后的蚕卵连同载玻片移入催青容器，25℃催青，孵化饲养G0代幼虫；

(5)荧光双筒解剖镜下观察G1代蚁蚕单眼色，挑选单眼显红色幼虫继续饲养、制种，G2世代后以同样方法以单眼红色为标记挑选饲养并继代，同时以Northern，Southern和Western blot方法检测外源基因转座及表达情况。