CN101361474B - 一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法该方法是以二化性家蚕实用品种“秋丰”为材料，从越年蚕卵丙₂胚胎期开始用15℃～20℃的温度黑暗催青，胚胎发育至己₅期时用25℃～26℃继续催青至孵化。孵化后正常温度饲养和蛰中保护，羽化后雌雄蛾交配制种，获得子代非滞育蚕卵，经适当消毒处理后用显微注射法制作转基因家蚕转基因操作后的蚕卵在正常温度湿度条件下催青即能孵化本发明解决了家蚕二化性实用品种因蚕卵滞育而不能直接用显微注射法制作转基因家蚕的难题，将极大地促进家蚕种质创新家蚕转基因实用品种的培育和自主式家蚕生物反应器的开发。

Description

一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法

技术领域

本发明涉及一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，属于生物学技术领域。专用于家蚕二化性实用品种蚕卵显微注射法制作转基因家蚕。

背景技术

自上世纪70年代以来，研究人员对家蚕转基因技术进行了大量艰苦的试验，建立了精子介导法、基因枪法、显微注射法、病毒介导法、孤雌生殖法等多种外源基因导入方法，利用同源重组原理进行转基因尝试。但是由于没有理想的转座子载体加上蚕卵壳坚硬等原因，使家蚕转基因的研究进展缓慢。最近，从昆虫中鉴定出多个可作为鳞翅目昆虫转基因载体的转座子：P因子、Hermes、minos、hobo、mariner和PiggyBac等，成功地在昆虫转基因中得到了应用。piggyBac转座子对家蚕也有转座作用，已经利用piggyBac转座子通过显微注射方法获得了稳定遗传的转基因系统，在研究家蚕重要功能基因、开发生物反应器和害虫防治等方面具有极大的优势。

由于现行生产上使用的家蚕品种基本上为二化性品种，产卵后需要采用盐酸处理等人工方法才能孵化；而且大多数品种卵壳比较坚硬，难以直接作成以提高和改进蚕丝产量和质量为目标的转基因家蚕，制约了家蚕实用品种转基因的研究。多化性品种尤其是无滞育期的多化性品种，在胚胎发育早期(2h～8h)转基因显微注射后，不需要进行盐酸刺激处理就可以直接催青孵化，这也是迄今作成的转基因都是Nistari等多化性品种的原因。然而多化性品种除了抗性强外，茧丝质性状都比较差，实用价值很低。目前蚕茧生产中使用的家蚕品种几乎都为二化性品种。如果能够建立一种蚕种处理方法，使二化性品种的蚕卵在进行转基因操作(显微注射)后不经过盐酸刺激可以直接催青孵化，那无疑将极大地促进家蚕种质创新研究和转基因实用蚕品种培育以及作为生产贵重药用蛋白质的自主式家蚕生物反应器的开发。

发明内容

为了解决上述的二化性家蚕品种转基因存在的技术问题，本发明提供一种二化性家蚕蚕卵的制备方法，使二化性家蚕实用品种的蚕卵在进行转基因操作(显微注射)后不需要经过盐酸刺激等处理而直接催青孵化。

为了达到上述的目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。一种二化性家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其步骤如下：

(1)家蚕实用品种的准备：选择家蚕二化性实用品种，以正常饲养繁殖制备的越年蚕卵为亲本材料；

(2)亲本蚕卵胚胎发育的调节：将经过冬季冷藏30~60日胚胎活化的越年蚕卵置于10-15℃的环境中，调节胚胎发育至丙₂期；

(3)亲本蚕卵的催青：从蚕卵丙₂胚胎期开始，采用15～20℃温度催青，胚胎发育至己₅期即蚕卵转青时改用正常温度催青，直至蚕卵孵化获得幼虫；

(4)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：将步骤(3)中孵化获得的幼虫，按品种分别饲养，羽化后同一品种的雌蛾与雄蛾交配，制备获得的子代蚕卵即为非滞育蚕卵。

上述的步骤(1)所述的家蚕二化性实用品种为中国系统品种。

上述的步骤(3)所述的催青为采用黑暗催青；所述的胚胎发育至己₅期为经过30—18天。

有益效果

本发明以二化性家蚕实用品种为材料，采用15～18℃温度催青，经过30～18日胚胎发育至己₅期(转青期)时改用25～26℃催青，再经过2日蚕卵孵化。孵化的蚁蚕采用正常温度饲养和保护，羽化后雌、雄蛾交配制种获得的子代蚕卵为非滞育蚕卵，其发育类似多化性品种，在正常温度湿度条件下，产下后经过9～10日即能孵化成蚁蚕，良卵孵化率达到96％以上。在这种蚕卵的胚胎发育早期经适当的消毒处理后直接用于显微注射法制作转基因家蚕，使二化性家蚕实用品种转基因操作后不需要经过盐酸刺激等处理就能直接催青孵化，解决了家蚕实用品种转基因中滞育卵不能及时孵化的难题。本发明成果国内外尚未见类似报道。

本发明成果有良好的应用前景，其应用将极大地促进家蚕种质创新研究和转基因实用蚕品种培育以及作为贵重药用蛋白质生产的自主式家蚕生物反应器的开发，从而提高我国蚕业科技水平和经济效益，实现从蚕丝大国到蚕丝强国的转变。

附图说明

图1为家蚕品种“秋丰”越年蚕卵经17-17.5℃温度黑暗催青饲养获得的子代非滞育蚕卵(点青期)；

图2为家蚕品种“秋丰”越年蚕卵经25-25.5℃温度正常催青后饲养获得的子代滞育卵圈(灰紫色)。

具体实施方式

下面结合实例对本发明“一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法”作进一步描述：

一、家蚕品种：“秋丰”[公知公用，见参考文献：章佩祯，季平，沈雪华等.夏秋用蚕品种秋丰×白玉的育成.蚕业科学，1994(1)：17-25]

二、来源：由中国农业科学院蚕业研究所培育和保存的家蚕品种，并对外提供。

三、主要特征特性：中系二化性四眠品种；幼虫具有限性斑纹，雌蚕为普斑、雄蚕为素蚕，蚕体粗壮，食桑旺盛，发育整齐，体质较强；老熟齐涌，熟蚕有趋密性，多营上层茧；越年卵正常催青经过10日，幼虫期经过22日，蛰中经过13～14日；茧形椭圆，茧色洁白，缩皱中等；全茧量1.8g～2.0g，茧层率21％，茧丝长1000m以上，解舒良好；羽化集中，雄蛾活泼、交配性能较好，雌蛾产卵性能良好，单蛾产卵数450粒～600粒，卵壳色有淡黄色和白色两种。

四、制备方法

实例1：

(1)亲本蚕卵胚胎发育的调节：以二化性家蚕实用品种“秋丰”越年蚕卵为材料，待滞育蚕卵活化后在12℃～13℃的环境中，调节胚胎发育至丙₂期。

(2)亲本蚕卵(种)的催青：丙₂胚胎期开始，采用17℃～17.5℃温度黑暗催青，经过25日胚胎发育至己₅期时，转移到25℃-26℃继续催青，再经过2日蚕卵孵化获得幼虫，良卵孵化率90.23％。

(3)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：步骤(2)获得的幼虫采用正常温度饲养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得子代非滞育蚕卵。以卵圈计算，非滞育卵率达到96.39％以上，非滞育卵孵化率96.11％。

二化性家蚕实用品种“秋丰”亲代越年蚕卵采用17℃～17.5℃温度黑暗催青，获得的子代蚕卵非滞育卵率高。

实例2：

(1)亲本蚕卵胚胎发育的调节：按照实例1的方法，调节“秋丰”越年蚕卵胚胎发育至丙₂期。

(2)亲本蚕卵(种)的催青：丙₂胚胎期开始，采用15℃～15.5℃温度黑暗催青，经过30日胚胎发育至己₅期时，转移到25℃-26℃继续催青，再经过2日蚕卵孵化获得幼虫。良卵孵化率68.63％，蚁蚕体质虚弱。

(3)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：步骤(2)获得的幼虫采用正常温度饲养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得子代非滞育卵。以卵圈计算，非滞育卵率达100％，孵化率95.86％。

二化性家蚕实用品种“秋丰”亲代越年蚕卵采用17℃～17.5℃温度黑暗催青，获得的子代蚕卵100％为非滞育卵。但是，因亲代蚕种催青时间过长，幼虫体质虚弱，饲养困难。

实例3：

(1)亲本蚕卵胚胎发育的调节：按照实例1的方法，调节“秋丰”越年蚕卵胚胎发育至丙₂期。

(2)亲本蚕卵(种)的催青：丙₂胚胎期开始，采用19.5℃～20.0℃温度黑暗催青，经过14日胚胎发育至己₅期时，转移到25℃-26℃继续催青，再经过2日蚕卵孵化获得幼虫。良卵孵化率92.17％。

(3)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：步骤(2)获得的幼虫采用正常温度饲养，羽化后雌蛾与雄蛾交配制种，获得子代蚕卵，以卵圈计算非滞育卵率为23.53％。

虽然家蚕二化性品种亲代蚕种采用15℃～20℃黑暗催青，获得的幼虫正常饲养都可以制备获得子代非滞育蚕卵，但是15℃黑暗催青时亲代幼虫生命率低，20.0℃黑暗催青时子代非滞育卵率低，因此不适宜转基因用蚕卵的制备。而17.0℃～17.5℃黑暗催青，不仅亲代体质正常，而且子代非滞育卵率达到96％以上，所以采用本发明制备家蚕实用品种转基因用蚕卵时，亲代蚕种最适宜的催青温度是17℃～17.5℃。

制作条件

(1)应具备家蚕品种繁育设备和技术。

(2)应具备温度可控的蚕种催青设备(15℃～26℃)和饲养场所(24℃～28℃)(中国农业科学院蚕业研究所主编，中国养蚕学，上海科技出版社，1991年1月：629-709)。

Claims (2)

1.一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其特征包括如下步骤：

(1)家蚕实用品种的准备：选择家蚕二化性中国系统实用品种“秋丰”，以正常饲养繁殖制备的越年蚕卵为亲本材料；

(2)亲本蚕卵胚胎发育的调节：将经过冬季冷藏30～60日胚胎活化的越年蚕卵置于10-15℃的环境中，调节胚胎发育至丙₂期；

(3)亲本蚕卵的催青：从蚕卵丙₂胚胎期开始，采用15～20℃温度黑暗催青，胚胎发育至已₅期即蚕卵转青时改用25～26℃温度催青，直至蚕卵孵化获得幼虫；

(4)亲代家蚕的饲养和非滞育蚕卵的制备：将步骤(3)中孵化获得的幼虫，按品种分别饲养，羽化后同一品种的雌蛾与雄蛾交配，制备获得的子代蚕卵即为非滞育蚕卵。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕实用品种转基因用蚕卵的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的胚胎发育至已₅期为经过30～18日。