CN102864165A - 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法 - Google Patents

一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102864165A
CN102864165A CN2012103003799A CN201210300379A CN102864165A CN 102864165 A CN102864165 A CN 102864165A CN 2012103003799 A CN2012103003799 A CN 2012103003799A CN 201210300379 A CN201210300379 A CN 201210300379A CN 102864165 A CN102864165 A CN 102864165A
Authority
CN
China
Prior art keywords
brush
plant
seed
seedling
wicresoft
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012103003799A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102864165B (zh
Inventor
王海波
吕孟雨
董福双
张艳敏
任志恒
杨帆
孙果忠
徐显
石学萍
张欢欢
赵和
柴建芳
高义平
刘永伟
朱金永
韩秋芬
张强
马辉杰
王占武
关军锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Original Assignee
INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES filed Critical INSTITUTE OF GENETICS AND PHYSIOLOGY HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY SCIENCES
Priority to CN201210300379.9A priority Critical patent/CN102864165B/zh
Priority to US14/422,650 priority patent/US20160135379A1/en
Priority to PCT/CN2012/001266 priority patent/WO2014029045A1/zh
Publication of CN102864165A publication Critical patent/CN102864165A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102864165B publication Critical patent/CN102864165B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G22/00—Cultivation of specific crops or plants not otherwise provided for
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法。其技术要点是：去掉一片子叶暴露生长点，用可移栽的营养基质体育苗；用刷毛单根直径4～20μm、露出长度0.5～3mm、根数100～5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对所述生长点刺刷，实施非离体转化；完成共培养后进一步发育成苗，带营养基质体移栽，促铃、荚、果及籽粒发育，分株收获；T1代进行鉴定。本发明的优点是不需要离体培养、不需要嫁接、不受基因型限制、不必须抗性筛选、移栽成活率高且缓苗快、操作简便、易规模化，适用于所有结种子的双子叶植物。利用本发明在棉花、大豆的转化中，分别获得了转化率为50%和76.5%的转化效果。

Description

一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法
技术领域
本发明涉及一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，适用于所有结种子的双子叶植物。
背景技术
在诸多植物转基因方法中，农杆菌介导法最被普遍认可。它具有获得的转基因植株育性较高、外源基因多以单拷贝或低拷贝在受体中整合、可转移大片段DNA等优点。但是，目前所有以农杆菌介导为基础的转基因技术，大都离不开组织培养，故存在着受基因型限制、操作复杂、需借助抗性标记筛选、无性系变异率高、周期长、转化效率低、转化结果不稳定等突出问题。以大豆、棉花等为代表的双子叶植物的转基因，多是在一些容易培养的基因型中取得了成功，所建技术难以广泛应用。
植物种子芽或幼苗的茎生长点是形成生殖器官和地上大部分营养体的原始细胞群。萌发后的双子叶植物种子芽或幼苗的茎生长点，具有很强的再生能力和发育补偿能力，去掉一片子叶和已分化的幼叶后，乃至受到较强的创伤后，仍然能发育成正常的植株，是实施转基因的理想受体。
有的报道和专利虽也注意到了用种子芽或茎的生长点做受体的优势，但对生长点的发育特点研究得不够，未形成稳定、简易、高效的技术方案和技术体系，存在较多问题，如：对双子叶植物种子芽或茎的生长点的转化多在离体状态下进行，转化后需要复杂的嫁接和较漫长的恢复生长过程，成功率不高；对生长点的创伤不够充分，转化效果较差；有的甚至不做创伤处理，就用农杆菌进行转化，效果难以保障，等等。
中国专利《一种转化大粒种子植物的方法及其应用》（专利号：01104428.4），所述方法主要包括以下步骤：（1）取大粒种子或成熟胚或未成熟胚萌发，得到受体植株;（2）以幼年的受体植株为材料，在适宜时机剥去芽鞘或子叶及幼叶，裸露出茎尖作为遗传转化的直接受体；（3）用农杆菌介导法转化受体植株的茎尖，将目的基因导入茎尖分生组织细胞；（4）转化后的植株长出3～4片新叶后喷洒选择剂，筛选出表现抗性的转基因植株；（5）对转基因植株的子代进行抗性和分子证据检测，选出转基因个体。
所述大粒种子包括大豆、棉花等。
所述“适宜时机”因植物种类而异，且以植物生长点处于对农杆菌为最佳感受态时为最佳。
上述专利的主要问题如下：
（1）转化措施过笼统，缺乏一些必要的条件限定，如是否对生长点进行创伤、如何创伤等，无明确要求，确定性差、保障性差。
（2）转化后的植株长出3～4片新叶后喷洒选择剂，容易淘汰被有效转化了的嵌合体，即淘汰那些形成生殖器官的细胞已被转化但其他部位未被转化的植株，选出的抗性株又未必是被有效转化了的。
而其他有关以生长点为转化对象的专利和报道，大都存在离不开“离体培养”环节、筛选策略使用不当等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不需要离体培养、不需要离体转化和嫁接、不必须抗性筛选、不再移栽困难和缓苗慢、操作简易方便、转化效率高、转化效果稳定、实用性强、易于规模化、耗费成本低的一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：
一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于：
（1）前期准备
在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；用纸卷成直径2～5cm的纸筒，做成纸桶，加满蛭石，制成微型柱状可连同苗一起移栽的“营养基质体”，将其纵向排放于塑料盒内备用；
（2）受体及侵染液的准备
选取拟转化植物的饱满、无破损、无病斑、无霉变的种子，常规消毒，用无菌水洗3～5遍；对于子叶皱摺不容易分开的植物，将种皮较厚的种子浸泡7h～10h,将种子播于所述营养基质体，播深0.5～1.0cm，沿盒壁浇水使水渗透至纸桶顶部的蛭石，盖上盒盖，培养3d至子叶分开；对于子叶易分开的植物，将种子置于消过毒的含2层滤纸的培养皿中，加刚好使种子吸胀水量的无菌水，培养2～3d至根长达0.4cm以上；所述受体为经上述处理过的种子芽或幼苗茎的生长点；
培养条件：25℃、暗培养；
所述子叶皱摺不易分开的植物包括棉花；所述子叶易分开的植物包括大豆、绿豆和黄瓜；
挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接种到含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm培养至菌液OD600=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5～1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液摇匀，制成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；
所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS盐、30g/L葡萄糖、68g/L蔗糖，pH 5.6；
（3）生长点暴露与用微创转基因刷转化
去掉一片子叶暴露种子芽或幼苗茎的生长点，用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准欲转化的种子芽或幼苗茎的生长点刺刷2～3次；
（4）共培养
对于子叶皱摺不容易分开的植物，转化处理后，将装有所述营养基质体的塑料盒盖盖上培养；对于子叶易分开的植物，转化后按去子叶面向上的方向放于加有2层滤纸的培养皿，所述滤纸用无菌水润湿，盖上培养皿盖培养；
共培养条件：25℃、暗培养3d；
（5）成苗培养及移栽
完成共培养后，对于已在所述营养基质体上生长的植物，将塑料盒盖揭开进行光照培养，培养至长出1片真叶展开；对于子叶易分开的植物，光照培养1d后，按根朝下的方向插到所述营养基质体上，培养至1片真叶展开；
培养条件：25℃，光照12h /d；
成苗后连同所述营养基质体一起移栽于按转基因管理标准隔离的温室或农田；
（6）苗及植株管理
采取光温水肥措施，促进苗健壮发育，促进植株多长果枝、多结桃或荚或果、多结籽粒；
（7）检测
在T0代不进行检测，以免结果不真实；将T0代植株所结的种子，按单株收获；将所收种子萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料，进行Southern blot检测予以确证。
所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛纤维的直径为4～20μm，每刷的刷毛根数为100～5000根，刷毛露出长度0.5～3mm。
所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8～18μm，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为1～2mm。
所述“刺刷”为既刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准种子芽或幼苗的茎生长点顶部直刺，送入带有外源基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个种子芽或幼苗茎的生长点象梳头一样刷划，送入带有外源基因的农杆菌。
本发明的技术原理如下：
申请人研究发现：（1）棉花、大豆种子芽或幼苗茎的生长点细胞直径均为50μm左右。（2）将棉花、大豆种子萌发，待子叶能展开时，去掉一片子叶暴露茎生长点，不影响以后的正常发育。但是，长大了的苗移栽时极易伤根，从而影响移栽的成活率和以后的发育速度。据此，申请人建立了既能使子叶尽早展开，又不伤根的微型柱状可移栽“营养基质体”育苗技术，找到了既可以对种子芽或幼苗茎的生长点尽早地实施非离体的转化，又可以保障移栽成活的方法。（3）欲获得好的转化效果，必须对生长点进行充分的微创伤。为此，申请人发明了由若干根（100～5000根）微米级刚性纤维（即不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维，单根直径4～20μm）组成的可对生长点实施较充分微创伤的转基因工具——微创转基因刷，简称“微创刷”或“转基因刷”。用这种微创刷蘸带目的基因的农杆菌对生长点实施转化，可获得很好的转化效果。（4）适当控制转化处理后的苗生长环境，使受微创的细胞不胀破、不萎缩，并促进农杆菌与受创细胞结合，可提升转基因的效果。（5）微创转化处理后的茎生长点，可以基本不受影响地发育成植株并开花结桃或荚或果、结籽，比一般的转化技术耗时少、效果好。（6）将转化处理后长成的植株所结的种子分桃或荚或果、分枝、分株进行收获，再将种子萌发成苗（T1代）针对外源基因进行鉴定，不需要抗性筛选，不需要特别的选择标记，检测结果可显示出整个植株被转化部位的分布情况，既具体又准确。（7）这样的做法也适用于绿豆、黄瓜等。
在此基础上，申请人还建立了评价这种转基因技术的专门指标：
损伤率与成株率：用“微创刷”刺刷种子芽或幼苗茎的生长点时，有些生长点难免会因受伤过重而不能成株。它们所占的百分率，即为“损伤率”。与之对应的便是“成苗率”。                                               
Figure 599114DEST_PATH_IMAGE001
Figure 291126DEST_PATH_IMAGE002
转化率：转化处理后，所有长成植株中“有转化种子的植株”所占的百分率。
Figure 28138DEST_PATH_IMAGE003
转化度：单株种子总粒数中，“转化种子”所占的百分率，可按桃或荚或果、枝等测出的布局情况形成转化分布图。此指标反映的是 芽生长点或茎生长点被转化的程度和状态。
Figure 251657DEST_PATH_IMAGE004
本发明的有益效果是使农杆菌介导的双子叶植物转基因方法具备了不再依赖离体培养、不再需要离体转化和嫁接、不再有苗移栽困难和缓苗慢的问题、不再必须抗性筛选、操作简易方便、转化效率高、转化效果稳定、实用性强、易于规模化、耗费成本低等诸多优点，本发明适用于所有结种子的双子叶植物。
附图说明
图1为微创刷的结构示意图。图中，A：刷毛材质为不锈钢纤维的微创刷，B：刷毛材质为玻璃纤维的微创刷，C：刷毛材质为碳硅纤维的微创刷，a：刷毛单根直径为8μm、刷毛根数为4000根（不锈钢纤维）的微创刷，b：刷毛单根直径为4μm、刷毛根数为200根（不锈钢纤维）的微创刷，c：刷毛单根直径为16μm、刷毛根数为200根（不锈钢纤维）的微创刷。
图2为重要双子叶植物芽生长点纵切显微观察图片。图中，a为棉花芽生长点纵切显微观察图，b为大豆芽生长点纵切显微观察图。
图3为典型双子叶植物茎生长点微创转化关键图片集锦——棉花。图中，a为准备好的受体苗，b为生长点放大观察图（圆圈所框部分即生长点的位置），c为微创转基因刷(局部)，d为用微创刷转化生长点的实况图，e为转化后只带1片子叶的幼苗，f为T0代植株，g为T0代株所结种子的萌发苗（T1代），h为PCR检测结果图。
图4为所有参试双子叶植物生长点微创转化当代及后代植株图片集锦。图中，a为转基因防护温室，b为转基因棉花T2代植株，c为大豆T0代移栽成活苗，d为转基因大豆的T2代植株，e为转基因绿豆T0代植株，f为转基因黄瓜T0代植株。
图5为棉花T1代抗性植株NPT-Ⅱ基因的PCR检测结果。
图6为棉花T2代植株基因组Southern blot分析结果。图中，ck+为质粒对照，ck-为阴性对照，1～11为被测样品。
图7为大豆T1代BAR基因的PCR检测结果。
图8为大豆T2代基因组的Southern blot检测结果。图中，M为Mark，1～8为被测样品，9为质粒，10为PCR产物对照。
具体实施方式
实施例1:利用微创刷转化棉花幼苗茎生长点的实验
1、材料与方法
棉花品种：冀棉27。
农杆菌株：C58C1。
外源基因：gus+npt-Ⅱ，构建于质粒pCAMBIA2201。
挑取单菌落，接种到100ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.5，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/5所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS盐、30g/L葡萄糖、68g/L蔗糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
用纸卷成直径2～5cm的纸筒，做成纸桶，加满蛭石，制成微型柱状可连同苗一起移栽的“营养基质体”，将其纵向排放于塑料盒内备用；选取完整饱满的棉花种子40粒，浸泡7h，播种到塑料盒内的所述营养基质体中，播深1cm，将蛭石浇水浸透，盖上塑料盒盖，置于25℃暗培养3d至子叶展开。去除1片子叶，暴露茎生长点，用刷毛单根直径8 μm、根数5000根、刷毛露出长度2mm的转基因刷蘸农杆菌介导转化液对茎生长点刺刷2～3次，盖上塑料盒盖，置于25℃暗培养3d。然后揭开塑料盒盖，光照12h/d培养至1片真叶展开，连同所述营养基质体一起移栽于按标准防护的温室。
按株分收棉铃、剥取种子，然后按T0代株分组萌发育苗，用10g/L的卡那霉素溶液涂抹叶片进行抗性鉴定，从抗性植株分别剪取部分叶片提取DNA，用npt-Ⅱ基因的引物（上游：5′- TGT TCC GGC TGT CAG CGC AG - 3′；下游：5′- TCG GCA AGC AGG CAT CGC CA - 3′）进行PCR检测。根据PCR结果计算转化度和转化率。将PCR阳性株自交分离，选择再次PCR阳性的后代，进行Southern blot检测验证。
2.实验结果
40粒种子中，31粒萌发成正常幼苗，对其茎生长点实施转化处理后，有14株进一步发育成株，成株率达45.2%，共结种子605粒（由于温室条件不佳，近2/3的种子干瘪）。按株分组将这些种子萌发，有213粒成苗，分别来自12个T0代株，有2株的种子因成熟度不够未发出苗。在卡那霉素抗性鉴定的基础上，对T1代苗中有抗性的植株进行PCR检测（图5），44株表现阳性，分别来源于6个T0代株，由此可见转化率达到了50%（6÷12×100%），每株的转化度分别为2.3%、11.1%、14.3%、33.3%、57.1%、53.8%。对T2代中的PCR阳性株进行Southern blot检测（图6），表明外源基因npt-Ⅱ整合到了棉花基因组中。
实施例2:利用微创刷转化大豆种子芽生长点的实验
1、材料与方法
大豆品种：冀豆16号。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：bar+pta+bt，构建于质粒pCAMBIA3300。
挑取单菌落，接种到100ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10MS盐，30g/L葡萄糖，68g/L蔗糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；选取完整饱满无霉变的大豆种子21粒，放到直径为9cm的玻璃培养皿内加10ml无菌水发芽，置于25℃暗培养3d。去除1片子叶，暴露种子芽生长点，用刷毛单根直径20μm、每刷2000根刷毛、刷毛露出长度3mm的转基因刷蘸农杆菌介导转化液，对种子芽生长点刺刷2～3次，以去子叶面向上的方向摆放于灭过菌的含2层滤纸（用无菌水润湿）的直径9cm玻璃平皿中，盖盖保湿，25℃暗培养3d。然后光照培养1d，按根朝下方向移入所述营养基质体，并加水润湿，培养至1片真叶展开，连同所述营养基质体一起移栽到按要求防护的温室。
分株收获各株所结的种子，按T0代植株分组萌发育苗，从长成的苗上分别剪取部分叶片提取总DNA，用bar的引物（上游：5′- ATG AGC CCA GAA CGA CGC C - 3′；下游：5′- TCA GAT CTC GGT GAC GGG CA - 3′）进行PCR检测。根据PCR结果计算转化度和转化率。将PCR阳性植株进行自交分离，选择再次PCR阳性的后代，进行Southern blot检测验证(委托北京美莱博医学科技有限公司完成)。
2、实验结果
21粒种子中，19粒正常萌发，对其芽生长点实施转化处理，获得17株成苗，共收获种子66粒。将这些种子按T0代株号分组播种，有61粒出苗，逐株进行PCR检测（图7），有27株表现阳性，来源于13个T0代植株，转化率为76.5%(13÷17×100%)，虽然结种子数较少但转化度较高，其中有2株达到了100%、3株为66.7%、4株为50%、4株为33.3%～46.2%。选择部分PCR阳性植株进行Southern blot检测，表明外源基因以单拷贝整合到了大豆基因组中（图8）。
实施例3:利用微创刷转化不同大豆品种种子芽生长点的实验
1、材料与方法
大豆品种：冀豆12号、冀豆17号。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：bar+pta+bt，构建于质粒pCAMBIA3300。
挑取单菌落，接种到50ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于1/5所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10 MS盐，30g/L葡萄糖，68g/L蔗糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；将每个大豆品种分别选取完整饱满无霉变的种子30粒，放到直径为9cm的玻璃培养皿内加10ml无菌水发芽，置于25℃暗培养2d。去除1片子叶，暴露芽生长点，用刷毛单根直径18 μm、刷毛根数2000根、刷毛露出长度3mm的转基因刷蘸农杆菌介导转化液刷2～3次，以去子叶面向上的方向摆放于灭过菌的含2层滤纸（用无菌水润湿）的直径为9cm玻璃培养皿中，盖盖保湿，25℃暗培养3d。然后光照培养2d，根长达0.4cm以上，按根朝下方向移栽到所述营养基质体，并加水润湿，培养至1片真叶展开时，带所述营养基质体移栽到按要求防护的温室。
分别收获各株所结的种子，按T0代株分组萌发育苗，剪取部分叶片分别提取总DNA，用bar的上游（5′- ATG AGC CCA GAA CGA CGC C - 3′）、下游（5′- TCA GAT CTC GGT GAC GGG CA - 3′）引物进行PCR检测，根据PCR结果计算转化率。
2、实验结果
两个不同基因型的大豆品种均被成功转化，表明基因型不是转化的限制因素。具体结果如下：
冀豆12号：30粒种子中，全部正常萌发，对28粒的芽生长点实施转化处理，获得23株成苗，共收获种子44粒。将这些种子分株播种，有42粒出苗，逐株进行PCR检测，有9株表现阳性，来源于8个T0代植株，转化率为34.8%（8÷23×100%）。
冀豆17：30粒种子中，全部正常萌发，对29粒芽生长点实施转化处理，获得27株成苗，共收获种子78粒。将这些种子分株播种，有78粒出苗，逐株进行PCR检测，有9株表现阳性，来源于8个T0代植株，转化率为29.6%（8÷27×100%）。
实施例4：利用微创刷转化绿豆种子芽生长点的实验
1、材料与方法
绿豆品种：冀绿7号。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：bar+pta+bt，构建于质粒pCAMBIA3300。
挑取单菌落，接种到50ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，重新悬浮于1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10 MS盐，30g/L葡萄糖，68g/L蔗糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
在直径为9cm玻璃培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；选取完整饱满无霉变的绿豆种子20粒，放到直径为9cm的玻璃培养皿内加5ml无菌水发芽，置于25℃暗培养1d。去除1片子叶，暴露茎生长点，用刷毛单根直径10μm、刷毛根数100根、刷毛露出长度1mm的转基因刷蘸农杆菌介导转化液刺刷2～3次，以去子叶面向上的方向摆放于灭过菌的含2层滤纸（用无菌水润湿）的直径为9cm玻璃培养皿中，盖盖保湿，25℃暗培养3d。然后光照培养1d，按根朝下方向插入营养基质体，并加水润湿，培养至1片真叶展开时，带营养基质体移栽到按要求防护的温室。
分株收获各株所结的种子，按T0代植株分组萌发育苗，剪取部分叶片分别提取总DNA，用bar的引物（上游：5′- ATG AGC CCA GAA CGA CGC C - 3′；下游：5′- TCA GAT CTC GGT GAC GGG CA - 3′）进行PCR检测。根据PCR结果计算转化率。
2、实验结果
20粒种子中，全部正常萌发，对其中15粒实施芽生长点转化处理，11株成苗。移栽后10株成活并结荚，结荚数2～3个，取最上荚的种子（3～6粒）分株播种，逐株进行PCR检测，有7个T0代植株为被有效转化株，转化率为70%（7÷10×100%）。
实施例5:利用微创刷转化黄瓜种子芽生长点的实验
1、材料与方法
黄瓜品种：欧朗-Km567。
农杆菌株：EHA105。
外源基因：bar+pta+bt，构建于质粒pCAMBIA3300。
挑取单菌落，接种到50ml含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃、220 rpm条件下培养至菌液OD600=0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液（含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES，1/10MS盐，30g/L葡萄糖，68g/L蔗糖，pH 5.6）摇匀制备成农杆菌介导转化液。
在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；选取完整饱满无霉变的种子30粒，放到直径为9cm的玻璃培养皿内加4ml无菌水发芽，置于25℃暗培养2d。去除1片子叶，暴露芽生长点，用刷毛单根直径4μm、刷毛根数90根、刷毛露出长度0.5mm的转基因刷蘸转化液刺刷2～3次，以去子叶面向上的方向摆放于灭过菌的含2层滤纸（用无菌水润湿）的直径为9cm玻璃培养皿中，盖盖保湿，25℃暗培养3d。然后光照培养1d，按根朝下方向插入所述营养基质体，并加水润湿，培养至1片真叶时，带所述营养基质体移栽到按要求防护的温室。
分株收获各株所结的种子，按T0株分组萌发育苗，剪取部分叶片分别提取总DNA，用bar的上游（5′- ATG AGC CCA GAA CGA CGC C - 3′）、下游（5′- TCA GAT CTC GGT GAC GGG CA - 3′）引物进行PCR检测。根据PCR结果计算转化率。
2、实验结果
30粒种子中，26粒萌发，对19粒的芽生长点实施转化处理，14株成苗。移栽温室后成活9株，因夏季温室温度过高5株受到热害、4株发育正常，取第一个成熟果中的种子，分株播种，逐株进行PCR检测，有3个T0代植株检测到阳性后代，转化率为75%（3÷4×100%）。

Claims (4)

1.一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于：
（1）前期准备
在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；用纸卷成直径2～5cm的纸筒，做成纸桶，加满蛭石，制成微型柱状可连同苗一起移栽的“营养基质体”，将其纵向排放于塑料盒内备用；
（2）受体及侵染液的准备
选取拟转化植物的饱满、无破损、无病斑、无霉变的种子，常规消毒，用无菌水洗3～5遍；对于子叶皱摺不容易分开的植物，将种子播于所述营养基质体，播深0.5～1.0cm，沿盒壁浇水使水渗透至纸桶顶部的蛭石，盖上盒盖，培养3d；对于子叶易分开的植物，将种子置于消过毒的含2层滤纸的培养皿中，加刚好使种子吸胀水量的无菌水，培养2～3d至根长达0.4cm以上；所述受体为经上述处理过的种子芽或幼苗茎的生长点；
培养条件：25℃、暗培养；
所述子叶皱摺不易分开的植物包括棉花；所述子叶易分开的植物包括大豆、绿豆和黄瓜；
挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接种到含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm暗培养至菌液OD600=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液加入1/5～1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液摇匀，制成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；
所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS盐、30g/L葡萄糖、68g/L蔗糖，pH 5.6；
（3）生长点暴露与用微创转基因刷转化
去掉一片子叶暴露种子芽或幼苗茎的生长点，用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准欲转化的种子芽或幼苗茎的生长点刺刷2～3次；
（4）共培养
对于子叶皱摺不容易分开的植物，转化处理后，将装有所述营养基质体的塑料盒盖盖上培养；对于子叶易分开的植物，转化后按去子叶面向上的方向放于加有2层滤纸的培养皿，所述滤纸用无菌水润湿，盖上培养皿盖培养；
共培养条件：25℃、暗培养3d；
（5）成苗培养及移栽
完成共培养后，对于已在所述营养基质体上生长的植物，将塑料盒盖揭开进行光照培养，培养至长出1片真叶展开；对于子叶易分开的植物，光照培养1d后，按根朝下的方向插到所述营养基质体上，培养至1片真叶展开；
培养条件：25℃，光照12h /d；
成苗后连同所述营养基质体一起移栽于按转基因管理标准隔离的温室或农田；
（6）苗及植株管理
采取光温水肥措施，促进苗健壮发育，促进植株多长果枝、多结桃或荚或果、多结籽粒；
（7）检测
在T0代不进行检测，以免结果不真实；将T0代植株所结的种子，按单株收获；将所收种子萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料，进行Southern blot检测予以确证。
2.根据权利要求1所述的一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛纤维直径为4～20μm，每刷的刷毛根数为100～5000根，刷毛露出长度0.5～3mm。
3.根据权利要求2所述的一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷的刷毛单根直径为8～18μm，每刷的刷毛根数为大于100根、小于等于2000根，刷毛露出长度为1～2mm。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于所述“刺刷”为既刺又刷；所述“刺”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准种子芽或幼苗的茎生长点顶部直刺，送入带有外源基因的农杆菌；所述“刷”为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个种子芽或幼苗的茎生长点象梳头一样刷划，送入带有外源基因的农杆菌。
CN201210300379.9A 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法 Expired - Fee Related CN102864165B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210300379.9A CN102864165B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法
US14/422,650 US20160135379A1 (en) 2012-08-22 2012-09-14 Dicotyledon transgenic method for invading growing points of seed sprouts or seedling stems minimally and fully
PCT/CN2012/001266 WO2014029045A1 (zh) 2012-08-22 2012-09-14 充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210300379.9A CN102864165B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102864165A true CN102864165A (zh) 2013-01-09
CN102864165B CN102864165B (zh) 2014-01-29

Family

ID=47443292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210300379.9A Expired - Fee Related CN102864165B (zh) 2012-08-22 2012-08-22 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20160135379A1 (zh)
CN (1) CN102864165B (zh)
WO (1) WO2014029045A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103667342A (zh) * 2013-11-29 2014-03-26 河南科技学院 一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法
CN109892227A (zh) * 2019-03-27 2019-06-18 河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心） 一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法及其应用
CN116445537A (zh) * 2023-06-19 2023-07-18 海南大学三亚南繁研究院 一种龙珠果的遗传转化方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019018059A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, método para produzir um polipeptídeo, método de controle de ervas daninhas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
CN113854091B (zh) * 2020-07-30 2022-04-19 佛山市连艺生物科技有限公司 一种提高红火炬郁金田间栽培/盆栽品质的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201459148U (zh) * 2009-06-12 2010-05-12 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种植物芽生长点微创转基因刷

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110162111A1 (en) * 2009-12-31 2011-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for transforming somatic embryos
CN102321662A (zh) * 2011-07-14 2012-01-18 中国科学院植物研究所 植物茎尖转化方法及其专用工具

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN201459148U (zh) * 2009-06-12 2010-05-12 河北省农林科学院遗传生理研究所 一种植物芽生长点微创转基因刷

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姚冉等: "农杆菌介导的植物遗传转化研究进展", 《生物技术进展》 *
王秀芹等: "农杆菌介导的玉米转基因研究进展", 《安徽农业科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103667342A (zh) * 2013-11-29 2014-03-26 河南科技学院 一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法
CN103667342B (zh) * 2013-11-29 2015-10-28 河南科技学院 一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法
CN109892227A (zh) * 2019-03-27 2019-06-18 河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心） 一种利用玉米芽生长点直接分化多茎的方法及其应用
CN116445537A (zh) * 2023-06-19 2023-07-18 海南大学三亚南繁研究院 一种龙珠果的遗传转化方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20160135379A1 (en) 2016-05-19
WO2014029045A1 (zh) 2014-02-27
CN102864165B (zh) 2014-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102876712B (zh) 一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法
CN102864165B (zh) 一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法
CN104542299B (zh) 一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法
CN101884294A (zh) 一种缩短杂交柑橘童期的方法
CN102174562A (zh) 一种新型生根方法在大豆转基因技术中的应用
CN102212552A (zh) 一种利用化学杀雄剂高效活体转化基因的方法
CN112335549A (zh) 一种通过组织离体培养获得落叶松再生植株的方法
CN112544440A (zh) 块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法
CN101736028B (zh) 一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法
CN109735538A (zh) 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
CN105505991B (zh) 一种龙眼快速转基因方法
CN103340180A (zh) 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法
CN101935672B (zh) 木本植物的活体生长锥农杆菌转化法
CN106811482A (zh) 三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法
CN106332779A (zh) 一种绞股蓝组培快速繁殖方法
CN106978440B (zh) 一种外源基因导入红腺忍冬的方法
CN105420272A (zh) 一种培育无选择标记抗除草剂转基因植物的方法及其专用载体
CN103053426A (zh) 山葵幼苗培养方法
CN113564201B (zh) 一种十字花科作物花粉电击遗传转化方法
CN102321666A (zh) 双子叶植株转基因受体的快速制备方法
Jalaja Micropropagation of sugarcane varieties for quality seed production
CN117844855A (zh) 一种利用甘蔗种茎快速获得转基因甘蔗的方法
KR100470451B1 (ko) 노지재배용 부추 신품종 식물
CN113647330A (zh) 一种创制花生新种质与育种方法
CN113678731A (zh) 一种快速培育花生品种的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140129

Termination date: 20190822

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee