CN102321666A - 双子叶植株转基因受体的快速制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双子叶植株转基因受体的快速制备方法，包括以下步骤：1)双子叶植株种子的表面消毒；2)双子叶植株种子的吸胀：将灭菌后双子叶植株种子放入灭菌后的分化罐中，并加入无菌水，灭菌后双子叶植株种子在黑暗下于18～22℃浸泡12～15小时；得吸胀后双子叶植株种子；3)受体的制备：将吸胀后双子叶植株种子置于无菌吸水纸中，沿着种脐纵向切割从而将子叶分开两瓣，去除种皮，得双子叶植株转基因受体。本发明使转基因程序简便宜行、效率稳定，对提高双子叶植株(例如大豆)转基因效率意义重大。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种快速、稳定高效的双子叶植株(例如大豆)转基因用受体的制备方法，用于培育稳定的转基因株系；同时本发明利用相关受体材料开展大豆及其他双子叶植株转基因的程序。
背景技术
大豆(Glycine max L. Merrill)是属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n＝40)植物，是中国乃至全球重要的粮食作物和经济作物，是食用植物油、蛋白等的主要来源之一，在国内外市场占有十分重要的地位。然而，普通栽培大豆由于遗传基础相对狭窄，育种周期相对较长，且受各种病、虫害及各种非生物逆境的影响，仅靠常规育种手段培育的大豆的品质和产量难以满足国内外市场对大豆日益增长的需求。与此同时，借助分子生物学手段培育的转基因大豆被越来越多的人所接受。植物转基因技术作为一种新兴的生物技术手段，在抗性育种、提高产量和品质以及缩短育种周期等方面有着显著的优势。由此可见，通过遗传工程手段可为传统的大豆育种提供新的思路和方法。
利用遗传转化技术将有功能的目的基因转入大豆基因组需要一种快速有效地转基因整合和转化植株的再生的方法。现在全世界应用最多的两种转化大豆的方法，一种是利用基因枪轰击大豆不成熟胚，这种方法需要很长时期培养组织；另一种方法是根癌农杆菌介导的转化大豆组织，例如胚轴、从萌发种子中分离的不成熟子叶或子叶节组织。早前报道，农杆菌介导转化大豆子叶节法产生的转基因大豆，这种方法需要在发芽5-7天的大豆幼苗的子叶节位置进行精细的致伤(Clemente et al.，2000；Olhoft & Somers，2001；Olhoft et al.，2003；Paz et al.，2004；Zhang et al.，1999 & 2000)。这种方法不仅步骤烦琐、周期较长，而且由于受体材料在制备过程中受到操作者技术的影响，重复性较差；同时相对较长的培育期也造成受体材料中细胞有5天的发育期，因而细胞的被转化效率明显下降，转化后嵌合体比例增加。
上述参考文献具体如下：
1.Clemente T， LaValle BJ，Howe AR，Ward DC et al.(2000)Progeny analysis ofglyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-mediated transformation.Crop Sci 40：797-803(Clemente T， LaValle BJ，Howe AR，Ward DC et al.(2000)农杆菌介导法抗草甘膦转基因大豆的后代分析.美国作物科学杂志40：797-803.)。
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4.Zhang Z，Xing A，Staswick P，Clemente T(1999)The use of glufosinate as a selectiveagent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean.Plant Cell Tiss Org Cult56：37-46(Zhang Z，Xing A，Staswick P，Clemente T(1999)利用草丁膦进行筛选的农杆菌介导的大豆转基因方法。植物细胞、组织和器官培养.56：37-46)。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能快速制备双子叶植株转基因受体的方法，该方法能将整个转基因程序缩短5天，并节省了工时和发芽培养基的消耗，使双子叶植株转基因的体系具有高效和稳定的特点，本发明的方法同时可用于豇豆等双子叶植物的转基因。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种双子叶植株转基因受体的快速制备方法，包括以下步骤：
1)、双子叶植株种子的表面消毒：
将双子叶植株种子单层置于培养皿中，将上述装有双子叶植株种子的培养皿开盖放入干燥器内，在干燥器内加入质量浓度为5～6％的次氯酸钠溶液，然后再加入11～13mol/L的HCl溶液，次氯酸钠溶液与HCl溶液的体积比为100∶3～4；
密封干燥器后，于室温下灭菌10～16小时；
灭菌完成后，先将培养皿加盖，然后从干燥器内转移到无菌超净台上，打开培养皿的盖子以除去培养皿内的残留氯气；得灭菌后双子叶植株种子；
2)、双子叶植株种子的吸胀：
将灭菌后双子叶植株种子放入灭菌后的分化罐中，并加入无菌水，灭菌后双子叶植株种子在黑暗下于18～22℃浸泡12～15小时；得吸胀后双子叶植株种子；
3)、受体的制备：
将吸胀后双子叶植株种子置于无菌吸水纸中，沿着种脐纵向切割从而将子叶分开两瓣，去除种皮，得双子叶植株转基因受体。
作为本发明的双子叶植株转基因受体的快速制备方法的改进：双子叶植株为大豆或豇豆。
作为本发明的双子叶植株转基因受体的快速制备方法的进一步改进：步骤1)中：每个培养皿中放置120～170颗大豆种子，每个干燥器内放置3～4个所述装有大豆种子的培养皿；在干燥器内加入100ml质量浓度为5～6％的次氯酸钠溶液和3～4ml的摩尔浓度为11～13mol/L的HCl溶液。
作为本发明的双子叶植株转基因受体的快速制备方法的进一步改进：步骤1)中：打开培养皿的盖子以除去培养皿内的残留氯气的时间为25～40分钟。
本发明所得的转基因受体，用于大豆和其他双子叶植物转基因的程序，具有转基因周期短、效率高等特点。
在本发明的步骤中，用无菌水浸泡干燥大豆种子12-15小时，浸泡后的大豆用手术刀切开为二瓣作为2个转基因用的受体材料。与已发表的子叶节大豆转基因方法相比，本方法省去了种子发芽所需的培养基和时间，同时也省去了原程序中对发芽豆苗进行精细致伤的步骤，使外植体制备时间缩短到原来所需时间的1/3，同时对操作人员的技术要求大大降低。
本发明所用的受体制备方法适用于大豆“黑农37”、“黑农58”、“中黄39”、“中豆32”、“华春3号”、“华春5号”等全国各地大豆品种，及美国的大豆品种“威廉姆斯82(Williams 82)”。本方法也可用于豇豆转基因，已在豇豆品种“邦达夏龙”、“之豇28-2”和“高产8号”中应用，均能显著提高转基因效率。
本发明直接用吸胀种子通过子叶的简单分离，从而获得子叶节受体，再进行农杆菌介导转化。本发明的转基因程序在受体准备中省去了种子萌发所需的5-7天的时间及相应的培养基，同时程序中不需要对受体进行精细的致伤，提高了目的组织的获得效率从而增加了转化受体数目。本发明使大豆转基因程序简便、快速易行、效率稳定，对提高大豆及其他双子叶植物转化效率，意义重大。
本发明的外植体具有制备简便、快速、转基因效率高等特点，本发明所得的受体材料能进行大豆及其他双子叶类植物的各种转基因程序，具有通用性。
综上所述，利用遗传转化技术将有目的基因转入大豆基因组，需要一种快速有效地转基因整合和转化植株的再生的方法。全世界应用最多的大豆转基因方法是通过根癌农杆菌介导，转化大豆组织，例如胚轴、从萌发种子中分离的不成熟子叶或子叶节组织。其中农杆菌介导转化大豆子叶节法是其中最常用的方法。在农杆菌介导转化大豆子叶节转化法中，转基因受体材料主要利用发芽5天后的幼苗。这种方法不仅步骤烦琐、周期较长，而且由于受体材料制备过程中受到操作者技术的影响，重复性较差；同时相对较长的培育期也造成受体材料中细胞有5天的发育期，因而细胞的被转化效率明显下降，转化后嵌合体比例增加。本发明的转基因程序在外植体准备中省去了种子萌发所需的5-7天的时间及相应的培养基，同时程序中不需要对外植体进行精细的致伤，不仅提高了目的组织的获取效率从而增加了转化外植体数目，还显著地提高了大豆转基因的效率。本发明使转基因程序简便宜行、效率稳定，对提高大豆转基因效率意义重大。本发明同时可应用于其他双子叶植物如豇豆转基因程序的制定和改进。
附图说明
图1是大豆种子的吸胀示意图；
A，种子用无菌水吸胀；B，吸胀后种子。
图2是转基因受体的制备和农杆菌侵染示意图；
A，左侧为吸胀的大豆种子，右侧为切开两瓣的受体；B，农杆菌侵染；C，侵染后受体材料的吸水干燥；D，受体材料与农杆菌的共培养；E，共培养5天后的受体材料；F，受体移入芽诱导培养基中。
图3是大豆转基因用双元载体的示意图；
A，载体pTF102的载体图；B，载体pSOY12的载体图；C，载体pDT004的载体图。
图4是芽诱导培养示意图；
A，芽诱导2周后的生长状况；B，芽诱导4周后的生长状况。
图5是芽伸长培养示意图；
A，B，C，转基因幼芽在筛选培养基中的伸长状况；D，E，F，G转基因幼芽生根状况；芽伸长和生根培养。
图6是传统的大豆子叶节受体的制备方法示意图；
A，发芽5天的子叶节致伤后的状况；B，子叶节致伤的放大图；C，共培养后子叶节的状况。
图7是用吸胀种子法进行农杆菌介导的豇豆转基因程序示意图；
A，种子表面消毒；B，从吸胀种子纵切获得的转基因受体；C，受体的农杆菌侵染；D，受体与农杆菌共培养；E，F，芽诱导；G，芽伸长；H，转基因苗的入土培植。
图8是转基因大豆和豇豆的GUS染色、PCR及试纸条鉴定结果示意图。
A，转基因大豆叶片GUS染色；B，转基因豇豆叶片GUS染色；C，转基因大豆和豇豆的PCR鉴定结果；D，转基因大豆和豇豆的试纸条鉴定结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1、
一、大豆种子的表面消毒和萌发：
1.大豆黑农37种子的表面消毒：大豆种子单层置于100×15mm的培养皿中(每皿大约150颗种子)，3-4个装有种子的培养皿开盖放入直径为24厘米的干燥器内，干燥器内置有250ml的烧杯。烧杯中加入100毫升的次氯酸钠溶液(质量浓度5.25％)，然后沿着杯壁缓缓加入3.5毫升12M HCl，立即盖上干燥器的盖子，于室温(10～25℃)下放置10-16小时灭菌。灭菌完成后打开干燥器盖，迅速盖上培养皿后将大豆种子移到无菌超净台上，打开培养皿约30分钟，以除去残留氯气。表面消毒后的种子在室温下可以保存2周。
2.大豆种子的吸胀：已灭菌后的大豆种子放在灭菌后的分化罐中，加入灭菌水，使种子浸泡在无菌水中，20℃，黑暗，12～15小时，如图1所示。
二、受体的制备和侵染：
1.受体的准备：将吸胀后的大豆种子置于无菌的吸水纸中，沿着种脐纵向切割将子叶分开两瓣，去除种皮，如图2A所示。
2.转基因用农杆菌的制备：本实验使用的质粒为pTF102(图3)，该质粒携带有GUS和bar基因二个能在植物细胞中表达的基因表达框。质粒的抗生素筛选标记为壮观霉素。质粒pTF102通过电击转化，转入农杆菌菌株EHA101中，划板培养。实验前，在培养板中，选取单克隆，放入2ml添加了100mg/L的壮观霉素的YEP液体培养基中。在27℃，转速为250rpm摇床培养菌落至饱和(大约12小时)。取0.2ml饱和菌液加入装有已加抗生素的250ml YEP培养基的1L烧瓶，250rpm，27℃培养至对数生长期(OD650＝0.6-1.0)。离心收集农杆菌(3,500rpm离心10分钟)后，用共培养基(CM，如表1所示)轻轻吹打，重悬浮沉淀。侵染用的农杆菌重悬液OD650为0.6。
3.农杆菌侵染：将准备好的大约50-100个受体材料置于一个培养皿中，浸泡在重悬的农杆菌菌液中，室温侵染约30分钟，如图2所示。
4.外植体与农杆菌的共培养：将受体从菌液中取出，用无菌吸水纸吸干后，置于放有滤纸的共培养培养基(表1)上，近轴面朝上。在16小时光照/8小时黑暗，23℃培养箱中培养5天，如图2所示。
三、丛生芽诱导：
将上述步骤二所得的受体放在加有一定浓度筛选剂的芽诱导(SI)培养基(表2)上，每皿6个受体。受体的子叶下胚轴部分须插入培养基中，而再生组织则须与水平面成30-45°角斜插在表面(图2F)。培养皿用透气胶带封口，培养(24℃，18/6光照强度)。受体组织在SI培养基上生长4周(图4)，两周更换一次新鲜的SI培养基，下胚轴要切一个新伤口。芽选择培养生长4周后对产生丛生芽的外植体进行计数，该丛生芽数与侵染的总受体数比值为计算丛生芽再生百分率。
四、芽伸长培养：
将分化的受体切除子叶残余后，转移到芽伸长(SE)培养基(表3)上，在生长箱中培养2-8周。每隔2周换一次新鲜的SE培养基(图5)。每一次换培养基时在受体基部切一个新鲜的水平切口。
五、伸长芽的生根和培植：
将伸长3-4厘米的幼芽切下后放入生根培养基(RM，表4)中生根，1-2周后根长约2-3厘米，将生根后的幼苗从培养基中取出转入土中培植(图5)。
表1.共培养基培养基配方
表2.丛生芽诱导培养基配方
表3芽伸长培养基配方
表4.生根培养基配方
表5.GUS染色液的配方
对比例1、以现有的子叶节法制备受体，来制备转基因苗：
按照文献报导的农杆菌介导的大豆子叶节转基因方法的受体材料准备中，操作者须将子叶连同3mm长的下胚轴从发芽5天的豆芽中切下，然后再纵切成两瓣，切开后还须在子叶节的位置划6-8条伤口(图6)。所得受体替代上述实施例1的步骤二的“受体的制备和侵染”中的所得受体(即步骤二.1所得)，后续步骤同实施例1。
为了充分证明本发明的创造性所在，将上述实施例1和对比例1进行了如下的实验：
实验1、吸胀种子法制备大豆转基因受体方法简便，转基因效率显著提高。
按照对比例1的告知：操作者须将子叶连同3mm长的下胚轴从发芽5天的豆芽中切下，然后再纵切成两瓣，切开后还须在子叶节的位置划6-8条伤口(图6)，受体材料的准备耗时长，对操作技术要求高，使不同操作人员间转基因效率差异很大。由表6列举了本实验室2008年10月用农杆菌介导大豆子叶节法开展大豆转基因的效率数据可见，用该方法制备大豆外植体，人均每小时可完成受体制备56.3个，用该方法制备的受体最终获得的携带有GUS报告基因的转基因数量很少，转基因效率为0-0.3％，平均效率为0.18％。与此相对应，本发明中大豆转基因用受体的制备时，只需将吸胀种子沿种脐纵向切割将子叶分开两瓣(图2)，程序简便，技术要求低。人均每小时可完成外植体制备100个，同时由于所用的受体材料处于高度未分化状态，农杆菌侵染率高，转基因效率稳定。采用新方法进行的大豆转基因试验，平均转基因效率为3.2％，各技术人员间差异不大。
表6.用不同受体制备法开展的大豆转基因的效率比较
实验2、吸胀种子法制备大豆转基因受体方法节约成本、缩短了转基因周期
发明中转基因受体的制备采用无菌水吸胀12-15小时的方法，从成熟种子到外植体的制备时间少于一天。与此相对应的传统受体准备法，将大豆种子用发芽培养基发芽5天后，从发芽的豆苗中切下子叶节作为转基因受体。二种方法相比而言，本发明缩短了整个转基因周期、节约了发芽培养基的成本。同时缩短了组织培养的时间，可减轻因组织培养带来的体细胞变异，提高转基因产品的质量。
实验3.本发明的受体制备法可用于其他双子叶植物的转基因
利用本发明的受体制备方法，对豇豆进行了转基因(即以豇豆替代大豆，其余等同于实施例1)。本实验中四个豇豆品种分别为帮达夏龙(购自杨州帮达集团)、之豇28-2、高产八号和凤豇555。以上品种用子叶节法进行转基因试验，未获得转基因植株，转基因效率为0％。用本发明所示的方法制备受体后，在四个品种中均获得了转基因植株，转基因平均效率为1.1％。豇豆转基因的各步骤请见图7。
实验4.转基因大豆的GUS染色鉴定、PCR鉴定和bar试纸条鉴定
本发明前述的各项转基因效率数据均为鉴定后确认的转基因苗数据。由于本发明数据用的试验选用农杆菌菌株EHA101，转基因用双元质粒为pTF102，带有筛选标记基因bar，报告基因gus。鉴定方法包括GUS染色鉴定，PCR核酸扩增鉴定及bar试纸条鉴定。
GUS染色鉴定：从待鉴定的疑拟转基因苗中取其部分叶片，浸置于含有适量GUS染液的离心管中，放入37℃恒温箱中过夜染色，染色完毕用75％乙醇进行脱色处理，体视镜下观察记载。表5为GUS染液的配方。转基因大豆和豇豆的GUS染色结果如图8所示。
PCR鉴定：在bar基因中选取引物，可扩增662个碱基长度的DNA产物。其中上游引物序列为：CGAGTCGACCGTGTACGTC，下游引物序列为：GCAACTGTCGGTCCAATAGAC。PCR检测结果如图7所示。
为了进一步鉴定转基因大豆中外源基因的蛋白表达水平，研究利用商用的bar蛋白快速检测试纸(EnviroLogix公司，美国)，对获得的转基因大豆进行了蛋白抗体鉴定。试纸条的鉴定方法与PCR鉴定结果的重合率达到100％(图8)。
实验5.本发明的受体制备法可用于大豆品种黑农58、中黄39、中豆32、华春3号、华春5号和威廉姆斯82。
为了充分证明本发明的受体制备方法可用于其他大豆品种，我们用黑农58、中黄39、中豆32、华春3号、华春5号和威廉姆斯82等5个大豆品种进行了受体制备和转基因。试验结果列于表7。由表7可知，用本发明的受体制备方法，在以上列举的品种中均获得了转基因植株，效率为0.2-3.03％。转基因个体的鉴定采用bar蛋白快速检测试纸(如图8所示)。
实验6.本发明的受体制备法可用于其他转基因载体
为了证明本发明所制备的受体同样适用于其他转基因载体，实验中我们采用了二个新的载体进行大豆转基因。载体pSOY12的T-DNA区域含有bar基因和EPSPS二个表达盒(图3B)，载体所含的抗生素标记为壮观霉素；载体pDT004是一个双T-DNA载体，其二个T-DNA分别带有bar基因和EPSPS基因(图3C)，载体所含的抗生素标记为卡那霉素。由实验数据可知，利用本发明制备的受体材料用于二个新载体转基因时，均能明显地提高转基因效率(表7)，本实验中转基因个体的鉴定采用bar蛋白快速检测试纸(如图8所示)。
表7.不同大豆品种及载体以吸胀种子法制备受体获得的转基因效率
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.双子叶植株转基因受体的快速制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、双子叶植株种子的表面消毒：
将双子叶植株种子单层置于培养皿中，将上述装有双子叶植株种子的培养皿开盖放入干燥器内，在干燥器内加入质量浓度为5～6％的次氯酸钠溶液，然后再加入11～13mol/L的HCl溶液，所述次氯酸钠溶液与HCl溶液的体积比为100∶3～4；
密封干燥器后，于室温下灭菌10～16小时；
灭菌完成后，先将培养皿加盖，然后从干燥器内转移到无菌超净台上，打开培养皿的盖子以除去培养皿内的残留氯气；得灭菌后双子叶植株种子；
2)、双子叶植株种子的吸胀：
将所述灭菌后双子叶植株种子放入灭菌后的分化罐中，并加入无菌水，所述灭菌后双子叶植株种子在黑暗下于18～22℃浸泡12～15小时；得吸胀后双子叶植株种子；
3)、受体的制备：
将所述吸胀后双子叶植株种子置于无菌吸水纸中，沿着种脐纵向切割从而将子叶分开两瓣，去除种皮，得双子叶植株转基因受体。
2.根据权利要求1所述的双子叶植株转基因受体的快速制备方法，其特征是：所述双子叶植株为大豆或豇豆。
3.根据权利要求2所述的双子叶植株转基因受体的快速制备方法，其特征是：所述步骤1)中：每个培养皿中放置120～170颗大豆种子，每个干燥器内放置3～4个所述装有大豆种子的培养皿；在干燥器内加入100ml质量浓度为5～6％的次氯酸钠溶液和3～4ml的摩尔浓度为11～13mol/L的HCl溶液。
4.根据权利要求3所述的双子叶植株转基因受体的快速制备方法，其特征是：所述步骤1)中：打开培养皿的盖子以除去培养皿内的残留氯气的时间为25～40分钟。
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