CN103614413A - 表面活性剂与超声波协同提高大豆遗传转化效率的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表面活性剂与超声波协同提高大豆遗传转化效率的方法及其应用。该方法是根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法，它包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体，共培养所述侵染后的外植体，得到共培养后的外植体，完成转化，其中，所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体为将所述大豆子叶节外植体置于含有所述重组根癌农杆菌的侵染液中进行超声处理后再进行侵染培养得到侵染后的外植体，所述侵染液含有表面活性剂；所述大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。该方法可用于转基因大豆新品种培育及基因功能挖掘、鉴定。

Description

表面活性剂与超声波协同提高大豆遗传转化效率的方法及其应用

技术领域

本发明涉及表面活性剂与超声波协同提高大豆遗传转化效率的方法及其应用。

背景技术

大豆（Glycine max(L.).Merr）起源于中国，是重要的油料作物和经济作物，也是食用植物油与植物蛋白质的主要来源，在我国人民的饮食结构中占有极其重要的位置。建立简便高效的大豆转基因技术体系，能弥补传统杂交育种方法基因资源匮乏的不足和缺陷，有助于提高大豆病虫害抗性及抗逆性，有助于改善大豆的蛋白和油脂品质，也有助于提高大豆功能基因的挖掘。然而大豆遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一，是公认的难转化作物之一，其最主要原因是遗传转化效率低。

根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化技术体系具有插入拷贝数少、目的基因整合完整、遗传稳定且转化体系受目的基因分子量影响小等优点，是大豆遗传转化最经典最常用的转化方法，但也存在一定缺陷，如基因型限制严重、再生植株困难、转化受体系统不健全、实验结果可重复性不够、受体与农杆菌的共侵染性（Susceptibility）差异大、外植体伤口对农杆菌防卫反应严重导致T-DNA难以进入靶细胞等问题是导致遗传转化效率较低的主要原因。

不同大豆基因型对农杆菌反应存在基因型差异，外植体与农杆菌之间复杂的互作关系是导致基因型差异的一个主要因素，农杆菌侵染时外植体创伤分泌的酚类物质激活农杆菌Vir毒性基因的表达，使农杆菌在外植体创伤处积聚，引起植物对农杆菌的防卫反应（plant defense desponse mechanism），过氧化物的分泌导致外植体靶细胞（子叶节划痕处）坏死，从而导致农杆菌T-DNA难以穿越细胞壁进入靶细胞或再生植株困难，降低遗传转化效率；外植体靶细胞周围创伤越大，植物对农杆菌的防卫反应越严重，外植体坏死越严重。抗氧化剂的添加能抑制外植体对农杆菌的防卫反应，从而促进农杆菌T-DNA向子叶节分生细胞的传递，提高转化效率，在共培养基中同时添加1.0mmol/L二硫苏糖醇、1.0mmol/L硫代硫酸钠、3.3mmol/L-半胱氨酸时，能显著提高GUS基因的瞬时转化效率（Liu et al,2003）；硝酸银和抗坏血酸的功能与L-半胱氨酸类似，且在丛生芽诱导、伸长芽诱导阶段添加10mg/L的AgNO₃能抑制乙烯的生成，有助于靶细胞的分化与再生。

传统的农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法用手术刀创伤外植体制备伤口，但靶细胞在下胚轴与子叶节之间，一个好的转基因受体，有一圈圆形的组织围绕靶细胞生长，传统的划痕方法很难对靶细胞进行准确有效的创伤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种克服现有农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法中存在的转化效率低、外植体准确有效创伤困难、外植体对农杆菌防卫反应严重、丛生芽得率低等难点的表面活性剂与超声波协同提高农杆菌介导大豆子叶节遗传转化效率的方法及其应用。

本发明所提供的根癌农杆菌介导大豆子叶节遗传转化方法，包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体，共培养所述侵染后的外植体，得到共培养后的外植体，完成转化，其中，所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体为将所述大豆子叶节外植体置于含有所述重组根癌农杆菌的侵染液中进行超声处理后再进行侵染培养得到侵染后的外植体，所述侵染液含有表面活性剂；

所述大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。

所述大豆子叶节外植体可按照下述方法制备：去掉萌发大豆种子的种皮，只留靠近子叶的3-4mm下胚轴，将其余部分下胚轴切除，然后将一粒萌发的大豆种子从下胚轴中线将下胚轴沿轴向切开，除去顶芽（真叶组织），得到大豆子叶节外植体，即每个子叶节外植体是由一片子叶及与所述一片子叶相连的长度为3-4mm的下胚轴组成。

上述方法中，所述超声处理的超声频率可为35Hz-45Hz（如40Hz），超声时间可为1秒-4秒（如2秒或4秒），超声功率可为100W。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表面活性剂可为Silwet L-77，所述侵染液中的Silwet L-77的体积含量可为0.01%-0.02%（如0.02%）。

上述方法中，所述超声处理的超声频率可为40Hz，超声时间可为2秒-4秒，超声功率可为100W，Silwet L-77的体积含量可为0.01%-0.02%。在本发明的一个具体实施方式中，所述大豆为中黄10号，所述超声处理的超声频率为40Hz，超声时间为2秒-4秒（如2秒或4秒），超声功率为100W，Silwet L-77的体积含量为0.02%；在本发明的另一个具体实施方式中，所述大豆为中黄10号，所述超声处理的超声频率为40Hz，超声时间为4秒，超声功率为100W，Silwet L-77的体积含量为0.01%。

上述方法中，所述侵染培养的温度可为22-25（如24℃），所述侵染培养的时间可为25-40（如30分钟）。

上述方法中，以只去除所述侵染液中的所述重组根癌农杆菌得到的液体为空白对照，所述侵染液的OD600nm为0.5-1.0。

所述侵染液可按照下述方法配制：用空白侵染液悬浮所述重组根癌农杆菌的菌体得到所述侵染液，以所述空白侵染液为空白对照，所述侵染液的OD600nm为0.5-1.0。每升所述空白侵染液可按照下述方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.7g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用水定容至1L，调节pH至5.45，灭菌；再添加过滤除菌的赤霉素、乙酰丁香酮和Silwet L-77，至赤霉素的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L，Silwet L-77的体积含量为0.01%-0.02%（如0.02%），得到所述空白侵染液。

上述方法中，所述重组根癌农杆菌是将含有所述目的DNA的重组表达载体导入根癌农杆菌得到的重组菌，所述重组表达载体可含有作为筛选标记基因的草甘膦抗性基因。

上述方法中，所述共培养可采用常用的共培养培养基，在本发明的一个具体实施方式中，每升共培养培养基按照如下方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.9g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，0.15g二硫苏糖醇，0.25g硫代硫酸钠，1.07g半胱氨酸，用水定容至1L，调节pH至5.45，再加入凝固剂（如5g琼脂），再添加过滤除菌的赤霉素和乙酰丁香酮，至赤霉素的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L，得到所述共培养培养基。

所述共培养的温度可为22-25（如24℃），共培养的时间可为3天（2.5-3.5天）。

上述方法中，所述大豆可为下述任一种：Jack、水里站、中黄10号、绥农18、九丰6号、绥农14、北丰2号、合丰44、红丰12、绥农11、合引一号、羊眼睛豆、绥农4号、齐茶豆2号、吉林小粒4号、吉育54、黑河5号、丰收8号、丰收9号、黑河23、黑河4号、耐盐279和吉原引3号。

上述根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法可用于培育转基因大豆新品种以及基因功能验证。

在本发明的一个实施方式中，本发明还提供了利用上述根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法在抗草甘膦转基因大豆培育上的应用。

本发明所提供的培育转基因大豆的方法包括将由上述方法得到的共培养后的外植体进行培养得到带根再生苗的步骤，对所述带根再生苗进行筛选得到转入所述目的DNA的转基因大豆植株。

上述培育转基因大豆的方法中，可按照如下方法对所述带根再生苗进行筛选：对所述带根再生苗进行草甘膦抗性鉴定得到草甘膦抗性植株，对所述草甘膦抗性植株进行分子检测，得到转入所述目的DNA的转基因大豆植株。

本发明还保护用根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体的方法，是用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体，其中，所述侵染是将所述大豆子叶节外植体置于含有所述重组根癌农杆菌的侵染液中进行超声处理后再进行侵染培养得到侵染后的外植体，所述侵染液含有表面活性剂；所述大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。

上述用根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体的方法中，所述超声处理的超声频率可为35Hz-45Hz，超声时间可为1秒-4秒（如2秒或4秒），超声功率可为100W；和/或，

所述表面活性剂可为Silwet L-77，所述侵染液中的Silwet L-77的体积含量可为0.01%-0.02%（如0.02%）；和/或，

所述侵染培养的温度可为22-25（如24℃），所述侵染培养的时间可为25-40（如30分钟）。

实验证明，以水里站为受体，本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的子叶节靶细胞处的染色效率平均为52±18%，显著高于超声波单独处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SAAT）、表面活性剂和划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SUR）和单独划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称CK）CK（p<0.05）。以Jack为受体，采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）培育转基因大豆的抗性丛生芽率显著高于采用SAAT、SUR和CK的抗性丛生芽率；以Jack为受体，采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）培育转基因大豆的外植体坏死率低于采用SAAT培育转基因大豆的外植体坏死率，二者差异不显著，但显著低于采用SUR和CK培育转基因大豆的外植体坏死率。本发明对传统的子叶节技术方法进行改良，用超声波处理代替传统划痕，能在子叶节靶细胞处制造均匀细密的伤口，该伤口在农杆菌侵染时，引起的外植体对靶细胞的防卫反应较小，从而外植体坏死率下降，提高了外植体利用率和抗性丛生芽得率，节约人力且事半功倍。在农杆菌侵染阶段，表面活性剂与超声波同时处理，产生协同效应，其作用效果显著好于单因素处理及对照（传统划痕），显著提高靶细胞处GUS基因瞬时表达效率，显著提高抗性丛生芽率，提高转基因效率。除草剂喷雾鉴定与分子检测相结合，能减小检测工作量，提高工作效率。本发明将在转基因大豆新品种培育及基因功能挖掘、鉴定中得到广泛的应用。

附图说明

图1a为Jack采用SAAT的GUS基因表达照片。

图1b为Jack采用SUR的GUS基因表达照片。

图1c为Jack采用CK的GUS基因表达照片。

图1d为Jack采用2S的GUS基因表达照片。

图1e为水里站采用2S的GUS基因表达照片。

图1f为水里站采用SUR的GUS基因表达照片。

图2为Jack转基因再生苗对对除草剂草甘膦的不同耐药性反应。

图中，从左至右的三张图片分别是不抗草甘膦植株、草甘膦抗性植株和草甘膦抗性植株。

图3为除草剂处理存活材料的PCR-测序分析

图中，M：100bp marker；质粒：pCambia3300-GR02；Jack：受体对照；菌液：Ag10/pCambia3300-GR02对照；BF1、BF2、BF4、BF12、BF15、BF16、BF18：草甘膦抗性鉴定中存活不同转pCambia3300-GR02单株；EP-F2/R2：GR02载体所含EPSPS基因的上下游引物；BF15-EPF2R2为用引物EP-F2和EP-R2对BF15的基因组DNA进行PCR扩增得到的PCR产物的序列。

图4为采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的转化效率高于天隆1号的大豆品种。

图中，a为九丰6号，b为羊眼睛豆，c为水里站，d为耐盐279。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pCAMBIA3301（Cynthia Crane et al.Transgenicmedicagotruncatulaplants obtained from agrobacterium tumefacines-transformedroots and agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots.Planta(2006),223:1344-1354）公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。该载体含有bar基因和GUS基因；该GUS基因带有内含子，只在植物细胞中表达，在原核生物（农杆菌）中不表达。

下述实施例中的pCambia3300-GR02（参考文献：郭兵福，刘杰，洪慧龙，邱丽娟.一种简便大豆原位转基因方法研究，大豆科学，31（3），2012）公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。pCambia3300-GR02含有草甘膦抗性基因EPSPS及筛选报告基因Bar。

下述实施例中的根癌农杆菌菌株Ag10（程伟.AtMGT4基因在水稻中异味表达的初步研究（D）.湖南师范大学，2012）公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的Jack（Venkata S.Tavva,Yul-Ho Kim,IsabelleA.Kaganetal.,Plant cell rep(2007)26:61-70.Increasedα-tocopherol contentin soybean seed overexpressing the Perillafrutescensγ-tocopherolmethyltransferase gene），中黄10号（<<中国大豆品种志>>，邱丽娟、王曙明主编，中国农业出版社，2007）和表2的150个大豆品种公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的B5干粉培养基和乙酰丁香酮为sigma公司产品，2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）、赤霉酸（GA3）和6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）为Biodee公司产品，表面活性剂Silwet L-77为Biodee公司产品。

实施例1、表面活性剂与超声波协同提高根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的转化效率

本实施例比较了本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）、表面活性剂和划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SUR）、超声波单独处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SAAT）和单独划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称CK）的转化效率，这四种方法均同时进行实验。

1、本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）具体步骤如下：

1.1、不带划痕的大豆子叶节外植体的制备

挑选饱满无病害的成熟大豆Jack和水里站的种子，每100粒置于90mm的玻璃培养皿中，用75%的酒精表面消毒30s，再用无菌抹布擦拭干净，将装有种子的培养皿置于密封干燥箱中，干燥箱内置一小烧杯，加入100ml次氯酸钠，再缓缓滴入4ml浓盐酸，密闭氯气灭菌16h。将灭菌后的大豆种子下胚轴朝下接种于萌发培养基中（每升萌发培养基按照如下方法配制：0.32g B5干粉培养基，30g蔗糖，用5M KOH调节pH至5.85，加入8g琼脂，用水定容至1L；121℃，18min高压灭菌后分装，每升分装30皿），恒温恒湿培养箱培养4-5d（24℃，每天18小时光照6小时黑暗）。待萌发种子的下胚轴伸长至2-3cm时，认真核对萌发材料，淘汰污染个体，筛选表型绿色健壮的幼苗按照如下方法制备大豆子叶节外植体：去掉萌发大豆种子的种皮，只留靠近子叶的3-4mm下胚轴，将其余部分下胚轴切除，然后将一粒大豆种子的两片子叶从下胚轴中线将下胚轴沿轴向切开，除去顶芽（真叶组织），得到不带划痕的大豆子叶节外植体，即每个子叶节外植体是由一片子叶及与所述一片子叶相连的长度为3-4mm的下胚轴组成。其中，不带划痕的大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。由此，每个无菌苗可得到两个用于转化的不带划痕的大豆子叶节外植体。

1.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

含有目的DNA（GUS基因）的重组载体为pCAMBIA3301，pCAMBIA3301载体含有草丁膦抗性基因Bar及报告基因GUS基因，载体抗性为卡那霉素抗性。

参照电激仪（EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司）操作指南，将pCAMBIA3301用电击法转化根癌农杆菌Ag10，经含卡那霉素和利福平的抗性平板筛选得到转入pCAMBIA3301的重组菌，即含有目的DNA的重组根癌农杆菌，命名为Ag10/pCAMBIA3301。

用接种环蘸取少量的Ag10/pCAMBIA3301划平板，接菌种于LB固体培养基上（含卡那霉素、利福平各50mg/L），平板倒置，28℃培养36-48h。再挑取单菌落，接菌种于5毫升含有同样抗生素的YEP培养液中，220rpm28℃活化培养12h，使菌液达到饱和状。再将这5毫升菌液移至含有100ml同样抗生素的YEP培养液的摇瓶中，在28℃220rpm条件下第二次活化。待Ag10/pCAMBIA3301充分活化后将菌液在4000rpm，4℃条件下离心10min，收集沉淀，得到Ag10/pCAMBIA3301菌体。用空白侵染液悬浮Ag10/pCAMBIA3301菌体得到含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液，以空白侵染液为空白对照，含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液的OD600nm为0.5-1.0。其中，每升空白侵染液按照下述方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.7g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.45，121℃灭菌18分钟；再添加过滤除菌的赤霉酸、乙酰丁香酮和Silwet L-77，至赤霉酸的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L和Silwet L-77的体积含量为0.02%。

1.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCAMBIA3301侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体。

每个三角瓶中放30-40个1.1制备的不带划痕的大豆子叶节外植体，再加入1.2制备的含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液中，先用超声清洗仪进行超声处理，该超声处理的超声频率为40Hz，超声时间为2秒，超声功率为100W。超声处理后，24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌对外植体的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

1.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

完成重组根癌农杆菌侵染后倒去重组根癌农杆菌的侵染液，收集侵染后的外植体，在共培养培养基上铺一层经过高压灭菌的滤纸，将侵染后的外植体平铺于滤纸上，向轴一侧朝下，24℃暗培养3天，得到共培养后的外植体，完成转化。每升共培养培养基按照如下方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.9g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，0.15g二硫苏糖醇，0.25g硫代硫酸钠，1.07g半胱氨酸，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.45，加入5g琼脂，121℃，18min高压灭菌，再添加过滤除菌的赤霉酸和乙酰丁香酮，至赤霉酸的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L。每升共培养培养基分装40皿（直径为100mm培养皿）。

2、表面活性剂和划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SUR）

2.1、带划痕的大豆子叶节外植体的制备

将按照1.1方法制备的不带划痕的大豆子叶节外植体用解剖刀在子叶节处轴向划5-7刀，得到带划痕的大豆子叶节外植体。每个无菌苗可得到两个用于转化的带划痕的大豆子叶节外植体。

2.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

同1.2。

2.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCAMBIA3301侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个2.1制备的带划痕的大豆子叶节外植体，再加入2.2制备的含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液中，再24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

2.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

3、超声波单独处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SAAT）

3.1、不带划痕的大豆子叶节外植体的制备

同1.1。

3.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液的制备方法中，除空白侵染液不含SilwetL-77外，其余与1.2完全相同。SAAT中的每升空白侵染液按照下述方法配制：将0.32gB5干粉培养基，3.7g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.45，121℃灭菌18分钟；再添加过滤除菌的赤霉酸和乙酰丁香酮，至赤霉酸的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L。

3.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCAMBIA3301侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个3.1制备的不带划痕的大豆子叶节外植体，再加入3.2制备的含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液中，先用超声清洗仪进行超声处理，该超声处理的超声频率为40Hz，超声时间为2秒，超声功率为100W。超声处理后，在24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

3.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

4、单独划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称CK）

4.1、带划痕的大豆子叶节外植体的制备

同2.1。

4.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

同3.2。

4.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCAMBIA3301侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个4.1制备的带划痕的大豆子叶节外植体，再加入4.2制备的含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCAMBIA3301菌体的侵染液中，再24℃培养30min，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

4.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

5、GUS染色测定转化效率

瞬时表达效率能反应出大豆外植体对农杆菌的敏感程度。实验重复三次，每次重复每个大豆品种分别测定50余个1.4、2.4、3.4和4.4共培养后的外植体，方法如下：将1.4、2.4、3.4和4.4得到的共培养后的外植体进行GUS染色，GUS染色配方在参照Jefferson的配方基础上进行改良，配方如下：

B.配GUS stain buffer(30ml配方)

称15mg X-Gluc,用N，N-二甲基甲酰胺溶解，溶解后添加至GUS stain buffer母液中定容至30ml，得到染色液。其中，200ml GUS stain buffer母液按照如下方法配制：取NaH₂PO₄.2H₂03.12g，0.5M EDTA9.30g，20%Triton X-1001ml，用水定容至200ml，pH=8.0(调pH时用NaOH固体粉末调节，加到7.7-7.8时缓慢加，pH值要准确)。

染色时确保染色液完全浸没外植体，37℃，暗培养，染色时间24h，染色后先无水乙醇脱色12h，再75%乙醇脱色12h，统计外植体的整体染色效率及在子叶节靶细胞处的染色效率。染色效率=（GUS染色阳性的外植体数/GUS染色的外植体总数）*100%。用SPSS软件进行差异显著性分析。

其中，GUS染色阳性的外植体是GUS染色后显蓝色的外植体。

结果如表1所示，以Jack为受体，本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的子叶节靶细胞处的染色效率平均为25±11%，高于SAAT、SUR和CK。以水里站为受体，本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的子叶节靶细胞处的染色效率平均为52±18%，显著高于SAAT、SUR和CK（p<0.05）。

表1、各种遗传转化方法对两个大豆品种的子叶节靶细胞处的染色效率（%）

注：表中的数值为平均值±标准差。

上述实验结果说明超声波与表面活性剂同时处理能产生协同效应，协同提高GUS基因在整体与靶细胞子叶节处的瞬时表达效率。图1a-图1f显示了部分植株的GUS基因染色结果。

实施例2、培育转基因大豆

本实施例比较了采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）、表面活性剂和划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SUR）、超声波单独处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SAAT）和单独划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称CK）培育转基因大豆的抗性丛生芽率和外植体坏死率，这四种方法均同时进行实验。

1、本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）具体步骤如下：

1.1、不带划痕的大豆子叶节外植体的制备

除大豆为Jack外，其余同实施例1的1.1。

1.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

含有目的DNA的重组载体为pCambia3300-GR02。

参照电激仪（EasyJecT Plus电激仪，英国EquiBio公司）操作指南，将pCambia3300-GR02用电击法转化根癌农杆菌Ag10，经含卡那霉素和利福平的抗性平板筛选得到转入pCambia3300-GR02的重组菌，即含有目的DNA的重组根癌农杆菌，命名为Ag10/pCambia3300-GR02。

用接种环蘸取少量的Ag10/pCambia3300-GR02划平板，接种于LB固体培养基上（含卡那霉素、利福平各50mg/L），平板倒置，28℃培养36-48h。再挑取单菌落，接种于5毫升含有同样抗生素的YEP培养液中，220rpm28℃活化培养12h，使菌液达到饱和状态。再将这5毫升菌液移至含有100ml同样抗生素的YEP培养液的摇瓶中，在28℃220rpm条件下第二次活化。待Ag10/pCambia3300-GR02充分活化后将菌液在4000rpm，4℃条件下离心10min，收集沉淀，得到Ag10/pCambia3300-GR02菌体。用空白侵染液悬浮Ag10/pCambia3300-GR02菌体得到含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液，以空白侵染液为空白对照，含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液的OD600nm为0.5-1.0。其中，每升空白侵染液按照下述方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.7g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.45，121℃灭菌18分钟；再添加过滤除菌的赤霉酸、乙酰丁香酮和Silwet L-77，至赤霉酸的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L和Silwet L-77的体积含量为0.02%。

1.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCambia3300-GR02侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

除将重组根癌农杆菌替换为Ag10/pCambia3300-GR02外，其余同实施例1的1.3。

1.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同实施例1的1.4。

2、表面活性剂和划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SUR）

2.1、带划痕的大豆子叶节外植体的制备

将按照1.1方法制备的不带划痕的大豆子叶节外植体用解剖刀在子叶节处轴向划痕5-7刀，得到带划痕的大豆子叶节外植体。每个无菌苗可得到两个用于转化的带划痕的大豆子叶节外植体。

2.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

同1.2。

2.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCambia3300-GR02侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个2.1制备的带划痕的大豆子叶节外植体，再加入2.2制备的含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液中，在24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

2.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

3、超声波单独处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称SAAT）

1.1、不带划痕的大豆子叶节外植体的制备

同1.1。

3.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液的制备方法中，除空白侵染液不含Silwet L-77外，其余与1.2完全相同。SAAT中的每升空白侵染液按照下述方法配制：将0.32g B5干粉培养基，3.7g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.45，121℃灭菌18分钟；再添加过滤除菌的赤霉酸和乙酰丁香酮，至赤霉酸的浓度为0.25mg/L，乙酰丁香酮的浓度为39mg/L。

3.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCambia3300-GR02侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个3.1制备的带划痕的大豆子叶节外植体，再加入3.2制备的含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液中，先用超声清洗仪进行超声处理，该超声处理的超声频率为40Hz，超声时间为2秒，超声功率为100W。超声处理后，在24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

3.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

4、单独划痕处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称CK）

4.1、带划痕的大豆子叶节外植体的制备

同2.1。

4.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

同3.2。

4.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCambia3300-GR02侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个4.1制备的带划痕的大豆子叶节外植体，再加入4.2制备的含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液中，再24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

4.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同1.4。

5、筛选获得抗性丛生芽

实验中的每种处理至少重复三次，每次重复分别取实施例1中1.4共培养后的外植体、2.4共培养后的外植体、3.4共培养后的外植体和4.4共培养后的外植体接种至丛生芽诱导培养基上，在24℃，每天18小时光照6小时黑暗的光照体系下培养诱导丛生芽，15天后，用丛生芽诱导培养基继代一次，继代时在子叶节的背轴重新切一新的伤口，以使外植体能更好地吸收培养基中的养分，24℃，每天18小时光照6小时黑暗的光照体系下培养15天，统计抗性丛生芽率和外植体坏死率。抗性丛生芽率=获得的丛生芽数/外植体数×100%。外植体坏死率=褐化坏死外植体数/总外植体数×100%。每升丛生芽诱导培养基按照如下方法配制：将3.2g B5干粉培养基，0.6g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，1.67mg6-苄氨基腺嘌呤，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH水溶液调节pH至5.75，加入8g琼脂，121℃，18min高压灭菌，再添加过滤除菌的噻孢霉素、羧苄青霉素、草甘膦和AgNO₃，使噻孢霉素的浓度为250mg/L、羧苄青霉素的浓度为250mg/L、草甘膦的浓度为15mg/L、AgNO₃的浓度为10mg/L；每瓶分装10皿（直径为120mm的培养皿）。

以Jack为受体，本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计902个，设7次重复，每次重复120余个外植体，其抗性丛生芽率为34.26±7.44%；SUR处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计411个，设4次重复，每次重复100余个外植体，其抗性丛生芽率为8.98±1.78%;SAAT处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计384个，设3次重复，每次重复120余个，其抗性丛生芽率为14.03±1.87%;CK处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计686个，设5次重复，每次重复130余个外植体，其抗性丛生芽率为6.37±2.24%（表2）。单因素方差分析结果表明，采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）培育转基因大豆的抗性丛生芽率显著高于采用其他三种大豆子叶节遗传转化方法；采用SAAT培育转基因大豆的抗性丛生芽率和采用SUR培育转基因大豆的抗性丛生芽率虽然比CK有一定的提高，但差异不显著；说明超声波与表面活性剂同时处理产生协同效应，能显著提高外植体的抗性丛生芽得率。

表2、采用各种遗传转化方法培育转基因大豆的抗性丛生芽率

注：表中的数值为平均值±标准差。

以Jack为受体，本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计538个，设17次重复，每次重复30余个外植体，其外植体坏死率为13±8%；SUR处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计176个，设5次重复，每次重复30余个，其外植体坏死率为50±20%;SAAT处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计124个，设4次重复，每次重复30余个外植体，其外植体坏死率为18±7%;CK处理进行丛生芽诱导的共培养外植体总计224个，设7次重复，每次重复30余个外植体，其外植体坏死率为46±11%（表3）。采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）培育转基因大豆的外植体坏死率低于采用SAAT培育转基因大豆的外植体坏死率，二者差异不显著，但极显著低于采用另外两种大豆子叶节遗传转化方法培育转基因大豆的外植体坏死率。说明在外植体制备时，划痕造成的伤口是造成外植体褐化的重要原因，超声波制备伤口的外植体褐化率极显著低于传统划痕，说明利用超声波制备伤口时，相对传统划痕，伤口细密均匀，可能这种伤口引起的外植体对农杆菌及其它外来入侵物的防卫反应较小，故有利于提高外植体的利用效率、降低外植体坏死率。

表3、采用各种遗传转化方法培育转基因大豆的外植体坏死率

注：表中的数值为平均值±标准差。

6、获得伸长芽与再生苗

筛选步骤5中健壮的丛生芽，淘汰污染个体；在生长点的基部作新的水平方向切口，切口朝下接种至伸长培养基中。每两周继代一次，每次继代时在外植体的基部作一个新的水平切口。伸长芽伸长至6cm左右时，从伸长芽的基部将伸长芽与丛生芽分开，接种至生根培养基中诱导生根。生根的周期一般为2周，待诱导的根伸长至2-3cm时，将培养皿上的封口膜揭开，开口炼苗3-5天；再将转化苗移栽到草炭：蛭石：营养土=1：2：4（V：V：V）的混合基质中，套袋保湿一个星期，逐渐揭开塑料袋，使其正常生长、发育与结实。

其中，每升芽伸长培养基按照如下方法配制：将4.3g MS干粉培养基（sigma），0.6g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，30g蔗糖，50mg天冬氨酸，50mg谷氨酸，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH调节pH至5.75；加入8g琼脂，121℃，18min高压灭菌后，再添加过滤除菌的噻孢霉素、羧苄青霉素、草甘膦、吲哚-3-乙酸和赤霉酸，使噻孢霉素的浓度为250mg/L、羧苄青霉素的浓度为250mg/L、草甘膦的浓度为5mg/L、吲哚-3-乙酸的浓度为0.3mg/L，赤霉酸的浓度为0.25mg/L；每升分装25瓶（100ml三角瓶）。

每升生根培养基按照如下方法配制：将4.3g MS干粉培养基（sigma），0.6g2-(N-吗啡啉)乙磺酸，20g蔗糖，50mg天冬氨酸，50mg谷氨酸，用蒸馏水定容至1L，用5M KOH调节pH至5.75加入8g琼脂，121℃，18min高压灭菌后，每升分装20瓶（100ml三角瓶）。

7、转基因植株的鉴定

7.1抗性鉴定

待移栽的转基因再生苗第一片三出复叶完全展开时，对其进行草甘膦抗性喷雾鉴定，喷雾浓度农达100ml/亩（草甘膦异丙胺盐，有效成分41%，Monsanto），连续观察转基因再生苗对除草剂的药害反应，1个月后对存活的植株进行分子检测（图2）。

7.2抗性鉴定存活植株的分子鉴定

喷药处理1个月后，从存活材料中提取植物基因组DNA，用EP-F2，EP-R2引物对草甘膦抗性基因EPSPS进行扩增：

EP-F2：5’-CAAATCCATTACCAACCGTGC-3’（序列1）

EP-R2：5’-ACCACCATCAATCTCGAAACG-3’（序列2）；目的条带大小为430bp。

由结果可知，PCR扩增出的条带约为430bp，与预计的EPSPS基因大小相符，同时测序结果也与EPSPS基因相一致。而同时野生型及水对照并无该条带，初步认定扩增出430bp目的片段的转基因植株为阳性植株（图3）。

结果表明，采用步骤1的本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）获得的共培养后的外植体按照步骤5的方法进行筛选获得抗性丛生芽、按照步骤6的方法进行再生、按照步骤7的方法进行鉴定，从80个萌发种子中获得了4个阳性植株，转基因效率为5%。

实施例3、本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）对不同大豆品种的转化效率

以对根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法敏感的大豆天隆1号（国审豆2008023）号为对照，采用实施例1的步骤1中1.1-1.4和步骤5的方法测定了本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法（简称2S）对表2的150份大豆品种的外植体的整体染色效率及在子叶节靶细胞处的染色效率。实验重复三次，每次重复每个品种测定30-35个外植体。

结果表明子叶节靶细胞处的染色效率是天隆1号子叶节靶细胞处的染色效率的2倍以上的品种有绥农18、九丰6号、绥农14、北丰2号、合丰44、红丰12、绥农11、合引一号、羊眼睛豆、水里站、绥农4号、齐茶豆2号、吉林小粒4号、吉育54、黑河5号、丰收8号、丰收9号、黑河23、黑河4号、耐盐279、吉原引3号（表5）。

表5、各大豆品种的子叶节靶细胞处的染色效率

品种名称	子叶节靶细胞处的染色效率	与天隆1号比值	非专利文献出处
				84-51	0.07	0.31	3
GR8836	0.14	0.63	3
				绥农18	0.71	3.22	4
九丰6号	0.65	2.95	4
				绥农14	0.54	2.46	4
北丰2号	0.69	3.12	2
				合丰44	0.67	3.05	4
红丰12	0.66	3	4
				绥农11	0.50	2.25	4
合引一号	0.48	2.18	4
				羊眼睛豆	0.57	2.6	1
水里站	0.52	2.38	1
				绥农4号	0.56	2.56	2
齐茶豆2号	0.45	2.04	4
				吉林小粒4号	0.50	2.29	4
吉育54	0.49	2.21	4
				黑河5号	0.48	2.18	3
丰收8号	0.46	2.08	1
				丰收9号	0.44	2.01	1
黑河23	0.46	2.07	4
				黑河4号	0.45	2.05	3
耐盐279	0.54	2.47	1
				吉原引3号	0.44	2	4
宝丰8号	0.43	1.96	4
				黑河28	0.41	1.88	4

黑农7号	0.41	1.86	1
				长农17	0.38	1.72	4
东农43	0.37	1.66	4
				丰收18号	0.36	1.62	2
丰收10号	0.35	1.57	1
				东豆1号	0.34	1.56	4
丰收1号	0.34	1.56	1
				黑河54	0.34	1.53	1
垦鉴豆26	0.33	1.51	4
				北呼豆	0.33	1.5	1
吉林20号	0.33	1.48	2
				北丰11	0.32	1.46	4
合丰45	0.28	1.25	4
				吉科豆1号	0.27	1.21	4
东农46	0.24	1.08	4
				黑农38	0.24	1.08	4
北丰16	0.23	1.04	4
				九丰7号	0.23	1.04	4
合丰35	0.22	0.98	4
				辽豆14	0.21	0.97	4
东生1号	0.21	0.94	4
				晋豆26	0.21	0.94	4
垦农17	0.21	0.94	4
				垦鉴豆4号	0.20	0.93	4
豫豆20	0.20	0.92	4
				邯豆3号	0.19	0.88	4
蒙豆14	0.19	0.86	4
				丰收12	0.18	0.81	1
合丰42	0.18	0.81	4
				吉黄60号	0.18	0.81	3
九丰4号	0.18	0.81	3
				垦鉴豆27	0.18	0.81	4
嫩丰16	0.17	0.76	4
				豫豆15	0.17	0.76	4
合丰40	0.16	0.71	4
				东农34号	0.15	0.69	2
垦鉴豆23	0.15	0.69	4
				冀豆12	0.15	0.67	4
垦农19	0.15	0.67	4
				嫩丰10号	0.15	0.67	2
九丰1号	0.14	0.65	2

晋遗30	0.14	0.63	4
				徐豆8号	0.14	0.63	4
垦丰9号	0.13	0.59	4
				垦农2号	0.13	0.59	3
嫩良2号	0.13	0.59	1
				白农6号	0.12	0.54	4
黑农30号	0.12	0.54	3
				黑农35号	0.12	0.54	3
黑河30	0.11	0.51	4
				垦农18	0.11	0.48	4
吉育58	0.10	0.45	4
				红丰11	0.09	0.42	4
徐豆11	0.09	0.41	4
				proto	0.09	0.4	3
黑河11	0.09	0.4	4
				吉林33	0.09	0.4	4
黑河7号	0.08	0.35	3
				东农44	0.07	0.33	4
九丰3号	0.07	0.33	3
				红丰8号	0.07	0.32	4
铁秆1号	0.07	0.32	3
				中黄13	0.07	0.31	4
中品661	0.07	0.3	4
				合丰27号	0.06	0.29	2
绥农21	0.06	0.29	4
				早熟17	0.06	0.26	3
丰收14	0.05	0.24	1
				晋大70	0.05	0.24	4
宝丰7号	0.05	0.22	4
				黑河18	0.05	0.22	4
东大1号	0.04	0.2	4
				科新5号	0.04	0.18	4
绥农8号	0.04	0.17	3
				黑农46	0.03	0.14	4
嫩丰13号	0.03	0.14	3
				合丰39	0.03	0.13	4
绥农10号	0.03	0.13	4
				合丰30号	0.02	0.11	3
抗线虫5号	0.02	0.09	4
				高丰1号	0.02	0.08	4
邯豆5号	0.02	0.08	4

晋大74	0.02	0.08	4
				五星2号	0.02	0.08	4
吉林47	0.01	0.05	4
				嫩丰17	0.01	0.05	4
绥农15	0.01	0.05	4
				丰收19号	0.00	0	2
合引2号	0.00	0	4
				菏豆13	0.00	0	4
黑河19	0.00	0	4
				黑河34	0.00	0	4
黑河3号	0.00	0	1
				黑农48	0.00	0	4
化诱542	0.00	0	4
				吉育70	0.00	0	4
晋豆22	0.00	0	4
				晋豆28	0.00	0	4
晋豆29	0.00	0	4
				垦丰10号	0.00	0	4
垦丰11	0.00	0	4
				垦鉴豆25	0.00	0	4
垦农16	0.00	0	4
				辽首2号	0.00	0	4
鲁豆10号	0.00	0	4
				鲁豆11	0.00	0	4
鲁豆8号	0.00	0	3
				蒙豆11	0.00	0	4
蒙豆13	0.00	0	4
				内豆4号	0.00	0	4
南农217	0.00	0	4
				青皮平顶香	0.00	0	1
铁丰28	0.00	0	4
				铁丰31	0.00	0	4
文丰1号	0.00	0	1
				五星1号	0.00	0	4
予豆一号	0.00	0	2
				豫豆12	0.00	0	3
豫豆19	0.00	0	4
				郑90007	0.00	0	4
中黄19	0.00	0	4
				中黄20	0.00	0	4
中黄3	0.00	0	3

中品662	0.00	0	4
				天隆1号	0.22	1

注：数值为平均值，第4列中，1表示：中国农业科学院油料作物研究所主编，中国大豆品种资源目录，农业出版社，1982；2表示：中国农业科学院作物品种资源研究所主编，中国大豆品种资源目录续编一，农业出版社，1991；3表示：中国农业科学院作物品种资源研究所主编，中国大豆品种资源目录续编二，中国农业出版社，1996；4表示：<<中国大豆品种志>>，邱丽娟、王曙明主编，中国农业出版社，2007。

图4显示了九丰6号、羊眼睛豆、水里站和耐盐279采用本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法的GUS基因染色照片。

对比例1、上述实施例中采用的本申请的表面活性剂与超声波协同处理的根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法中的超声条件和表面活性剂浓度是通过如下实验以抗性丛生芽得率为指标得出的。具体实验方法如下：

1.1、不带划痕的大豆子叶节外植体的制备

除将实施例2的大豆品种由Jack替换为中黄10号外，其余实验方法均相同。

1.2、含有目的DNA的重组根癌农杆菌的制备

除将实施例2的1.2中的空白侵染液中的Silwet L-77的体积含量改变外，其余实验方法均相同。其中，Silwet L-77的体积含量设六个处理，分别为0.00%、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%、0.12%。

1.3、用含有目的DNA的重组根癌农杆菌Ag10/pCambia3300-GR02侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体

每个三角瓶中放30-40个1.1制备的不带划痕的大豆子叶节外植体，再加入1.2制备的含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液35ml-45ml，使大豆子叶节外植体浸没在含有Ag10/pCambia3300-GR02菌体的侵染液中，先用超声清洗仪进行超声处理，该超声处理的超声频率为40Hz，超声时间分别为0秒、1秒、2秒、4秒、8秒和12秒，超声功率为100W。超声处理后，在24℃培养30min，以完成重组根癌农杆菌的侵染，得到侵染后的外植体，期间并不时地轻摇三角瓶以使重组根癌农杆菌和外植体充分接触。

1.4、共培养侵染后的外植体，完成转化

同实施例2的1.4。

2、筛选获得抗性丛生芽

同实施例2的步骤5。

均以空白处理（超声时间为0秒，空白侵染液中的Silwet L-77的体积含量为0.00%）为对照，每个实验3次重复，每次重复中30-35个外植体。

抗性丛生芽率（E）=抗性丛生芽数/外植体数×100%。

36个实验的实验结果如表5所示，表明适宜时间的超声处理与适宜浓度的表面活性剂处理均能增加抗性丛生芽得率，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.02%、超声2秒的实验的抗性丛生芽得率为91.00%；空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.02%、超声4秒的实验抗性丛生芽得率为87.95%；空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.01%、超声4秒的实验抗性丛生芽得率为80.56%；均高于对照（空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.00%、超声0秒的实验抗性丛生芽得率为59.86%）；长时间的超声处理及过高浓度的表面活性剂处理均抑制抗性丛生芽的获得，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.00%、超声8s的实验的抗性丛生芽得率为29.9%，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.08%、超声0秒的实验的抗性丛生芽得率为41.4%，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.12%、超声0秒的实验的抗性丛生芽得率为29.92%，明显低于对照的60.7%。同时研究结果表明，在适宜的处理范围内（超声2-4秒，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.02%；超声4秒，空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.01%；），两因素同时处理能产生协同作用，获的抗性丛生芽率明显高于对照及单因素处理时的丛生芽得率，空白侵染液中SilwetL-77的体积含量为0.02%超声2秒的实验的抗性丛生芽得率高达91.00%，明显高于单因素处理及空白对照的丛生芽得率。

表5、6个超声波处理时间和6个Silwet L-77浓度的交互实验的平均抗性丛生芽率

注：表中带*号的表示抗性丛生芽率较对照具有显著性差异。

大豆遗传转化可以分为2部分，第一部分是农杆菌介导将外源基因整合入受体靶细胞基因组的部分，即通过农杆菌把目的基因转化入靶细胞；第二部分是再生与筛选，即在含有筛选剂的组织培养培养基中，将靶细胞再生为植株。

该实验说明，适宜时间超声处理及适宜浓度表面活性剂处理对抗性丛生芽得率具有促进作用，具有利于转化和再生（抗性丛生芽多，说明含有目的基因的靶细胞通过组培诱导的丛生芽较多，相对侵染效率提高；同时丛生芽多可用于诱导更多的再生植株，适宜范围的处理不影响转基因再生）。但是长时间的超声处理（8s、12s）及高浓度的表面活性剂处理（空白侵染液中Silwet L-77的体积含量为0.08%、0.12%）抑制抗性丛生芽的获得，即影响再生。因此在不影响再生的前提下，选择抗性丛生芽率较高的（超生2s,表面活性剂0.02%）进行上述实验。

Claims (10)

1.根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法，包括用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体，共培养所述侵染后的外植体，得到共培养后的外植体，完成转化，其特征在于：所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体为将所述大豆子叶节外植体置于含有所述重组根癌农杆菌的侵染液中进行超声处理后再进行侵染培养得到侵染后的外植体，所述侵染液含有表面活性剂；所述大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超声处理的超声频率为35HZ-45HZ，超声时间为1秒-4秒，超声功率为100W；和/或，

所述表面活性剂为Silwet L-77，所述侵染液中的Silwet L-77的体积含量为0.01%-0.02%。

3.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述侵染培养的温度为22-25℃，所述侵染培养的时间为25-40分钟。

4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述重组根癌农杆菌是将含有所述目的DNA的重组表达载体导入根癌农杆菌得到的重组菌，所述重组表达载体含有作为筛选标记基因的草甘膦抗性基因。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述大豆为下述任一种：Jack、水里站、中黄10号、绥农18、九丰6号、绥农14、北丰2号、合丰44、红丰12、绥农11、合引一号、羊眼睛豆、绥农4号、齐茶豆2号、吉林小粒4号、吉育54、黑河5号、丰收8号、丰收9号、黑河23、黑河4号、耐盐279和吉原引3号。

6.一种培育转基因大豆的方法，包括将由权利要求1至5中任一所述方法得到的共培养后的外植体进行培养得到带根再生苗的步骤，对所述带根再生苗进行筛选得到转入所述目的DNA的转基因大豆植株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：按照如下方法对所述带根再生苗进行筛选：对所述带根再生苗进行草甘膦抗性鉴定得到草甘膦抗性植株，对所述草甘膦抗性植株进行分子检测，得到转入所述目的DNA的转基因大豆植株。

8.用根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体的方法，是用含有目的DNA的重组根癌农杆菌侵染大豆子叶节外植体得到侵染后的外植体，其特征在于：所述侵染是将所述大豆子叶节外植体置于含有所述重组根癌农杆菌的侵染液中进行超声处理后再进行侵染培养得到侵染后的外植体，所述侵染液含有表面活性剂；所述大豆子叶节外植体的子叶节处不制作划痕。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述超声处理的超声频率为35HZ-45HZ，超声时间为1秒-4秒，超声功率为100W；和/或，

所述表面活性剂为Silwet L-77，所述侵染液中的Silwet L-77的体积含量为0.01%-0.02%。

10.权利要求1-9中任一所述的方法在培育转基因大豆中的应用，或权利要求1-9中任一所述的方法在基因功能验证中的应用。

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